Спосіб стимуляції росту та розвитку рослин зернових культур під впливом bacillus subtilis та її метаболітів

Реферат: Спосіб стимуляції росту та розвитку зернових культур включає предпосівну обробку насіння зернових ліофілізованними препаратами на основі біомаси Bacillus subtilis IMB В-7392 та метаболітів культури, які за умов обробки насіння зернових, у розведеннях 0,5 гр на 5 літрів води (1:500), витрата - 1 л на тонну насіння, забезпечують зниження зрідженості посівів, стимуляцію росту і розвитку рослин, збільшення ефективності фотохімії ФС II та ефективності темнових процесів асиміляції вуглецю. UA 123162 U (12) UA 123162 U UA 123162 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до біотехнології і сільського господарства, а саме до стимулювання росту рослин під впливом перспективного штаму Bacillus subtilis IMB В-7392 для зниження зрідженості посівів, підвищення продуктивності різних видів зернових сільськогосподарських культур. Використання метаболічного потенціалу бактерій роду Bacillus, що мають виражену антибактеріальну, антифунгальну і антинематодну активності, має значні перспективи у біотехнології і сільському господарстві [1]. Окремі роботи висвітлюють ряд факторів, що стимулюють ріст рослин, антагоністичну активність Bacillus subtilis щодо фітопатогенних бактерій і міксоміцетів за рахунок синтезу останніми біологічно активних речовин: вуглеводів, органічних кислот, амінокислот, фітогормонів, пептидних антибіотиків, включаючи бактеріоцини та нерибосомальні пептиди, у тому числі мікобацилін [2, 3]. До важливих факторів, що стимулюють ріст рослин при інокуляції бактеріями виду Bacillus subtilis в агроекосистемах, відносять їх здатність до конкурентної колонізації коріння та продукції біологічно активних речовин - вуглеводів, органічних кислот, амінокислот, а також гормонів росту [4; 5]. Крім цього показано, що бактерії виду Bacillus subtilis, мають потенціал для мобілізації фосфатів, підвищення вмісту амоніфікуючих мікроорганізмів, продукції індоліл оцтової кислоти (IOК), яка здатна до стимуляції схожості насіння, прискорення росту коренів та впливає на збільшення кореневої біомаси [6; 7]. Саме продукція фітогормонів різобактеріями вважається одним з найбільш важливих механізмів, за допомогою яких бактерії виду Bacillus subtilis стимулюють проростання насіння, сприяють росту рослин, прискорюють ріст коренів, збільшують приріст кореневої біомаси. [8; 9; 10]. Тому перспектива у розробці засобів захисту рослин належить культурам Bacillus subtilis, що здатні виявляти ріст стмулювальну дію за рахунок продукції ауксинів, гіберелінів, цитокінінів [11; 12], органічних кислот [13], амінокислот [14]. Одним з перспективних штамів, для створення біопрепаратів, виступає штам Bacillus subtilis IMB В-7243, як агент для захисту зернобобових культур від хвороб, збудниками яких є фітопатогенні бактерії та гриби [15]. Показано антагоністичну дію, Bacillus subtilis IMB В-7243 на бактерії родів Xantomonas, Clavibacter, Pseudomonas та Erwinia та ряду фітопатогенних грибів. Біопрепарат на його основі, відрізняється тим, що як активний агент містить біомасу штаму Bacillus subtilis IMB В-7243 та прийнятний наповнювач. Недоліком препарату є його рідка форма у водному розчині лактози та не висвітлена здатність препарату до підсилення росту рослин. Відома композиція для захисту рослин від патогенної мікрофлори на основі біомаси бактерій-антагоністів роду Bacillus. Композиція містить бактерії-антагоністи: Bacillus 9 10 amyloliguefaciens IMB В-7099 та Bacillus subtilis IMB В-7243 із титром 1×10 -1×10 КУО/мл, узятих у співвідношенні 1:1, а також наповнювач (1 % желатину та 4 % лактозу) у перерахунку на загальний об'єм наповнювача. Композиція забезпечувала захист суниці від ураження хворобами, такими, як кореневі гнилі, сіра гниль, вертицильозне в'янення суниці та ураження рослин картоплі мокрою бактеріальною гниллю. [16]. Недоліком препарату є його рідка форма у водному розчині лактози, відсутність рістстимулюючих і адаптогенних властивостей препарату та вузька сфера використання для видової різноманітності рослин. Показано захист рослин від фітопатогенних грибів та бактерій під впливом Bacillus subtilis НИИ ККМ ГНЦ ВБ "ВЕКТОР", В-1149 [17]. Дія препарату направлена на пригнічення кореневих гнилей та бактеріозів капусти. Недоліком препарату є відсутність стимуляції росту рослин та ряд складнощів, пов'язаних з органічною сферою використання препарату на видову різноманітність рослин. Перспективним штамом для підсилення росту рослин є Bacillus subtilis IMB В-7023. Відомо, що при вирощуванні Bacillus subtilis IMB В-7023 у живильному середовищі з гліцерофосфатом у культуральному середовищі накопичуються біологічно активні речовини, які позитивно впливають на схожість насіння та формування проростків рослин. Так, штам Bacillus subtilis IMB В-7023 здатний до синтезу у культуральному середовищі амінокислот, кількісний склад яких відрізняється, у залежності від типу вуглецевого харчування і часу культивування бактерій [18]. Штам Bacillus subtilis IMB В-7023 входить до складу комплексного бактеріального препарату для рослинництва. Даний препарат суттєво підвищує врожайність рослин і захищає їх від широкого спектру фітопатогенних бактерій і грибів. Проте препарат відрізняється складною технологією отримання - як носій для виготовлення комплексного бактеріального препарату використовують вермикуліт. Цей носій інокулюють композицією азотфіксувальних бактерій Azotobacter vinelandii IMB В-7076 і фосфатмобілізувальних бактерій Bacillus subtilis IMB В-7023, які попередньо вирощують окремо у оптимізованому для кожного штаму рідкому середовищі. Відомо, штам В. subtilis IMB В-7514 із меланінсинтезувальною та фітостимулювальною активністю [19]. Штам В. subtilis IMB В-7514 є продуцентом меланінових пігментів (до 1,72 г/л), 1 UA 123162 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 що проявляють рістстимулювальну активність щодо рослин. Обробка насіння препаратом культуральної рідини у розведенні 1:200 підвищувала схожість пшениці до 75 %. Саме, культуральна рідина штаму В. subtilis IMB В-7514 у розведенні 1:200 виявляла ауксиноподібну активність, за рахунок можливої присутності гормонів росту, які можуть синтезуватися одночасно з меланіновими пігментами. Проте можливий синтез гормонів росту відбувається у невеличких концентраціях (робоче розведення культуральної рідини 1:200). Автори використовували для дослідження лише культуральну рідину та залишали осад культури В. subtilis IMB В-7514 не використовуючи його для стимуляції росту рослин. Крім цього недоліком зазначеного штаму є не визначена ефективність проти фітопатогенних бактерій та грибів, виникає ряд складнощів, пов'язаних із рістстимулювальним впливом препарату на видову різноманітність рослин та особливостями зберіганням біопрепарату. Відомий препарат "Фітоспорин", основою якого є бактерії В. subtilis 26Д, який використовується для передпосівної обробки насіння сільськогосподарських культур. Препарат виявляє високу антагоністичну активність щодо фітопатогенних мікроміцетів. Фітоспорин містить спори ендофітних та ризосферних бактерій, здатних захищають рослини від патогенів [20; 21, 22]. Препарат виявляє рістстимулювальні властивості. Недоліками препарату виступають тривалий термін культивування культури протягом 336 годин та необхідність дотримання значної концентрації спор та клітин В. subtilis 26Д (порошок - не менше ніж 2 млрд. спор і живих клітин) та значна витрата препарату. Найбільш близьким штамом та прототипом виступає відомий регулятор росту рослин препарат Біокомплекс AT (Виробник: НВП "Агротехнічні технології", ПП), препарат містить 7 10 7 бактеріальні культури Azotobacter crococcum титр 1×10 -1×10 ; Bacillus mesaterium титр 5×10 10 7 10 1×10 та Bacillus subtilis - титр 1×10 -1×10 . Біокомплекс AT використовують у дозі 1 л/т, що дозволяє підвищити схожість і енергію проростання, силу початкового росту і життєздатність насіння. Біокомплекс AT використовують для захисту озимої пшениці, ярого ячменю, соняшнику, кукурудзи від фітопатогенної мікрофлори, завдяки потенціалу антагоністичних бактерій, що входять до складу біокомплексу AT. До недоліків препарату слід віднести складнощі його отримання, за рахунок багатокомпонентного складу, маловідомий спектр фіто захисної дії препарату та особливості його зберігання (при температурі від + 3 °C до+15 °C). Гарантійний термін зберігання: 6 місяців від дати виготовлення. Підвищення температури при зберіганні призводить до зменшення терміну придатності препарату. Задача, поставлена в основу даної корисної моделі, включає розробку способу оцінки рістстимулювальної та адаптаційної дії Bacillus subtilis на процеси метаболізму зернових, що дозволяє обґрунтувати їх використання, для інтенсифікації метаболічних процесів при проростанні насіння Fagopyrum tataricum (L) Caertn та Triticum aestivum. L. Заявлений штам Bacillus subtilis IMB B-7392 знаходиться у депозитарії Інституту мікробіології та вірусології ім. Д.К. Заболотного НАНУ та характеризується наступними культурально-морфологічними ознаками: Штам нетоксичний, авірулентний, облігатний аероб. Грампозитивні, спороутворючі аеробні палички, із закругленими кінцями розміром 0,8×2,7 мкм. Росте при 38±1 °C протягом 24-48 год. на поживному середовищі Гаузе, МПА, сусло агарі. Клітини рухливі, утворюють спори овальної форми, при спороутворенні не роздуваються. На середовище Гаузе на 24-48 годину культивування утворюють складчасті, матові колонії рожевувато - білуватого кольору. Штам не росте в анаеробних умовах і при 10 % NaCl, не гідролізує сечовину, не продукує аргінінгідролазу, росте у присутності 7 % NaCl, гідролізує крохмаль на казеїн, розріджує желатину. Ферментує глюкозу, арабінозу ксилозу, маніт з утворенням кислоти без газу. Редукує нітрати, не має коагулазної та лецитиназної активностей. Культура добре засвоює широко коло вуглеводних субстратів: маніт, глюкоза, сахароза, фукоза, маноза, рафіноза, арабіноза, ксилоза картопляний крохмаль, соєве борошно, розчинний крохмаль, лактоза. Спосіб, умови та склад середовища для культивування штаму. Культивування можна проводити на середовищах - МПА, МПБ, агаризованому середовищі Гаузе № 2, сусло агарі при 38±1 °C протягом 24-48 год. У мазках із колоній, що виросли на МПА через 18 год. можна побачити прямі палочковидні клітини розміром 0,8 × 2,7 мкм, які розташовані поодиноко, зрідка ланцюгом. Клітини рухливі, утворюють спори овальної форми, при спороутворенні не роздуваються. На середовище Гаузе при температурі 37 °C на 24-48 годину культивування утворюють складчасті, матові колонії рожево - білуватого кольору. До унікальних особливостей Bacillus subtilis IMB В-7392 слід віднести підвищення енергії проростання насіння, прискорення появи посіву, ріст стимулюючу здатність, що зберігається при отриманні біопрепаратів на основі біомаси та супернатанту культуральної рідини (СКР) та їх 2 UA 123162 U 5 10 15 20 25 30 35 40 властивість підсилювати інтенсивність метаболічних процесів при проростанні насіння рослин гречки Fagopyrum tataricum (L) Caertn та озимої пшениці Triticum aestivum L та впливати на адаптаційні процеси метаболізму рослин, які підтримуються станом фотосинтетичного апарату. Приклад 1. Отримання біологічно активних сухих препаратів біомаси та культуральної рідини штаму Bacillus subtilis IMB В-7392. Перед початком роботи клітини штаму Bacillus subtilis IMB В-7392 пересівають на щільних середовищах, після 24-30 годинної інкубації клітини змивають фосфатним буфером (рН 7,2) або фізіологічним розчином, переносять в колби з МПБ при рН 6,8-7,0 і проводять культивування при 28 °C з аерацією при перемішуванні 240 об./хв. протягом 48 годин, центрифугують при 6 тис. об./хв. Для тривалого зберігання препарату в отриману біомасу клітин вносять сахарозожелатинове захисне середовище (1 % і 1 % відповідно) до загального обсягу та розливають у скляні чашки Петрі. Отриманий супернатант СКР, розливають у ємності з нержавіючої сталі по 300 мл. Біомасу та СКР заморожують при -25-30°протягом 24-48 год. із подальшою ліофілізацією у вакуумній сушильної камері протягом 36 год. при t і від -20° до +36° С. та контролем бактеріальної чистоти препарату на щільних поживних середовищах (МПА, Гаузу № 2, Громико, картопляний агар). Отримана кількість життєздатні клітин при ліофілізації біомаси з кріопротектором складає 10 3 (1,2±0,02)х10 см , отримана кількість життєздатні клітин при ліофілізації СКР без 3 3 кріопротектора складає (1,0±0,02)х10 см . Суху біомасу або СКР фасували по 1 гр у поліетиленові пакети та пакували гарячим способом (фасували по 0,5 гр). Приклад 2. Підбір оптимальних концентрацій сухих препаратів біомаси та СКР штаму Bacillus subtilis IMB В-7392 для регуляції процесу проростання зерна пшениці Triticum aestivum L in vitro. Об'єктами дослідження були 5 сортів пшениці м'якої озимої, переважно вітчизняної селекції, які занесені до Державного реєстру сортів рослин, придатних для поширення в Україні: Смуглянка, Подолянка, Жайвір, Лісова пісня, Царівна. Культуру Bacillus subtilis IMB В-7392 вирощували так, як описано у Прикладі 1. Досліджували окремо ріст стимулювальні властивості сухих препаратів: СКР та біомаси Bacillus subtilis IMV В7392 у різних розведеннях. Проводили передпосівне змочування насіння на 1 хв. у водних розчинах суспензії клітин 5 6 7 Bacillus subtilis IMB В-7392; (1,2±0,02×10 КУО/мл); (1,2±0,02×10 КУО/мл); (1,2±0,02×10 КУО/мл) та у водних розчинів СКР, у розведеннях 1:200, 1:500, 1:1000, що містили метаболіти Bacillus subtilis IMB В-7392 у поєднанні з низькими концентраціями бактеріальних клітин (50 3 3 3 КУО/ см , 20 КУО/ см , 10 КУО/ см ). Контрольні партії змочували в дистильованій воді. Повторюваність лабораторних дослідів триразова. Насіння після обробки пророщували в чашках Петрі на зволоженому фільтрувальному папері в термостаті при температурі 24±1 °C. Оцінювали вплив передпосівної обробки препаратами на енергію проростання та лабораторну схожість насіння, що визначали відповідно на 3 та 10-й день (згідно з ДСТУ 4138-2002), проводили морфометричний аналіз проростків. Таблиця 1 Енергія проростання і схожість насіння пшениці м'якої озимої за дії препаратів культуральної рідини та біомаси Bacillus subtilis IMB В-7392 Смуглянка Подолянка Царівна Жайвір Лісова пісня 45 І 80 85 82 84 83 Енергія проростання, % II IIІ IV V VI 86 92 91 94 96 88 94 93 93 95 89 93 91 94 93 87 92 90 92 93 86 92 91 91 92 VII 93 94 94 92 92 І 86 86 85 84 87 Лабораторна схожість, % II III IV V VI 90 96 94 96 98 88 98 93 97 99 90 97 92 98 100 89 96 93 98 97 90 98 95 96 97 VII 96 96 97 96 97 I контроль (змочування у стерильної дистильованій воді 1 хв.) II, III, IV - змочування СКР Bacillus subtilis IMB В-7392 відразу, відповідно у розведеннях (1:200,1:500, 1:1000). 3 UA 123162 U 5 10 15 20 25 30 V, VI, VII - змочування у препараті на основі біомаси Bacillus subtilis IMB В-7392 відразу, 5 3 6 3 7 3 відповідно у 1,2±0,02×10 см ; 1,2±0,02×10 см ; 1,2±0,02×10 см кількості життєздатних мікробних клітин. Встановлено, оптимальні дози бактеріальних клітин, для підвищення енергії проростання насіння пшениці м'якої озимої за умов передпосівної обробки насіння суспензією Bacillus subtilis IMB В-7392. Ріст стимулюючу активність виявляли: ліофілізовані препарати на основі біомаси В. 6 subtilis IMB В-7392 у концентраціях, що наближались до 10 кл/мл та СКР (1:500). Тобто для отримання робочих концентрацій сухої речовини біомаси Bacillus subtilis IMB В-7392 для одержання біопрепарату для передпосівної обробки насіння з метою стимуляції росту рослин, необхідно 0,1 г сухої речовини розвести на 1 літр води. Передпосівна обробка насіння суспензією в оптимальних концентраціях дозволяє підвищити показники проростання насіння до 10 %. Встановлено позитивний вплив водних розчинів СКР, що містили продукти метаболізму В. subtilis IMB В-7392, на енергію проростання та підвищення схожості насіння Triticum aestivum L до 10-11 %. Здатність сухих препаратів на основі Bacillus subtilis IMB В-7392 впливати на процеси проростання, схожість насіння, швидкість їх росту, дозволяє розглядати їх як стимулятори росту зернових. Передпосівна обробка насіння суспензією або СКР Bacillus subtilis ІMB В-7392 сприяє підвищенню лабораторної схожість насіння озимої пшениці на 3-10 %. Встановлено робочі концентрації сухих біопрепаратів на основі біомаси Bacillus subtilis ІMB В-7392 та метаболітів СКР для передпосівної обробки насіння з метою стимуляції росту рослин. Так, необхідно 0,5 г сухої речовини розвести у 5 літрах води. Витрати складають - 5 л на 1 т насіння зернових. Приклад № 3 Дослідження рістстимулювальних властивостей ліофільно висушених препаратів СКР та біомаси В. subtilis ІMB В-7392, що зберігали протягом 6 місяців. Проведення вегетаційного досліду по визначенню біологічного потенціалу В. subtilis IMB В-7392 на проростання, схожість та розвиток паростків озимої пшениці сорту Смуглянка показало перспективу їх використання для передпосівної обробки насіння Triticum aestivum L. Готували робочі водні розчини суміші сухої біомаси або СКР 0,1 г/л та препарат порівняння 6 добова культура В. subtilis IMB В-7392 (1×10 кл/мл). Проводили передпосівне змочування насіння - 1 хв. Оброблене насіння пророщували у чашках Петрі, як наведено у прикладі 2, з подальшим визначенням середніх біометричних показників проростків. Повторність лабораторних дослідів триразова. Таблиця 2 Вплив інокуляції насіння озимої пшениці сорту Смуглянка препаратами культуральної рідини та біомаси Bacillus subtilis IMB В-7392 на проростання, схожість та розвиток проростків Варіант Контроль Ліофільна біомаса В. subtilis ІMB В6 7392 10 кл/мл Ліофільна СКР B. subtilis ІMB В-7392 (1:500) Добова культура В. subtilis ІMB В6 7392 1×10 кл/мл КонтрольБіокомплекс AT-1:1000 Проростання Схожість насіння насіння % до % до шт. шт. контролю контролю 80±1,0 100 86±1,0 100 91±1,0 113,75 96±1,6 92±1,0 115 93±2,0 92±2,0 довжина кореня довжина стебла 4,8±0,5 % до контролю 100 5,2±0,3 % до контролю 100 111,62 6,4±0,3 133,3 6,4±0,5 123 95±1,0 110,46 6,3±0,2 129,16 6,4±0,5 123 116,25 97±2,0 112,79 6,8±0,2 141,6 6,5±0,6 125 115 95±1,0 110,46 6,1±0,5 127,08 6,0±0,6 115,3 35 4 см. см. UA 123162 U 5 10 15 20 25 30 Обробка насіння озимої пшениці сорту Смуглянка нативними та ліофільно-висушеними препаратами В. subtilis IMB В-7392, дозволила збільшити показники проростання насіння на 1315 %, схожості на 9-12 %, довжини кореня на 29-40 %, та довжини стебла на 23-30 % у порівнянні з контролем. Морфометричний аналіз довжини надземної та підземної частини паростків на 10 добу досліду виявив істотний вплив В. subtilis IMB В-7392 на висоту рослин. Довжина проростків озимої пшениці збільшилась на 23 %. Препарати на основі біомаси та добової культури В. subtilis IMB В-7392 більш активно впливали на розвиток бокових коренів та довжину кореневої системи рослин, порівняно з препаратом порівняння Біокомплекс AT. Передпосівне змочування насіння у розчинах СКР (1:500) сприяло підвищенню довжини кореня у 1,3 рази порівняно з контролем та поліпшенню архітектури кореневої системи, розвитку бічних і додаткових коренів. Встановлено позитивний вплив СКР, що містить продукти метаболізму В. subtilis IMB В-7392 на енергію проростання, схожість насіння рослин та формування їх проростків. Так, за стимуляцією енергії проростання, впливу на схожість та формуванням проростків дослідні препарати перевищували показники комерційного препарату Біокомплекс AT. Біологічну активність виявили препарати на основі біомаси та СКР (продуктів метаболізму В. subtilis IMB В-7392). Ліофільне висушування СКР та біомаси В. subtilis IMB В-7392 сприяло збереженню рістстимулювальних властивостей штаму. Отримані ліофільно висушені препарати В. subtilis IMB В-7392, що зберігалися 6 місяців та були здатні до збереження біологічних властивостей. Це дозволяє рекомендувати сухі препарати В. subtilis IMB В-7392, для підвищення якості насіння перед висівом у ґрунт. Відмічено стимуляцію росту рослин пшениці м'якої озимої за умов передпосівної інокуляції насіння добовими та 6 ліофільно висушеними препаратами В. subtilis IMB В-7392 у концентраціях (10 кл/мл). Приклад №4 Дослідження рістстимулювальних властивостей ліофільно висушених препаратів СКР та біомаси Bacillus subtilis IMB В-7392, що зберігали протягом 6 місяців, на рослинах гречки татарської Fagopyrum tataricum Gaertn сорту "Роксолана". Для проведення вегетаційного досліду для визначення біологічного потенціалу В. subtilis IMB В-7392 на проростання, схожість та розвиток проростків рослин гречки сорту "Роксолана" готували робочі водні розчини суміші сухої біомаси В. subtilis IMB В-7392 або СКР (см. Приклад № 3). Препаратами порівняння виступали розчини Біокомплексу AT та добової культури В. subtilis IMB В-7392 (1×106 кл/мл). Насіння замочували у готових розчинах на 1 хв. Оброблене насіння пророщували в чашках Петрі, як наведено у прикладі № 1. Таблиця 3 Вплив інокуляції насіння гречки сорту Роксолана препаратами GKP та біомаси Bacillus subtilis IMB В-7392 на проростання, схожість та розвиток проростків Варіант Проростання Схожість насіння довжина кореня довжина стебла насіння % до % до % до % до шт. шт. см. см. контролю контролю контролю контролю 40,0±0,2 100 45,0±2,4 100 6,7±1,1 100 7,0+1,5 100 Контроль Ліофілізована біомаса В. 55,0±2,4 subtilis IMB В6 7392 10 кл/мл Ліофілізована культуральна рідина В. 54,0±2,2 subtilis IMB В7392 1:500 137,5 58,0±2,6 128,8 7,2±1,2 107,4 7,7+1,2 110 135 59,0±1,4 131,1 6,7±1,1 100 7,0+1,5 100 35 5 UA 123162 U Продовження таблиці 3 Добова культура В. subtilis IMB В6 7392 1×10 кл/мл КонтрольБіокомплекс AT-1:1000 5 10 15 20 25 30 56,0±1,4 140 61,0±2,6 135,5 6,8±1,2 101,4 7,2+2,4 102,8 49,0±1,6 122,5 60,0±3,2 133,3 6,8+1,2 101,4 7,0+2,6 100 Отже, передпосівне змочування насіння гречки сорту Роксолана водними розчинами суміші сухої біомаси або СКР В. subtilis IMB В-7392, супроводжувалось інтенсифікацією процесів проростання і стимуляції початкового росту рослин. Показники проростання насіння гречки сорту Роксолана при зволожуванні дослідними препаратами підвищувались на 35-40 %. Препарати виявляли суттєвий вплив на розвиток проростків. Відмічено стимуляцію росту рослин гречки сорту Роксолана за умов передпосівної обробки насіння добовими та ліофільно 6 висушеними препаратами Bacillus subtilis IMB В-7392 у концентраціях (10 кл/мл). Проте, найбільш високі показники проростання насіння, виявлено за умов передпосівної обробки насіння СКР, що містило екзометаболіти та культуру Bacillus subtilis IMB В-7392. Саме препарати СКР В. subtilis IMB В-7392 виявляли найбільший вплив на довжину проростків, що можливо пов'язано з продукцією штамом екзометаболітів фітогормонів. Дослідження рістстимулювальних властивостей ліофільно висушених препаратів СКР та біомаси Bacillus subtilis IMB В-7392, що зберігали протягом 6 місяців, показало, що біопрепарати у відповідних розведеннях, можуть бути рекомендовані для підвищення якості насіння гречки перед висівом у ґрунт. Дослідні препарати позитивно впливали на морфометричні показники рослин, сприяли їх росту та розвитку. Приклад 5. Ауксиноподібна специфічна дія Bacillus subtilis IMB В-7392 та СКР на довжину відрізків колеоптилів пшениці. Для виявлення ауксинів використовувався тест із використанням відрізків колеоптилів. Насіння пшениці м'якої озимої сорту Смуглянка стерилізували 10 % Н2O2, протягом 3 хв, промивали дистильованою стерильною водою протягом 7 хвилин, 3 рази, та розподіляли по 50 шт. на чашки Петрі (18 см х 1,8 см) на вологому фільтрувальному папері. Проводили інкубування насіння при 25 °C у термостаті протягом 3-х днів. Отримані колеоптилі різали на сегменти та витримували у дистильованій воді протягом 1 години з подальшим перенесенням у чашки Петрі з натрій-фосфатним буфером 15 ммоль / л 10 мл, 1 % глюкози та СКР у кінцевої концентрації 0,1 %. Позитивним контролем був розчин -5 індолил-3-оцтової кислоти (IOК, Sigma-Aldrich, США)-10 М. Таблиця 4 Ауксин подібна специфічна дія СКР Bacillus subtilis IMB В-7392 на довжину відрізків колеоптилів пшениці Варіант Вода IOК Ліофілізований СКР 1:200 Ліофілізований СКР 1:500 Ліофілізований СКР 1:1000 35 Приріст довжини колеоптилів, % щодо контролю 100 120 104 110 105 Встановлено, що ліофілізований СКР штаму Bacillus subtilis IMB В-7392, стимулює приріст довжини відрізків колеоптилів озимої пшениці. Оптимальним розведенням ліофілізованого СКР, виявилось розведення у 500 разів, що стимулювало ріст колеоптилів на 10 % по відношенню до контролю. Спостерігали зменшення дії СКР на відрізки колеоптилів при подальшому розведенні препарату. Тобто, одним із механізмів стимуляції росту проростків є наявність ауксиноподібної 6 UA 123162 U 5 10 15 20 25 30 35 40 активності у штаму Bacillus subtilis IMB В-7392, оскільки СКР штаму IMB В-7392 підсилює ріст відрізків колеоптилів. Приклад 6. Вирощені проростки гречки та озимої пшениці, досліджували методом індукції флуоресценції хлорофілу з метою обґрунтування фізіологічної дії метаболітів Bacillus subtilis IMB B-7392 на активність фотосинтетичного апарату листків пшениці озимої та гречки за показниками чутливості фотохімії фотосистеми II (ФСІІ) у рослинах за умов передпосівної обробки насіння ліофілізованим препаратом супернатанту Bacillus subtilis IMB В-7392. Вимірювання індукції флуоресценції хлорофілу (ІФХ) листків представників роду Fagopyrum tataricum (L) Caertn та Triticum aestivum L здійснювали портативним приладом "Флоратест", який розроблений державним науково-інженерним центром мікроелектроніки Інституту кібернетики ім. В.М. Глушкова НАН України. За методикою брали вирощені у лабораторних умовах 21добові рослини пшениці, відбираючи для вимірів листки приблизно однакового розміру. Для здійснення темнової адаптації, перед вимірюванням, яка становила 20 хв., на листок одягався чохол із щільного паперу після темнової адаптації на листок кріпили спеціальну кліпсу з виносним оптичним сенсором (довжина хвилі опромінення 470±15, площа опромінення не 2 2 менше 15 мм і освітленість в її межах не менше 2,4 Вт/м ). Інтенсивність флуоресценції опроміненої площі листа фіксувалася приладом в межах від 670 до 800 нм. Надалі зафіксовані дані передавали на стаціонарний комп'ютер. Обчислювали основні параметри флуоресценції, будували криві Каутського, визначали відповідні критичні параметри та порівнювали контрольні і дослідні показники. F0 - фонову флуоресценцію; Fpl - "плато" флуоресценції - тимчасового сповільнення; Крl - коефіцієнту "плато"; qF - гасіння флуоресценції; Кі - коефіцієнту індукції флуоресценції, що характеризує ефективність перебігу темнових біохімічних процесів, корелює із активністю рибулозобісфосфат-карбоксилази; Fst - стаціонарний рівень флуоресценції через 4 хв. після початку освітлення Отриманий після серії вимірювань масив цифрових даних обчислювали на ПК для статистичної обробки даних використовували програму Statistica 8.0. Встановлено, що за передпосівної обробки насіння ліофілізованим СКР Bacillus subtilis IMB В-7392 спостерігається зміна фотохімічної активність листків рослин озимої пшениці та гречки. Це дало можливість дослідити вплив метаболітів Bacillus subtilis IMB В-7392 на спрямованість фізіологічних процесів рослин, що віддзеркалює стан і активність фотосинтетичного апарату, зокрема ФС II, зміни активності електрон-транспортного ланцюга, а також розробити підходи, які дозволяють оцінювати вплив стимуляторів росту рослин на стан і активність фотосинтетичного апарату листків. Оскільки зміни флуоресценції від моменту освітлення до досягнення стаціонарного рівня корелюють з функціонуванням відповідних ланок ланцюгу фотосинтезу, аналіз цих змін дає можливість оцінити функціональну активність фотосинтетичного апарату і його стан. Зміна флуоресценції відображає зміни донорно-акцепторної системи реакційних центрів (РЦ) ФС II, яка є надзвичайно чутливою до стресових факторів. Отримані результати наведені у таблиці 6 Таблиця 6 Вплив обробки насіння пшениці м'якої озимої сорту Смуглянка та гречки сорту Роксолана ліофільно висушеним препаратом СКР Bacillus subtilis IMB В-7392 на термінальні параметри індукції флуоресценції хлорофілу Варіанти F0 а Контроль Допосівна обробка 480,0±19,9 550 Параметри флуоресценції хлорофілу Fv/Fm Kpl=(Fpl-Fo):(Fp- qF=(Fm-Fst) / Fo) Fst в б г Озима пшениця 10 доба досліду 0,67 0,11 2,1 0,69 0,12 45 7 2,4 Ki=(Fp-Ft)/Fp д 0,7 0,85 UA 123162 U Продовження таблиці 6 Контроль Допосівна обробка 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 900 Гречка 10 доба досліду 0,58 0,45 0,35 0,28 850 0,60 0,51 0,38 0,36 Встановленого фонова флуоресценція F0 в листках, інтактних рослин пшениці складала 480 відн. од. В цей же час, обробка насіння пшениці ліофільно висушеним препаратом культуральної рідини В. subtilis IMB В-7392 (1:1000) опосередковано сприяла підвищенню рівня фонової флуоресценції до 550 відн. од. Зростання інтенсивності фонової флуоресценції (F 0) порівняно з контролем, може бути зумовлено збільшенням кількості молекул не активного хлорофілу, що не бере участі у фотоасиміляції вуглецю. Відомо, що величина F 0 залежить від кількості хлорофілу в клітинах та на думку деяких дослідників дозволяє оцінювати потенційну 23 продуктивність рослин [ ]. Зростання інтенсивності фонової флуоресценції за умов передпосівного замочування насіння пшениці може свідчити про синтез нових молекул хлорофілу, які ще функціонально не 24 пов'язані з світлозбиральними комплексами [ ]. В цей же час на рослинах гречки спостерігали зниження показника фонової флуоресценції, що корелює зі зростанням кількості активного хлорофілу за умов передпосівної обробки насіння ліофілізованними препаратами культуральної рідини В. subtilis IMB В-7392 та може бути фактором, що свідчить про зростання функціональної активності фотосинтетичного апарату листків. Отже можна зробити припущення, що передпосівна обробка насіння ліофільно висушеним препаратом СКР В. subtilis IMB В-7392, що містить метаболіти, сприяла зростанню інтенсивності ферментативних і біосинтетичних процесів у тканинах проростків. Така рістстимулююча дія СКР скоріш за все сприяла зростанню як синтезу фотосинтетичних пігментів, так і довжини антени СЗК, що поліпшує ефективність залучення квантів поглинутого світла при їх міграції по пігментній матриці. Зазвичай, лише невелика частина поглинутого світла - близько 3 % відбивається шляхом фонової флуоресценції. Передпосівна обробка насіння СКР Bacillus subtilis IMB В-7392 впливає на кількісну міру світлової чутливості - квантову ефективність фотохімії. Співвідношення Fv/Fm, характеризує загальну ефективність флуоресценції при відкритих і закритих реакційних центрах та відображає ефективність функціонування ФСП. Цей показник, використовують як чутливий індикатор продуктивності фотосинтетичного апарату рослин. За цим показником, дають попередню оцінку стану активності залучення фотосинтетичним апаратом квантів енергії світла, що можуть використовуватись у процесах фотоасиміляції; або висвічуватись у вигляді флуоресценції. Оптимальні значення параметра Fv/Fm виміряними для більшості видів рослин 25 знаходиться у діапазоні 0,8-0,832. [ .]. Під впливом передпосівної обробки насіння пшениці та гречки ліофілізованим супернатом В. subtilis IMB В-7392 у оптимальній дозі, спостерігається збільшення квантової ефективності фотохімії ФСП, завдяки збільшенню вмісту активного хлорофілу в антенах світлозбиральних комплексів ФС II. Підвищення показника потенційної квантової ефективності ФСП віддзеркалює ефективність дії досліджуваного препарату на фотосинтетичний апарат рослин, зростання його 26 функціональної активності. [ ]. Відомо, що параметр квантової ефективності фотохімії ФСП вимірює частку світла, поглиненого хлорофілом, пов'язаним з ФСП та може визначати 27 швидкість лінійного транспорту електронів [ ]. Отже, передпосівна обробка насіння ліофілізованим супернатантом В. subtilis IMB В-7392 сприяла поліпшенню ефективності функціонування фотохімічних реакцій у ФСП, зокрема світової фази фотосинтезу завдяки зростанню кількості фотохімічно активних комплексів пов'язаними з ФСП. Дослідження додаткового показника ефективності передачі енергії у електрон-транспортному ланцюгу Коефіцієнту плато Kpl=(Fpl-F0):(Fp-F0), що відповідає кількості QВ-невідновлювальних комплексів, показало тенденцію до збільшення кількості комплексів, які не беруть участі у транспорті електронів на пул пластохінонів. Це опосередковано вказує, на сповільнення фотосинтетичних процесів за умов обробки насіння пшениці ліофілізованим супернатантом В. subtilis IMB В-7392. Проте, на рослинах гречки за допосівної обробки насіння ліофілізованим супернатантом В. subtilis IMB В-7392, відмічали зниження коефіцієнта плато Крl. Це свідчить про прискорення відтоку електронів від первинних акцепторів реакційних центрів ФС II до 8 UA 123162 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 реакційних центрів ФСІ (фотосистема І), зниження впливу стресових факторів та підсилення 28 ефективності передачі енергії у листків гречки [ ]. В цей же час, за опосередкованої дії супернатанту бацил на проростання та поліпшення фізіологічного стану паростків, відмічається підвищення коефіцієнта індукції хлорофілу. Коефіцієнт Ki=(Fp-Ft)/Fp, відображує ефективність перебігу процесів темнової фази фотосинтезу. Підвищення коефіцієнта Кі супроводжується підсиленням активності фотосинтезу та корелює з активністю рибулозобісфосфат-карбоксилази - основного ферменту циклу Кальвіна. Це свідчить про активацію темнових біохімічних процесів під впливом обробки насіння пшениці та гречки ліофілізованим супернатантом В. subtilis IMB В-7392. Передпосівна обробка насіння ліофілізованим супернатантом В. subtilis IMB В-7392 супроводжувалась підвищенням, ще одного важливого параметра - гасіння флуоресценції (qF), який розраховують, як співвідношення qF=(Fm-Fst)/Fst, де Fm і Fst - відповідно максимальний і стаціонарний рівні флуоресценції, одержувані з фотоіндукційних кривих. Встановлено, стимулюючу дію на фотохімічну активність рослин пшениці та гречки до посівної обробки насіння ліофілізованим супернатом В. subtilis IMB В-7392. Підвищення qF відображує підсилення процесів, що підтримують електронний транспорт та реакції у яких витрачаються АТФ і НАДФН2, що свідчить про активацію біохімічних реакцій асиміляції вуглецю (фіксація СО 2). Підвищення показника qF разом із поліпшенням квантової ефективності фотосинтезу свідчить про підвищення життєздатності рослин, і, таким чином, покращення стану і функціональної активності фотосинтетичного апарату рослин [29]. Тобто у листках проростків пшениці та гречки, вирощених із насіння, за умов передпосівної обробки ліофілізованим супернатантом В. subtilis IMB В-7392, виявлено інтенсивніше функціонування певних ланок фотосинтетичного апарату, а саме збільшення ефективності фотохімії ФС II (параметр Fv/Fm); підсилення перебігу фотосинтетичних процесів у листках рослин гречки, зростання коефіцієнта індукції - Кі, тобто ефективності темнових процесів асиміляції вуглецю. Ці термінальні фотосинтетичні характеристики віддзеркалюють зростання ефективності використання сонячного світла для синтезу органічних речовин та інтенсифікацію ростових процесів рослин. Джерела інформації: 1. Смирнов В.В. Сорокулова И.Б., Пинчук И.В. Бактерии рода Bacillus - перспективный істочник биологически активных веществ // Мікробіол. журн. - 2001 - Т. 63, № 1. - С. 72-79. 2. Majumder, S., Mukhopadhyay, N.K., Ghosh, S.K., and Bose, S.K. (1988) Genetic analysis of the mycobacillin biosynthetic pathway in Bacillus subtilis B3. J Gen Microbiol 134: 1147-1153. 3. Kudoyarova GR1, Melentiev AI2, Martynenko EV2, Timergalina LN2, Arkhipova TN2, Shendel GV2, Kuz'mina LY2, Dodd ІC3, Veselov SY4. Cytokinin producing bacteria stimulate amino acid deposition by wheat roots. //Plant Physiol Biochem. 2014 Oct.; 83:285-91. doi: 10.10.16/j.plaphy.2014.08.015. Epub 2014 Aug. 27. 4. Gutierrez-Маnего F, Ramos-Solano B, Probanza A, Mehouachi J, Tadeo FR, Talon M. The plant-growthpromotingBrhizobacteria Bacillus pumilus and Bacillus licheniformisBproduce high amounts of physiologically active gibberellins. Physiol Plant, 2001;111:206-211. 5. Probanza A, Garcia JAL, Palomino MR, Ramos B, Manero FJG. Pinuspinea L. seedling growth and bacterial rhizosphere structure after inoculation with PGPR Bacillus (B. licheniformis CECT 5106 and B. pumilus CECT 5105). Appl. 2002. 6. Mena-Violante, H., Olalde-Portugal V. 2007.Alteration of tomato fruit quality by root inoculation with plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR): Bacillus subtilis BEB-13bs. Sci. Hortic-Amsterdam 113, 103-106. 7. Martinez-Viveros O, Jorquera M, Crowley D, Gajardo G, Mora M (2010) Mechanisms and practical considerations involved in plant growth promotion by rhizobacteria. J Soil Sci Plant Nutr 10:293-319. 8. Kumar AS, Lakshmanan V, Caplan JL, Powell D, Czymmek KJ, et al. 2012. Rhizobacteria Bacillus subtilis restricts foliar pathogen entry through stomata. Plant J. 72:694-706. 9. Kumar, P. K. R, Lonsane, В. К. Microbial Production of Gibberellins: state of the art. Advances in Applied Microbiology, 1989;34, 29-139. 10. Swain, M.R., Naskar, S.K., Ray, R.C. 2007. Indole-3-acetic acid production and effect on sprouting of Yam (Dioscorea rotundata L.) minisetts by Bacillus subtilis isolated from culturable cowdung microflora. Pol. J. Microbiol. 56, 103-110. 11. Arkhipova T.N., S.U. Veselov, A.I. Melentiev, E.V. Martynenko and G.R. Kudoyarova Ability of bacterium Bacillus subtilis to produce cytokinins and to influence the growth and endogenous hormone content of lettuce plants // Plant and Soil Vol. 272, № 1/2 (May. 2005). - Р. 201-209. 9 UA 123162 U 5 10 15 20 25 30 35 40 12. Цавкелова Е.А., Климова С.Ю., Чердынцева Т.А., Нетрусов А.И. Микроорганизмы продуценты стимуляторов роста растений и их практическое применение. // Прикладная биохимия и микробиология. - 2006. - Т. 42, № 2. - С. 133-143. 13. Токмакова Л.Н. Штаммы Bacillus polymyxa и Achromobacter album - основа для создания бактериальных препаратов // Мікробіол. журнал. - 1997. - Т. 59. № 4. С. 131-138. 14. Кретович В.Л. Основы биохимии растений. - М.: Высшая школа, 1971. - 46 с. 15. Патент України 90181 Штам Bacillus Subtilis - антагоніст фітопатогенних бактерій та грибів та біопрепарат на його основі, призначений для захисту зернобобових культур. 16. Патент України № 78164, Композиція для захисту рослин від фітопатогенної мікрофлори, кл. А01N 63/00, опубл. 11.03.2013. 17. Патент РФ № 2337955, кл. C12N 1/20, опубл. 10.11.2008 18. Церковняк Л.С, А.О. Рой, І.К. Курдиш Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, вул. Академіка Заболотного, 154, Київ МСП, Д03680, Україна 19. Патент України № 104623, Меланінсинтезувальний штам В. Subtilis для одержання біопрепарату з фітостимулювальною активністю, кл. A01N 63/02 (2006.01), A01N 63/00, А01Р 21/00,опубл. 0.02.2016, Бюл.№ З 20. Мікробні препарати у землеробстві. Теорія і практика /[Волкогон В.В, Надкернична О.В., Ковалевська Т.М. та ін.]. - К.: Аграрна 102 наука, 2006. - 312 с. 21. Сахибгареев А.А.; Лукьянов С.А.; Мухутдинов Ф.Г.; Кудоярова Р.А. Фитоспорин-М модифицированный промышленный микробиологический фунгицид комплексного действия [Эффективность предпосевной обработки семян яровой пшеницы и ячменя в борьбе с корневыми гнилями. 22. Эффективность гербицидов и фунгицидов при совместном применении с антистрессовыми регуляторами роста на зерн.культурах. - Уфа: Гилем, 2003. - С. 65-70. 23. Lichtenthaler H.K. The Kautsky effect 60 years of chlorophyll fluorescence induction kinetics / H.K. Lichtenthaler // Photosynthetica. - 1992. - Vol. 27, № 1-2. - P. 45-55. 24. Богдан M.M. Фізіологічне обгрунтування застосування комплексних добрив у посівах пшениці озимої 03.00.12 - фізіологія рослин, дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата сільськогосподарських наук. - К., 2016. 25. Maxwell Kate, Giles N. Johnson. Chlorophyll fluorescence-a practical guide / Kate Maxwell, Giles N. Johnson // Journal of experimental botany. - Volume 51, 2000. - Issue 345. - P. 659-668. 26. Ouzounidou G. Changes in variable chlorophyll fluorescence as a result of Cu-treatment dose response relations in Silene and Thlaspi // Photosynthetica. - 1993. - Vol. 29. - P. 455-462. 27. Maxwell Kate, Giles N. Johnson. Chlorophyll fluorescence-a practical guide / Kate Maxwell, Giles N. Johnson // Journal of experimental botany. - Volume 51, 2000. - Issue 345. - P. 659-668. 28. Genty B, Briantais J-M, Baker NR.1989. The relationship between quantum yield of photosynthetic electron transport and quenching of chlorophyll fluorescence. Biochimica et Biophysica Acta 990, 87-92. 29. Govindjee R (1995) Sixty-three years since Kautsky: chlorophyll a fluorescence. Aust J Plant Physiol 22: 131-160. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 45 Спосіб стимуляції росту та розвитку зернових культур, який відрізняється тим, що включає предпосівну обробку насіння зернових ліофілізованними препаратами на основі біомаси Bacillus subtilis IMB В-7392 та метаболітів культури, які за умов обробки насіння зернових, у розведеннях 0,5 гр на 5 літрів води (1:500), витрата - 1 л на тонну насіння, забезпечують зниження зрідженості посівів, стимуляцію росту і розвитку рослин, збільшення ефективності фотохімії ФС II та ефективності темнових процесів асиміляції вуглецю. 50 Комп’ютерна верстка О. Гергіль Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 10