Антитіло проти гепсидину та його застосування

Реферат: Винахід належить до ізольованого антитіла, яке зв’язує людський гепсидин-25 з високою афінністю, полінуклеотиду, що його кодує, вектора, клітини-хазяїна, способу одержання антитіла. Винахід також належить до фармацевтичної композиції, що містить дане антитіло, застосуванню антитіла для лікування анемії, способу підвищення сироваткового заліза та набору для проведення імунологічного аналізу. UA 98983 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Цей винахід належить до галузі медицини, зокрема, стосується антитіл проти зрілого людського гепсидину. Конкретніше, цей винахід стосується селективних моноклональних антитіл проти гепсидину-25, які є здатними до нейтралізування біологічної активності зрілого людського гепсидину, а отже є придатними для підвищення рівня сироваткового заліза, кількості ретикулоцитів, кількості еритроцитів, рівня гемоглобіну та/або гематокриту у людини з метою лікування або запобігання захворювання, стану або розладу, розвиток якого стимулюється зрілим людським гепсидином, такого як анемія. На сучасному етапі кількість прийнятних та ефективних методів лікування анемії, або анемії, спричиненої хронічними захворюваннями, є обмеженою. Зокрема, введення еритропоетину ефективне лише у приблизно 50 % усіх пацієнтів і пов'язане з небажаними побічними ефектами. Крім того, переливання крові є небажаним через ризик зараження, інфікування та перевантаження залізом. Вважають, що людський гепсидин, поліпептид, що експресується переважно гепатоцитами, являє собою важливий залізорегулювальний білок, який регулює, за принципом негативного зворотного зв'язку, всмоктування заліза у кишечнику, рециркуляцію заліза макрофагами та мобілізацію заліза з печінкових депо заліза. Виявлено, що надпродукування гепсидину відіграє головну роль у патофізіології анемії та/або. анемії, спричиненої хронічними захворюваннями. Людський гепсидин кодується у вигляді 84-амінокислотного препропептиду, який містить типову N-кінцеву 24-амінокислотну сигнальну послідовність, яка забезпечує доставку до ендоплазматичного ретикулуму, та 35-амінокислотну ділянку-попередник з консенсусним сайтом розщеплення фурином, безпосередньо за якою знаходиться С-кінцевий 25амінокислотний біологічно активний залізорегуляторний гормон, людський гепсидин-25 (послідовність SEQ ID NO:1). Відомо, що in vivo також утворюються різні N-кінцеві скорочені форми людського гепсидину-25, такі як людський гепсидин-20 (тобто амінокислоти 6-25 послідовності SEQ ID NO:1) та людський гепсидин-22 (амінокислоти 4-25 послідовності SEQ ID NO:1). Незважаючи на те, що раніше вже повідомлялось про антитіла проти людського гепсидину (дивись, наприклад, публікації заявок на патент США 2004/0096990 і 2007/0224186 та публікацію міжнародної заявки WO 2008/097461), у цій галузі все ще залишається велика потреба у нових лікарських засобах для лікування захворювань та розладів, що пов'язуються з анемією, у тому числі анемією, спричиненою хронічними захворюваннями, наприклад, раковою анемією та запальною анемією. Оскільки гепсидин-25 є основною, якщо не єдиною, фізіологічно відповідною формою гепсидину у людей, то існує значна потреба в антитілах, що селективно спрямовуються проти людського гепсидину-25, порівняно з гепсидиновими поліпептидами, які не є фізіологічно відповідними. Таким чином, цей винахід пропонує селективні високоафінні генноінженерні терапевтичні антитіла проти людського гепсидину-25, що мають численні переваги при лікуванні або діагностуванні розладів, пов'язаних із підвищеними рівнями зрілого гепсидину, таких як анемія. Наприклад, ці антитіла, що є високоафінними нейтралізуючими людськими генноінженерними антитілами та високоселективними відносно фізіологічно відповідних форм гепсидину у людей, будуть зменшувати ризик побічних ефектів та клінічну дозу і частоту введення, необхідні для ефективного лікування. Цей винахід охоплює також нуклеїнові кислоти, яким віддається перевага, що кодують селективні антитіла проти гепсидину25, яким віддається перевага, причому згадані нуклеїнові кислоти були піддані генноінженерним модифікаціям для видалення криптичних сайтів сплайсингу, які зумовлюють небажане агрегування певних антитіл за цим винаходом при експресії клітинами-хазяями ссавців. Таким чином, додаткові переваги, що надаються цим винаходом, включають поліпшений вихід антитіл бажаного ступеня чистоти, завдяки чому зменшується вартість виробництва, а також більший ступінь клінічної ефективності та безпечності введення продукту, який містить антитіла. Крім того, існуючі методи імунологічного аналізу людського гепсидину не відрізняють активних, фізіологічно відповідних форм людського гепсидину від неактивних, фізіологічно невідповідних різновидів гепсидину (дивись, наприклад, Kemna E.H., et al., Haematologica, 93(1):90-97 (2008)). На сучасному етапі більшість методів селективного аналізу на гепсидин-25 включають рідинну хроматографію/мас-спектроскопію (LC/MS) або подібні трудомісткі методи, які потребують розділення різних форм гепсидину (дивись, наприклад, Gutierrez J.A., et al., BioTechniques, 38:S13-S17 (2005), Murphy, et al., Blood, 110:1048-1054 (2007) та Kemna Ε.Η., et al., Clin. Chem. 53:620-628 (2007)). Незважаючи на те, що ці аналізи можуть бути достовірними і точними, їх складність, вартість та необхідний високий рівень компетентності оператора значно обмежують їх повсякденне застосування. Відповідно, існує також велика потреба у нових антитілах, що з високою спорідненістю зв'язують зрілий людський гепсидин, для їх застосування у відносно простому, швидкому та надійному імунологічному аналізі для специфічного 1 UA 98983 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 виявлення або визначення зрілих форм людського гепсидину, прийнятному для різних варіантів діагностичного та/або прогностичного застосування. Цей винахід пропонує антитіла, що зв'язують людський гепсидин-25 зі зв'язувальною спорідненістю (КD) на рівні приблизно 800 пМ або менше, яку визначають за допомогою поверхневого плазмонного резонансу (SPR) при температурі 25 °C. За варіантом, якому віддається перевага, згадане антитіло має швидкість дисоціації (k off) з людським гепсидином-25 -3 -1 -4 -1 від приблизно 8,5×10 с до приблизно 1,8×10 с , яку визначають за допомогою SPR при температурі 25 °C. За варіантом, якому віддається більша перевага, згадане антитіло має зв'язувальну спорідненість КD до людського гепсидину-25 від приблизно 400 пМ до приблизно 30 пМ, яку визначають за допомогою SPR при температурі 25 °C. За варіантом, якому віддається ще більша перевага, згадане антитіло має зв'язувальну спорідненість K D до людського гепсидину-25 від приблизно 200 пМ до приблизно 30 пМ, яку визначають за допомогою SPR при температурі 25 °C. За варіантом, якому віддається ще більша перевага, згадане антитіло має ІС50 від приблизно 100 нМ до приблизно 25 нМ у in vivo аналізі біологічної активності гепсидину-25, причому за варіантом, якому віддається перевага, за допомогою згаданого аналізу визначають індуковане IL-6 (інтерлейкін-6) зниження рівня сироваткового заліза. За варіантом, якому віддається ще більша перевага, згадане антитіло має ІС 50 від приблизно 100 нМ до приблизно 50 нМ у in vitro аналізі біологічної активності гепсидину-25, причому за варіантом, якому віддається перевага, за допомогою згаданого аналізу визначають індуковану гепсидином інтерналізацію та/або деградацію феропортину. За варіантом, якому віддається ще більша перевага, згадані антитіла містять щонайменше одну з гіперваріабельних ділянок (CDR), вибрану з групи, яку складають і) HCDR3, що має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO:75, та іі) LCDR3, що має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO:62. Цей винахід стосується антитіла, яке селективно зв'язує людський гепсидин-25 зі зв'язувальною спорідненістю КD на рівні приблизно 800 пМ або менше і містить поліпептид варіабельної ділянки важкого ланцюга ("HCVR") та поліпептид варіабельної ділянки легкого ланцюга ("LCVR"), де (і) поліпептиди HCVR та LCVR мають амінокислотні послідовності, представлені послідовностями SEQ ID NO:148 та SEQ ID NO:126, відповідно; (іі) поліпептиди HCVR та LCVR мають амінокислотні послідовності, представлені послідовностями SEQ ID NO:128 та SEQ ID NO:127, відповідно; (iii) поліпептиди HCVR та LCVR мають амінокислотні послідовності, представлені послідовностями SEQ ID NO:151 та SEQ ID NO:125, відповідно; або (iv) поліпептиди HCVR та LCVR мають амінокислотні послідовності, представлені послідовностями SEQ ID NO:150 та SEQ ID NO:124, відповідно. Цей винахід стосується антитіла, яке селективно зв'язує людський гепсидин-25 зі зв'язувальною спорідненістю КD на рівні приблизно 800 пМ або менше і містить поліпептид важкого ланцюга та поліпептид легкого ланцюга, де (і) поліпептиди важкого ланцюга і легкого ланцюга мають амінокислотні послідовності, представлені послідовностями SEQ ID NO:6 та SEQ ID NO:14, відповідно; (іі) поліпептиди важкого ланцюга і легкого ланцюга мають амінокислотні послідовності, представлені послідовностями SEQ ID NO:7 та SEQ ID NO:15, відповідно; (ііі) поліпептиди важкого ланцюга і легкого ланцюга мають амінокислотні послідовності, представлені послідовностями SEQ ID NO:9 та SEQ ID NO:17, відповідно; або (iv) поліпептиди важкого ланцюга і легкого ланцюга мають амінокислотні послідовності, представлені послідовностями SEQ ID NO:8 та SEQ ID NO:16, відповідно. Цей винахід стосується антитіла, яке селективно зв'язує людський гепсидин-25 зі зв'язувальною спорідненістю КD на рівні приблизно 800 пМ або менше і містить поліпептид LCVR, який містить 3 послідовності CDR, які є присутніми разом у будь-якому з Fab-фрагментів, перелічених у наведеній у цьому описі Таблиці 1, причому згадані послідовності CDR є присутніми у згаданому антитілі у такому самому положенні CDR, яке є представленим у Таблиці 1. За варіантом, якому віддається перевага, таке антитіло містить поліпептид LCVR, що має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яку складають послідовності SEQ ID NO:101127. Цей винахід стосується антитіла, яке селективно зв'язує людський гепсидин-25 зі зв'язувальною спорідненістю КD на рівні приблизно 800 пМ або менше і містить поліпептид HCVR, який містить 3 послідовності CDR, які є присутніми разом у будь-якому з Fab-фрагментів, перелічених у наведеній у цьому описі Таблиці 2, причому згадані послідовності CDR є присутніми у згаданому антитілі у такому самому положенні CDR, яке є представленим у Таблиці 2. За варіантом, якому віддається перевага, таке антитіло містить поліпептид HCVR, що має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яку складають послідовності SEQ ID NO:128151. 2 UA 98983 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Цей винахід стосується антитіла, яке селективно зв'язує людський гепсидин-25 зі зв'язувальною спорідненістю КD на рівні приблизно 800 пМ або менше і містить і) поліпептид LCVR, який містить 3 послідовності CDR, які є присутніми разом у будь-якому з Fab-фрагментів, перелічених у Таблиці 1, причому згадані послідовності CDR є присутніми у згаданому антитілі у такому самому положенні CDR, яке є представленим у Таблиці 1, та іі) поліпептид HCVR, що містить 3 послідовності CDR, які є присутніми разом будь-якому з Fab-фрагментів, перелічених у Таблиці 2, причому згадані послідовності CDR є присутніми у згаданому антитілі у такому самому положенні CDR, яке є представленим у Таблиці 2. За варіантом, якому віддається перевага, таке антитіло містить 6 CDR, які є присутніми разом будь-якому з Fab-фрагментів, перелічених у Таблиці 3, і які є присутніми у згаданому антитілі у такому самому положенні CDR, яке є представленим у Таблиці 3. Цей винахід стосується антитіла, яке селективно зв'язує людський гепсидин-25 зі зв'язувальною спорідненістю KD на рівні приблизно 200 пМ або менше і містить (і) поліпептид LCVR, який має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яку складають послідовності SEQ ID NO:101-127, та (іі) поліпептид HCVR, який має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яку складають послідовності SEQ ID NO:128-151. Цей винахід також стосується антитіла, яке селективно зв'язує людський гепсидин-25 зі зв'язувальною спорідненістю KD на рівні приблизно 200 пМ або менше і містить два поліпептиди важкого ланцюга та два поліпептиди легкого ланцюга, причому кожен із поліпептидів важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO:8, і кожен із поліпептидів легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO:16. За іншими аспектами цей винахід пропонує ізольовані молекули нуклеїнових кислот, що кодують антитіла за цим винаходом; вектори, які містять молекули нуклеїнових кислот, що кодують антитіла за цим винаходом, причому за факультативним варіантом ці молекули функціонально зв'язані з контрольними послідовностями, які розпізнаються клітиною-хазяїном, трансформованою згаданим вектором; клітини-хазяї, які містять вектори, що містять молекули нуклеїнових кислот, що кодують антитіла за цим винаходом; спосіб одержання антитіла за цим винаходом, який включає культивування клітин-хазяїв, які містять вектори, що містять молекули нуклеїнових кислот, що кодують антитіла за цим винаходом, так що нуклеїнова кислота експресується, та факультативне виділення згаданого антитіла із середовища для культивування клітин-хазяїв. За іншим аспектом цей винахід пропонує фармацевтичну композицію, яка містить певну кількість антитіл за цим винаходом та фармацевтично прийнятний носій або розріджувач. За варіантом, якому віддається перевага, фармацевтична композиція містить гомогенну або по суті гомогенну популяцію антитіла за цим винаходом та фармацевтично прийнятний носій або розріджувач. За іншим варіантом здійснення цей винахід пропонує антитіло, яке селективно зв'язує людський гепсидин-25 зі зв'язувальною спорідненістю KD на рівні приблизно 800 пМ або менше, для застосування у терапії. Цей винахід пропонує також антитіло, яке селективно зв'язує людський гепсидин-25 зі зв'язувальною спорідненістю KD на рівні приблизно 800 пМ або менше, для застосування у лікуванні або запобіганні анемії у суб'єкта. Цей винахід охоплює також застосування антитіла, яке селективно зв'язує людський гепсидин-25 зі зв'язувальною спорідненістю KD на рівні приблизно 800 пМ або менше, для виготовлення лікарського засобу для лікування анемії, у тому числі анемії хронічних захворювань та ракової анемії. Крім того, цей винахід стосується застосування антитіла, яке селективно зв'язує людський гепсидин-25 зі зв'язувальною спорідненістю KD на рівні приблизно 800 пМ або менше, для виготовлення лікарського засобу для підвищення рівня сироваткового заліза, кількості ретикулоцитів, кількості еритроцитів, рівня гемоглобіну та/або гематокриту у тварини, за варіантом, якому віддається перевага, виду ссавців, за варіантом, якому віддається більша перевага, у людини. Цей винахід охоплює спосіб підвищення рівня сироваткового заліза, кількості ретикулоцитів, кількості еритроцитів, рівня гемоглобіну та/або гематокриту, який включає введення людині, яка цього потребує, ефективної кількості антитіла, що селективно зв'язує людський гепсидин-25 зі зв'язувальною спорідненістю KD на рівні приблизно 800 пМ або менше. За іншим аспектом цей винахід пропонує спосіб лікування у пацієнта розладу, розвиток якого стимулюється зрілим гепсидином, причому корисним для пацієнта є підвищення рівня сироваткового заліза, кількості ретикулоцитів, кількості еритроцитів, рівня гемоглобіну та/або гематокриту, у тому числі (але без обмеження нею) анемії, наприклад, анемії, що є наслідком інфекції, запалення, хронічного захворювання та/або раку, причому згаданий спосіб включає 3 UA 98983 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 введення ефективної кількості селективного антитіла проти гепсидину-25 за цим винаходом пацієнту, який цього потребує. Крім того, цей винахід пропонує імунологічний аналіз, селективний щодо зрілого людського гепсидину. Згаданий спосіб включає: по-перше, одержання зразка, призначеного для аналізу на зрілий людський гепсидин, та контактування згаданого зразка з антитілом за цим винаходом за прийнятних умов для зв'язування та надання можливості будь-якому присутньому зрілому людському гепсидину утворення комплексу антиген-антитіло; по-друге, виявлення присутності або відсутності згаданого комплексу та/або визначення кількості комплексу у зразку за допомогою методу імунологічного аналізу. Крім того, цей винахід пропонує діагностування стану, розвиток якого стимулюється зрілим людським гепсидином, у пацієнта шляхом визначення рівня зрілого людського гепсидину у зразку біологічної рідини, одержаної від пацієнта, та порівняння рівня зрілого людського гепсидину у зразку з рівнем зрілого людського гепсидину у зразку біологічної рідини, одержаної від одного або декількох контрольних індивідів, або з еталонним стандартом. Пропонується також спосіб моніторингу у пацієнта розладу, розвиток якого стимулюється зрілим гепсидином. Згаданий спосіб включає визначення рівня зрілого гепсидину у зразку біологічної рідини, одержаної від пацієнта, що страждає на (або належить до групи ризику) розлад, розвиток якого стимулюється зрілим гепсидином, у початковий момент часу; визначення рівня зрілого гепсидину у одному або декількох зразках біологічної рідини, одержаної від пацієнта, в один або декілька різних моментів часу; порівняння рівнів зрілого гепсидину, які були визначені у різні моменти часу, і контролювання, тим самим, розладу, розвиток якого стимулюється зрілим гепсидином. Крім того, цей винахід пропонує набір для здійснення імунологічного аналізу, який включає в себе антитіло за цим винаходом та прийнятний контейнер. На Фіг.1 зображений мас-спектр численних форм людського гепсидину, виділених зі зразків людської сироватки, визначений за допомогою MALDI-TOF (мас-спектрометрія з іонізацією методом лазерної десорбції у матричному розчині із часопролітним аналізатором). Сигнал 1 має масу, що відповідає очікуваній масі інтактного людського гепсидину-25. Сигнал 2, сигнал 3 та сигнал 4 мають маси, що відповідають скороченим на N-кінці формам зрілого людського гепсидину (гепсидин-24, гепсидин-22 та гепсидин-20). Мас-спектр одержали за допомогою масспектрометра MALDI-TOF у лінійному режимі із застосуванням методу позитивних іонів з αціано-4-гідроксикоричною кислотою (пептидна матриця) у ролі зразкової матриці, як описано у наведеному нижче Прикладі 5. На Фіг.2 зображений мас-спектр того самого зразка, що і на Фіг.1, визначений за допомогою MALDI-TOF із застосуванням 3,5-диметил-4-гідроксикоричної кислоти (матриця на основі синапінової кислоти) у ролі зразкової матриці. Сигнал 1 відображає інтактний людський гепсидин-25. Сигналу прогепсидину не спостерігалось. Мас-спектр одержали за допомогою масспектрометра у лінійному режимі із застосуванням методу позитивних іонів, як описано у наведеному нижче Прикладі 5. На Фіг.3А зображені амінокислотні послідовності повністю людського каркаса O2 легкого ланцюга, які чергуються з CDR. Чотири каркасні ділянки помічені як FRL1, FRL2, FRL3 та FRL4 (послідовності SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:96 та SEQ ID NO:97, відповідно). На Фіг.3В зображені амінокислотні послідовності людського каркаса VH1-69 важкого ланцюга, які чергуються з CDR. Чотири каркасні ділянки помічені як FRH1-4 (послідовності SEQ ID NO:35-38, відповідно). На Фіг.4А представлені зображені амінокислотні послідовності людського каркаса O18 легкого ланцюга, які чергуються з CDR. Чотири каркасні ділянки помічені як FRL1, FRL2, FRL3 та FRL4 (послідовності SEQ ID NO:154, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:156 та SEQ ID NO:97, відповідно). На Фіг.4В зображені амінокислотні послідовності людського каркаса VH1-18 важкого ланцюга, які чергуються з CDR. Чотири каркасні ділянки помічені як FRH1, FRH2, FRH3 та FRH4 (послідовності SEQ ID NO:157, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:158 та SEQ ID NO:38, відповідно). На Фіг.5А зображені амінокислотні послідовності людського каркаса L12 легкого ланцюга, які чергуються з CDR. Чотири каркасні ділянки помічені як FRL1, FRL2, FRL3 та FRL4 (послідовності SEQ ID NO:159, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:160 та SEQ ID NO:97, відповідно). На Фіг.5В зображені амінокислотні послідовності людського каркаса VH1-46 важкого ланцюга, які чергуються з CDR. Чотири каркасні ділянки помічені як FRH1, FRH2, FRH3 та FRH4 (послідовності SEQ ID NO:157, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:161 та SEQ ID NO:38, відповідно). У цьому описі вживають наведені нижче скорочення: CAN - ацетонітрил, BSA - бичачий сироватковий альбумін, DTT - дитіотреїтол, EDTA - етилендіамінтетраоцтова кислота, ELISA 4 UA 98983 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 твердофазний імуноферментний аналіз, ІМАС - афінна хроматографія з іммобілізованим іоном металу, IPTG - ізопропіл-β-D-1-тіогалактопіранозид, Mab - моноклональне антитіло, Mabs моноклональні антитіла, MALDI-TOF - мас-спектрометрія з іонізацією методом лазерної десорбції у матричному розчині із часопролітним аналізатором, PBS - фосфатно-сольовий буферний розчин, SPR - поверхневий плазмонний резонанс, TFA - трифтороцтова кислота. Усі скорочення амінокислот, що вживаються у цьому описі, являють собою скорочення, прийняті Патентним відомством США, як представлено у статті 37 Зведення федеральних постанов США (C.F.R.) § 1.822 (В) (2). При вживанні у цьому описі термін "гепсидин" означає будь-яку форму гепсидинового білка, який, як відомо, є присутнім у організмі ссавців. При вживанні у цьому описі термін "зрілий гепсидин" означає будь-яку зрілу, біологічно активну, форму гепсидинового білка, що експресується у організмі ссавців. При вживанні у цьому описі словосполучення "людський гепсидин" означає будь-яку форму гепсидинового білка, присутню у організмі людей. При вживанні у цьому описі словосполучення "людський гепсидин-25" означає зрілу форму людського гепсидину, яка має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO:1. Термін "антитіло" у відношенні антитіла проти гепсидину за цим винаходом (або просто "антитіла за цим винаходом"), який вживається у цьому описі, означає людське генноінженерне моноклональне антитіло або повністю людське моноклональне антитіло, якщо не зазначено інше. За варіантом, якому віддається перевага, антитіла за цим винаходом є людськими генноінженерними антитілами. Антитіла за цим винаходом можуть продукуватись за допомогою, наприклад, методів рекомбінантних ДНК, методів фагового дисплея, синтетичних методів, наприклад, пересадження CDR, або комбінацій таких методів чи інших методів, широко відомих у цій галузі. Термін "моноклональне антитіло" означає антитіло, що є похідним однієї копії або клону, у тому числі, наприклад, будь-якого еукаріотного, прокаріотного або фагового клону, а не спосіб, за допомогою якого воно продукується. Антитілом, що застосовують у цьому описі, може бути інтактне антитіло (що містить повну або непроцесовану Fc-ділянку) або частина чи фрагмент антитіла, що містить антигензв'язувальний домен, наприклад, Fab-фрагмент, Fab'фрагмент або F(аb')2-фрагмент людського генноінженерного або повністю людського антитіла. Антигензв'язувальні фрагменти антитіла за цим винаходом, яким віддається перевага, зберігають здатність до пригнічення або нейтралізації однієї або декількох біологічних активностей, характерних для зрілої форми гепсидину ссавців in vivo або in vitro. Наприклад, у одному з варіантів здійснення цього винаходу антигензв'язувальна ділянка антитіла за цим винаходом може пригнічувати взаємодію людського гепсидину-25 з одним або декількома рецепторами, наприклад, людським феропортином (послідовність SEQ ID NO:25), та/або може пригнічувати індуковану гепсидином інтерналізацію феропортину. Крім того, термін "антитіло за цим винаходом" або просто "антитіло", який вживається у цьому описі, може означати одноланцюговий Fv-фрагмент, який може продукуватись шляхом з'єднання ДНК, що кодує LCVR та HCVR, з лінкерною послідовністю (Дивись, Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315, 1994). Слід розуміти, що незалежно від того, чи визначаються антигензв'язувальні фрагменти або ділянки, термін "антитіло", який вживається у цьому описі, охоплює такі фрагменти або ділянки, а також одноланцюгові форми, якщо не зазначено інше. Терміни "селективне" або "селективно", що вживається у цьому описі стосовно антитіла проти гепсидину-25 або стосовно його зв'язування, відповідно, мають відношення до антитіла, яке селективно зв'язує гепсидин-25 зі зв'язувальною спорідненістю KD, яка є у приблизно 1000 разів, 500 разів, 200 разів, 100 разів, 50 разів, 10 разів або у приблизно 5 разів нижчою за зв'язувальну спорідненість, з якою згадане антитіло зв'язує щонайменше одну формупопередника гепсидину-25, та/або щонайменше одного скороченого на N-кінці різновиду зрілого гепсидину, що, як відомо, утворюється у організмі того самого виду ссавця, що визначають за допомогою SPR при температурі 25 °C. На додаток до цього або альтернативно селективне антитіло проти гепсидину-25 за цим винаходом зв'язується з гепсидином-25, але не зв'язується чи зв'язується на мінімальному рівні із щонайменше однією формою-попередником гепсидину25 та/або щонайменше одним скороченим на N-кінці різновидом зрілого гепсидину, що, як відомо, утворюється у організмі того самого виду ссавця, що визначають за допомогою імунологічного аналізу та/або мас-спектрометричних методів MALDI-TOF, що застосовуються досвідченими фахівцями у цій галузі, у тому числі (але без обмеження ним) за допомогою аналізу, опис якого наведений у представленому у цьому документі Прикладі 5. За варіантом, якому віддається перевага, селективне антитіло проти гепсидину-25 за цим винаходом зв'язує людський гепсидин-25 зі зв'язувальною спорідненістю KD, яка є у приблизно 1000 разів, 500 5 UA 98983 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 разів, 200 разів, 100 разів, 50 разів, 10 разів або у приблизно - 5 разів нижчою за зв'язувальну спорідненість, з якою згадане антитіло зв'язує людський прогепсидин, за варіантом, якому віддається перевага, людський прогепсидин, який має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO:34, та/або щонайменше одну скорочену на N-кінці форму зрілого людського гепсидину, що визначають за допомогою SPR при температурі 25 °C. На додаток до цього або альтернативно селективне антитіло проти гепсидину-25 за цим винаходом зв'язується з людським гепсидином-25, але не зв'язується чи зв'язується на мінімальному рівні з людським прогепсидином, за варіантом, якому віддається перевага, з людським прогепсидином, який має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO:34, та/або щонайменше одним скороченим на N-кінці різновидом зрілого гепсидину, що, як відомо, утворюється у організмі того самого виду ссавця, що визначають за допомогою імунологічного аналізу та/або мас-спектрометричних методів MALDI-TOF, які застосовуються досвідченими фахівцями у цій галузі, у тому числі (але без обмеження ним) за допомогою аналізу, опис якого наведений у представленому у цьому документі Прикладі 5. За варіантом, якому віддається більша перевага, селективне антитіло проти гепсидину-25 за цим винаходом зв'язує людський гепсидин-25 зі зв'язувальною спорідненістю KD, яка є у приблизно 1000 разів, 500 разів, 200 разів, 100 разів, 50 разів, 10 разів або у приблизно 5 разів нижчою за зв'язувальну спорідненість, з якою згадане антитіло зв'язує людський прогепсидин, який має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO:34, та щонайменше одну скорочену на N-кінці форму зрілого людського гепсидину, що визначають за допомогою SPR при температурі 25 °C. На додаток до цього або альтернативно селективне антитіло проти гепсидину-25 за цим винаходом зв'язується з людським гепсидином-25, але не зв'язується чи зв'язується на мінімальному рівні з людським прогепсидином (послідовність SEQ ID NO:34) та щонайменше одним скороченим на N-кінці різновидом зрілого гепсидину, що, як відомо, утворюється у організмі того самого виду ссавця, що визначають за допомогою імунологічного аналізу та/або мас-спектрометричних методів MALDI-TOF, які застосовуються досвідченими фахівцями у цій галузі, у тому числі (але без обмеження ним) за допомогою аналізу, опис якого наведений у представленому у цьому документі Прикладі 5. За варіантом, якому віддається найбільша перевага, селективне антитіло проти гепсидину-25 за цим винаходом і) зв'язує людський гепсидин-25 зі зв'язувальною спорідненістю KD, яка є у приблизно 1000 разів, 500 разів, 200 разів, 100 разів, 50 разів, 10 разів або у приблизно 5 разів нижчою за зв'язувальну спорідненість, з якою згадане антитіло зв'язує людський прогепсидин (послідовність SEQ ID NO:34), та іі) зв'язує людський гепсидин-25 зі зв'язувальною спорідненістю KD, яка є у приблизно 1000 разів, 500 разів, 200 разів, 100 разів, 50 разів, 10 разів або у приблизно 5 разів нижчою за зв'язувальну спорідненість, з якою згадане антитіло зв'язує людський гепсидин-20 (тобто амінокислоти 6-25 послідовності SEQ ID NO:1) та/або людський гепсидин-22 (амінокислоти 4-25 послідовності SEQ ID NO:1), що визначають за допомогою SPR при температурі 25 °C. На додаток до цього або альтернативно селективне антитіло проти гепсидину-25 за цим винаходом зв'язується з людським гепсидином-25, але не зв'язується чи зв'язується на мінімальному рівні з і) людським прогепсидином (послідовність SEQ ID NO:34) та іі) людським гепсидином-20 та/або людським гепсидином-22, що визначають за допомогою імунологічного аналізу та/або масспектрометричних методів MALDI-TOF, які застосовуються досвідченими фахівцями у цій галузі, у тому числі (але без обмеження ним) за допомогою аналізу, опис якого наведений у представленому у цьому документі Прикладі 5. Термін "виявляти" або "виявлення" вживається у найширшому значенні з охопленням кількісних, напівкількісних або якісних визначень цільової молекули. За одним з аспектів способи, опис яких наведений, можуть лише визначати присутність або відсутність конкретного гепсидинового поліпептиду у біологічному зразку, а отже те, що гепсидиновий поліпептид є виявним або за альтернативним варіантом невиявним у зразку, що визначають згаданим способом. Термін "антигенна детермінанта" стосується тієї частини молекули, яку може розпізнавати та зв'язувати антитіло на одному або декількох антигензв'язувальних ділянках антитіла. Термін "біологічна активність" стосовно антитіла за цим винаходом охоплює (але не обмежується ними) зв'язувальну спорідненість з антигенною детермінантою або антигеном, in vivo та/або in vitro стабільність антитіла, імуногенні властивості антитіла, наприклад, при введенні в організм людини, та/або здатність нейтралізувати або антагонізувати біологічну активність гепсидину, in vivo або in vitro, у тому числі (але без обмеження ним) пригнічення порушення регулювання рівня сироваткового заліза при запаленні, наприклад, у випадку провокаційної проби із введенням IL-6, наприклад, як описано у наведеному у цьому документі Прикладі 4. Вищезгадані властивості або характеристики можуть спостерігатись або 6 UA 98983 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 визначатись за допомогою визнаних у цій галузі методів, у тому числі (але без обмеження ними) аналізу сцинтиляційної близькості, ELISA (твердофазний імуноферментний аналіз), імунологічного аналізу ORIGEN (IGEN), гасіння флуоресценції, ELISA з флуоресцентним підсиленням, конкурентного ELISA, SPR аналізу, в тому числі (але без обмеження ним) SPR аналізу із застосуванням біосенсора ВІАсоrе, in vitro та in vivo аналізів нейтралізації без обмеження (дивись, наприклад, WO 2006/062685), зв'язування рецепторів та імуногістохімічних методів зі зрізами тканин із різних джерел, у тому числі від людини, приматів або з будь-якого іншого джерела, у залежності від потреби. Термін "біологічна активність" у відношенні до зрілого гепсидину, у тому числі гепсидину-25, охоплює (але не обмежується ним) специфічне зв'язування зрілого гепсидину з іншим білком, у тому числі (але без обмеження ним) з його рецептором феропортином, одну або декілька феропортин-опосередкованих функцій зрілого гепсидину, наприклад, індуковану зрілим гепсидином інтерналізацію та/або деградацію феропортину (дивись, наприклад, Nemeth Ε., et al., Hepcidin Regulates Iron Efflux by Binding to Ferroportin and Inducing Its Internalization, Science 306, 2090-2093, (2004)), регуляцію зрілим гепсидином опосередкованого феропортином відтоку заліза, рівня сироваткового заліза, кількості ретикулопитів, кількості еритроцитів, рівня гемоглобіну та/або гематокриту у людини, стабільності білка, тобто зрілий гепсидин впливає на рівень або активність іншого білка in vivo або in vitro та рівні експресії та/або тканинний розподіл гепсидину. Термін "пригнічувати" або "нейтралізувати", який вживається у цьому описі відносно біологічної активності антитіла за цим винаходом, означає здатність до суттєвого антагонізування, перешкоджання, запобігання, стримування, уповільнення, порушення, ліквідування, припинення, зменшення або обертання на протилежну біологічної активності зрілого людського гепсидину, у тому числі (але без обмеження нею) біологічної активності зрілого людського гепсидину, як визначають у наведених у цьому описі Прикладі 3 або Прикладі 4. Антитіла за цим винаходом відрізняються тим, що мають зв'язувальну спорідненість K D до людського гепсидину-25 менше ніж приблизно 1000 пМ, за варіантом, якому віддається перевага, менше ніж приблизно 800 пМ, за варіантом, якому віддається більша перевага, менше ніж приблизно 400 пМ, за варіантом, якому віддається ще більша перевага, менше ніж приблизно 200 пМ, за варіантом, якому віддається ще більша перевага, менше ніж приблизно 100 пМ, за варіантом, якому віддається ще більша перевага, менше ніж приблизно 75 пМ або за варіантом, якому віддається найбільша перевага, менше ніж приблизно 50 пМ, яку визначають за допомогою SPR при температурі 25 °C. За варіантом, якому віддається перевага, згадане антитіло селективно зв'язує людський гепсидин-25 зі зв'язувальною спорідненістю KD, меншою ніж приблизно 800 пМ, за варіантом, якому віддається перевага, меншою ніж приблизно 400 пМ, за варіантом, якому віддається більша перевага, меншою ніж приблизно 200 пМ, за варіантом, якому віддається ще більша перевага, меншою ніж приблизно 100 пМ, за варіантом, якому віддається ще більша перевага, меншою ніж приблизно 75 пМ або за варіантом, якому віддається найбільша перевага, меншою ніж приблизно 50 пМ, яку визначають за допомогою SPR при температурі 25 °C, і згадане антитіло селективно зв'язує щонайменше один гепсидин25 іншого виду, такий як гепсидин-25 макак-крабоїдів. За варіантом, якому віддається більша перевага, такі антитіла селективно зв'язують гепсидин-25 макак-крабоїдів зі зв'язувальною спорідненістю KD, меншою ніж приблизно 800 пМ, за варіантом, якому віддається ще більша перевага, меншою ніж приблизно 400 пМ, за варіантом, якому віддається ще більша перевага, меншою ніж приблизно 200 пМ, за варіантом, якому віддається ще більша перевага, меншою ніж приблизно 100 пМ, за варіантом, якому віддається ще більша перевага, меншою ніж приблизно 75 пМ або за варіантом, якому віддається найбільша перевага, меншою ніж приблизно 50 пМ, що визначають за допомогою SPR при температурі 25 °C. До антитіл за цим винаходом належать селективні антитіла проти гепсидину-25, які мають зв'язувальну спорідненість KD до людського гепсидину-25 від приблизно 800 пМ до приблизно 30 пМ, за варіантом, якому віддається перевага, від приблизно 400 пМ до приблизно 30 пМ, за варіантом, якому віддається більша перевага, від приблизно 200 пМ до приблизно 30 пМ, за варіантом, якому віддається ще більша перевага, від приблизно 100 пМ до приблизно 30 пМ, за варіантом, якому віддається ще більша перевага, від приблизно 75 пМ до приблизно 30 пМ або за варіантом, якому віддається найбільша перевага, від приблизно 50 пМ до приблизно 30 пМ, яку визначають за допомогою SPR при температурі 25 °C. За варіантом, якому віддається перевага, такі антитіла також мають зв'язувальну спорідненість KD до гепсидину-25 макаккрабоїдів від приблизно 800 пМ до приблизно 10 пМ, за варіантом, якому віддається більша перевага, від приблизно 400 пМ до приблизно 10 пМ, за варіантом, якому віддається ще більша 7 UA 98983 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 перевага, від приблизно 200 пМ до приблизно 10 пМ, за варіантом, якому віддається ще більша перевага, від приблизно 100 пМ до приблизно 10 пМ, за варіантом, якому віддається ще більша перевага, від приблизно 75 пМ до приблизно 10 пМ або за варіантом, якому віддається найбільша перевага, від приблизно 50 пМ до приблизно 10 пМ, яку визначають за допомогою SPR при температурі 25 °C. До антитіл за цим винаходом також належать антитіла, які мають зв'язувальну спорідненість KD до людського гепсидину-25 та/або гепсидину-25 макак-крабоїдів, яка є у щонайменше приблизно 20 разів, у щонайменше приблизно 30 разів, у щонайменше приблизно 40 разів, у щонайменше приблизно 50 разів, у щонайменше приблизно 60 разів, у щонайменше приблизно 70 разів, у щонайменше приблизно 80 разів, у щонайменше приблизно 90 разів, у щонайменше приблизно 100 разів або у щонайменше приблизно 200 разів меншою, ніж зв'язувальна спорідненість KD згаданого антитіла до мишачого гепсидину-25 та/або пацючого гепсидину-25, що визначають за допомогою SPR при температурі 25 °C. До антитіл за цим винаходом також належать антитіла, які мають швидкість дисоціації k off з -2 -1 -4 -1 людським гепсидином-25 від приблизно 1×10 с до приблизно 1,8×10 с , за варіантом, якому -3 -1 -4 -1 віддається перевага, від приблизно 8,5×10 с до приблизно 1,8×10 с , за варіантом, якому -4 -1 -4 -1 віддається більша перевага, від приблизно 7,7×10 с до приблизно 1,8×10 с , за варіантом, -4 -1 -4 -1 якому віддається ще більша перевага, від приблизно 6,5×10 с до приблизно 1,8×10 с або -4 -1 за варіантом, якому віддається найбільша перевага, від приблизно 5,5×10 с до приблизно -4 -1 2,0×10 с , яку визначають за допомогою SPR при температурі 25 °C. За варіантом, якому віддається перевага, таке антитіло також селективно зв'язує людський гепсидин-25 зі зв'язувальною спорідненістю KD від приблизно 800 пМ до приблизно 30 пМ, за варіантом, якому віддається ще більша перевага, від приблизно 400 пМ до приблизно 30 пМ, за варіантом, якому віддається ще більша перевага, від приблизно 200 пМ до приблизно 30 пМ, за варіантом, якому віддається ще більша перевага, від приблизно 100 пМ до приблизно 30 пМ, за варіантом, якому віддається ще більша перевага, від приблизно 75 пМ до приблизно 50 пМ, та за варіантом, якому віддається найбільша перевага, від приблизно 50 пМ до приблизно 30 пМ, яку визначають за допомогою SPR при температурі 25 °C. Цей винахід також охоплює антитіла, які зв'язують людський гепсидин-25, за варіантом, якому віддається перевага, селективно зв'язують, зі зв'язувальною спорідненістю K D, яка дорівнює приблизно 200 пМ або менше, та нейтралізують або антагонізують щонайменше одну біологічну активність зрілого людського гепсидину in vitro або in vivo. За варіантом, якому віддається перевага, антитіло за цим винаходом має значення ІС 50 менше ніж приблизно 200 пМ, за варіантом, якому віддається більша перевага, менше ніж приблизно 100 пМ, за варіантом, якому віддається ще більша перевага, менше ніж приблизно 75 нМ, та за варіантом, якому віддається найбільша перевага, менше ніж приблизно 50 нМ, у in vitro або in vivo аналізі біологічної активності зрілого гепсидину, як описано, наприклад, у наведеному у цьому описі Прикладі 3 або Прикладі 4. До антитіл за цим винаходом також належать антитіла, які зв'язують, за варіантом, якому віддається перевага, селективно зв'язують, людський гепсидин-25, які значно пригнічують індуковане IL-6 зниження рівня сироваткового заліза при проведенні аналізу на макакахкрабоїдах, як описано, наприклад, у наведеному у цьому описі Прикладі 4. За варіантом, якому віддається перевага, такі антитіла пригнічують зниження рівня сироваткового заліза у макакикрабоїда, індуковане людським IL-6 у дозі 5 мкг/кг, на щонайменше приблизно 30 %, на щонайменше приблизно 40 %, на щонайменше приблизно 50 %, на щонайменше приблизно 60 %, на щонайменше приблизно 70 %, на щонайменше приблизно 80 %, на щонайменше приблизно 90 % або на щонайменше приблизно 100 % періоду часу тривалістю приблизно 6 год. після внутрішньовенного введення антитіла у дозі приблизно 10 мг/кг. Антитіло за цим винаходом має значення ІС50 менше ніж приблизно 200 нМ, за варіантом, якому віддається перевага, менше ніж приблизно 100 нМ, за варіантом, якому віддається більша перевага, менше ніж приблизно 75 нМ, за варіантом, якому віддається ще більша перевага, менше ніж приблизно 50 нМ, або за варіантом, якому віддається найбільша перевага, менше ніж приблизно 25 нМ у аналізі індукованої зрілим гепсидином інтерналізації феропортину, опис якого наведений у представленому у цьому документі Прикладі 3. За варіантом, якому віддається перевага, антитіло за цим винаходом має значення ІС50 від приблизно 200 нМ до приблизно 25 нМ, за варіантом, якому віддається більша перевага, від приблизно 100 нМ до приблизно 50 нМ, за варіантом, якому віддається більша перевага, від приблизно 100 нМ до приблизно 25 нМ, за варіантом, якому віддається ще більша перевага, від приблизно 75 нМ до приблизно 25 нМ або за варіантом, якому віддається найбільша перевага, 8 UA 98983 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 від приблизно 75 нМ до приблизно 50 нМ, у аналізі індукованої зрілим гепсидином інтерналізації феропортину, опис якого наведений у представленому у цьому документі Прикладі 3. За іншим варіантом здійснення антитіло за цим винаходом має значення ІС 50 від приблизно 200 нМ до приблизно 25 нМ, за варіантом, якому віддається перевага, від приблизно 100 нМ до приблизно 50 нМ, за варіантом, якому віддається більша перевага, від приблизно 100 нМ до приблизно 25 нМ, за варіантом, якому віддається ще більша перевага, від приблизно 75 нМ до приблизно 25 нМ або за варіантом, якому віддається найбільша перевага, від приблизно 75 нМ до приблизно 50 нМ, у аналізі індукованої зрілим гепсидином інтерналізації феропортину, опис якого наведений у представленому у цьому документі Прикладі 3, причому швидкість дисоціації -2 -1 -4 -1 koff з людським гепсидином-25 становить від приблизно 1×10 с до приблизно 1,8×10 с , за -3 -1 -4 -1 варіантом, якому віддається перевага, від приблизно 8,5×10 с до приблизно 1,8×10 с , за -4 -1 -4 варіантом, якому віддається більша перевага, від приблизно 7,7×10 с до приблизно 1,8×10 -1 -4 -1 с , за варіантом, якому віддається ще більша перевага, від приблизно 6,5×10 с до приблизно -4 -1 -4 -1 1,8×10 с або за варіантом, якому віддається найбільша перевага, від приблизно 5,5×10 с -4 -1 до приблизно 2,0×10 с , яку визначають за допомогою SPR при температурі 25 °C, і згадане антитіло селективно зв'язує людський гепсидин-25 зі зв'язувальною спорідненістю KD від приблизно 800 пМ до приблизно 30 пМ, за варіантом, якому віддається перевага, від приблизно 400 пМ до приблизно 30 пМ, за варіантом, якому віддається більша перевага, від приблизно 200 пМ до приблизно 30 пМ, за варіантом, якому віддається ще більша перевага, від приблизно 100 пМ до приблизно 30 пМ, за варіантом, якому віддається ще більша перевага, від приблизно 75 пМ до приблизно 50 пМ, та за варіантом, якому віддається найбільша перевага, від приблизно 50 пМ до приблизно 30 пМ, яку визначають за допомогою SPR при температурі 25 °C. Термін "схема нумерації, яка розроблена Кабатом", вжитий у цьому описі, є визнаним у цій галузі і стосується системи нумерації амінокислотних залишків, які є більш варіабельними (тобто гіперваріабельними) порівняно з іншими амінокислотними залишками на ділянках важких і легких ланцюгів антитіла (Kabat, et al., Ann. NY Acad. Sci. 190:382-393 (1971); Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 (1991)). Полінуклеотид є "функціонально зв'язаним", коли він знаходиться у функціональному зв'язку з іншим полінуклеотидом. Наприклад, промотор або енхансер є функціонально зв'язаним із кодувальною послідовністю, якщо він впливає на транскрипцію згаданої послідовності. Терміни "суб'єкт" та "пацієнт", вжиті у цьому описі взаємозамінно, стосуються ссавця, за варіантом, якому віддається перевага, людини. За певними варіантами здійснення цього винаходу пацієнт має розлад, корисний вплив на який могло б справити зниження рівня гепсидину-25, зниження біологічної активності гепсидину-25 та/або підвищення рівня сироваткового заліза, кількості ретикулоцитів, кількості еритроцитів, рівня гемоглобіну та/або гематокриту. Термін "вектор" стосується молекули нуклеїнової кислоти, здатної до транспортування іншої нуклеїнової кислоти, з якою вона є функціонально зв'язаною, у тому числі (але без обмеження ними) плазмід та вірусних векторів. Певні вектори є здатними до автономної реплікації у клітиніхазяїні, до якої вони введені, у той час як інші вектори можуть бути інтегровані до геному клітини-хазяїна при введенні до клітини-хазяїна і, таким чином, розмножуються разом із геномом згаданого хазяїна. Більше того, певні вектори є здатними до спрямування експресії генів, з якими вони є функціонально зв'язаними. Такі вектори згадуються у цьому описі як "рекомбінантні експресійні вектори" (або просто "експресійні вектори"). Приклади векторів є добре відомими у цій галузі. Терміни "клітина" та "клітина-хазяїн", вжиті у цьому описі, вживаються взаємозамінно і стосуються будь-якої прокаріотної клітини (наприклад, бактеріальних клітин, таких як Е. соli) або за варіантом, якому віддається перевага, еукаріотних клітин (наприклад, дріжджових клітин, рослинних клітин, клітин комах або клітин ссавців, таких як клітини СНО (клітини яєчника китайського хом'ячка)), які знаходяться in vitro або in vivo. До клітин-хазяїв належать клітини трансформовані, трансдуковані, трансфіковані або інфіковані одним або декількома рекомбінантними експресійними векторами, які містять полінуклеотид, який кодує антитіло за цим винаходом. Клітина-хазяїн може знаходитись in vitro або in vivo. Наприклад, клітини-хазяї можуть знаходитись у трансгенній тварині або трансгенній рослині. Кожен важкий ланцюг непроцесованого антитіла містить N-кінцеву варіабельну ділянку важкого ланцюга (у цьому описі "HCVR") та С-кінцеву константну ділянку важкого ланцюга. Кожен легкий ланцюг непроцесованого антитіла містить N-кінцеву варіабельну ділянку легкого ланцюга (у цьому описі "LCVR") та С-кінцеву константну ділянку легкого ланцюга. HCVR та LCVR можуть додатково підрозділятись на гіперваріабельні ділянки, які називають ділянками, 9 UA 98983 C2 5 10 15 20 що обумовлюють комплементарність ("CDR"), які чергуються з більш консервативними ділянками, які називають каркасними ділянками ("FR"). На функціональну здатність антитіла до зв'язування конкретного антигену або антигенної детермінанти значний вплив чинять шість CDR, які знаходяться на варіабельній ділянці антитіла. Кожна HCVR та LCVR складається з трьох CDR (HCDR1, HCDR2 та HCDR3 у HCVR та LCDR1, LCDR2 і LCDR3 у LCVR) та чотирьох каркасних ділянок, які розміщуються у напрямку від амінокінця до карбоксильного кінця у такому порядку: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Відповідно, термін "CDR" або "гіперваріабельна ділянка", який вживають у цьому описі, означає несуміжні антигензв'язувальні центри, що знаходяться у межах варіабельної ділянки поліпептидів як важкого, так і легкого ланцюгів. Ці конкретні ділянки були описані у Kabat, et al., J. Biol. Chem. 252, 6609-6616 (1977), Kabat, et al., Sequences of protein of immunological interest (1991), Chothia, et al., J. Моl. Biol. 196:901-917 (1987) та MacCallum, et al., J. Моl. Biol., 262:732745 (1996), де визначення охоплють амінокислотні залишки, що перекриваються, або субпопуляції амінокислотних залишків, при взаємному порівнянні. У цьому описі віднесення амінокислот до кожного домену відповідає добре відомим домовленностям (наприклад, Kabat (1991) та/або Chothia (1987)). CDR містять більшість залишків, що забезпечують специфічні взаємодії з антигеном. У наведених нижче Таблиці 1 та Таблиці 2 представлені амінокислотні послідовності та консенсусні амінокислотні послідовності, що кодують CDR, яким віддається перевага, для антитіл за цим винаходом. Таблиця 1 10 UA 98983 C2 Таблиця 2 5 У наведеній нижче Таблиці 3 представлені амінокислотні послідовності та консенсусні амінокислотні послідовності, що кодують CDR, яким віддається більша перевага, для антитіл за цим винаходом. Таблиця 3 11 UA 98983 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Константні ділянки людського легкого ланцюга класифікуються як каппа або лямбда, і легкі ланцюги відрізняються конкретною константною ділянкою, як відомо у цій галузі. Константні ділянки людського важкого ланцюга класифікуються як гамма, мю, альфа, дельта або епсилон, і визначають ізотип антитіла як IgG, IgM, IgA, IgD та IgE, відповідно, і, крім того, декілька з них можуть бути поділені на підкласи, наприклад, IgG 1, IgG2, IgG3, IgG4. Важкий ланцюг кожного типу має конкретну константу ділянку з послідовністю, широко відомою у цій галузі. Константна ділянка типу каппа легкого ланцюга і константні ділянки IgG 1, IgG2 та IgG4 важкого ланцюга являють собою константні ділянки, яким віддається перевага, у антитілах за цим винаходом. Константними ділянками людського важкого ланцюга, яким віддається перевага, для антитіл за цим винаходом є константні ділянки важкого ланцюга, що мають амінокислотні послідовності, представлені послідовностями SEQ ID NO:90-94, та будь-які їх варіанти, що мають 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 або приблизно 15 амінокислотних змін (у тому числі замін, інсерцій або делецій). За варіантом, якому віддається більша перевага, константними ділянками людського важкого ланцюга антитіл за цим винаходом є константні ділянки важкого ланцюга, що мають амінокислотні послідовності, представлені послідовностями SEQ ID NO:93 та SEQ ID NO:94. За варіантом, якому віддається найбільша перевага, константною ділянкою людського важкого ланцюга антитіл за цим винаходом є константна ділянка важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO:93. Константними ділянками людського легкого ланцюга, яким віддається перевага, антитіл за цим винаходом є константна ділянка легкого ланцюга типу каппа, що має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO:89, та будь-який її варіант, що має 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або приблизно 10 амінокислотних змін (у тому числі замін, інсерцій або делецій). За варіантом, якому віддається найбільша перевага, константною ділянкою людського легкого ланцюга антитіл за цим винаходом є константна ділянка легкого ланцюга типу каппа, що має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO:89. Словосполучення "антигензв'язувальна ділянка" або "антигензв'язувальна частина", яке вживається у цьому описі, стосується тієї частини молекули антитіла у межах варіабельної ділянки, що містить амінокислотні залишки, які взаємодіють з антигеном і надають згаданому антитілу його специфічність та спорідненість до антигену. Ця частина антитіла охоплює каркасні амінокислотні залишки, необхідні для підтримання відповідної конформації антигензв'язувальних залишків. Цей винахід охоплює антитіло, яке селективно зв'язує гепсидин-25 зі зв'язувальноюспорідненістю KD на рівні приблизно 800 пМ або менше, яку визначають за допомогою SPR при температурі 25 °C, причому згадане антитіло містить щонайменше одну CDR, вибрану з групи, яку складають: і) HCDR3, що має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO:75, та іі) LCDR3, що має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO:62. За варіантом, якому віддається перевага, таке антитіло містить шість CDR, що містять амінокислотні та/або консенсусні амінокислотні послідовності, вибрані з групи, яку складають: (i)LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 та HCDR3, що мають амінокислотні послідовності, представлені послідовностями SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:71 та SEQ ID NO:75, відповідно; та (ii) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 та HCDR3, що мають амінокислотні послідовності, представлені послідовностями SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:87 та SEQ ID NO:46, відповідно. За варіантом, якому віддається більша перевага, антитіло за цим винаходом містить шість CDR, вибраних з групи, яку складають: (і) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 та HCDR3, що мають амінокислотні послідовності, представлені послідовностями SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:84 та SEQ ID NO:46, відповідно; (ii) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 та HCDR3, що мають амінокислотні послідовності, представлені послідовностями SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:44 та SEQ ID NO:46, відповідно; (iii) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 та HCDR3, що мають амінокислотні послідовності, представлені послідовностями SEQIDNO:43, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:85 та SEQ ID NO:46, відповідно; та (iv) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 та HCDR3, що мають амінокислотні послідовності, представлені послідовностями SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:84 та SEQ ID NO:46, відповідно. За варіантом, якому віддається ще більша перевага, антитіло за цим винаходом містить два поліпептиди важкого ланцюга та два 12 UA 98983 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 поліпептиди легкого ланцюга, причому кожен з поліпептидів важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO:9, і кожен з поліпептидів легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO:17. За варіантом, якому віддається ще більша перевага, згадане антитіло має значення ІС 50 від приблизно 100 нМ до приблизно 50 нМ у аналізі індукованої зрілим гепсидином інтерналізації феропортину, опис якого наведений у Прикладі 3, швидкість дисоціації k off з людським -4 -1 -4 -1 гепсидином-25 від приблизно 5,5×10 с до приблизно 2,0×10 с , яку визначають за допомогою SPR при температурі 25 °C, і згадане антитіло селективно зв'язує людський гепсидин-25 зі зв'язувальною спорідненістю KD від приблизно 100 пМ до приблизно 50 пМ. За варіантом, якому віддається найбільша перевага, антитіло за цим винаходом містить два поліпептиди важкого ланцюга та два поліпептиди легкого ланцюга, причому кожен із поліпептидів важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO:8, і кожен із поліпептидів легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO:16, де згадане антитіло має значення ІС 50 від приблизно 100 нМ до приблизно 50 нМ у аналізі індукованої зрілим гепсидином інтерналізації феропортину, опис якого наведений у Прикладі 3, швидкість дисоціації k off людським -4 -1 -4 -1 гепсидином-25 від приблизно 5,5×10 с до приблизно 2,0×10 с , яку визначають за допомогою SPR при температурі 25 °C, і згадане антитіло селективно зв'язує людський гепсидин-25 зі зв'язувальною спорідненістю KD від приблизно 100 пМ до приблизно 50 пМ. Інші антитіла за цим винаходом, яким віддається перевага, містять LCVR, що має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яку складають послідовності SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:125, SEQ ID NO:126 та SEQ ID NO:127. За варіантом, якому віддається більша перевага, антитіло за цим винаходом містить HCVR, що має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яку складають послідовності SEQ ID NO:148, SEQ ID NO:128, SEQ ID NO:150 та SEQ ID NO:151. За варіантом, якому віддається ще більша перевага, антитіло за цим винаходом містить LCVR, що має послідовність SEQ ID NO:126, та HCVR, що має послідовність SEQ ID NO:148. За варіантом, якому віддається ще більша перевага, антитіло за цим винаходом містить LCVR, що має послідовність SEQ ID NO:127, та HCVR, що має послідовність SEQ ID NO:128. За варіантом, якому віддається ще більша перевага, антитіло за цим винаходом містить LCVR, що має послідовність SEQ ID NO:125, та HCVR, що має послідовність SEQ ID NO:151. Антитіло за цим винаходом, якому віддається найбільша перевага, містить LCVR, що має послідовність SEQ ID NO:124, та HCVR, що має послідовність SEQ ID NO:150. Такі LCVR, за варіантом, якому віддається перевага, є зв'язаними з константною ділянкою легкого ланцюга людського походження або такою, що одержана з константної ділянки легкого ланцюга людського походження, за варіантом, якому віддається перевага, людського ланцюга типу каппа, а за варіантом, якому віддається найбільша перевага, ланцюга типу каппа, що має послідовність SEQ ID NO:89. Такі HCVR за варіантом, якому віддається перевага, є зв'язаними з константною ділянкою важкого ланцюга людського походження або такою, що одержана з константної ділянки важкого ланцюга людського походження, за варіантом, якому віддається перевага, IgG1 IgG2 або IgG4, за варіантом, якому віддається більша перевага, константної ділянки важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яку складають послідовності SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93 та SEQ ID NO:94, а за варіантом, якому віддається найбільша перевага, константної ділянки важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність SEQ ID NO:93. За варіантом, якому віддається перевага, згадане антитіло має значення ІС50 від приблизно 100 нМ до приблизно 50 нМ у аналізі індукованої зрілим гепсидином інтерналізації феропортину, опис якого наведений у -4 -1 Прикладі 3, швидкість дисоціації koff з людським гепсидином-25 від приблизно 5,5×10 с до -4 -1 приблизно 2,0×10 с , яку визначають за допомогою SPR при температурі 25 °C, і згадане антитіло селективно зв'язує людський гепсидин-25 зі зв'язувальною спорідненістю KD від приблизно 100 пМ до приблизно 50 пМ. Антитіло за цим винаходом може містити поліпептид важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO:6, та поліпептид легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO:14. Поліпептид важкого ланцюга, що має амінокислоту послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO:6, може кодуватись полінуклеотидною послідовністю SEQ ID NO:2. Поліпептид легкого ланцюга, що має амінокислоту послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO:14, може кодуватись полінуклеотидом, що має нуклеїновокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO:10. Антитіло за цим винаходом містить поліпептид важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO:7, та поліпептид легкого ланцюга, що 13 UA 98983 C2 5 10 15 20 25 має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO:15. Поліпептид важкого ланцюга, що має амінокислоту послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO:7, може кодуватись полінуклеотидною послідовністю SEQ ID NO:3. Поліпептид легкого ланцюга, що має амінокислоту послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO:15, може кодуватись полінуклеотидом, що має нуклеїновокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO:11. Антитіло за цим винаходом також містить поліпептид важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO:8, та поліпептид легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO:16. Поліпептид важкого ланцюга, що має амінокислоту послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO:8, може кодуватись полінуклеотидною послідовністю SEQ ID NO:4. Поліпептид легкого ланцюга, що має амінокислоту послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO:16, може кодуватись полінуклеотидом, що має нуклеїновокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO:12. За іншим варіантом здійснення антитіло за цим винаходом містить поліпептид важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO:9, та поліпептид легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO:17. Поліпептид важкого ланцюга, що має амінокислоту послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO:9, може кодуватись полінуклеотидною послідовністю SEQ ID NO:5. Поліпептид легкого ланцюга, що має амінокислоту послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO:17, може кодуватись полінуклеотидом, що має нуклеїновокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ-ID NО:13. Людські генноінженерні антитіла за цим винаходом, яким віддається перевага, позначаються у цьому описі як моноклональні антитіла (Mab) L1.5, Нu22, 3.12 та 3.23. Амінокислотні послідовності, що кодують важкі ланцюги, легкі ланцюги, варіабельні ділянки важких і легких ланцюгів та CDR моноклональних антитіл L1.5, Нu22, 3.12 та 3.23, представлені у наведеній нижче Таблиці 4. Таблиця 4 30 35 40 45 50 Для одержання рекомбінантного експресійного вектора, трансфікування клітин-хазяїв, відбирання трансформантів, відбирання ізольованих ліній клітин-хазяїв, що продукують антитіло за цим винаходом, культивування цих клітин-хазяїв та виділення антитіла з культурального середовища застосовують стандартні методи молекулярної біології. Цей винахід також стосується клітин-хазяїв, що експресують антитіло проти гепсидину за цим винаходом. Найрізноманітніші експресійні системи-хазяї, відомі у цій галузі, можуть бути застосовані для експресії антитіла за цим винаходом, у тому числі прокаріотні (бактеріальні) та еукаріотні експресійні системи (наприклад, дріжджові клітини, бакуловіруси, рослинні клітини, клітини ссавців та клітини інших тварин, трансгенні тварини та клітини гібридом), а також експресійні системи, одержані з використанням технології фагового дисплея. Антитіло за цим винаходом можна одержати шляхом рекомбінантної експресії генів легкого і важкого імуноглобулінових ланцюгів у клітині-хазяїні. Для рекомбінатної експресії антитіла клітину-хазяїна трансформують, трансдукують, інфікують тощо за допомогою одного або декількох рекомбінантних експресійних векторів, що несуть фрагменти ДНК, які кодують легкі та/або важкі імуноглобулінові ланцюги антитіла так, що згадані легкі та/або важкі ланцюги експресуються у клітині-хазяїні. Важкий ланцюг і легкий ланцюг можуть експресуватись незалежно з різних промоторів, з якими вони є функціонально зв'язаними у одному векторі, або альтернативно важкий ланцюг і легкий ланцюг можуть експресуватись незалежно з різних промоторів, з якими вони є функціонально зв'язаними у двох векторах, - один експресує важкий ланцюг, а інший експресує легкий ланцюг. За факультативним варіантом важкий ланцюг і легкий ланцюг можуть експресуватись у різних клітинах-хазяях. Крім того, рекомбінантний експресійний вектор може кодувати сигнальний пептид, що полегшує секрецію легкого та/або важкого ланцюга антитіла з клітини-хазяїна. Ген легкого 14 UA 98983 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 та/або важкого ланцюга антитіла може бути клонований у вектор так, що сигнальний пептид виявляється функціонально зв'язаним у межах рамки зчитування з амінокінцем гена ланцюга антитіла. Згаданий сигнальний пептид може бути імуноглобуліновим сигнальним пептидом або гетерологічним сигнальним пептидом. За варіантом, якому віддається перевага, рекомбінантні антитіла секретуються у середовище, у якому культивують клітини-хазяї, з якого згадані антитіла можуть бути виділені або від якого можуть бути очищені. Ізольована ДНК, що кодує HCVR, може бути перетворена на ген непроцесованого важкого ланцюга шляхом функціонального зв'язування ДНК, що кодує HCVR, з молекулою іншої ДНК, що кодує константні ділянки важкого ланцюга. Послідовності генів константних ділянок важкого ланцюга, як людини так і інших ссавців, є добре відомими у цій галузі. Фрагменти ДНК, які охоплюють ці ділянки, можна одержати, наприклад, шляхом стандартної ПЛР-ампліфікації. Згадана константна ділянка важкого ланцюга може бути константною ділянкою будь-якого типу (наприклад, IgG, IgA, IgE, IgM або IgD), класу (наприклад, IgG 1, IgG2, IgG3 та IgG4 або підкласу та будь-яким її алотиповим варіантом, як описано у роботі Kabat (supra). Ізольована ДНК, що кодує LCVR, може бути перетворена на ген непроцесованого легкого ланцюга (а також на ген легкого ланцюга Fab-фрагмента) шляхом функціонального зв'язування ДНК, що кодує LCVR, з молекулою іншої ДНК, що кодує константну ділянку легкого ланцюга. Послідовності генів константних ділянок легкого ланцюга, як людини так і інших ссавців, є добре відомими у цій галузі. Фрагменти ДНК, які охоплюють ці ділянки, можна одержати шляхом стандартної ПЛР-ампліфікації. Константною ділянкою легкого ланцюга може бути константна ділянка типу каппа або лямбда. Крім гена(-ів) важкого та/або легкого ланцюгів антитіла, рекомбінантний експресійний вектор за цим винаходом несе регуляторні послідовності, що контролюють експресію гена(-ів) ланцюгів антитіла у клітині-хазяїні. Термін "регуляторна послідовність" залежно від контексту охоплює промотори, енхансери та інші контрольні елементи експресії (наприклад, сигнали поліаденілування), які контролюють транскрипцію або трансляцію гена(-ів) ланцюгів антитіла. Конструювання експресійного вектора, у тому числі вибір регуляторних послідовностей, може залежати від таких факторів як вибір клітини-хазяїна, призначеної для трансформування, та рівень експресії необхідного білка. До регуляторних послідовностей, яким віддається перевага, призначених для експресії клітин-хазяїв ссавців, належать вірусні елементи, які спрямовують високі рівні експресії білка у клітинах ссавців, такі як промотори та/або енхансери, похідні від цитомегаловірусу (CMV), вакуолізуючого мавпячого вірусу 40 (SV40), аденовірусу (наприклад, головний пізній промотор аденовірусу (AdMLP)) та/або вірусу поліоми. Крім того, рекомбінантні експресійні вектори за цим винаходом можуть нести додаткові послідовності, такі як послідовності, що регулюють реплікацію вектора у клітинах-хазяях (наприклад, точка ініціювання реплікації), та один або декілька селектовних маркерних генів. Селектовний маркерний ген полегшує вибір клітин-хазяїв, у які був введений вектор. Наприклад, як правило, селектовний маркерний ген надає стійкість до лікарських засобів, таких як G418, гігроміцин або метотрексат, клітині-хазяїну, у яку був введений вектор. До селектовних маркерних генів, яким віддається перевага, належать ген дигідрофолатредуктази (dhfr) (для застосування у клітинах-хазяях, у яких відсутня дигідрофолатредуктаза, з селекцією/ампліфікацією із застосуванням метотрексату), ген neo (для селекції із застосуванням G418) та глутамінсинтетаза (GS) у GS-негативній клітинній лінії (такій як NS0) для селекції/ампліфікації. Для експресії легкого та/або важкого ланцюгів експресійний(-і) вектор(-и), що кодує(-ють) важкий та/або легкий ланцюги, вводять у клітину-хазяїна за допомогою стандартних методів, наприклад, шляхом електропорації, осадження фосфатом кальцію, DEAE-декстранопосередкованої трансфекції, трансдукції, інфікування тощо. Незважаючи на теоретичну можливість експресії антитіл за цим винаходом у прокаріотних або еукаріотних клітинах-хазяях, перевага віддається еукаріотним клітинам і найбільша перевага віддається клітинам-хазяям ссавців, оскільки такі клітини з більшим ступенем ймовірності збираються і секрутують відповідним чином укладене та імунологічно активне антитіло. До одержаних від ссавців клітинхазяїв, яким віддається перевага, для експресії рекомбінантних антитіл за цим винаходом належать клітини яєчника китайського хом'ячка (клітини СНО) [у тому числі клітини СНО, у яких відсутня дигідрофолатредуктаза, як описано у Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, 1980, які застосовують з селектовним DHFR-маркером, наприклад, як описано у Kaufman and Sharp, J. Моl. Biol. 159:601-621, 1982], клітини мієломи NS0, клітини COS (клітини яєчника мавпи) та клітини SP2/0. Якщо рекомбінантні експресійні вектори, що кодують гени антитіла, вводять у клітину-хазяїна ссавців, антитіла продукують шляхом культивування клітинхазяїв впродовж періоду часу достатньої тривалості для уможливлення експресії антитіла у 15 UA 98983 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 клітинах-хазяях, або за варіантом, якому віддається більша перевага, секреції антитіла у культуральне середовище, у якому клітини-хазяї вирощуються у відповідних умовах, відомих у цій галузі. Антитіла можуть бути виділені з клітини-хазяїна та/або культурального середовища за допомогою стандартних способів очищення. Клітини-хазяї можуть також бути застосовані для продукування частин, або фрагментів, інтактних антитіл, наприклад, Fab-фрагментів або молекул scFv-фрагментів, за допомогою способів, що є традиційними для цієї галузі. Наприклад, бажаним може бути трансфікування клітини-хазяїна ДНК, що кодує або легкий ланцюг, або важний ланцюг антитіла за цим винаходом. Метод рекомбінантних ДНК також може бути застосований для видалення певної частини або усієї ДНК, що кодує легкий і важкий ланцюги або будь-який з них, які не є необхідними для зв'язування з людським гепсидином-25. Термін "антитіла" за цим винаходом охоплює також молекули, експресовані з таких скорочених молекул ДНК. Цей винахід пропонує клітину-хазяїна, що містить нуклеїновокислотну молекулу за цим винаходом. За варіантом, якому віддається перевага, клітина-хазяїн за цим винаходом містить один або декілька векторів або генно-інженерних конструкцій, що містять нуклеїновокислотну молекулу за цим винаходом. Наприклад, клітина-хазяїн за цим винаходом являє собою клітину, у яку був введений вектор за цим винаходом, причому згаданий вектор містить полінуклеотид, що кодує LCVR антитіла за цим винаходом, та/або полінуклеотид, що кодує HCVR за цим винаходом. Цей винахід пропонує також клітину-хазяїна, у яку були введені два вектори за цим винаходом; один містить полінуклеотид, що кодує LCVR антитіла за цим винаходом, а інший містить полінуклеотид, що кодує HCVR, присутній у антитілі за цим винаходом, кожний з яких є функціонально зв'язаним з енхансерними/промоторними регуляторними елементами (наприклад, одержаними з SV40, CMV, аденовірусу тощо, такими як CMV енхансерний/AdMLP промоторний регуляторний елемент або SV40 енхансерний/AdMLP промоторний регуляторний елемент) для стимулювання високих рівнів транскрипції генів. Після завершення експресії інтактні антитіла, окремі легкі та важкі ланцюги або інші форми імуноглобулінів за цим винаходом можуть бути очищені за допомогою стандартних способів цієї галузі, у тому числі за допомогою фракціонування сульфатом амонію, іономобмінної афінної (наприклад, білок А) хроматографії з оберненою фазою, хроматографії на колонці з гідрофобною взаємодією, хроматографії на гідроксилапатитній адсорбційній колонці, гельелектрофорезу тощо. Опис стандартних способів очищення терапевтичних антитіл наведений, наприклад, у статті Feng Li, Joe X. Zhou, Xiaoming Yang, Tim Tressel and Brian Lee "Current Therapeutic Antibody Production and Process Optimization" (BioProcessing Journal, Sept./Oct. 2005). Крім того, у цій галузі відомі також стандартні способи видалення вірусів із препаратів рекомбінантно експресованих антитіл (дивись, наприклад, Gerd Kern and Mani Krishnan, "Viral Removal by Filtration: Points to Consider" (Biopharm International, Oct. 2006)). Відомо, що ефективність фільтрування для видалення вірусів із препаратів терапевтичних антитіл принаймні частково залежить від концентрації білка та/або антитіла у розчині, призначеному для фільтрування. Спосіб очищення антитіл за цим винаходом може включати стадію фільтрування для видалення вірусів з основного потоку однієї або декількох хроматографічних операцій. За варіантом, якому віддається перевага, перед фільтруванням за допомогою фармацевтичного нанофільтра для видалення вірусів, основний хроматографічний потік, що містить антитіло за цим винаходом, розбавляють або концентрують для одержання загальної концентрації білка та/або загальної концентрації антитіла на рівні від приблизно 1 г/л до приблизно 3 г/л. За варіантом, якому віддається ще більша перевага, згаданим нанофільтром є нанофільтр DV20 (наприклад, Pall Corporation; East Hills, штат Нью-Йорк). Для фармацевтичного застосування перевага віддається по суті чистим імуноглобулінам з однорідністю на рівні щонайменше приблизно 90 %, приблизно 92 %, приблизно 94 % або приблизно 96 %, і найбільша перевага віддається імуноглобулінам з однорідністю на рівні від приблизно 98 % до приблизно 99 % або більше. Після завершення очищення, часткового або до рівня бажаної однорідності, стерильні антитіла можуть бути застосовані з терапевтичними цілями, як вказано у цьому описі. Приймаючи до уваги вищенаведене обговорення, цей винахід також стосується антитіла, яке можна одержати способом, який включає стадію культивування клітин-хазяїв, у тому числі (але без обмеження ними) клітин ссавців, рослинних клітин, бактеріальних клітин, клітин трансгенних тварин або клітин трансгенних рослин, які були трансформовані полінуклеотидом або вектором, який містить молекули нуклеїнової кислоти, які кодують антитіла за цим винаходом, завдяки чому нуклеїнова кислота експресується, і факультативну стадію виділення антитіла з культурального середовища клітин-хазяїв. За варіантом, якому віддається перевага, клітина-хазяїн містить вектор, який містить молекулу нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид 16 UA 98983 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, яка представлена послідовностями SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 або SEQ ID NO:17. За варіантом, якому віддається більша перевага, клітина-хазяїн містить вектор, який містить молекулу нуклеїнової кислоти, що представлена послідовністями SEQ ID NO:12 або SEQ ID NO:13. За варіантом, якому віддається ще більша перевага, трансформованою клітиною-хазяїном є клітина яєчника китайського хом'ячка, клітина мієломи NS0, клітина COS або клітина SP2/0. Крім того, цей винахід стосується способу продукування антитіла за цим винаходом, який включає стадію трансформування клітини-хазяїна, у тому числі (але без обмеження ними) клітини ссавця, рослинної клітини, бактеріальної клітини, клітини трансгенної тварини або клітини трансгенної рослини полінуклеотидом або вектором, який містить молекулу нуклеїнової кислоти, яка кодує антитіло за цим винаходом, завдяки чому нуклеїнова кислота експресується, і стадію виділення антитіла з культурального середовища клітини-хазяїна. За варіантом, якому віддається перевага, клітину-хазяїна трансформують вектором, який містить молекулу нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептид легкого ланцюга, який має амінокислотну послідовність, яка представлена послідовностями SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 або SEQ ID NO:17. За варіантом, якому віддається більша перевага, клітина-хазяїн трансформується вектором, який містить молекулу нуклеїнової кислоти, яка представлена послідовністю SEQ ID NO:12 або SEQ ID NO:13. За варіантом, якому віддається ще більша перевага, клітиною-хазяїном є клітина яєчника китайського хом'ячка, клітина мієломи NS0, клітина COS або клітина SP2/0. Термін "ізольований полінуклеотид", вжитий у цьому описі, означає полінуклеотид геномного, кДНК або синтетичного походження чи певної комбінації цих варіантів, де унаслідок свого походження, згаданий ізольований полінуклеотид (1) не є зв'язаним з усім або частиною полінуклеотиду, у якому ізольований полінуклеотид знаходиться у природі, (2) є зв'язаним із полінуклеотидом, з яким він не є зв'язаним у природі, або (3) не зустрічається у природі, як частина більшої послідовності. Термін "ізольований білок", що згадується у цьому описі, означає, що згаданий білок (1) є вільним від принаймні деяких інших білків, з якими його можна було б знайти за нормальних обставин, (2) є по суті вільним від інших білків із того самого джерела, наприклад, із того самого виду, (3) експресується клітиною іншого виду, (4) був відокремлений від щонайменше приблизно 50 % полінуклеотидів, ліпідів, вуглеводів або інших матеріалів, з якими він є зв'язаним у природі, (5) не є зв'язаним (ковалентною або нековалентною взаємодією) із частинами білка, з яким "ізольований білок" є зв'язаним у природі, (6) є функціонально зв'язаним (ковалентною або нековалентною взаємодією) з поліпептидом, з яким він не є зв'язаним у природі, або (7) не зустрічається у природі. Такий ізольований білок може кодуватись геномною ДНК, кДНК, мРНК або іншою РНК синтетичного походження або будьякою їхньою комбінацією. За варіантом, якому віддається перевага, ізольований білок є по суті очищеним від білків або поліпептидів чи інших забруднювачів, які знаходяться у його природному середовищі, які могли б перешкоджати його застосуванню (терапевтичному, діагностичному, профілактичному, науково-дослідницькому тощо). "Ізольованим" антитілом є антитіло, яке було ідентифіковане та відділене від та/або виділене з певного компонента його природного середовища. Забруднювальними компонентами його природного середовища є матеріали, які б могли перешкоджати діагностичному або терапевтичному застосуванню згаданого антитіла, і до яких можуть належати ферменти, гормони та інші білкові або небілкові розчинені речовини. У варіантах здійснення, яким віддається перевага, антитіло буде очищене (1) до рівня, вищого ніж 95 % (мас.) антитіла, що визначають за методом Лоурі, а за варіантом, якому віддається найбільша перевага, вищого за 99 % (мас), (2) до рівня, достатнього для одержання щонайменше 15 залишків N-кінцевої або внутрішньої амінокислотної послідовності, за допомогою секвенатора з обертовим циліндром, або (3) до однорідності за допомогою SDS-PAGE (електрофорез у поліакриламідному гелі у присутності додецилсульфату натрію) за відновних або невідновних умов із застосуванням забарвлення кумасі синім або, за варіантом, якому віддається перевага, сріблом. Термін "ізольоване антитіло" охоплює антитіла, які знаходяться в рекомбінантних клітинах, оскільки щонайменше один із компонентів природного середовища антитіл буде відсутнім. Словосполучення "по суті чистий" або "по суті очищений", які вживають у цьому описі, означають сполуку або різновид молекули, який являє собою переважний присутній різновид молекули (тобто на мольній основі, це більш численний, ніж будь-який інший окремий присутній у композиції різновид молекули). У певних варіантах здійснення цього винаходу по суті очищеною композицією є композиція, де згаданий різновид молекули становить щонайменше 17 UA 98983 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 приблизно 50 % (на мольній основі) усіх присутніх макромолекулярних різновидів молекул. У певних варіантах здійснення по суті чиста композиція буде містити більше ніж приблизно 80 %, 85 %, 90 %, 95 % або 99 % усіх макромолекулярних різновидів молекул, присутніх у композиції. У певних варіантах здійснення згаданий різновид молекули очищають до суттєвого ступіня однорідності (забруднювальні різновиди молекул не можуть бути виявлені у згаданій композиції традиційними способами виявлення), де згадана композиція складається суттєвою мірою з одного макромолекулярного різновиду молекул. Крім того, цей винахід пропонує ізольований полінуклеотид, що кодує амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яку складають послідовності SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:125, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:127, SEQ ID NO:128, SEQ ID NO:148, SEQ ID NO:150 та SEQ ID NO:151. У інших варіантах здійснення цей винахід пропонує рекомбінантний експресійний вектор, який містить полінуклеотид, що кодує амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яку складають послідовності SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:125, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:127, SEQ ID NO:128, SEQ ID NO:148, SEQ ID NO:150 та SEQ ID NO:151. Словосполучення "людські генноінженерні антитіла", яке вживається у цьому описі, означає антитіло, де щонайменше одна частина має людське походження. Крім того, у значенні, вжитому у цьому описі, словосполучення "людські генноінженерні антитіла" означає специфічні антитіла, описані у цьому документі, а також додаткові антитіла, які мають подібні функціональні властивості за цим винаходом, що й антитіла, описані у цьому документі, і мають каркасні ділянки, які є по суті людськими або повністю людськими, що оточують CDR, які походять із нелюдського антитіла. По суті людськими каркасами є каркаси, що мають щонайменше 80 % ідентичність послідовності з відомою людською зародковою каркасною послідовністю. За варіантом, якому віддається перевага, по суті людські каркаси мають щонайменше приблизно 85 %, приблизно 90 %, приблизно 95 % або приблизно 99 % ідентичність послідовності з відомою людською зародковою каркасною послідовністю. За варіантом, якому віддається найбільша перевага, людські генноінженерні антитіла за цим винаходом містять мінімальну послідовність, яка походить з нелюдського антитіла. Наприклад, людське генноінженерне антитіло може містити частини, що походять з антитіла нелюдського походження, такого як мишаче, і частини, що походять з антитіла людського походження, з'єднані одне з одним, наприклад, хімічним шляхом, за допомогою традиційних способів (наприклад, синтетичним) або одержані у вигляді суміжного поліпептиду за допомогою методів генної інженерії. Термін "каркас", який вживається у цьому описі, при застосуванні по відношенню до варіабельної ділянки антитіла, означає усі амінокислотні залишки за межами CDR у межах варіабельної ділянки антитіла. Термін "каркасна ділянка", який вживається у цьому описі, означає кожний домен каркаса, який відокремлюється гіперваріабельними ділянками (CDR). Каркасні ділянки легкого ланцюга подібним чином відокремлені кожною з CDR варіабельної ділянки легкого ланцюга. За варіантом, якому віддається перевага, варіабельна ділянка легкого ланцюга та/або варіабельна ділянка важкого ланцюга містить каркас або принаймні частину каркасної ділянки (наприклад, містить 2 підділянки або 3 підділянки, такі як FR2 та FR3). За варіантом, якому віддається більша перевага, принаймні FRL1, FRL2, FRL3 або FRL4 є повністю людськими або принаймні FRH1, FRH2, FRH3 або FRH4 є повністю людськими. За варіантом, якому віддається ще більша перевага, принаймні FRL1, FRL2, FRL3 або FRL4 являє собою зародкову послідовність (наприклад, людську зародкову послідовність) або містить людські консенсусні послідовності для конкретного каркаса, відомі у цій галузі, та/або принаймні FRH1, FRH2, FRH3 або FRH4 являє собою зародкову послідовність (наприклад, людську зародкову послідовність) або містить людські консенсусні послідовності для конкретного каркаса. У варіантах здійснення, яким віддається перевага, антитіло за цим винаходом містить людські зародкові каркасні послідовності легкого ланцюга та людські зародкові каркасні послідовності важкого ланцюга (дивись, наприклад, WO 2005/005604). За варіантом, якому віддається більша перевага, людські зародкові каркаси легкого ланцюга вибрані з групи, яку складають: A11, А17, А18, А19, А20, А27, А30, L1, L11, L12, L2, L5, L6, L8, O12, О18, О2 та O8. За варіантом, якому віддається ще більша перевага, людським зародковим каркасом легкого ланцюга є O2 або O18. За варіантом, якому віддається найбільша перевага, людським, зародковим каркасом легкого ланцюга є O2. Крім того, людські зародкові каркаси важкого ланцюга, яким віддається перевага, вибрані з групи, яку складають: VH2-5, VH2-26, VH2-70, VH3-20, VH3-72, VH1-24, VH1-46, VH3-9, VH3-66, VH3-74, VH4-31, VH1-18, VH1-69, VH3-7, VH311, VH3-15, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-48, VH4-39, VH4-59, VH5-51, VH3-73, VH1-58, VH1-3 та VH1-2. За варіантом, якому віддається ще більша перевага, людським зародковим каркасом 18 UA 98983 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 важкого ланцюга є VH1-69 або VH1-18. За варіантом, якому віддається найбільша перевага, людським зародковим каркасом важкого ланцюга є VH1-69. Людські генноінженерні антитіла, крім антитіл, які розкриті у цьому описі, що селективно зв'язують людський гепсидин-25, із функціональними властивостями за цим винаходом, можна одержати за допомогою декількох різних методик. Специфічні антитіла, розкриті у цьому описі, можуть бути застосовані як матриця або вихідне антитіло для одержання додаткових антитіл. За однією з методик гіперваріабельні ділянки (CDR) вихідного антитіла пересаджують в людський каркас, який має високий ступінь ідентичності послідовності з каркасом вихідного антитіла. Ідентичність послідовності нового каркаса буде взагалі досягати рівня щонайменше 80 %, щонайменше 85 % або щонайменше 90 % з відповідним каркасом вихідного антитіла. Результатом цього пересадження може бути зниження зв'язувальної спорідненості, порівняно з вихідним антитілом. У подібному випадку згаданий каркас може бути підданим зворотній мутації до вихідного каркаса у певних положеннях, виходячи з конкретних критеріїв, опублікованих Queen та іншими. Ідентифікація залишків для прийняття рішення щодо проведення зворотної мутації може бути здійснена таким чином: якщо амінокислота підпадає під наведену нижче категорію, каркасну амінокислоту людської зародкової послідовності, що застосовується, (каркас-акцептор) замінюють на каркасну амінокислоту з каркаса вихідного антитіла (каркасдонор): (a) амінокислота у людському каркасі каркаса-акцептора є незвичайною для людських каркасів у цьому положенні, у той час як відповідна амінокислота у донорному імуноглобуліні є типовою для людських каркасів у цьому положенні; (b) положення амінокислоти є безпосередньо прилеглим до однієї з CDR; або (c) будь-який атом бічного ланцюга каркасної амінокислоти знаходиться на відстані приблизно 5-6 ангстремів (міжцентрова відстань) від будь-якого атому амінокислоти CDR у тривимірній моделі імуноглобуліну [Queen, et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 88, 2869 (1991)]. Якщо кожна з амінокислот у людському каркасі каркаса-акцептора та відповідна амінокислота у каркасі-донорі є загалом незвичайною для людських каркасів у цьому положенні, така амінокислота може бути замінена на амінокислоту, типову для людського каркаса у цьому положенні. Цей критерій зворотної мутації надає можливість відновлення активності вихідного антитіла. Іншою методикою була б довільна мутація пересаджених CDR без зміни каркаса і відбір таких антитіл за зв'язувальною спорідненістю, які є такими самими або кращими за вихідне антитіло. Крім того, можливими є комбінації обох цих методик. Після пересадження специфічні каркасні ділянки можуть бути піддані зворотній мутації на додаток до здійснення змін у CDR. Ця загальна методика описана у статті Wu, et al., (1999), "Humanization of a murine monoclonal antibody by simultaneous optimization of framework and CDR residues", J. Моl. Biol., 294:151-162. Термін "донор", який вживається у цьому описі, означає молекулу вихідного антитіла або його фрагмент, виділену з яких частину передають або додають до молекули іншого антитіла або його фрагмента для того, щоб перенести структурні або функціональні характеристики вихідної молекули на молекулу-одержувача. У конкретному прикладі пересадження CDR вихідна молекула, з якої одержують пересаджувані CDR, є молекулою-донором. Донорні CDR переносять зв'язувальну спорідненість вихідної молекули на молекулу-одержувача. Слід розуміти, що молекула-донор не повинна походити від виду, що відрізняється від виду молекули-одержувача або її фрагмента. Замість цього, достатньою умовою є те, що донор являє собою окрему та відмінну молекулу. Термін "акцептор", який вживається у цьому описі, означає молекулу антитіла або його фрагмент, призначені для приймання частини, наданої від вихідної молекули-донора або її фрагмента. Молекулі антитіла-акцептора або її фрагментові таким чином надаються структурні або функціональні характеристики наданої частини вихідної молекули. У конкретному прикладі пересадження CDR молекула-одержувач, на яку переносяться CDR, є молекулою-акцептором. Акцепторна молекула антитіла або її фрагмент наділяється зв'язувальною спорідненістю донорних CDR або вихідної молекули. Як і у випадку з молекулою-донором, зрозуміло, що молекула-акцептор не повинна походити від виду, що відрізняється від виду донора. Словосполучення "варіабельна ділянка" при застосуванні по відношенню до антитіла або його важкого чи легкого ланцюга означає амінокінцеву частину антитіла, яка надає молекулі властивості зв'язування антигену і яка не є константною ділянкою. Згаданий термін охоплює її функціональні фрагменти, які зберігають певну частину зв'язувальної функції усієї варіабельної ділянки. Таким чином, термін "зв'язувальні фрагменти гетеромерної варіабельної ділянки" означає щонайменше одну варіабельну ділянку важкого ланцюга і щонайменше одну варіабельну ділянку легкого ланцюга або їх функціональні фрагменти, зібрані у гетеромерний 19 UA 98983 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 комплекс. До зв'язувальних фрагментів гетеромерної варіабельної ділянки належать, наприклад, такі функціональні фрагменти як Fab, F(ab)2, Fv, одноланцюговий Fv (scFv) тощо. Такі функціональні фрагменти добре відомі фахівцям у цій галузі. Відповідно, вживання цих термінів при описуванні функціональних фрагментів гетеромерної варіабельної ділянки відповідає визначенням, добре відомим фахівцям у цій галузі. Такі терміни описані у, наприклад, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989); Molec. Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference (Myers, R.A. (ed.), New York: VCH Publisher, Inc.); Huston et al., Cell Biophysics, 22:189-224 (1993); Plϋckthun and Skerra, Meth. Enzymol., 178:497-515 (1989) та у Day E.D., Advanced Immunochemistry, Second Ed., Wiley-Liss, Inc., New York, NY (1990). За варіантом, якому віддається перевага, людське генноінженерне антитіло має гіперваріабельні ділянки (CDR), що походять з або які одержують із вихідного антитіла, тобто нелюдського антитіла, за варіантом, якому віддається перевага, мишачого антитіла або його фрагмента, такого як мишаче Fab JXB7, у той час як каркасна та константна ділянка, до тієї міри, у якій вона є присутньою (або її значна або суттєва частина, тобто щонайменше приблизно 90 %, 92 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % або 99 %), кодуються інформацією з нуклеїновокислотної послідовності, яка знаходиться у людській зародковій імуноглобуліновій ділянці (дивись, наприклад, International ImMunoGeneTics Database) або у її рекомбінованій чи мутованій формах, незалежно від того, продукуються чи ні згадані антитіла у людській клітині. За варіантом, якому віддається перевага, щонайменше дві, три, чотири, п'ять або шість гіперваріабельних ділянок людського генноінженерного антитіла оптимізуються з гіперваріабельними ділянками нелюдського вихідного антитіла, з якого було одержано людське генноінженерне антитіло, для одержання бажаної властивості, наприклад, поліпшеної специфічності, спорідненості або нейтралізації, яка може бути ідентифікована відбірковим аналізом, наприклад, ELISA. За варіантом, якому віддається перевага, антитіло за цим винаходом містить HCDR3, що є ідентичною HCDR3 вихідного мишачого Fab JXB7 (тобто послідовність SEQ ID NO:46), a HCDR1, HCDR2, LCDR1, LCDR2 та LCDR3 містять щонайменше одну амінокислотну заміну, при порівнянні з амінокислотою, присутньою у вихідному мишачому Fab JXB7. Певні амінокислотні заміни у гіперваріабельних ділянках людських генноінженерних антитіл за цим винаходом, порівняно з амінокислотами вихідного мишачого Fab JXB7, зменшують ймовірність нестабільності антитіла (наприклад, видалення одного або декількох залишків Asn CDR) або зменшують ймовірність імуногенності антитіла при введенні людині (наприклад, як прогнозується методом IMMUNOFILTER™ (фірма Хеnсоr, Inc., Monrovia, штат Каліфорнія)). Людські генноінженерні антитіла можуть бути піддані in vitro мутагенезу за методами, загальноприйнятими у цій галузі, і таким чином амінокислотні послідовності каркасних ділянок HCVR та LCVR людських генноінженерних рекомбінантних антитіл являють собою послідовності, які хоча й одержані з послідовностей, споріднених із людськими зародковими послідовностями HCVR та LCVR, можуть не існувати за природних умов у межах людського зародкового набору антитіл in vivo. Передбачається, що такі амінокислотні послідовності каркасів HCVR та LCVR людських генноінженерних рекомбінантних антитіл є на щонайменше приблизно 85 %, приблизно 90 %, приблизно 92 %, приблизно 94 %, приблизно 95 %, приблизно 96 %, приблизно 98 % або за варіантом, якому віддається більша перевага, щонайменше приблизно 99 %, або за варіантом, якому віддається найбільша перевага, 100 % ідентичними до людської зародкової послідовності. Відповідно, людські генноінженерні антитіла можуть містити залишки, яких не знаходять ні у антитілі-реципієнті, ні у CDR або каркасних послідовностях, імпортованих із вихідного антитіла. У цій галузі існують численні способи одержання людських генноінженерних антитіл (дивись, наприклад, WO 2006/06046935; Queen, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2869 (1991); Jones et al., Nature, 321:522 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); та Verhoeyen et al., Science, 239:1534 (1988)). Наприклад, людські генноінженерні антитіла можуть бути продуковані шляхом одержання нуклеїновокислотних послідовностей, що кодують HCVR та LCVR вихідного антитіла (наприклад, мишачого антитіла або антитіла, що продукується гібридомою), яке селективно зв'язує гепсидин-25, ідентифікування гіперваріабельних ділянок у згаданих HCVR та LCVR (нелюдських) та пересадження таких нуклеїновокислотних послідовностей, що кодують CDR, на вибрані нуклеїновокислотні послідовності, що кодують людський каркас. Факультативно гіперваріабельна ділянка (CDR) може бути оптимізована шляхом довільного мутагенезу або на конкретних ділянках для заміни однієї або декількох амінокислот CDR на іншу амінокислоту перед пересадженням CDR у каркас. Альтернативно CDR може бути 20 UA 98983 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 оптимізована після інсерції у людський каркас задопомогою способів, доступних фахівцю у цій галузі. Після пересадження послідовностей, що кодують CDR, на вибрані послідовності, що кодують людський каркас, одержані у результаті послідовності ДНК, що кодують послідовності людських генноінженерних варіабельних ділянок важких та легких ланцюгів, у подальшому експресують з одержанням людського генноінженерного антитіла, яке селективно зв'язує гепсидин-25. Людські генноінженерні HCVR та LCVR можуть бути експресовані як частина цілої молекули антитіла проти гепсидину-25, тобто як гібридний білок із послідовностями людського константного домену. Однак послідовності HCVR та LCVR можуть також бути експресовані за відсутності послідовностей константних ділянок із продукуванням людських генноінженерних селективних Fv-фрагментів або Fab-фрагментів проти гепсидину-25 (дивись, наприклад, Watkins J., et al., Anal. Biochem., 253:37-45 (1997) та Watkins J., et al., Anal. Biochem. 256:169-177, (1998)). Слід розуміти, що при застосуванні ідей цього винаходу фахівець у цій галузі може вдаватись до звичайних методів, наприклад, сайт-спрямованого мутагенезу, для заміни, додання або видалення амінокислот конкретних CDR та каркасних послідовностей, розкритих у цьому описі, і завдяки цьому одержати додаткові амінокислотні послідовності варіабельних ділянок, що є похідними послідовностей, які пропонуються у цьому описі. На конкретний сайт заміни можуть бути введені майже усі з 21 альтернативних природних амінокислот. І врештірешт, фахівцю є доступними in vitro або in vivo методи відбору, наприклад, методи, опис яких представлений у наведеному у цьому документі Прикладі 2, для вибору амінокислотних послідовностей варіабельних ділянок для Fab-фрагментів, що мають бажану зв'язувальну спорідненість до гепсидинових поліпептидів. Подібним чином можуть бути ідентифіковані інші Fab-фрагменти, що є придатними для одержання антитіла проти гепсидину у відповідності із цим винаходом. За варіантом, якому віддається перевага, амінокислотна заміна, додання та делеція у межах каркасів обмежуються однією, двома, трьома або чотирма положеннями однієї або кожної з послідовностей каркасних ділянок (тобто FRL1, FRL2, FRL3, FRL4, FRH1, FRH2, FRH3, FRH4), розкритих у цьому описі. За варіантом, якому віддається перевага, амінокислотна заміна, додання та делеція у межах CDR обмежуються одним-трьома положеннями однієї або кожної з CDR, за варіантом, якому віддається більша перевага, у межах однієї або кожної з CDR заміну, додання та делецію здійснюють у одному або двох амінокислотних положеннях. За варіантом, якому також віддається перевага, амінокислотну заміну, додання та делецію на гіперваріабельних ділянках (CDR) варіабельної ділянки важкого ланцюга здійснюють у одному або двох амінокислотних положеннях. За варіантом, якому віддається найбільша перевага, амінокислотну заміну, додання та делецію здійснюють у одному або двох амінокислотних положеннях у межах CDRH2. Одержані у результаті послідовності ДНК, що кодують людські генноінженерні послідовності варіабельних ділянок важкого та легкого ланцюгів, у подальшому експресують з одержанням людського генноінженерного антитіла, яке селективно зв'язує людський гепсидин-25 з високою спорідненістю. Людські генноінженерні HCVR та LCVR можуть бути експресовані як частина усієї молекули антитіла проти гепсидину-25, тобто як гібридний білок із людськими послідовностями константного домену. За іншим аспектом цей винахід пропонує способи застосування антитіла за цим винаходом у відносно простих, однак високочутливих та селективних, імунологічних аналізах для виявлення і визначення зрілого гепсидину у людських тканинах та біологічних рідинах для діагностичних та прогностичних цілей. Антитіла за цим винаходом являють собою засіб для точного виявлення та визначення кількості зрілого гепсидину у тканині або біологічній рідині людини для визначення схильності до розладів, розвиток яких стимулюється зрілим людським гепсидином, та для виявлення і діагностування таких розладів у пацієнтів, які на них страждають. Наприклад, антитіла за цим винаходом можуть бути застосовані у чутливих та надійних імунологічних аналізах, таких як ELISA (імуноферментний твердофазний аналіз), RIA (радіоімуноаналіз), аналіз імунодифузії, або імунологічний аналіз, такий як SPR. Так само, антитіла за цим винаходом є також придатними для імуногістохімічного (IHС) та імунофлуоресцентного (IF) аналізів зразків тканин або біологічних рідин. Такі аналізи можуть застосовуватись для виявлення аномальних рівнів гепсидину-25 і тим самим для діагностування розладів, розвиток яких стимулюється гепсидином-25. Конкретніше, цей винахід пропонує способи діагностування у пацієнта розладу, розвиток якого стимулюється зрілим людським гепсидином, шляхом визначення рівня зрілого людського гепсидину у зразку тканини або біологічної рідини від згаданого пацієнта і порівняння рівня зрілого людського гепсидину у зразку з рівнем зрілого людського гепсидину у відповідному 21 UA 98983 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 зразку від одного або декількох контрольних індивідів або з еталонним стандартом, із визначенням таким чином розладу, пов'язаного з підвищеними рівнями зрілого людського гепсидину. Хворобливий стан може охоплювати одне або декілька генетичних або негенетичних захворювань, пов'язаних зі зниженими рівнем сироваткового заліза, кількістю ретикулоцитів, кількістю еритроцитів, рівнем гемоглобіну та/або гематокритом. За варіантом, якому віддається перевага, хворобливий стан може охоплювати один або декілька розладів, пов'язаних з анемією. Пропонується також спосіб моніторингу у пацієнта захворювання, розладу або стану, розвиток якого стимулюється зрілим людським гепсидином. Згаданий спосіб включає визначення рівня зрілого людського гепсидину у зразку тканини або біологічної рідини від пацієнта, що страждає на (або належить до групи ризику) захворювання, розлад або стан, розвиток якого стимулюється зрілим людським гепсидином, у перший момент часу; визначення рівня зрілого людського гепсидину у одному або декількох зразках тканини або біологічної рідини від пацієнта в один або декілька різних моментів часу; порівняння рівнів зрілого людського гепсидину, які були визначені у різні моменти часу, і контролювання тим самим захворювання або стану, розвиток якого стимулюється зрілим людським гепсидином. Селективні антитіла проти зрілого людського гепсидину за цим винаходом є особливо придатними при застосуванні у високопродуктивних способах. До таких способів належать способи із застосуванням мікрочипів та біочипів, за допомогою яких багато зразків можуть бути перевірені на мікропланшеті або предметному склі чи інших аналітичних субстратах, відомих у цій галузі. Присутність зрілого людського гепсидину або його рівень у біологічному зразку можуть бути встановлені шляхом об'єднання біологічного зразка з, наприклад, антитілом за цим винаходом, за умов, придатних для утворення комплексу антиген-антитіло. Згадане антитіло безпосередньо або, за варіантом, якому віддається більша перевага, опосередковано мітять виявним складником для полегшення виявлення зв'язаного або незв'язаного антитіла. У цій галузі добре відомими є численні способи виявлення утворення імунного комплексу, наприклад, ELISA, RIA, імуноблотинг (наприклад, дот-блотинг, слот-блотинг, вестерн-блотинг), методи непрямої імунофлуоресценції та способи, які полягають у виявленні змін фізичних параметрів, такі як SPR тощо. До таких варіантів застосування належать способи, в яких використовують селективне антитіло проти гепсидину-25 за цим винаходом, кон'юговане з виявним складником для виявлення гепсидину у біологічному зразку, наприклад, у людській біологічній рідині або у клітинному чи тканинному екстракті. Антитіла за цим винаходом можуть бути застосовані у таких аналізах з або без модифікування виявним складником. При модифікуванні виявним складником, антитіла за цим винаходом можуть бути модифіковані шляхом ковалентного або нековалентного приєднання виявного складника. Термін "виявний", який вживають у цьому описі, описує ознаку речовини (кон'югату, сполуки або складника), яка дозволяє ідентифікувати або відслідковувати речовину за допомогою детектора із застосуванням відомих аналітичних методів. Репрезентативними прикладами виявних складників є (без обмеження ними) хромофори, флуоресцентні складники, фосфоресцентні складники, люмінесцентні складники, радіоактивні складники, різні ферменти (наприклад, лужна фосфатаза або пероксидаза з хрону), магнітні складники (наприклад, діамагнітні, парамагнітні та феромагнітні матеріали) та кластери важких металів, а також будь-які інші відомі виявні складники. Кількісне визначення стандартних утворених комплексів антиген-антитіло може бути здійснене різними способами, відомими у цій галузі, такими як, наприклад, фотометричні або колориметричні засоби. За варіантом, якому віддається перевага, антитіла за цим винаходом застосовують без модифікування, тобто опосередкованого мічення, способами, добре відомими у цій галузі. Цей винахід пропонує спосіб виявлення зрілого людського гепсидинового білка у біологічному зразку, який включає інкубування антитіла за цим винаходом з біологічним зразком за умов і впродовж періоду часу достатньої тривалості для надання можливості згаданому антитілу зв'язування зі зрілими людськими гепсидиновими білками та виявлення згаданого зв'язування. Цей винахід пропонує також композиції, способи та набори для перевірки зразків, які підозрюють на вміст зрілих людських гепсидинових поліпептидів. Така перевірка може бути здійснена на зразках від пацієнта або лабораторних зразках, які підозрюють на вміст або продукування таких поліпептидів. Набір може включати в себе селективне антитіло проти гепсидину-25 за цим винаходом. Набір може включати в себе відповідний буфер та реактиви для виявлення взаємодії між зразком та селективним антитілом проти гепсидину-25 за цим винаходом. Запропонований реактив може являти собою речовину з радіоактивною міткою, 22 UA 98983 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 флуоресцентною міткою або ферментативною міткою, здатну до зв'язування або взаємодії з антитілом за цим винаходом, наприклад, антимишачим IgG антитілом. Згаданий реактив набору може бути наданий у вигляді рідкого розчину, нанесеного на тверду основу або у вигляді сухого порошку. Якщо згаданий реактив наданий у вигляді рідкого розчину, за варіантом, якому віддається перевага, згаданий рідкий розчин являє собою водний розчин. За варіантом, якому віддається перевага, якщо наданий реактив є нанесеним на тверду основу, то згаданою твердою основою може бути хроматографічне середовище, експериментальний планшет із певною кількістю лунок або предметне скло. Якщо наданий реактив являє собою сухий порошок, згаданий порошок може бути відновлений доданням відповідного розчинника, який також може бути наданий у складі набору. Набір за цим винаходом запропонований у контейнері, який, як правило, включає в себе флакони, у яких можуть бути розміщені антитіло, антиген або реактив для виявлення, за варіантом, якому віддається перевага, поділені на відповідні аліквоти. Набори за цим винаходом будуть, як правило, включати в себе також засоби для вміщення контейнерів з антитілом, антигеном та реактивом для комерційного продажу. Такими контейнерами можуть бути пластикові контейнери, у яких розміщують необхідні флакони та один або декілька необхідних хімікатів, таких як хроматографічний матеріал, розчинники та елюенти, культури бактерій на живильному середовищі, детергенти, антитіла та хімікати для реакції виявлення. Антитіло за цим винаходом може бути застосоване для діагностування розладу або захворювання, пов'язаних з активністю зрілого гепсидину. Подібним чином, антитіло за цим винаходом може бути застосоване у аналізі для моніторингу рівня зрілого гепсидину у суб'єкта, якого піддають лікуванню з приводу стану, захворювання або розладу, розвиток якого стимулюється зрілим гепсидином. До таких варіантів застосування належать способи, в яких використовують антитіло за цим винаходом та мітку для виявлення зрілого гепсидину у біологічному зразку, наприклад, у загальній воді організму людини або у клітинному чи тканинному екстракті. Антитіла за цим винаходом можуть бути застосовані з модифікацією або без неї і можуть бути мічені шляхом ковалентного або нековалентного приєднання виявного складника. У цій галузі відомі різноманітні традиційні методики визначення рівнів білка у біологічному зразку, у тому числі, наприклад, ELISA, RIA та FACS (клітинний сортер зі збудженням флуоресценції), які становлять основу для діагностування змінених або аномальних рівнів експресії зрілого гепсидину. Нормальні або стандартні рівні гепсидину, присутнього у зразку, встановлюють за допомогою будь-якого відомого способу, наприклад, шляхом об'єднання зразка, що містить зрілий гепсидиновий поліпептид, з, наприклад, антитілом за цим винаходом, за умов, придатних для утворення комплексу антиген: антитіло. Антитіло безпосередньо або опосередковано мітять виявною речовиною для полегшення виявлення зв'язаного або незв'язаного антитіла. До числа прийнятних виявних речовин належать різні ферменти, простетичні групи, флуоресцентні матеріали, люмінесцентні матеріали та радіоактивні матеріали. Кількісне визначення утворених стандартних комплексів здійснюють різними способами, наприклад, за допомогою фотометричних засобів. Після цього кількість зрілого гепсидинового поліпептиду, присутнього у зразках, порівнюють зі стандартними значеннями. Антитіло, якому віддається перевага, для застосування у діагностичних, прогностичних та/або моніторингових аналізах, наборах та способах має (і) поліпептид важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO:6, і поліпептид легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO:14; (іі) поліпептид важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO:7, і поліпептид легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO:15; (ііі) поліпептид важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO:9, і поліпептид легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO:17; або (iv) поліпептид важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO:8, і поліпептид легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO:16. Ізольоване селективне антитіло проти гепсидину-25 за цим винаходом може бути застосоване для лікування, за варіантом, якому віддається перевага, для лікування людей. Фармацевтична композиція, що містить антитіло за цим винаходом, може бути застосована для підвищення рівня сироваткового заліза, кількості ретикулоцитів, кількості еритроцитів, рівня гемоглобіну та/або гематокриту у людини, якщо ефективну кількість антитіла вводять людині, яка цього потребує. Крім того, антитіло за цим винаходом може бути корисним для лікування станів, захворювань або розладів, при яких присутність гепсидину-25 спричинює або додає свій 23 UA 98983 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 внесок до небажаних патологічних ефектів або зниження рівнів чи біологічної активності гепсидину-25 чинить сприятливий терапевтичний вплив на людей. До таких станів, захворювань або розладів належить (але без обмеження нею) анемія, у тому числі (але без обмеження нею) анемія, що є наслідком інфекції, запалення, хронічного захворювання та/або раку. Суб'єктами можуть бути чоловік або жінка. Цей винахід охоплює спосіб підвищення рівня сироваткового заліза, кількості ретикулоцитів, кількості еритроцитів, рівня гемоглобіну та/або гематокриту, який включає введення людині, яка цього потребує, ефективної кількості антитіла за цим винаходом, яке селективно зв'язує людський гепсидин-25 зі зв'язувальною спорідненістю KD на рівні приблизно 800 пМ або менше. На додаток до цього або альтернативно цей винахід охоплює спосіб лікування захворювання, стану або розладу у людини, причому корисним для пацієнта є підвищення рівня сироваткового заліза, кількості ретикулоцитів, кількості еритроцитів, рівня гемоглобіну та/або гематокриту, у тому числі (але без обмеження нею) анемії, наприклад, анемії, яка є наслідком інфекції, запалення, хронічного захворювання та/або раку. За варіантом, якому віддається перевага, суб'єкт має або ризикує мати небажано низький рівень сироваткового заліза, низьку кількість ретикулоцитів, низьку кількість еритроцитів, низький рівень гемоглобіну та/або низький гематокрит. За варіантом, якому віддається більша перевага, згаданий суб'єкт належить до групи ризику виникнення або страждає на анемію, у тому числі (але без обмеження нею) анемію, яка є наслідком інфекції, запалення, хронічного захворювання та/або раку. За варіантом, якому віддається ще більша перевага, згадане антитіло містить LCVR, що містить: і) LCDR1, що має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яку складають послідовності SEQ ID NO:41 та SEQ ID NO:43; іі) LCDR2, що має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яку складають послідовності SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58 та SEQ ID NO:76; та iii) LCDR3, що має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яку складають послідовності SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:61 та SEQ ID NO:60; і HCVR, що містить: і) HCDR1, що має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яку складають послідовності SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:78 та SEQ ID NO:79; ii) HCDR2, що має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яку складають послідовності SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:86 та SEQ ID NO:87; і iii) HCDR3, що має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO:46. За варіантом, якому віддається ще більша перевага, антитіло містить поліпептид важкого ланцюга і поліпептид легкого ланцюга, які мають: (і) амінокислотні послідовності, представлені послідовностями SEQ ID NO:6 та SEQ ID NO:14, відповідно; (ii) амінокислотні послідовності, представлені послідовностями SEQ ID NO:7 та SEQ ID NO:15, відповідно; (iii) амінокислотні послідовності, представлені послідовностями SEQ ID NO:9 та SEQ ID NO:17, відповідно; або (iv) амінокислотні послідовності, представлені послідовностями SEQ ID NO:8 та SEQ ID NO:16, відповідно. За варіантом, якому віддається найбільша перевага, антитіло містить поліпептид важкого ланцюга і поліпептид легкого ланцюга, що мають амінокислотні послідовності, представлені послідовностями SEQ ID NO:8 та SEQ ID NO:16, відповідно. Крім того, передбачається застосування антитіла за цим винаходом для виготовлення лікарського засобу для лікування анемії або щонайменше одного з вищезгаданих розладів. За варіантом, якому віддається перевага, антитіло містить LCVR, що містить: і) LCDR1, що має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яку складають послідовності SEQ ID NO:41 та SEQ ID NO:43; ii) LCDR2, що має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яку складають послідовності SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58 та SEQ ID NO:76; і iii) LCDR3, що має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яку складають послідовності SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:61 та SEQ ID NO:60; і HCVR, що містить: і) HCDR1, що має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яку складають послідовності SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:78 та SEQ ID NO:79; ii) HCDR2, що має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яку складають послідовності SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:86 та SEQ ID NO:87; і iii) HCDR3, що має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO:46. За варіантом, якому віддається більша перевага, антитіло містить поліпептид важкого ланцюга і поліпептид легкого ланцюга, які мають: (і) амінокислотні послідовності, представлені 24 UA 98983 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 послідовностями SEQ ID NO:6 та SEQ ID NO:14, відповідно; (іі) амінокислотні послідовності, представлені послідовностями SEQ ID NO:7 та SEQ ID NO:15, відповідно; (iii) амінокислотні послідовності, представлені послідовностями SEQ ID NO:9 та SEQ ID NO:17, відповідно; або (iv) амінокислотні послідовності, представлені послідовностями SEQ ID NO:8 та SEQ ID NO:16, відповідно. За варіантом, якому віддається найбільша перевага, антитіло містить поліпептид важкого ланцюга і поліпептид легкого ланцюга, які мають амінокислотні послідовності, представлені послідовностями SEQ ID NO:8 та SEQ ID NO:16, відповідно. Термін "лікування" (або "лікувати") має відношення до усіх процесів, у яких може спостерігатись уповільнення, переривання, зупинка, контролювання або припинення розвитку розладів, опис яких наведений у цьому документі, але не обов'язково вказує на повну ліквідацію усіх симптомів розладу. Термін "лікування", який вживають у цьому описі, передбачає введення сполуки за цим винаходом для лікування захворювання або стану у ссавця, зокрема, у людини, і охоплює: (а) пригнічення подальшого розвитку захворювання, тобто припинення його розвитку; та (b) полегшення захворювання, тобто спричинення зворотного розвитку захворювання або розладу чи полегшення тяжкості його симптомів або ускладнень. Схеми приймання лікарського засобу можуть регулюватись таким чином, щоб забезпечити оптимальну бажану реакцію (наприклад, терапевтичну реакцію). Наприклад, може бути введена разова ударна доза, впродовж певного періоду часу можуть бути введені декілька поділених доз, або доза може бути пропорційно зменшеною або збільшеною, як вказується вимогами терапевтичної ситуації. Термін "запобігання" (або "запобігати") означає перешкоджання, стримування або пригнічення виникнення або розвитку симптому, розладу, стану або захворювання. Гострі явища та хронічні стани можуть лікуватись та запобігатись. У разі гострого явища антитіло за цим винаходом вводять на початку появи симптому, розладу, стану або захворювання, і припиняють введення після закінчення гострого явища. У протилежність до цього хронічний симптом, розлад, стан або захворювання лікують впродовж більш тривалого періоду часу. "Розладом" є будь-який стан, сприятливий вплив на який мало б лікування за цим винаходом. Терміни "розлад", "стан" та "захворювання" вживають у цьому описі взаємозамінно, і вони охоплюють хронічні та гострі розлади, розвиток яких стимулюється зрілим гепсидином, у тому числі (але без обмеження нею) анемію, у тому числі (але без обмеження нею) анемію хронічних захворювань, у тому числі (але без обмеження нею) анемію, що є наслідком інфекції, запалення та/або раку. Антитіло за цим винаходом може бути включене до складу фармацевтичної композиції, придатної для введення людині. Антитіло за цим винаходом може бути введене людині окремо або у комбінації з фармацевтично прийнятним носієм та/або розріджувачем у формі разової дози або декількох доз. Такі фармацевтичні композиції розробляються так, щоб бути придатними для вибраного способу введення, і фармацевтично прийнятні розріджувачі, носії та/або наповнювачі, такі як диспергувальні засоби, буфери, поверхнево-активні речовини, консерванти, солюбілізувальні засоби, засоби для регулювання ізотонічності, в тому числі (але без обмеження ним) хлорид натрію, стабілізатори тощо, застосовують відповідним чином. Такі композиції можуть бути розроблені відповідно до традиційних способів, розкритих, у, наприклад, th Remington. The Science and Practice of Pharmacy, 19 Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA 1995, що являє собою довідник зі способів виготовлення лікарських форм, які загалом відомі лікарям-практикам. Відповідні носії для фармацевтичних композицій включають будь-який матеріал, який, при об'єднанні з антитілом за цим винаходом, зберігає активність молекули і не вступає у реакцію з імунною системою суб'єкта. У певних варіантах здійснення фармацевтична композиція за цим винаходом містить і) антитіло за цим винаходом, іі) цитратний буфер та ііі) хлорид натрію. За варіантом, якому віддається перевага, концентрація згаданого антитіла становить від приблизно 1 мг/мл до приблизно 35 мг/мл, концентрація цитрату становить від приблизно 5 мМ до приблизно 20 мМ, концентрація хлориду натрію становить від приблизно 100 мМ до приблизно 300 мМ, і рН композиції становить від приблизно 5,0 до приблизно 7,2. За варіантом, якому віддається більша перевага, концентрація згаданого антитіла становить від приблизно 5 мг/мл до приблизно 30 мг/мл, концентрація цитрату становить від приблизно 5 мМ до приблизно 15 мМ, концентрація хлориду Натрію становить від приблизно 150 мМ до приблизно 300 мМ, і рН композиції становить від приблизно 5,5 до приблизно 6,5. За варіантом, якому віддається ще більша перевага, концентрація згаданого антитіла становить від приблизно 5 мг/мл до приблизно 25 мг/мл, концентрація цитрату становить приблизно 10 мМ, концентрація хлориду натрію становить від приблизно 200 мМ до приблизно 300 мМ, і рН композиції становить від приблизно 5,5 до приблизно 6,5. Фармацевтична композиція, яка містить антитіло проти гепсидину-25 за цим винаходом, може бути введена суб'єкту, для якого існує ризик виникнення або який демонструє патології, 25 UA 98983 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 опис яких наведений, наприклад, анемічні розлади, за допомогою стандартних способів введення. Словосполучення "ефективна кількість", яке вживають у цьому описі, означає кількість, необхідну (у дозах та для періодів часу і для засобів введення) для досягнення бажаного терапевтичного результату. Ефективна кількість антитіла може змінюватись у відповідності до таких факторів, наприклад, як хворобливий стан, вік, стать та маса індивіда, а також здатність антитіла або фрагмента антитіла викликати необхідну реакцію у індивіда. Ефективною кількістю також є кількість, при якій будь-яка токсична або шкідлива дія антитіла переважується терапевтично сприятливою дією. Ефективна кількість являє собою принаймні мінімальну кількість, однак меншу за токсичну кількість, активного засобу, яка є необхідною для спричинення терапевтично сприятливого впливу на суб'єкта. Іншими словами, ефективною кількістю або терапевтично ефективною кількістю антитіла за цим винаходом є кількість, яка у ссавців, за варіантом, якому віддається перевага, людей (і) підвищує рівень сироваткового заліза, кількість ретикулоцитів, кількість еритроцитів, рівень гемоглобіну та/або гематокрит, або (іі) лікує розлад, при якому присутність зрілого гепсидину спричинює або сприяє виникненню небажаного патологічного ефекту, або (ііі) наслідком зниження рівнів зрілого гепсидину або біологічної активності зрілого гепсидину є сприятливий терапевтичний вплив на ссавця, за варіантом, якому віддається перевага, причому згаданий розлад охоплює (але без обмеження нею) анемію, у тому числі (але без обмеження нею) анемію хронічних захворювань, у тому числі (але без обмеження нею) анемію, що є наслідком інфекції, запалення та/або раку. Ефективна кількість антитіла за цим винаходом може бути введена разовою дозою або декількома дозами. Крім того, ефективна кількість антитіла за цим винаходом може бути введена декількома дозами у кількостях, які були б меншими за ефективну кількість, якщо б їх не вводили більше одного разу. Як добре відомо у галузі медицини, дози для будь-якого суб'єкта залежать від багатьох факторів, у тому числі розміру пацієнта, площі поверхні тіла, віку, конкретної сполуки, призначеної до введення, статі, часу та шляху введення, загального стану здоров'я пацієнта та інших лікарських засобів, які вводяться одночасно. Крім того, доза може бути змінена у залежності від типу та тяжкості захворювання. Типова доза може становити, наприклад, від приблизно 1 мг до приблизно 200 мг, за варіантом, якому віддається перевага, від приблизно 2 мг до приблизно 200 мг, за варіантом, якому віддається більша перевага, від приблизно 5 мг до приблизно 200 мг; за варіантом, якому віддається ще більша перевага, від приблизно 5 мг до приблизно 50 мг, за варіантом, якому віддається ще більша перевага, від приблизно 5 мг до приблизно 25 мг; за варіантом, якому віддається ще більша перевага, від приблизно 5 мг до приблизно 20 мг, за варіантом, якому віддається ще більша перевага, від приблизно 5 мг до приблизно 15 мг; однак передбачаються дози нижчі або вищі за цей приклад діапазону, зокрема, приймаючи до уваги вищезгадані фактори. Добова схема парентерального введення лікарського засобу може передбачати діапазон від приблизно 10 мкг/кг до приблизно 20 мг/кг, за варіантом, якому віддається перевага, від приблизно 25 мкг/кг до приблизно 20 мг/кг, за варіантом, якому віддається більша перевага, від приблизно 50 мкг/кг до приблизно 20 мг/кг, за варіантом, якому віддається ще більша перевага, від приблизно 100 мкг/кг до приблизно 20 мг/кг, за варіантом, якому віддається ще більша перевага, від приблизно 200 мкг/кг до приблизно 20 мг/кг, за варіантом, якому віддається ще більша перевага, від приблизно 300 мкг/кг до приблизно 20 мг/кг, за варіантом, якому віддається ще більша перевага, від приблизно 400 мкг/кг до приблизно 20 мг/кг, за варіантом, якому віддається ще більша перевага, від приблизно 500 мкг/кг до приблизно 20 мг/кг, за варіантом, якому віддається ще більша перевага, від приблизно 600 мкг/кг до приблизно 20 мг/кг, від приблизно 700 мкг/кг до приблизно 20 мг/кг, від приблизно 800 мкг/кг до приблизно 20 мг/кг, від приблизно 900 мкг/кг до приблизно 20 мг/кг, за варіантом, якому віддається ще більша перевага, від приблизно 1 мг/кг до приблизно 20 мг/кг, за варіантом, якому віддається ще більша перевага, від приблизно 2 мг/кг до приблизно 20 мг/кг, за варіантом, якому віддається ще більша перевага, від приблизно 3 мг/кг до приблизно 20 мг/кг, за варіантом, якому віддається ще більша перевага, від приблизно 4 мг/кг до приблизно 20 мг/кг, за варіантом, якому віддається ще більша перевага, від приблизно 5 мг/кг до приблизно 20 мг/кг, за варіантом, якому віддається ще більша перевага, від приблизно 6 мг/кг до приблизно 20 мг/кт, за варіантом, якому віддається ще більша перевага, від приблизно 7 мг/кг до приблизно 20 мг/кг і за варіантом, якому віддається ще більша перевага, від приблизно 8 мг/кг до приблизно 20 мг/кг. Прогрес може контролюватись періодичним оцінюванням з відповідним регулюванням дози. Ці запропоновані кількості антитіла значною мірою залежать від розсуду лікаря. Ключовим фактором у виборі відповідної дози та розробці схеми є досягнутий результат. Факторами для 26 UA 98983 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 розгляду у цьому контексті є конкретний розлад, який піддають лікуванню, клінічний стан окремого пацієнта, причина розладу, місце доставки антитіла, конкретний тип антитіла, спосіб введення, схема застосування лікарського засобу та інші фактори, відомі лікарям-практикам. Шляхом введення антитіла за цим винаходом може бути пероральний, парентеральний, інгаляційний або місцевий. За варіантом, якому віддається перевага, антитіла за цим винаходом можуть бути включені до складу фармацевтичної композиції, придатної для парентерального введення. Термін "парентеральний", який вживають у цьому описі, охоплює внутрішньовенне, внутрішньом'язове, підшкірне, ректальне, вагінальне або внутрішньоочеревинне введення. Перевага віддається парентеральній доставці шляхом внутрішньовенної або внутрішньоочеревинної чи підшкірної ін'єкції. Найбільша перевага віддається підшкірній ін'єкції. Прийнятні носії для таких ін'єкцій є добре відомими у цій галузі. Фармацевтична композиція, за типовим варіантом, повинна бути стерильною та стабільною за умов виготовлення і збереження у запропонованому контейнері, у тому числі, наприклад, у герметизованому флаконі, шприці або іншому пристрої для доставки, наприклад, шприціін'єкторі. Таким чином, фармацевтичні композиції можуть фільтруватись за стерильних умов після виготовлення лікарської форми, або їх мікробіологічна прийнятність може· бути забезпечена іншим способом. Наведені нижче приклади пропонуються лише з ілюстративними цілями і не призначені для обмеження обсягу цього винаходу. Приклади Приклад 1: Продукування людського гепсидину-25 Людський гепсидин-25 можна одержати з комерційних джерел (наприклад, від Peptide International (Louisville, Kentucky)) або продукувати за допомогою цілого ряду синтетичних або рекомбінантних способів, відомих у цій галузі. Альтернативно гібридний білок, що містить двадцять п'ять амінокислот послідовності людського гепсидину-25 і має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO:95, експресується Ε. coli. Тільця включення виділяють з 3 л Ε. coli, що експресує людський гепсидиновий гібридний білок, після 3-6 год. індукування 1 мМ розчином IPTG при температурі 37 °C. Тільця включення солюбілізують у буфері А (50 мМ розчин трис та 8 Μ розчин сечовини (рН 8,0)). Супернатант пропускають через колонку ІМАС (20 мл смоли). Колонку промивають буфером А, доки показник оптичної густини не повернеться до вихідного значення, і зв'язані поліпептиди елююються порціями з колонки за допомогою 0,5 Μ розчину імідазолу у буфері А. Гібридний білок людського гепсидину-25 змішують і відновлюють за допомогою 50 мМ розчину DTT. Після цього цей гібридний білок повторно укладають шляхом розведення змішаного матеріалу у 2 Μ розчині сечовини, 3 мМ розчині цистеїну, 50 мМ розчині трис (рН 8,0) до кінцевої концентрації білка, меншої за 50 мкг/мл. Цей матеріал перемішують при кімнатній температурі, і окиснюють киснем повітря впродовж 48 год. Окиснені поліпептиди пропускають через колонку ІМАС (20 мл) при швидкості потоку 5 мл/хв, і гібридний білок людського гепсидину-25 елююють порціями з колонки за допомогою 0,5 Μ розчину імідазолу у буфері А. Змішані фракції, що містять гібридний білок людського гепсидину-25, концентрують і пропускають через роздільну колонку Superdex 75 (GE Healthcare, XK26/60), врівноважену 50 мМ розчином трис, 4 Μ розчином сечовини, рН 8,0, при швидкості потоку 3 мл/хв. Мономерний гібридний білок змішують, після чого розбавляють 50 мМ розчином трис, 2 Μ розчином сечовини, 5 мМ розчином СаСІ2, рН 8,0, після чого розщеплюють ентерокіназою для одержання людського гепсидину-25, що має послідовність SEQ ID NO:1. Нерозщеплений гібридний білок людського гепсидину-25 видаляють шляхом хроматографування пасивним методом на колонці ІМАС (як описано вище). Після цього потік із колонки ІМАС пропускають через хроматографічну колонку С-18 з оберненою фазою зі швидкістю потоку 4,0 мл/хв. Колонку промивають 0,1 % розчином TFA у воді, доки показник оптичної густини не повернеться до вихідного значення, і зв'язані поліпептиди елююють із колонки лінійним градієнтом ACN від 20 % до 40 % з 0,1 % розчином TFA при швидкості 0,5 %/хв. Фракції, що містять поліпептид людського гепсидину-25, змішують і аналізують шляхом секвенування N-кінцевих амінокислот та за допомогою мас-спектрометрїї з іонізацією методом лазерної десорбції у матричному розчині (MALDI-MS). Поліпептиди, що кодують гепсидин-25 пацюків, мишей та макак-крабоїдів, і різні скорочені на N-кінці форми людського гепсидину-25, у тому числі гепсидин-22 та гепсидин-20, були одержані комерційним шляхом (наприклад, від Peptide International). Приклад 2: Визначення афінного зв'язування Fab-фрагментів та моноклональних антитіл проти гепсидину-25 Для визначення кінетики та спорідненості зв'язування антитіл, розкритих у цьому описі, може бути застосований біосенсор на основі поверхневого плазмонного резонансу, наприклад, 27 UA 98983 C2 5 10 15 20 25 30 ВІАсоrе® ТІ 00. Система ВІАсоrе® використовує оптичні властивості SPR для виявлення змін білкової концентрації молекул, які взаємодіють, у межах декстранової біосенсорної матриці. Якщо конкретно не зазначено інше, усі реактиви та матеріали закуповуються від ВІАсоrе® АВ (Upsala, Sweden). Усі визначення здійснюють при температурі 25 °C. Зразки розчиняють у буфері HBS-EP (150 мМ натрію хлориду, 3 мМ EDTA, 0,05 % (у відношенні маси до об'єму) поверхнево-активної речовини Р-20 та 10 мМ HEPES, рН 7,4). Для захоплення Fab-фрагментів із людським ланцюгом типу каппа, козячий антилюдський ланцюг типу каппа іммобілізують на протокових кюветах 1-4 сенсорного чипа СМ5 на рівні 5000-10000 реакційних одиниць (Rus) за допомогою набору для зв'язування амінних груп. Для захоплення моноклональних антитіл (Mab) з мишачим IgG1, козячий антимишачий Fc-фрагмент гамма іммобілізують на протокових кюветах 1-4 сенсорного чипа СМ5 на рівні 5000-10000 реакційних одиниць за допомогою набору для зв'язування амінних груп. Для захоплення антитіл із людським IgG4, білок А іммобілізують на протокових кюветах 1-4 сенсорного чипа СМ4 на рівні 400-700 реакційних одиниць за допомогою набору для зв'язування амінних груп. Fab-фрагменти, одержані з периплазми Е. соli, та моноклональні антитіла (Mab), одержані з клітинної культури ссавців, оцінюють за допомогою численних аналітичнихциклів. Кожен цикл складається з наведених нижче стадій: 0,3-2 хв введення Fab або Mab при ~10мкл/хв, спрямоване на захоплення 200-1000 реакційних одиниць, 2 хв введення при 50 мкл/хв різних концентрацій людського гепсидину-25 (від 600 нМ до 0,1 нМ), який одержали, як описано у наведеному вище Прикладі 1, з подальшими 2-10 хв для дисоціації, і регенерація за допомогою 30 мкл 10 мМ розчину гліцину гідрохлориду, рН 1,5. Вимірювання здійснюють при температурі 25 °C, а швидкість асоціації та дисоціації для кожного циклу визначають за допомогою моделі зв'язування "1:1 з масопередачею" у програмному забезпеченні BIAevaluation. Параметри зв'язування людського гепсидину-25 мишачим Fab JXB7 та певними людськими генноінженерними Fab-фрагментами проти гепсидину наведені у Таблиці 5. Було визначено, що значення зв'язувальної спорідненості (KD) людського гепсидину-25 до інших людських генноінженерних Fab-фрагментів, наведених у Таблиці 3, становлять від приблизно 214 пМ до приблизно 54 пМ, де кожен мав швидкість дисоціації k off з людським гепсидином-25 від -4 -1 -4 -1 приблизно 7,68×10 с до приблизно 2,22×10 с . Таким чином, були визначені людські генноінженерні Fab-фрагменти проти гепсидину, які мають зв'язувальну спорідненість КD до людського гепсидину-25 у приблизно 52 рази меншу ніж зв'язувальна спорідненість мишачого Fab JXB7. Людські генноінженерні Fab-фрагменти проти гепсидину, наведені у Таблиці 5, містять людські зародкові каркаси O2 та VH1-69 легкого та важкого ланцюгів, відповідно. Таблиця 5 Властивості зв'язування з людським гепсидином-25 35 40 Параметри зв'язування людського гепсидину-25 мишачим моноклональним антитілом JXB7 та певними людськими генноінженерними моноклональними антитілами проти гепсидину наведені у Таблиці 6. Таким чином, були визначені людські генноінженерні моноклональні антитіла проти гепсидину, які мають зв'язувальну спорідненість (K D) до людського гепсидину-25 у приблизно 33 рази меншу ніж зв'язувальна спорідненість мишачого моноклонального антитіла JXB7. Константними ділянками важкого ланцюга для моноклональних антитіл JXB7 та 31В2 є мишачий IgG1. Константними ділянками важкого ланцюга інших моноклональних антитіл у Таблиці 6 були людські IgG4 (послідовність SEQ ID NO:94). 28