Тест-система імуноферментна для одночасного виявлення антигену р24 вірусу імунодефіциту людини першого та другого типів (віл- 1/2) та анти-віл антитіл (dia-hiv1/2-ag/at)

Винахід належить до біотехнології, імунохімії та медицини і може бути використаний для одночасного серологічного обстеження зразків сироваток, плазми крові людини на наявність антитіл проти вірусу імунодефіциту людини першого та другого типів (ВІЛ1 /2) і стр уктурного білка р24 ВІЛ. В Україні тест-системи для одночасного виявлення антитіл та антигенів ВІЛ не виробляються. Існує тестсистема "Genscreen Plus HIV Ag-Ab" виробництва "Bio-RacT (Франція) для детекції ВІЛ-інфекції в сироватке/плазмі крові людини методом імуноферментного аналізу [І], в якій на полістироловий планшет сорбовані антитіла проти антигена р24 ВІЛ та очищені ВІЛ-1 і ВІЛ-2 антигени, а як кон'югат використовують біотинільовані анти-ВІЛ-1-антитіла та стрептавідин, зв'язаний з пероксидазою. В основу винаходу покладено завдання створити імуноферментну тест-систему на основі імуносорбенту з сорбованими моноклональними антитілами проти антигена р24 ВІЛ та рекомбінантними поліпептидами аналогами-антигенів р36, р41 та р120. До складу кон'югату входять біотинільовані моноклональні антитіла до інших епітопів р24 ВІЛ і страптавідин, зв'язаний з перксидазою, а також рекомбінантні поліпептиди аналогіантигенів ВІЛ, мічені ферментом; або моноклональні антитіла проти р24 та рекомбінантні поліпептиди аналогіантигенів ВІЛ, мічені ферментом. Ферментативну реакцію визначають за допомогою субстратного розчину з хромогеном. За одну постановку (2 години) можна проаналізувати 91 сироватку. Приклад 1. Визначення наявності антигена р24 ВІЛ та анти-ВІЛ антитіл в сироватці крові хворої А., 1985 року народження. Визначення проводять за відомою методикою [2] твердофазного імуноферментного аналізу. Для цього вносять у лунки планшета-імуносорбенту з фіксованими на ньому моноклональними антитілами проти р24 ВІЛ та рекомбінантними поліпептидами аналогами-антигенів ВІЛ р36, р41 та р120 досліджуваний матеріал від хворої для визначення наявності ВІЛ-інфекції та контрольні зразки (2 позитивних і 3 негативних). Через 10 хв у всі лунки вносять біотинільовані моноклональні антитіла до р24 ВІЛ Накривають планшет клейкою плівкою або кришкою та інкубують при температурі 37°С протягом 60хв. Після закінчення інкубації видаляють вміст лунок за допомогою промивача або 8-канальної піпетки та промивають лунки шість разів розчином для промивання планшетів. В лунки планшета вносять по 100мкл розчину кон'югату-стренптавідин та рекомбінантні поліпептиди ВІЛ, мічені пероксидазою, та інкубують планшет у термостаті 30хв. при 37°С. Після закінчення інкубації промивають лунки шість разів і вносять по 100мкл розчину проявника (субстратний розчин з хромогеном) та інкубують при 18-22°С у темряві 30хв. Зупиняють кольорову реакцію, вносячи до всіх проб по 100мкл стоп-реагенту. Не більш як через 1хв. після зупинення кольорової реакції визначають оптичну густин у (ОГ) в лунках у двохвильовому режимі за допомогою спектрофотометра. При ОГ більше граничного значення досліджувана проба розцінюється як позитивна. Досліджений матеріал від хворої було ідентифіковано як позитивний на наявність ВІЛ-інфекції. Приклад 2. Визначення наявності антигена р24 ВІЛ та анти-ВІЛ антитіл в сироватці крові хворої С. 1990 року народження. Визначення проводили аналогічно прикладу 1, але замість біотинільованих моноклональних антитіл та стрептавідину, зв'язаного з пероксидазою використовували кон'югати моноклональних анти-р24 антитіл та рекомбінантні поліпептиди аналогі-антигенів ВІЛ, мічені ферментом Результати визначення антигену р24 ВІЛ та анти-ВІЛ антитіл в сироватці хворої, отримані при застосуванні нашої тест-системи, порівнювали з даними, одержаними при використанні тест-системи "Genscreen Plus HIV AgAb". Приклад 3. Визначення чутливості та специфічності пропонованої тест-системи. Використовуючи названі тест-системи, досліджували сироватки крові (по 20 достеменно позитивних та 100 достеменно негативних сироваток). Усі сироватки досліджували у дво х повторностях кожною тест-системою за описаною методикою. Обидві тест-системи показали однакові результати: з 20 позитивних сироваток всі зразки виявлено як позитивні, що складає 100% чутливості. З 100 негативних сироваток виявилися справді негативними 100 (специфічність - 100%). Таким чином, пропонована тест-система забезпечує виявлення ВІЛ-інфекції. Проста і надійна в роботі, проявляє високу чутливість та специфічність. Використана література 1. Инструкция по применению тест-системи "Genscreen Plus HIV Ag-Ab - kit for direction of HIV infection in human serum/plasma by enzyme immunoassay" виробництва "Bio-RacT (Франція) 2003, 20с. 2. А.Т.Ми хайлов, В.Н.Симирский "Методы иммунохимического анализа в биологии развития". М. "Наука", 1981.