Офтальмологічний пептидний препарат для місцевого застосування

Реферат: Винахід стосується застосування офтальмологічної композиції для місцевого застосування, що вибрана з групи, що охоплює очні краплі, мастила та мазі, що містить терапевтично ефективну кількість соматостатину або аналога соматостатину, який є вибраним з групи, що охоплює соматостатин-28, соматостатин-14, соматостатин-13, просоматостатин, октреотид, ланреотид, вапреотид, пасиреотид, сеглітид, кортистатин та їх фармацевтично прийнятні солі, для виготовлення лікарського засобу для лікування та/або профілактики захворювання заднього сегменту ока, яке вибране з групи, що охоплює непроліферативну та проліферативну діабетичну ретинопатію, нейродегенерацію сітківки, неоваскуляризацію сітківки, ішемічну ретинопатію, ретинопатію недоношених, серповидно-клітинну ретинопатію, оклюзію вен сітківки, пігментний ретиніт, увеїт, набряк макули, цістоідний набряк макули. UA 108484 C2 (12) UA 108484 C2 UA 108484 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Заявлений винахід має відношення до медицини, зокрема він стосується фармацевтичного препарату у вигляді офтальмологічної композиції соматостатину та аналогів соматостатину для місцевого застосування. Захворювання сітківки та склоподібного тіла, у тому числі важка діабетична ретинопатія та вікова макулярна дегенерація, є головними причинами сліпоти. Хоча у обмежувальній частині Формули Винаходу існують посилання на можливість застосування соматостатину та його аналогів у лікуванні захворювань заднього сегменту ока на основі наявності у цих розладах гіперекспресії рецепторів соматостатину, поки ще відсутні будьякі яскраві приклади подібної терапевтичної дії. Нещодавно було повідомлено про наявність ендогенного соматостатину та рецепторів соматостатину у різних частинах людського ока. Отже, наприклад, рецептори соматостатину sstr1, sstr2 та sstr5 були виявлені у слізній залозі, кон'юнктиві, рогівці та носослізних каналах [Minsel et al., Endocrinology, 2009, 150(5): 2254-22631 Було також повідомлено про наявність генів у задньому сегменті ока, відповідних рецепторам соматостатину sstr1, sstr2, sstr3, sstr4 та sstr5 у сітківці, циліарному тілі та судинній оболонці ока у здорових очах людини [Klisovic et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science, 2001, 42(10): 2193-2201], про наявність мРНК sstr2 та sstr3 у сітківці [van Hagen et al., European Journal of Endocrinology, 2000, 143: S43-S51; Cervia et al., Molecular та Cellular Endocrinology, 2008, 286: 112-122] та також про наявність ендогенного соматостатину у склоподібному тілі та у сітківці [Simo et al., Diabetes Care, 2002, 25(12): 22822286]. Також, з обмежувальної частини Формули Винаходу, відомо про існування пониженої експресії соматостатину в сітківці на перших стадіях розвитку діабетичної ретинопатії, можливо, пов'язаної з нейродегенерацією сітківки [Carrasco et al., Diabetes Care, 2007, 30(11): 1-7]. Існують різні шляхи введення ліків для лікування захворювання заднього сегмента ока, як то системне, місцеве, внутрішньоочне та навколоочне (періокулярне) введення. Документ WO 02/09739 А1 описує " застосування соматостатину або його аналога для лікування або запобігання очних розладів. Серед вказаних у цьому документі шляхів введення, кращим способом введення є системне парентеральне введення, підшкірно або внутрішньом'язово, однак у зазначеному документі немає ніяких вказівок на препарат у вигляді очних крапель для введення соматостатину або його аналога. Проте, у випадку системного введення дуже важко досягти терапевтичної концентрації у задньому сегменті ока через гематоретинальний бар'єр, що обмежує проникнення ліків у око. Іншим загальним недоліком системного введення є те, що його дія не є місцевою та вона не спрямована тільки до заднього сегмента ока. Більш того, у випадку зі соматостатином, у зв'язку з його нестабільністю в крові буде необхідним застосування великих доз. У разі застосування аналога окреотиду, наслідки його системного підшкірного введення оцінювали у різних клінічних дослідженнях, навіть якщо результати не дали помітної терапевтичної дії [Wegewitz et al., Current Pharmaceutical Design, 2005, 11: 2311-2330; Palii et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science, 2008,49(11): 50945102]. Альтернативою низької ефективності системного шляху введення до заднього сегменту ока є місцеве введення до заднього сегменту ока шляхом внутрішньоочних ін'єкцій та навколоочних (періокулярних) ін'єкцій, як то за допомогою субкон'юнктивальних, субтенонових та ретробульбарних ін'єкцій або з застосуванням субкон'юнктивальних імплантатів у цьому сегменті [Geroski et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science, 2000, 41(5): 961-964; Kiagiadaki et al. Investigative Ophthalmology & Visual Science, 2008, 49(7): 3080-3089]. Проте, ці форми введення є незручними для пацієнта та існують побічні дії, частота виникнення яких збільшується при неодноразовом введенні. Крім того, у випадку з імплантатами, вони тягнуть за собою хірургічне втручання. Хоча у доклінічних дослідженнях ці типи лікування були ефективними, вони потребують регулярного застосування ін'єкцій, що у деяких випадках мають побічні дії, як то відшарування сітківки, катаракту, почервоніння або ендофтальміт [Geroski et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science, 2000, 41(5): 961-964; Herrero-Vanrell et al, Journal of Drug Delivery Science and Technology, 2007, 17(1): 11-17; Robertson et al., Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics, 1997, 13(2): 171-177]. Іншою альтернативою попереднім шляхам введення ліків до ока є місцеве очне введення. Проте, місцевий очний канал введення ліків, мішень для яких знаходиться в задній частині ока досі вважався обмеженим через думку про те, що відсоток активної субстанції, здатної досягти заднього сегмента у більшості випадків є несуттєвим. [Andr s-Guerrero et al., Archivos de la Sociedad Espahola de Oftalmologia, 2008, 83: 683-686]. У попередніх дослідницьких роботах зазначено кілька варіантів місцевого очного введення соматостатину та аналогів. Наприклад, у документі US 2005/074497 А1 описано гідрогель, що містить анти-ангіогенні ліки, як то октреотид, для лікування захворювання заднього сегменту 1 UA 108484 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 очей. Октреотид наведено в цій патентній заявці всередині величезного списку ліків. Крім того, у цьому документі не описано жодних прикладів октреотиду або будь-яких ліків. Гідрогель розміщують у контакті з оком за допомогою контактних лінз або, альтернативно, його прикріпляють до ока за допомогою клеїв або хірургічним втручанням. Введення за допомогою очних крапель у цьому документі відсутнє. Проте, введення з застосуванням контактних лінз тягне за собою ризик інфікування очей патогенами, та, крім того, воно є неприйнятним для хворих з підвищеним внутрішньоочним тиском. Іншою можливістю є місцеве введення у вигляді мастила або мазі у внутрішню частину повіка. Проте, мастила, як правило, є незручними та знижують гостроту зору у зв'язку з їх надмірною в'язкістю та повільним поглинанням. У документі WO 99/24019 А1 також описано сухий та твердий препарат, отриманий з різних ліків, у тому числі зі соматостатину, що відтворюють у рідкому розчині та вводять у вигляді очних крапель. Проте, у цьому документі не надано ні жодного прикладу препарату соматостатину, ні жодного свідчення застосування цих або інших ліків, що здатні досягати заднього сегменту ока у вигляді очних крапель. З іншого боку, у документі US 5182258 А описано препарат у вигляді очних крапель, що застосовують для системного введення крізь носослізну систему, де активний компонент що вводять, серед багатьох інших, є соматостатином. Проте, у цьому документі нічого не говориться про введення цього або іншого активного компонента для лікування захворювання заднього сегменту очей. Те ж саме трапляється відносно інших препаратів обмежувальної частини Формули Винаходу при місцевому введенні октреотиду без можливого застосування для лікування та/або запобігання зазначених захворювань заднього сегмента ока [Danesi et al., Clinical Cancer Research, 1997, 3: 265-272; Demir et al. Documenta Ophthalmologica, 2003, 107: 87-92]. Отже, у попередніх дослідницьких роботах існує необхідність отримання препарату для місцевого очного введення соматостатину або його аналога для місцевого лікування та/або запобігання захворювання заднього сегмента ока, де у фармацевтично прийнятному препараті будуть вирішені обидві проблеми - комфортності для пацієнта та низької терапевтичної прийнятності. Об'єктом заявленого винаходу є офтальмологічна композиція для застосування введенням місцевим шляхом у око у вигляді рідкого фармацевтичного препарату соматостатину або його аналога, що досягає заднього сегменту ока та приєднується до розташованих там рецепторів соматостатину. Препарат вводять для лікування та/або запобігання захворювань заднього сегмента ока, де є корисним приєднання соматостатину або його аналогів до рецепторів соматостатину. Заявлений винахід надає безпрецедентний прорив у галузі місцевого офтальмологічного введення пептидів та особливо, соматостатину або його аналогів. Несподівано, заявлений винахід вирішує попередньо описані проблеми. У першому аспекті, заявлений винахід стосується місцевої офтальмологічної композиції, що містить пептид, що характеризується тим, що терапевтично ефективна кількість цього пептиду досягає заднього сегменту ока. У окремому втіленні, місцева офтальмологічна композиція вибрана від групи, що охоплює очні краплі, мастила та мазі. У ще одному аспекті, заявлений винахід стосується очних крапель, щомістять пептид, що характеризується тим, що терапевтично ефективна кількість цього пептиду досягає заднього сегменту ока. У контексті заявленого винаходу термін "очні краплі" стосується фармацевтичного рідкого препарату, що вводять у вигляді крапель на зовнішню поверхню ока та що має місцеву дію у задньому сегменті ока. У контексті заявленого винаходу термін "задній сегмент ока" охоплює судинну оболонку ока, пігментний епітелій сітківки, сітківку, жовту пляму, ямку, зоровий нерв та склоподібне тіло. У окремому втіленні, пептид вибраний з числа соматостатину або його аналога, де, бажано, соматостатин або аналог сомастатину є вибраним з групи, що охоплює соматостатин -28, соматостатин -14, соматостатин -13, про-соматостатин, октреотид, ланреотид, вапреотид, пасиреотид, сеглітид, користатин та іх фармацевтично прийнятні солі. У іншому окремому втіленні, соматостатин або аналог сомастатину заміщений з ацильною або поліетиленгліколевою групою. Переважно, ацильна група вибрана з групи, що охоплює ацетил, терт-бутанойл, гексанойл, 2-метилгексанойл, циклогексанкарбоксил, октанойл, деканойл, лауройл, міристойл, пальмітойл, стеаройл, олеойл та лінолеойл. Переважно, поліетиленгліколева група має молекулярну вагу 200-35,000 дальтон. У іншому окремому втіленні, концентрація пептиду, переважно соматостатину або аналога соматостатину, є у межах 0.1 мкг/мл -100 мг/мл, переважно, у межах 1 мкг/мл -10 мг/мл, більш переважно 10 мкг/мл -1 мг/мл. 2 UA 108484 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У іншому окремому втіленні, рН очних крапель дорівнює 3-8, переважно, 4-7. Для регулювання рН очних крапель для досягнення попередніх значень рН додають відомі досвідченим фахівцям кислоти та/або основи. У іншому окремому втіленні, засобом доставки очних крапель є ізотонічний водний розчин, як то ізотонічний розчин хлориду натрію або борної кислоти або водний розчин полівінілового спирту або їх суміші. У іншому окремому втіленні, пептид композиції винаходу також може бути інкорпорований у ліпосоми, змішані ліпосоми, ніосоми, етосоми, наночастинки, тверді ліпідні наночастинки, наноструктуровані ліпідні носії, міцели, змішані міцели поверхнево-активних речовин, змішані міцели поверхнево-активних речовин та фосфоліпідів, наносфери, ліпосфери та нанокапсули. У іншому окремому втіленні, очні краплі заявленого винаходу можуть вибірково містити консервант. Досвідченому фахівцю відомі існуючі консерванти, як то бензалконію хлорид, бензойна кислота, алкіл-парабени, алкіл-бензоати, хлорбутанол, хлорокрезол цетилові спирти, жирні спирти, як то гексадециловий спирт, металоорганічні сполуки ртуті, як то ацетат, нітрат фенілртуті або борат, діазолідинілсечовіна, диізопропіл- адипат, диметілполісилоксан, солі EDTA, вітамін Е та їх суміші. У іншому окремому втіленні, очні краплі заявленого винаходу можуть вибірково містити агент, що підвищує проникність пептиду, переважно пептиду соматостатину або аналога соматостатину, до заднього сегмента ока. Переважно, агент, що підвищує проникність вибраний з групи, що охоплює бензалконію хлорид, сапоніни, жирні кислоти, жирні ефіри поліоксиетилену, алкільні ефіри жирних кислот, піролідони, полівінілпіролідон, піровиноградну кислоту, піроглютамінову кислоту та, серед іншого, їх суміші. У другому аспекті, заявлений винахід стосується очних крапель для лікування та/або запобігання захворювання заднього сегменту ока. Переважно, лікування та/або запобігання захворювання заднього сегменту ока має перевагу завдяки приєднанню соматостатину або його аналогів до рецепторів соматостатину. Більш переважно, захворювання заднього сегменту ока вибране з групи, що охоплює непроліферативну діабетичну ретинопатію, проліферативну діабетичну ретинопатію, вікову макулярну дегенерацію сітківки, неоваскулярну хворобу, ішемічну ретинопатію, ретинопатію недоношених, серповидно - клітинну ретинопатію, оклюзію вен сітківки, пігментний ретиніт, хороідальну неоваскуляризацію, увеїт, макулярний набряк, цістоідний макулярний набряк. У випадку соматостатину, його висока стабільність у склоподібному тілі заднього сегменту ока по відношенню до його періоду напівжиття у сироватці є корисним для його дії на місцевому рівні для лікування та/або запобігання попередньо згаданих захворювань заднього сегменту ока. У третьому аспекті, заявлений винахід стосується способу лікування та/або запобігання захворювання заднього сегмента ока, що полягає у місцевому введенні терапевтично ефективної кількості пептиду за допомогою офтальмологічної композиції для місцевого застосування, вибраної з групи, що охоплює очні краплі, мастила та мазі. У окремому втіленні, пептид вибраний з числа соматостатину або його аналога, де, бажано, соматостатин або аналог сомастатину вибраний з групи, що охоплює соматостатин -28, соматостатин -14, соматостатин -13, про-соматостатин, октреотид, ланреотид, вапреотид, пасиреотид, сеглітид, користатин та іх фармацевтично прийнятні солі. У іншому окремому втіленні, частота введення може сильно змінюватися, у залежності від потреб кожного суб'єкта та від тяжкості хвороби, що лікують або запобігають, з рекомендуванням відносно курсу введення від одного разу на тиждень до десяти разів на день, переважно від трьох разів на тиждень до трьох разів на день, більш переважно один раз або двічі на день. У іншому окремому втіленні, спосіб лікування та/або запобігання також полягає у введенні іншого терапевтичного агента для лікування та/або запобігання захворювання заднього сегменту ока. Терапевтичні агенти для лікування та/або запобігання захворювання заднього сегменту ока являють собою, наприклад та без обмежень, агенти, вибрані з групи, що охоплює анти - судинні ендотеліальні фактори зростання (VEGF), простагландинові аналоги, бета адренергічні рецептори, альфа -2- агоністи, інгібітори карбоангідрази, агенти мейозу, моноклональні антитіла, кортикостероїди, глюкокортикоїди, інгібітори кінази, циклоплегічні агенти або антиметаболіти. Введення цих терапевтичних агентів для лікування та/або запобігання захворювання заднього сегмента ока може здійснюватися місцевим, пероральним або парентеральним шляхом. У контексті цього винаходу, термін "парентеральне " охоплює внутрішньовенні, внутрішньоочні, підшкірні, внутрішньошкірні, внутрішньосудиннії ін'єкції та ін'єкції у рогівку, як то внутрішньовенно, внутрішньом'язово та будь-яким подібним способом ін'єкції або вливання. 3 UA 108484 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Наступні приклади, наведені тут, служать для ілюстрації природи цього винаходу. Ці приклади наведені виключно для ілюстрації та не повинні тлумачитися як обмеження заявленого тут винаходу. Опис Фігур. Фіг. 1: Фіг. 1 показує сітківки двох мишей (1 та 2), що отримали соматостатин у праве око (+) та плацебо у ліве око (-) Фіг. 2: Фіг. 2 показує різницю між амплітудою другого ОР (коливального потенціалу) у контрольних щурів (група 1); діабетичних щурів (група 2); діабетичних щурів, оброблених соматостатином (група 3) та діабетичних щурів, оброблених октреотидом (група 4). Фіг. 3: Фіг. 3 показує зображення, отримані за допомогою конфокальної мікроскопії (конфокальна 40Х імуногістохімія GFAP (гліального фібрілярного кислого білку). Значно сильнішу експресію GFAP (більш світле маркування) спостерігали у шарі гангліозних клітин індукованих STZ діабетичних щурів (група 2). Обробка соматостатином (група 3) або октреотидом (група 4) запобігла активації гліальних клітин, що корелювалася з подібними до контролю (група І) рівнями GFAP. Фіг. 4: Фіг. 4 показує зображення, отримані за допомогою конфокальної мікроскопії (TUNEL 40X). Дегенерація сітківки корелювалося з підвищеною кількістю апоптотичних клітин (більш світле маркування означає TUNEL - позитивні), особливо у зовнішньому ядерному шарі (ONL), що спостерігали у індукованих STZ діабетичних щурів (група 2). Обробка соматостатином (група 3) та октреотидом (група 4) запобігла дегенерації сітківки та показала подібну до знайдених у здорових контрольних щурах кількість клітин (група 1). Приклади Приклад 1: Очні краплі, що містять соматостатин -14. Фармацевтичну композицію соматостатину отримали у вигляді очних крапель шляхом додавання 125 мкл 0.9 % хлориду натрію до 5 мг соматостатину -14. Приклад 2: Обчислення концентрації місцево застосованого офтальмологічного соматостатину у сітківці. У дослідженнях застосували восьмитижневих мишей C57BU6. Догляд за тваринами проводили відповідно з міжнародними керівними принципами протоколу інституту Institut de Recerca del Hospital Universitari Vail d'Hebron, Європейського Економічного Співтовариства та A.R.V.O. (Association for Research in Vision and Opthalmology) (наказ 86/609/CEE). Тварин тримали у окремих клітинах у поміщеннях для тварин в умовах з контрольованою температурою (20°) та вологістю (60 %), з постійним циклом "світло-темрява " протягом останніх 12 годин та вільним доступом до їжі та води. Очні краплі соматостатину -14 з Прикладу 1 (1 крапля у 5 мкл) вводили у праве око та плацебо (сольовий розчин) у ліве око. Дві краплі вводили протягом доби, одну вранці та одну ввечері, протягом 5 днів. Тварин піддали евтаназії шийною дислокацією під наркозом через 2 години після останньої дози. Очі піддослідних тварин негайно видалили та заморозили при -80° до початку маніпуляцій. Задній сегмент (сітківку та склоподібне тіло) відокремили від іншого вмісту ока шляхом його розсічення під збільшувальним склом. Кількість соматостатину -14 в сітківці визначали Вестерн-блотингом. Білки екстрагували з розчину 50 мМ Tris-HCI, рН 7.9, 300 мМ КСІ, 1.5 мМ МдСІ2, 0.1 % Nonidet Р-40 та 20 % гліцерину, що містив коктейль протеазного інгібітора Complete™ при 4° С протягом 12 год. Потім зразки центрифугували (12,000 об/хв. при 4° С) протягом 10 хв. Вестерн-блотинг проводили на білках з антитілами кролів проти соматостатин у-14 (ab53165, Abeam). Для стандартизації концентрації соматостатину -14 в якості контролю застосували отриманий Dактин. Специфічні комплекси антиген-антитіло визначили з застосуванням антитіл кози проти IgG кролів, помічених wit HRP або антитіл кролів проти IgG кози разом з хемілюмісцентними субстратами (Pierce Biotechnology Inc., Rockfort, Illinois, USA) з застосуванням радіографічних плівок. Був проведений денситометричний аналіз (Densitometer GS-800. Bio-Rad Laboratories, Hercules, California, USA) та результати виражені в умовних одиницях. У Фіг. 1 показано сітківки двох мишей (1 та 2), що отримали соматостатин у праве око (+) та плацебо у ліве око (-). Як можна побачити, кількість соматостатину у обробленому оці обох тварин була вищою. У контрольних мишах, що отримували плацебо у обидва ока, жодних різниць у концентрації соматостатину між цими двома очима виявлено не було. Приклад 3: Стабільність соматостатину у склоподібному тілі та сироватці людини. Соматостатин інкубували з рідиною склоподібного тіла або сироваткою людини з 90 % при 37 °C. Аліквоти екстрагували у різні проміжки часу інкубування. До преципітату сивороткових білків додали ацетонітрил, суміш центрифугували та супернатант відфільтрували та піддали ВЕРХ зі зворотною фазою (RP-HPLC) (градієнт: 20-80 % В у 30 хв., B=0.07 %TFA у ацетонітрилі). Був обчислений час напіввиведення та зникнення вихідного продукту аналізували 4 UA 108484 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 з застосуванням площини, що відповідала початковому продукту. Час напіввиведення соматостатину дорівнював 2.7 годин у сироватці та 64 годин у склоподібному тілі. Приклад 4: Очні краплі, що містять соматостатин -14. Фармацевтичну композицію соматостатину отримали у вигляді очних крапель додаванням 1 мл 0.9 % водного розчину хлориду натрію до 10 мг соматостатину -14. Зрештою, розчин відфільтрували крізь 0,22 мкм стерілізуючий фільтр. Приклад 5: Очні краплі, що містять октреотид. Фармацевтичну композицію октреотиду отримали у вигляді очних крапель шляхом додавання 1 мл 0.9 % водного розчину хлориду натрію до 10 мг октреотиду. Зрештою, розчин відфільтрували крізь 0,22 мкм стерілізуючий фільтр. Приклад 6: Очні краплі, що містять вапреотид. Фармацевтичну композицію вапреотиду отримали у вигляді очних крапель шляхом додавання 1 мл 0.9 % водного розчину хлориду натрію до 10 мг вапреотиду. Зрештою, розчин відфільтрували крізь 0,22 мкм стерілізуючий фільтр. Приклад 7: Очні краплі, що містять кортистатин. Фармацевтичну композицію кортистатину отримали у вигляді очних крапель шляхом додавання 1 мл 0.9 % водного розчину хлориду натрію до 10 мг кортистатину. Зрештою, розчин відфільтрували крізь 0,22 мкм стерілізуючий фільтр. Приклад 8: Очні краплі, що містять соматостатин -14. Фармацевтичну композицію соматостатину отримали у вигляді очних крапель шляхом додавання 1 мл водного розчину (0.9 % хлориду натрію та 1.4 % полівінілового спирту) до 0.27 мг соматостатину-14. Зрештою, розчин відфільтрували крізь 0,22 мкм стерілізуючий фільтр. Приклад 9: Очні краплі, що містять соматостатин -28. Фармацевтичну композицію соматостатину отримали у вигляді очних крапель шляхом додавання 1 мл 0.9 % водного розчину хлориду натрію до 0.05 мг соматостатину -28. Зрештою, розчин відфільтрували крізь 0,22 мкм стерілізуючий фільтр. Приклад 10: Очні краплі, що містять соматостатин-14, гідроксибензоати та жирні ефіри поліоксиетилену. Фармацевтичну композицію соматостатину отримали у вигляді очних крапель шляхом додавання 1 мл 0.9 % водного розчину хлориду натрію до 50 мкг метил 4-гідроксибензоату, 100 мкг пропіл 4-гідроксибензоату, 50 мкг поліоксіетилен-20-стеарил ефір (Brij-78) та 1 мг соматостатину -14. Зрештою, розчин відфільтрували крізь 0.22 мкл стерілізуючий фільтр. Приклад 11: Очні краплі, що містять ліпосоми соматостатину -14. Фармацевтичну композицію соматостатину отримали у 0.9 % хлориді натрію, що містив 20 мг фосфатидилхоліну та 2.7 мг соматостатину -14 на 1 мл. Якщо стисло, то фосфатидилхолін повільно додали з перемішуванням до 0.9 % водного розчину хлориду натрію, що містив соматостатин -14. Композицію подовжували перемішувати протягом 15 хвилин, доки не отримали ліпосомну суспензію. Потім ліпосоми поетапно екструдували через полікарбонатний фільтр з розміром пор у 400 нм, далі через фільтр з розміром пор у 200 нм та під кінець десять разів через фільтр з розміром пор у 100 нм. Зрештою, ліпосомальний розчин відфільтрували через 0.22 мкм стерілізуючий фільтр. Приклад 12: Очні краплі, що містять наночастинки соматостатину -14. Був отриманий 10 % розчин кополімеру полімолочної-ко-гліколевої кисоти (50:50) з молекулярною вагою 5000, 1 г, у дихлорометані. Соматостатин-14 (100 мг) розчинили у 1 мл води. Розчин соматостатину додали до розчину полімеру та суміш емульгували за допомогою одного ультразвукового зонду. Потім наноемульсію відфільтрували через 0.22 мкм стерілізуючий фільтр. Отриману наноемульсію далі диспергували у 1 % водному розчині полі (вінілового спирту) з застосуванням ультразвукового зонду для зменшення розміру частинок до отримання наноемульсії. Нанокапсули екстрагували у 40 % водному розчині етанолу та очистили тангенціальною потоковою ультрафільтрацією. Зрештою, 70 мг наночастинок, що містили соматостатин (16 мг) диспергували у 100 мл 1.4 % водного розчину полі (вінілового спирту). Приклад 13: Офтальмологічна мазь, що містить соматостатин -14. Фармацевтичну композицію соматостатину отримали у вигляді офтальмологічної мазі шляхом додавання 50 мл білого вазеліну USP до 200 мг соматостатину -14. Приклад 14: Вплив місцевого лікування очей соматостатином та октреотидом у запобіганні нейродегенерації сітківки у діабетичних щурів. Щурам Sprague Dawley ввели стрептозотоцин (STZ), 60 мг/кг. Тварин розділили на чотири групи, як зазначено у Таблиці 1: 60 5 UA 108484 C2 Таблиця 1 План досліджень (носій = водний розчин 0.9 % NaCI) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Через дві доби після введення STZ тваринам щоденно вводили одну або дві краплі носія (група 2), очні краплі прикладу 4 (група 3) або очні краплі прикладу 5 (група 4) протягом додаткових 14 днів. Здорові контрольні тварини отримали щоденно тільки одну або дві краплі носія (група І). Електроретинографія - це процедура, яку застосовують у клінічних умовах для оцінки функції сітківки у діабетичній ретинопатії. На ранніх стадіях захворювання можуть бути порушені декілька параметрів: латентність, амплітуда та коливальні потенціали [Tzekov et al., Survey of Ophthalmology, 1999, 44(1): 53-60]. Збільшення латентності та зменшення амплітуди коливальних потенціалів (ОР) також спостерігали у індукованих стрептозотоцином діабетичних щурів [Hancok et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science, 2004, 45(3): 1002-1008]. Результати електроретинографії показали, що після 14 діб лікування, латентність b-хвилі при 0 дБ значн о зростає у порівнянні з діабетичною групою перед початком лікування (група 2) (15,5 праве око; 15,2 ліве око) та не зазнає суттєвого збільшення у контрольній групі (група 1) (2,3 праве око; -7,5 ліве око) та у групах, оброблених соматостатиновою композицією прикладу 4 (група 3) (9,0 праве око; 4,9 ліве око) або октреотидною композицією прикладу 5 (група 4) (8,8 праве око; 1, 1 ліве око). По відношенню до амплітуди, соматостатин запобігає зменшенню амплітуди b-хвилі при -30 дБ, -10 дБ та 0 дБ у порівнянні з діабетичною групою та октреотид також запобігає зменшенню амплітуди b- хвилі при -30 дБ, але він був ефективним тільки при найвищій дозі у -10 дБ та 0 дБ. Аналіз коливальних потенціалів (ОР) b-хвилі при 0 дБ свідчить про те, що соматостатин та октреотид дають позитивну дію у попередженні зменшення амплітуди другого OP (OP2). Цю дію вже спостерігають на восьмий день та вона зберігається до чотирнадцятого дня. Фіг. 2 показує різницю між амплітудою другого ОР у контрольних щурів (група 1: 17,0 праве око; 15,9 ліве око); діабетичних щурів (група 2: -2,5 праве око; -1, 2 ліве око); діабетичних щурів, оброблених соматостатином (група 3: 44,8 праве око; 68,7 ліве око) та діабетичних щурів, оброблених октреотидом (група 4: 45,5 праве око; 55,1 ліве око). На чотирнадцятий день, тварин піддали евтаназії та парафінували тканини очей. В якості маркерів першого етапу розвитку діабетичної ретинопатії - нейродегенерації сітківки [Carrasco et al., Diabetes Care, 2007, 30(11): 1-7] обчислили гліальну активацію та кількість апоптотичних клітин. Гліальну активацію визначили за допомогою імунофлуоресцентного аналізу гліального фібрилярного білка (GFAP) з застосуванням конфокальної мікроскопії. Зрізи тканини очей з товщиною у 7 мкм зафіксували на предметному склі з адгезивним покриттям (Visionbiosystems, Newcastle Upon Туnе, UK). Потім їх депарафінували, регідратували та промили у фосфатному сольовому буфері (PBS). Неспецифічні з'єднання блокували інкубуванням зразків протягом години у PBS 1 % BSA (бичачий сироватковий альбумін) 0.5 % Triton X-100. Після цього, первинні анти-людинні антитіла GFAP кролів (Sigma, Madrid, Spain), розведені у блокуючому буфері (1:100) інкубували протягом 36 год. при 4 °C. Після трьох промивань по 5 хвилин з PBS, зрізи інкубували з вторинними анти-людинними IgG антитілами, міченими з Alexa Fluor® 488 (Invitrogen, Eugene, OR) протягом 1 год. при кімнатній температурі. Мічені зрізи промили та розмістили у флуоресцентне середовище, що містило 4,6-діамідино-2-феніліндол (DAPI) для забарвлення клітинного ядра (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Позитивні на GFAP зрізи 6 UA 108484 C2 5 10 15 20 25 30 захоплювали конфокальним мікроскопом (FV1000, Olympus. Hamburg, Germany), з отриманням оптичних секцій з 488 нм лазером для АІеха 488 та 405 нм лазером для DAPI. Флуоресценцію GFAP для кожного зображення обчислили з застосуванням програмного забезпечення Fluoview ASW 1.4 software (Olympus, Hamburg, Germany). Результати нормалізували до площини, що 2 аналізували (21705.33 мкм ). У Фіг. 3 наведені зображення, отримані за допомогою конфокального мікроскопа. Підвищену експресію GFAP (помічено світлішим) спостерігали в шарі гангліозних клітин STZ-індукованих діабетичних щурів (група 2). Лікування з соматостатином (група 3) або октреотидом (група 4) запобігає активації гліальних клітин, що корелює з подібними до контролю рівнями GFAP (група І). Ефективність місцевого лікування очей зі соматостатином (група 3) та октреотидом (група 4) у запобіганні спровокованої діабетом гліальної активації, визначали за допомогою значень GFAP флуоресценції, як індикаторів гліальної активації. Значення GFAP флуоресценції для здорової контрольної групи 1 дорівнювало 2095±26; для групи 2 дорівнювало 26871±159; для групи 3 дорівнювало 2514±90 та для групи 4 дорівнювало 1696±48. Обчислення ступеню апоптозу сітківки після 14 днів лікування отримали з застосуванням технології TUNEL ("мічення Nick-End кінців термінальної трансферази dUTP"). Було застосовано набор для визначення клітинної смерті in situ (In Situ Cell Death Detection Kit, Roche Diagnostics, Mannheim, Germany). Зрізи тканини очей депарафінували, регідратували та промили у фосфатному сольовому буфері (PBS). Для кожного зрізу за допомогою конфокального мікроскопу (40Х) отримали три зображення, що відповідають поверхні у 317,13 мкм X 317,13 мкм. Загальна кількість ядер та кількість позитивних для TUNEL ядер обчислили за допомогою програмного забезпечення Image J software (http://rsbweb.nih.gov/ij). Для вивчення морфології ядра та відхилення помилкових спрацьовувань застосували забарвлення йодистим пропідієм (РІ). Фіг. 4 показує зображення, отримані за допомогою конфокального мікроскопу. Дегенерацію сітківки, що корелюється з підвищеною кількістю апоптотичних клітин (більш світлі відмітки означають TUNEL - позитивні) спостерігали у стрептозотоцин -індукованих діабетичних щурів (група 2). Лікування соматостатином (група 3) та октреотидом (група 4) запобігає дегенерації сітківки та показує кількість клітин, подібну до знайденій у здорових контрольних щурів (група 1). У Таблиці 2 наведено відсоток апоптотичних клітин по відношенню до загальної кількості клітин у різних шарах сітківки, як то у пігментному епітелії сітківки (RPE), у зовнішньому ядерному шарі (ONL), внутрішньому ядерному шарі (INL) та у шарі гангліозних клітин (GCL). Приріст у відсотках апоптотичних клітин є суттєвим у діабетичних щурів (група.2). Місцеве лікування очей соматостатином (група 3) або октреотидом (група 4) знижує кількість апоптотичних клітин до контрольних рівнів (група 1). 35 Таблиця 2 Відсоток апоптотичних клітин 40 Нейродегенерація клітин сітківки є одним з перших етапів у розвитку діабетичної ретинопатії. Результати електроретинографії, гліальної активації та апоптозу свідчать про те, що місцеве очне введення соматостатину або октреотиду протягом 14 днів запобігають дегенерації сітківки у індукованих стрептозотоцином діабетичних щурів. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 45 1. Застосування офтальмологічної композиції для місцевого застосування, що вибрана з групи, що охоплює очні краплі, мастила та мазі, що містить терапевтично ефективну кількість соматостатину або аналога соматостатину, який є вибраним з групи, що охоплює соматостатин28, соматостатин-14, соматостатин-13, просоматостатин, октреотид, ланреотид, вапреотид, 7 UA 108484 C2 5 10 15 20 пасиреотид, сеглітид, кортистатин та їх фармацевтично прийнятні солі, для виготовлення лікарського засобу для лікування та/або профілактики захворювання заднього сегмента ока, яке вибране з групи, що охоплює непроліферативну та проліферативну діабетичну ретинопатію, нейродегенерацію сітківки, неоваскуляризацію сітківки, ішемічну ретинопатію, ретинопатію недоношених, серповидно-клітинну ретинопатію, оклюзію вен сітківки, пігментний ретиніт, увеїт, набряк макули, цистоїдний набряк макули. 2. Застосування за п. 1, де вказана офтальмологічна композиція є складом очних крапель. 3. Застосування за п. 1, де вказаний соматостатин або аналог соматостатину є заміщеним з ацильною або поліетиленгліколевою групою. 4. Застосування за будь-яким з пп. 1, 2, де концентрація вказаного пептиду є у діапазоні 0,1 мкг/мл -100 мг/мл. 5. Застосування за п. 4, де вказана концентрація є у діапазоні 1 мкг/мл - 10 мг/мл. 6. Застосування за п. 2, де рН очних крапель дорівнює 3-8. 7. Застосування за п. 2, де носій очних крапель є ізотонічним водним розчином, водним розчином полівінілового спирту або їх сумішами. 8. Застосування за будь-яким з пп. 1, 2, де вказана офтальмологічна композиція містить консервант. 9. Застосування за будь-яким з пп. 1, 2, де вказана офтальмологічна композиція містить агент, що підвищує проникність цього білка. 10. Застосування за п. 1, де вказане лікування та/або профілактика має перевагу завдяки приєднанню соматостатину або аналога соматостатину до рецепторів соматостатину. 8 UA 108484 C2 Комп’ютерна верстка В. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 9