Спосіб отримання вакцини, яка містить щонайменше два антигени, які здатні адсорбуватися на оксигідроксиді алюмінію

Реферат: Винахід належить до способу отримання вакцинної композиції, яка містить щонайменше оксигідроксид алюмінію (АlOОН) і щонайменше поверхневий антиген гепатиту В, і антиген Haemophilus influenzae типу b. Згідно з винаходом поверхневий антиген гепатиту В зберігається адсорбованим на АlOОН, тоді як антиген Hib зберігається неадсорбованим. З цією метою: поверхневий антиген гепатиту В адсорбують на АlOОН для отримання комплексу АlOОН/HBsAg, потім вказаний комплекс АlOОН /HBsAg змішують із антигеном Hib у присутності катіонних амінокислот у концентрації щонайменше 100 мг/л і фосфатних іонів у концентрації від 35 до 45 ммоль/л. UA 113000 C2 (12) UA 113000 C2 UA 113000 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід стосується галузі комбінацій вакцин, які містять одночасно валентність гепатиту В, що складається із поверхневого антигену (HBsAg) вірусу гепатиту В і валентності Haemophilus influenzae типу b, що складається із її капсулярного полісахариду, який називається полірибозилрибітолфосфат (PRP), який, для того, щоб він був ефективним у дітей у віці менше двох років, кон'югують із білком-носієм, наприклад, правцевим білком. Такі композиції, які призначені для введення дітям раннього віку, як правило, містять інші антигени, які забезпечують можливість вакцинації за одну операцію проти декількох захворювань, а також ад'ювант на основі алюмінію. Таким чином, у патентній заявці WO 99/13906 описана вакцинна композиція, яка містить, як описано на сторінці 13, антигени проти дифтерії, правця, поліомієліту, коклюшу, гепатиту В і інфекцій Haemophilus influenzae типу b. Для того, щоб деякі із цих антигенів були імуногенними, їх необхідно адсорбувати на солі алюмінію. Зокрема, це є випадком поверхневого антигену гепатиту В або HBsAg. Однак, як указано на сторінці 12 заявки WO 99/13906, валентність Hib, яка складається із капсулярного полісахариду, кон'югованого із правцевим білком, як правило, втрачає свою імуногенність протягом періоду часу, коли її адсорбують на солях алюмінію. Щоб уникнути цього недоліку рішення, яке пропонується в цьому відомому рівні техніки, яке вже рекомендували у попередній заявці PCT/FR96/00791, полягає в додаванні аніонів, і зокрема фосфатних, карбонатних або цитратних іонів. Однак автори даного винаходу зазначили, що в той час як додавання іонів, зокрема фосфатів або карбонатів, дозволяє ефективно запобігати адсорбції PRP-T на оксигідроксиді алюмінію (AlOOH) і, таким чином, зберігати його імуногенність протягом тривалого періоду часу, таке додавання також має недолік, який полягає у десорбції поверхневого антигену гепатиту В, коли останній також адсорбували на оксигідроксиді алюмінію. Таким чином, необхідно знайти спосіб отримання комбінації вакцин, яка містить оксигідроксид алюмінію, в якій поверхневий антиген гепатиту В зберігається адсорбованим на AlOOH, тоді як антиген Hib зберігається в неадсорбованому стані. З цією метою об'єктом даного винаходу є спосіб отримання рідкої комбінації вакцин, яка містить щонайменше: - один поверхневий антиген гепатиту В (HBsAg), - один антиген Haemophilus influenzae типу b (Hib), який складається із капсулярного полісахариду, кон'югованого із білком-носієм, - оксигідроксиду алюмінію (AlOOH), в якій поверхневий антиген гепатиту В зберігається адсорбованим на AlOOH, тоді як антиген Hib зберігається в неадсорбованому стані, де: - антиген гепатиту В адсорбують на AlOOH для отримання комплексу поверхневий AlOOH/HBsAg, - вказаний комплекс AlOOH/HBsAg змішують із антигеном Hib у присутності катіонних амінокислот в концентрації щонайменше 100 мг/л і фосфатних іонів в концентрації від 35 до 45 ммоль/л. Завдяки способу за винаходом можливо отримувати бажану рівновагу між підтримкою адсорбції поверхневого антигену гепатиту В на оксигідроксиді алюмінію і збереження в неадсорбованому стані антигену Hib. Згідно з одним конкретним варіантом здійснення винаходу антиген HBsAg адсорбують алюміній, змішуючи суспензію AlOOH із суспензією HBsAg при перемішуванні протягом щонайменше 4 годин, переважно щонайменше 12 годин, переважно від 20 до 24 годин. Згідно з одним окремим варіантом здійснення винаходу перед змішуванням із антигеном Hib до вказаного комплексу AlOOH/HBsAg додають катіонні амінокислоти. Згідно з альтернативним варіантом здійснення винаходу перед змішуванням із комплексом AlOOH/HBsAg до вказаного антигену Hib додають катіонні амінокислоти. За одним із варіантів здійснення винаходу перед змішуванням із антигеном Hib до вказаного комплексу AlOOH/HBsAg додають фосфатні іони. За одним із варіантів здійснення винаходу перед змішуванням із антигеном Hib регулюють pH препарату, який містить комплекс AlOOH/HBsAg, до 7,1±0,1. Об'єктом винаходу також є вакцинна комбінація, яка отримується заявленим у формулі винаходу способом і яка містить щонайменше: - поверхневий антиген гепатиту В, - антиген дифтерії у формі дифтерійного токсину D, - антиген правця у формі правцевого токсину Т, 1 UA 113000 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 - антигени коклюшу у формі очищеного токсину (PTxd) і фімбріального гемаглютиніну (FHA), - антиген Haemophilus influenzae типу b у формі полірибозилрибітолфосфату, кон'югованого із правцевим білком (PRP-T), - антигени поліомієліту у формі інактивованих вірусів типу 1, 2 і 3. Така вакцинна композиція має перевагу, яка полягає в тому, що вона знаходиться в рідкій формі, яка дозволяє уникати операції отримання ліофілізату, було доведено, що вона є достатньо стабільною, щоб залишатися імуногенною до доби її використання, і навіть через 36 місяців після дати її виробництва. За винаходом вакцинна композиція містить поверхневий антиген гепатиту В (HBsAg). Зокрема, цей антиген може являти собою поверхневий антиген гепатиту В, такий, як антиген, який міститься у вакцині Recombivax HB™, або у будь-якій іншій вакцині проти гепатиту B. Зокрема, він може являти собою рекомбінантний антиген, який отримується ферментацією дріжджів Hansenula polymorpha, модифікованих способом, розробленим Crucell, такий, як антиген, який міститься у вакцині Hepavax-Gene™. Для цілей винаходу кількість HBsAg, яка міститься в 0,5-мл дозі, переважно становить від 5 до 15 мкг, і зокрема 10 мкг. За винаходом вакцинна композиція містить антиген Haemophilus influenzae типу b (Hib). Цей антиген складається із капсулярного полісахариду бактерії або полірибозилрибітолфосфату (PRP), який кон'югований із білком-носієм. Білок-носій може являти собою будь-який білок, який використовується в цьому відношенні в галузі вакцин. Він може являти собою, наприклад, дифтерійний токсин D, правцевий токсин Т, ліпопротеїн D Haemophilus influenzae, CRM197 або білок зовнішньої мембрани N. meningitidis (OMP). Для отримання PRP-T кон'югату переважно використовують правцевий білок. Для цілей даного винаходу кон'югат PRP-T може міститися в пропорції від 1 до 30 мкг PRP в 0,5-мл дозі, переважно від 5 до 25 мкг PRP в дозі, переважно від 10 до 15 мкг PRP в дозі, найбільш переважно від 10 до 12 мкг PRP в дозі і більш конкретно 12 мкг PRP, кон'югованого із 22-36 мкг правцевого білка. За винаходом вакцинна композиція містить оксигідроксид алюмінію AlOOH. Цю сіль алюмінію дуже часто неправильно називають гідроксидом алюмінію. AlOOH, який можна використовувати для цілей даного винаходу, може являти собою, наприклад, сіль AlOOH, яка постачається Brenntag AG, або Rehydragel HPA від Reheis Corp. (Berkeley Heights, NJ), незважаючи на те, що спосіб отримання кожного із двох ад'ювантів різниться. Кількість використовуваного AlOOH розраховують таким чином, щоб забезпечувати отримання достатньої імунної відповіді, зокрема, вона залежить від кількості і природи антигенів, які міститься в композиції, а також від кількості кожного з цих антигенів. Тільки як інформація максимальна адсорбція HBsAg на AlOOH становить приблизно 780 мкг 3+ білка на мг алюмінію (загальноприйнято кількість AlOOH виражають як кількість алюмінію Al ). Для дози вакцини, яка містить 10 мкг HBsAg без інших додаткових антигенів, таким чином, буде досить 13 мкг алюмінію, кількість, яка проте є недостатньою для отримання бажаної ефективності, коли додають інші антигени. Таким чином, залежно від додавання одного або більше додаткових антигенів 10 мкг HBsAg можна приводити в контакт із від 0,01 мг до 1,25 мг алюмінію, що є максимальною кількістю, яка рекомендується європейською фармакопеєю. Наприклад, 0,5-мл доза вакцини для дітей, яка містить антигени дифтерії, правця, коклюшу і гепатиту В, може загально прийнято містити від 0,5 до 0,7 мг алюмінію, переважно приблизно 0,6 мг алюмінію. За винаходом поверхневий антиген гепатиту В зберігається адсорбованим на AlOOH, що означає, що щонайменше 60 %, переважно щонайменше 65 %, переважно щонайменше 70 %, переважно щонайменше 75 %, переважно щонайменше 80 %, переважно щонайменше 85 %, переважно щонайменше 90 %, переважно щонайменше 95 % від загальної кількості такого антигену, який міститься в композиції, знаходиться в адсорбованій формі. За винаходом антиген Hib зберігається неадсорбованим на AlOOH, що означає, що щонайменше 65 %, переважно щонайменше 70 %, переважно щонайменше 75 % від загальної кількості цього антигену, який міститься в композиції, міститься в неадсорбованій формі. За винаходом період часу, під час якого поверхневий антиген гепатиту В зберігається адсорбованим на AlOOH, і антиген Hib зберігається неадсорбованим, становить щонайменше 3 місяці, переважно щонайменше 6 місяців, переважно щонайменше 12 місяців, переважно щонайменше 18 місяців, переважно щонайменше 24 місяці, більш переважно щонайменше 36 місяців, починаючи від дати виробництва композиції, коли температура зберігання становить 5±3 °C. Переважно кількість адсорбованих або неадсорбованих антигенів є стабільною протягом тривалого періоду часу, але вона також може змінюватися, за умови, що вона залишається в прийнятних межах. Таким чином, коли щонайменше 85 % від загальної кількості HBsAg, що міститься в композиції, адсорбовано на AlOOH протягом 3 місяців, починаючи із дати 2 UA 113000 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 виробництва композиції, яка зберігається при температурі 5±3 °C, також можливим є те, що після одного року і також за аналогічних умов зберігання 80 % від загальної кількості HBsAg, що міститься в композиції, зберігається адсорбованим. Для оцінки кількості адсорбованого антигену фахівці в даній галузі можуть використовувати будь-який відомий спосіб. Щодо визначення процента адсорбції HBsAg можна використовувати спосіб сендвіч-ELISA відповідно до правил, встановлених European pharmacopeia 2.7.1. У короткому викладі HBsAg захоплюється первинним моноклональним антитілом проти HBsAg типу IgM в ямках 96ямкового планшета. Зв'язаний таким чином HBsAg покривають вторинним моноклональним антитілом проти HBsAg типу IgG, яке, своєю чергою, детектують за допомогою зв'язаного із пероксидазою поліклонального антитіла проти IgG. Хромогенний субстрат для пероксидази тетраметилбензидин (TMB) служить як проявляючий засіб. При його додаванні проявляється забарвлення, інтенсивність якого є пропорційною до кількості HBsAg, захопленого в ямці. Результати аналізують способом паралельних ліній, описаним в European pharmacopeia 5.3.3. Процент адсорбції отримують на основі визначення загального вмісту HBsAg і вмісту неадсорбованого HBsAg. Щодо кількості неадсорбованого PRP-T можна проводити оцінку за допомогою HPAEC-PAD (високоефективною іонообмінною хроматографією - імпульсною амперометричною детекцією). Згідно зі способом за винаходом поверхневий антиген гепатиту В адсорбується на AlOOH. Цей етап можна провести, приводячи поверхневий антиген гепатиту В і AlOOH в контакт за відсутності будь-якого іншого антигену і залишаючи поверхневий антиген гепатиту В адсорбуватися на AlOOH протягом щонайменше 4 годин, переважно щонайменше 12 годин, більш переважно від 20 до 24 годин, таким чином, щоб отримувати препарат, який містить комплекс AlOOH/HBsAg. За винаходом таку адсорбцію можна проводити за відсутності фосфатних іонів. Мета, переслідувана шляхом збільшеного часу контактування поверхневого антигену гепатиту В і AlOOH, полягає в максимальному збільшенні електростатичних взаємодій і в забезпеченні стабільних взаємодій, які можуть, таким чином, приводити до адсорбції шляхом заміщення ліганду. Це контактування переважно проводять при перемішуванні. Згідно зі способом за винаходом комплекс AlOOH/HBsAg змішують із антигеном Hib в присутності катіонних амінокислот і фосфатних іонів. Для цілей винаходу термін "катіонні амінокислоти" призначений для позначення амінокислот, pH яких є вищим, ніж pH вакцинної композиції, і які, таким чином, знаходяться в катіонній формі при pH вакцини, зокрема, вони являють собою лізин (Lys), аргінін (Arg) або гістидин (His); кожну із цих амінокислот можна використовувати окремо, у вигляді суміші по 2 (Lys+Arg; Lys+His; Arg+His) або всі 3 разом (Lys+Arg+His). В одному конкретному варіанті здійснення катіонні амінокислоти можуть бути асоційовані в формі дипептиду. Зокрема, можна вказати дипептиди Lys-Lys, Lys-Arg, Lys-His, Arg-Arg, Arg-Lys, Arg-His, His-His, His-Lys і His-Arg. Альтернативно, дипептид, придатний для цілей даного винаходу, може складатися із катіонної амінокислоти і незарядженої амінокислоти, яка вибрана із Ala, Val, Leu, Iso, Pro, Met, Phe, Trp, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asp і Gln. Таким чином, на практиці можна використовувати препарат, який містить одну або більше катіонних амінокислот у вільній формі і/або формі дипептиду. Також можливо використовувати препарати амінокислот, які містять катіонні амінокислоти в бажаній кількості, у вигляді суміші з іншими амінокислотами. Для того, щоб не отримувати дуже велике падіння pH під час додавання амінокислот, можна передбачати підвищення pH препарату, який містить амінокислоти, перед їх додаванням до комплексу AlOOH/HBsAg, за допомогою основи, зокрема гідроксиду натрію. За винаходом кількість катіонних амінокислот, які містяться в кінцевому результаті у вакцинній композиції, повинна становити щонайменше 100 мг/л, переважно щонайменше 300 мг/л, переважно щонайменше 400 мг/л, більш переважно щонайменше 500 мг/л. Не існує критичної максимальної дози. Однак переважно, щоб максимальна кількість становила не більше 2 мг/мл, більш переважно не більше 1 мг/мл, більш переважно не більше 800 мкг/мл, більш переважно не більше 700 мкг/мл. Коли додають розраховану кількість катіонних амінокислот, необхідно враховувати катіонні амінокислоти, які можуть вводитися із середовищем, в якому містяться антигени, відмінні від HBsAg і антигену Hib. Згідно з одним із альтернативних способів можна визначати кількість катіонних амінокислот відносно маси капсулярного полісахариду Hib і забезпечувати масове відношення полісахарид Hib/катіонна амінокислота від 1:4 до 1:100, переважно від 1:10 до 1:80, переважно від 1:15 до 1:60 або особливо переважно від 1:20 до 1:30 або 40. Згідно зі способом за винаходом комплекс AlOOH/HBsAg змішують із антигеном Hib в присутності катіонних амінокислот, а також у присутності фосфатних іонів. За одним із варіантів 3 UA 113000 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 здійснення винаходу фосфатні іони додають до комплексу AlOOH/HBsAg перед тим, як їх приводять у контакт з антигеном Hib. Введення фосфатних іонів можна, наприклад, проводити шляхом додавання вторинного кислого фосфату натрію або вторинного кислого фосфату калію, або ж у вигляді суміші двох. Кількість фосфатних іонів розраховують таким чином, щоб адсорбованим AlOOH залишалося максимальна кількість поверхневих антигенів гепатиту В, при цьому одночасно запобігаючи адсорбції антигену Hib. Ця кількість змінюється залежно від природи і кількості антигенів, які містяться, і, зокрема, залежно від антигенів, відмінних від антигенів HBsAg і Hib. Таким чином, для вакцинної комбінації, яка містить антигени, які звичайно використовуються у вакцинах для дітей, які є в доповнення до HBsAg і антигену Hib, антигенів дифтерії, правця і коклюшу, переважним може бути додавання фосфатних іонів таким чином, що концентрація фосфатних іонів, яка отримується у вакцинній композиції в кінцевому результаті щонайменше дорівнює 35 ммоль/л і більш конкретно становить від 35 до 45 ммоль/л, включаючи межі, переважно від 38 до 44 ммоль/л, включаючи межі, більш переважно від 38 до 42 ммоль/л, включаючи межі. За одним переважним варіантом здійснення кінцева концентрація фосфатних іонів, яка отримується, у вакцинній композиції становить 40 ммоль/л. За одним альтернативним варіантом здійснення фосфатні іони додають у такій кількості, щоб вони містилися у вакцинній композиції в кінцевій концентрації від 35 до 38 ммоль/л, включаючи межі. Це отримують також додаванням карбонатних іонів, але, проте, в обмеженій кількості, так як фактично зазначали, що надмірна кількість карбонатних іонів є несприятливою. Переважно їх можна додавати у такій кількості, щоб вони містилися у вакцинній композиції в кінцевій концентрації, меншій або такій, що дорівнює 10 ммоль/л. Щоб уникнути надмірного іонного впливу, який може дестабілізувати HBsAg і сприяти його десорбції, рекомендують додавати фосфатні іони декількома (приклад 2) окремими операціями (етапами). Таким чином, фосфатні іони можна додавати при першій операції в кількості, яка дозволяє отримувати кінцеву концентрацію від 20 до 30 ммоль/л, включаючи межі, потім при другій операції у кількості, яка дозволяє отримувати кінцеву концентрацію, як конкретно вказано вище. За одним переважним варіантом здійснення способу за винаходом, крім того, перед змішуванням антигену Hib із комплексом AlOOH/HBsAg pH препарату, який отримується, доводять до 7,1±0,1. Фактично зазначали, що таке значення pH здійснює позитивну дію на збереження антигену Hib у неадсорбованому стані. За одним конкретним варіантом здійснення, крім того, після змішування фаз pH доводять до 7,1±0,1. Таким чином, способом за винаходом можна отримувати вакцинну композицію, у якій: (i) щонайменше 60 % або 80 %, переважно щонайменше 85 % від загальної кількості поверхневого антигену гепатиту В, який міститься в композиції, є адсорбованим на AlOOH протягом щонайменше 3 місяців, починаючи із дати виробництва композиції, яка зберігається при температурі 5±3 °C, і (ii) щонайменше 65 %, 70 % або 75 % від загальної кількості антигену Hib, який міститься в композиції, не є адсорбованим на AlOOH. Вираз "комплекс AlOOH/HBsAg" потрібно інтерпретувати, як такий, який означає, що комплекс містить щонайменше антиген HBsAg, адсорбований на AlOOH. Комплекс може містити інші антигени, незважаючи на те, вказані вони чи не вказані. Крім того, один або більше додаткових антигенів можуть утворювати комплекс. Зокрема, вони можуть являти собою дифтерійний анатоксин (D), правцевий токсин (Т), безклітинні антигени коклюшу, такі, як: знешкоджений токсин Bordetella pertussis (PTxd), фімбріальний гемаглютинін (FHA), петрактин (антиген 69 кДа) і аглютиногени (фімбрії) деяких таких бактерій. Згідно з одним особливо ефективним варіантом здійснення для утворення комплексу можна додавати антигени D, Т, PTxd і FHA. Додаткові антигени можна додавати різними способами. Їх можна додавати послідовно після поверхневого антигену гепатиту В, заздалегідь адсорбованого (i) на загальній кількості AlOOH, яка повинна міститися у вакцинній композиції, (ii) або на частковій кількості, яка потім додається для отримання загальної кількості. Альтернативно, додаткові антигени можна адсорбувати окремо, кожний на частковій кількості AlOOH, також як HBsAg. Також можна забезпечувати спосіб змішаної адсорбції, де деякі антигени адсорбують окремо, інші адсорбують послідовно. За одним конкретним варіантом здійснення способу за винаходом після додавання кожного антигену композицію, яка отримується, перемішують. 4 UA 113000 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 За одним переважним варіантом здійснення, який наводиться тільки як приклад, HBsAg адсорбують окремо на частковій кількості AlOOH, яка відповідає приблизно 30 % (третині) від загальної кількості AlOOH, яка міститься в кінцевій композиції. Паралельно антигени D і Т послідовно адсорбують на додатковій частині AlOOH. Потім до препарату, який містить комплекс AlOOH-D-T, додають антигени коклюшу PTxd і FHA, де кожний з цих двох антигенів коклюшу, своєю чергою, заздалегідь адсорбували на AlOOH. На завершення об'єднують два препарати (комплекс AlOOH-HBsAg і комплекс AlOOH-D-T-PTxd-FHA) таким чином, щоб отримувати препарат, який містить AlOOH-HBsAg-D-T-PTxd-FHA, у якому кількості кожного із елементів вибирали, щоб отримувати дози вакцин 0,5 мл, які загальноприйнято містять: - від 5 до 15 мкг HBsAg/доза, переважно 10 мкг/доза, - від 20 до 40 Lf D/доза, переважно від 25 до 35 Lf/доза, більш переважно 30 Lf/доза (Lf межа флокуляції) (яка виражається іншим чином, кількість D є більшою або дорівнює 20 МОд/доза), - від 5 до 25 Lf Т/доза, переважно від 10 до 15 Lf/доза, більш переважно 10 Lf/доза (яка виражається іншим чином, кількість Т є більшою або дорівнює 40 МОд/доза), - від 20 до 30 мкг FHA/доза, переважно 25 мкг/доза, - від 20 до 30 мкг PTxd/доза, переважно 25 мкг/доза. Згідно із одним конкретним варіантом здійснення винаходу також додають антигени поліомієліту, які загальноприйнято складаються з інактивованих вірусів. Можна передбачати додавання 3 типів, як правило, які містяться у вакцинах для дітей, тобто типи 1, 2 або 3, або також у випадку, коли немає необхідності вакцинувати проти 3 типів, вводити тільки типи, від яких мають намір забезпечувати захист. Кількості поліовірусу у дозі, зокрема, можуть складати: - від 20 до 43 DU (одиниць антигену D), зокрема 40 для 1 типу, - від 5 до 9 DU, зокрема 8 для 2 типу, - від 17 до 36 DU, зокрема 32, для 3 типу. Ці антигени необов'язково заздалегідь адсорбують на солі алюмінію перед додаванням у вакцинний препарат. Згідно із одним конкретним варіантом здійснення спосіб за винаходом являє собою спосіб, де: (i) (a) HBsAg і AlOOH приводять у контакт за відсутності будь-якого іншого антигену і залишають HBsAg адсорбуватися на AlOOH протягом щонайменше 4 годин, переважно щонайменше 12 годин, більш переважно приблизно 24 годин, таким чином, щоб отримувати препарат, який містить комплекс AlOOH/HBsAg; (i) (b) до препарату, який отримується в пункті (i) (a), додають препарат, який містить антигени D, Т, PTxd і FHA, заздалегідь адсорбовані на AlOOH, і необов'язково додаткові антигени Bordetella pertussis, такі, як петрактин і аглютиногени; (ii) до препарату, який отримується у пункті (i) (b), додають фосфатні іони, щоб отримувати кінцеву концентрацію у вакцині 40 ммоль/л; (iii) до препарату, який отримується в пункті (ii), необов'язково додають антигени поліомієліту; (iv) до препарату, який отримується в пункті (ii) або (iii), додають препарат, який містить антиген Hib; (v) pH доводять до 7,1±0,1, і (vi) (a) перед додаванням антигену Hib додають щонайменше одну катіонну амінокислоту таким чином, щоб доповнювати препарат, який отримується в пункті (ii) або (iii), або (b) до антигену Hib додають щонайменше одну катіонну амінокислоту; де вказану катіонну амінокислоту додають у кількості, достатній для отримання кінцевої концентрації у вакцині щонайменше 100 мг/л. Згідно з одним конкретним варіантом здійснення вакцинна композиція за винаходом являє собою композицію, яка містить HBsAg, дифтерійний токсин D, правцевий токсин Т, антигени коклюшу PTxd і FHA, заздалегідь адсорбовані на AlOOH, антиген Hib і необов'язково валентність поліомієліту, у якій: (i) щонайменше 85 %, переважно щонайменше 90 % від загальної кількості HBsAg, яка міститься в композиції, зберігається адсорбованим на AlOOH протягом щонайменше 3 місяців, починаючи з дати виробництва композиції, яка зберігається при температурі 5±3 °C, і (ii) щонайменше 65 %, 70 % або переважно 75 % від загальної кількості антигену Hib, який міститься в композиції, не є адсорбованим на AlOOH, де ця кількість залишається відносно стабільною протягом тривалого періоду часу. 5 UA 113000 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Крім того, способом за винаходом також забезпечують збереження в адсорбованому стані відмінних від HBsAg антигенів, для яких продемонстровано, що перевагою є те, що вони повинні бути адсорбовані на оксигідроксиді алюмінію, щоб бути імуногенними. Таким чином, як приклад вказують, що композиція за винаходом може містити: - від 10 до 30 мкг HBsAg/мл, переважно 20 мкг/мл; - від 40 до 80 Lf D/мл, переважно від 50 до 70 Lf/мл; - від 10 до 50 Lf Т/мл, переважно від 10 до 30 Lf/мл; - від 40 до 60 мкг FHA/мл, переважно 50 мкг/мл; - від 40 до 60 мкг PTxd/мл, переважно 50 мкг/мл; - від 2 до 60 мкг PRP/мл, переважно 20-24 мкг/мл; - від 1 до 2 мг AlOOH/мл, переважно 1,2 мг AlOOH/мл; - фосфатні іони в концентрації від 35 до 45 ммоль/л, переважно від 38 до 42 ммоль/л фосфатних іонів; - від 100 до 1000 мкг/мл катіонних амінокислот, переважно від 400 до 800 мкг/мл, і необов'язково - 1, 2 і 3 типи поліовірусу в неактивованій формі у відповідній кількості 80, 16 і 64 DU/мл. Як указано вище, композиція за винаходом також може містити додаткові антигени Bordetella pertussis, такі, як петрактин (69 кДа) або аглютиногени. Опис креслень: фіг. 1 являє собою схему способу відомого рівня техніки, де змішування проводять після додавання кожного компонента. ПРИКЛАД - Отримання в промисловому масштабі нефасованої (250 л) шестивалентної вакцини HepB-Dt-Tt-Pertussis-поліомієліт-HiB Таке отримання проводять в стерильних умовах і при постійному перемішуванні. А - Отримання HBsAg, адсорбованого на AlOOH Гомогенну суспензію гелю оксигідроксиду алюмінію (AlOOH), яка постачається Brenntag AG, при 8 г алюмінію/л в стерильних умовах вводили в 50-л резервуар. Після фільтрування через 0,22-мкм фільтр у резервуар, який вже містить AlOOH, безперервно додавали об'єм HBsAg, необхідний для отримання концентрації в кінцевій вакцині 20 мкг/мл. Суміш залишали при перемішуванні протягом 20-24 годин при температурі навколишнього середовища таким чином, щоб отримувати гомогенну суспензію. В - Отримання D+Т+PTxd+FHA, адсорбованих на гелі алюмінію Паралельно отримують суміш гелю алюмінію, дифтерійного анатоксину (D), правцевого токсину (Т), анатоксину Bordetella pertussis (PTxd) і фімбріального гемаглютиніну (FHA) Bordetella pertussis поданим нижче способом. У 250-л резервуар вносять у стерильних умовах гомогенну суспензію гелю AlOOH, яка постачається Brenntag AG, при 8 г алюмінію/л. У 250-л резервуар, який вже містить AlOOH, після фільтрування через 0,22-мкм фільтр послідовно вводять розчини D, а потім після гомогенізації Т, для отримання відповідних концентрацій D і Т в кінцевій вакцині 60 Lf (межа флокуляції)/мл і 20 Lf/мл. Після отримання гомогенної суміші в цей резервуар послідовно вводять в стерильних умовах суспензію PTxd, заздалегідь адсорбованого на AlOOH, а потім суспензію FHA, заздалегідь адсорбованого на AlOOH, для отримання концентрацій PTxd і FHA у кінцевій вакцині 25 мкг/мл. На закінчення після фільтрування через 0,22-мкм фільтр додають об'єм 500 мМ фосфатного буфера, необхідний для отримання концентрації фосфатних іонів від 20 до 30 ммоль/л. Суспензію D-T-PTxd-FHA-AlOOH, яка отримується, залишають перемішуватися протягом щонайменше 14 годин при температурі 5±3 °C. С - Отримання суміші HBsAg+D+Т+PTxd+FHA, адсорбованих на гелі алюмінію Препарат, отриманий в пункті А, додають у стерильних умовах до препарату, отриманого в пункті В. Цю суміш залишають перемішуватися таким чином, щоб отримувати гомогенну суспензію. Потім об'єм додають 500 мМ фосфатного буфера, необхідний для отримання концентрації фосфатних іонів 40 ммоль/л в кінцевій композиції, після фільтрування через 0,22-мкм фільтр. D - Насичення електростатичних ділянок комплексу гелю алюмінію/HBsAg+D+Т+PTxd+FHA розчином амінокислот Отримують розчин амінокислот, який містить 12 незамінних амінокислот, що має подану нижче композицію: - гідрохлорид аргініну 2,1 г/л, тобто 1,73 г/л аргініну; - цистин 1,2 г/л; 6 UA 113000 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 - гістидин 0,8 г/л; - ізолейцин 2,6 г/л; - лейцин 2,6 г/л; - гідрохлорид лізину 3,65 г/л, тобто 2,91 г/л лізину; - метіонін 0,75 г/л; - фенілаланін 1,65 г/л; - треонін 2,4 г/л; - триптофан 0,4 г/л; - тирозин 1,8 г/л; - валін 2,35 г/л. Таким чином отримують 21,2 г/л амінокислот, включаючи 5,44 г/л катіонних амінокислот (HisArg-Lys). Додають 450 мл 2,5 н. гідроксиду натрію (NaOH) (0,5 л/хв.). Продовжують проводити гомогенізацію при перемішуванні протягом 10 хвилин. Цей розчин амінокислот, профільтрований через 0,22-мкм фільтр, безперервно додають у суміш, отриману в пункті С, таким чином, щоб отримувати концентрацію 572 мкг/мл катіонних амінокислот в кінцевій композиції. Е - Доведення pH pH суспензії, отриманої в пункті D, регулюють до pH 7,1 (7,0-7,2) із використанням профільтрованого вихідного 2,5 н. розчину гідроксиду натрію. F - Додавання антигенів поліомієліту Потім у резервуар, який містить суспензію, отриману в пункті Е, вводять препарат, який містить 1, 2 і 3 серотипи поліовірусу в неактивованій формі (штами Mahoney, MEF-1 і Saukett відповідно), профільтрований через 0,22-мкм фільтр. G - Додавання PRP-T Спочатку отримують проміжний розчин PRP-T наступним чином: до препарату PRP-T, профільтрованого через 0,22-мкм фільтр, додають Tris-сахарозний буфер, заздалегідь профільтрований через 0,22-мкм фільтр, щоб отримати проміжну суміш. Цю суміш вводять у стерильних умовах в суміш, яка отримана в пункті F. Н - Кінцева фаза регуляції Після гомогенізації суспензії, яка отримана в пункті G, додають достатню кількість заздалегідь профільтрованої води PPI для отримання цільового об'єму 250 л. Потім за необхідності доводять pH суміші до pH 7,1±0,1, додаючи заздалегідь профільтрований 2,5 н. розчин гідроксиду натрію або 10 % розчин оцтової кислоти. Суміш зберігають при 5±3 °C, потім розподіляють у шприци або флакони в пропорції 0,5 мл/доза. 3+ Таким чином, одна 0,5-мл доза містить 600 мкг Al , 10 мкг HBsAg, не менше 20 МОд D, не менше 40 МОд Т, 25 мкг Pt, 25 мкг FHA, від 20 до 43 DU (антигенних одиниць D) поліомієліту 1 типу, від 5 до 9 DU поліомієліту 2 типу, від 17 до 36 DU поліомієліту 3 типу, 12 мкг PRP (в формі PRP-T), фосфатні іони в концентрації 40 ммоль/л, Tris-сахарозний буфер у концентрації 2,5 ммоль/л Tris і 2,125 % сахарози, а також 286 мкг катіонних амінокислот (His-Arg-Lys). Клінічне випробування У клінічному випробуванні тестували вакцинну композицію, яка отримана згідно із вказаним вище прикладом, порівняно із шестивалентною вакциною Infanrix Hexa™, вже представленою на ринку, яка забезпечує можливість вакцинації дітей від таких же захворювань, як вакцина, яка отримується за винаходом (від дифтерії, правця, коклюшу, поліомієліту, інфекцій Hib і гепатиту В), але яка, зокрема, має недолік, який полягає в тому, що вона містить ліофілізовану частину, і, таким чином, перед процедурою введення необхідною є операція відновлення ліофілізату. Під час клінічного випробування дітям вводили 2 типи вакцинних композицій за схемою вакцинації, яка включає 3 дози, які вводяться в 2, 4 і 6 місяців. Продемонстровано, що рідка вакцина, яка отримується способом за винаходом, є такою, що дуже добре переноситься, і такою ж імуногенною, як вакцина, яка представлена на ринку. ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНІ ДАНІ Процент адсорбції HBsAg/кількість неабсорбованого PRP-T Три серії кінцевого нефасованого продукту (PFV39-41-42), а також три серії розподіленого по флаконах (S12-13-14) - всі серії отримували згідно із наданим прикладом - зберігали при +5 °C і аналізували у різні моменти часу протягом періоду 9 і 22 місяці відповідно. Аналіз стосувався процента адсорбції HBsAg і кількості неабсорбованого PRP-T. Визначення процента адсорбції HBsAg проводили, як указано вище, починаючи визначення загального вмісту HBsAg і вмісту неадсорбованого HBsAg, де визначення HBsAg проводили із 7 UA 113000 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 використанням способу сендвіч-ELISA відповідно до правил, які визначаються European pharmacopeia 2.7.1. У короткому викладі, HBsAg захоплювався первинним моноклональним антитілом проти HBsAg типу IgM в ямках 96-ямкового планшета. Зв'язаний таким чином HBsAg покривали вторинним моноклональним антитілом проти HBsAg типу IgG, яке, своєю чергою, детектували за допомогою зв'язаного із пероксидазою IgG поліклонального антитіла проти IgG. Хромогенний субстрат для пероксидази тетраметилбензидин (TMB) служив як проявляючий засіб. При його додаванні проявляється забарвлення, інтенсивність якого була пропорційною до кількості HBsAg, захопленого в ямці. Результати аналізували способом паралельних ліній, описаним в European pharmacopeia 5.3.3. Для визначення процента адсорбції HBsAg вакцину піддавали центрифугуванню (8800 g, 5 хвилин, 20 °C), що дозволяло збирати супернатант, який містить неадсорбований BsAg. Зразки супернатантів, які необхідно тестувати, розбавляли буфером для ELISA, який містить десорбційний буфер, в 2-разовому серійному розведенні у діапазоні, наприклад, від 1/400 до 1/12800. Зразки загальної вакцини і стандартного діапазону розбавляли буфером ELISA, який містить десорбційний буфер, в 2-разовому серійному розведенні у діапазоні, наприклад, від 1/8 до 1/25600. 96-ямковий планшет, покритий первинним моноклональним антитілом, інкубували протягом 12 годин при 5 °C, а потім промивали розчином PBS-Tween 20. Розбавлення супернатантів загальної вакцини і стандартного діапазону розподіляли по ямках. Потім додавали вторинне антитіло і проводили проявлення із використанням зв'язаного із пероксидазою антитіла і TMB (тетраметилбензидину). Реакцію зупиняли додаванням 1 н. HCl. Після кожного етапу планшет інкубували протягом 30 хвилин при 25 °C, а потім послідовно промивали розчином PBS-Tween 20. Холосту пробу (буфер для розведення) додавали в доступну ямку і піддавали аналогічним обробкам. Планшет зчитували при OD 450 і 630 нм. Кількість неадсорбованого PRP-T оцінювали HPAEC-PAD (високоефективною аніонообмінною хроматографією - імпульсною амперометричною детекцією) поданим нижче способом. Спочатку отримували стандартний діапазон PRP-T еталона від 0,5 до 12,5 мкг/мл. Зразки, які необхідно тестувати, а також зразки стандартного діапазону центрифугували при 5000 g протягом 5 хвилин при температурі навколишнього середовища. Збирали супернатанти, а потім піддавали гідролізу 1,5 н. розчином NaCl, який містить глюкозамін-1-фосфат як внутрішній стандарт. Додавали холосту пробу (0,9 % NaCl, 1,5 н. NaOH+внутрішній стандарт). Проводили хроматографію із рухомою фазою, яка складається із 35 мМ NaOH і 114 мМ ацетату натрію, які впорскуються в колонку зі швидкістю 1,2 мл/хв. Концентрацію неадсорбованого PRP (мкг/мл) розраховували із використанням наступного рівняння: (площа поверхні піка PRP/площа поверхні піка внутрішнього стандарту)=a×[концентрація PRP]+b, у якому "a" являє собою нахил, і "b" являє собою відрізок на осі у, де а і b визначають на основі лінії регресії. Результати наведені в 4 таблицях нижче: Процент адсорбції HBsAg у складі кінцевого нефасованого продукту (PVF 39-41-42) при +5 °C Час, який пройшов після операції формулювання 0 1 місяць 2 місяці 3 місяці 4 місяці 5 місяців 6 місяців 9 місяців 8 PFV39 95 92 92 91 89 85 89 88 PFV41 97 93 92 90 90 88 88 86 PFV42 98 95 93 91 92 91 89 91 UA 113000 C2 Процент адсорбції HBsAg в складі, який зберігається у флаконах (серії S12-S13-S14) при +5 °C Час, який пройшов після операції формулювання 0 4 місяці 5 місяців 7 місяців 10 місяців 13 місяців 16 місяців 22 місяці S12 95 88 85 85 83 82 81 83 S13 97 88 86 80 84 86 83 78 S14 98 90 88 86 87 84 85 86 Неадсорбований PRP-T (мкг/мл) в складі кінцевого нефасованого продукту (PVF 39-41-42) при +5 °C Час, який пройшов після операції формулювання 0 1 місяць 2 місяці 3 місяці 4 місяці 5 місяців 6 місяців 9 місяців PFV39 22,6 23,1 23,3 24,9 24,2 22,2 27,7 27,0 PFV41 20,0 19,5 21,6 22,6 22,0 22,7 22,9 24,8 PFV42 21,0 20,4 22,0 23,1 20,7 24,5 21,6 23 Неадсорбований PRP-T (мкг/мл) у складі, який зберігається у флаконах (серії S12-S13-S14) при +5 °C Час, який пройшов після операції формулювання 0 4 місяці 5 місяців 7 місяців 10 місяців 13 місяців 16 місяців 22 місяці 5 10 15 S12 22,6 21,1 23,0 23,1 25,0 24,6 23,5 23,9 S13 20,0 21,1 19,6 21,0 23,4 22,6 22,3 22,0 S14 21,0 19,8 18,6 19,5 21,8 20,8 20,8 19,9 Для порівняння також протягом певного періоду часу тестували адсорбцію HBsAg, який міститься в трьох серіях кінцевого нефасованого продукту (FDN5-6-7), а також у трьох серіях розподіленого по флаконах (S 44-45-46), рідкого препарату, який складається із аналогічних антигенів, але який отримується способом лінійного формулювання, описаного на фіг. 1, і таким чином відмінного від способу, описаного в прикладі вище. Цей препарат містив в 0,5 мл: 10 мкг HBsAg, 30 Lf Dt, 10 Lf Tt, 25 мкг Pt, 25 мкг FHA, 40 DU полівірусу 1 типу, 8 DU полівірусу 2 типу, 32 DU полівірусу 3 типу, 12 мкг PRP (у формі PRP-T), 0,6 мг Al, фосфатні іони в концентрації 55 ммоль/л, карбонатні іони в концентрації 20 ммоль/л, Tris-сахарозний буфер у концентрації 2,5 ммоль/л відносно Tris і 2,125 % відносно сахарози і 14 мкг катіонних амінокислот (His-Arg-Lys), які отримуються із середовища M199 (валентність поліомієліту), pH 6,8-7,2. Результати, які отримуються, були такими, як зазначено нижче: 9 UA 113000 C2 Процент адсорбції HBsAg у складі кінцевого нефасованого продукту (FDN5-6-7) при +5 °C Час, який пройшов після операції формулювання 0 1 місяць 2 місяці 3 місяці 6 місяців FDN5 81 78 74 66 61 FDN6 85 82 78 84 77 FDN7 81 62 63 62 61 Процент адсорбції HBsAg у складі, який зберігається у флаконах (серії S44-S45-S46) при +5 °C Час, який пройшов після операції формулювання 0 7 місяців 10 місяців 13 місяців 16 місяців 22 місяці 28 місяців 34 місяці 40 місяців 5 10 15 S44 81 63 57 47 33 44 44 45 49 S45 85 64 65 54 56 47 51 54 52 S46 81 77 51 53 38 36 44 42 48 Кількості неадсорбованого PRP-T, який вимірюється протягом аналогічного періоду часу, демонстрували, що існувала невелика зміна порівняно із моментом часу 0 і, таким чином, була задовільною. Однак ці результати демонструють, що, у цьому випадку, який не стосується складу, який отримується способом за винаходом, поверхневий антиген гепатиту В не зберігався адсорбованим на оксигідроксиді алюмінію. Експериментальні дані, які стосуються катіонних амінокислот Порівнювали композицію за винаходом, яка отримується безпосередньо за експериментальним протоколом, який проводиться в наданому прикладі, і композицію, яка отримується за протоколом, модифікованим таким чином, що композицію, яка містить тільки три катіонні амінокислоти (Arg-Lys-His), замінювали на композицію із 12 незамінних амінокислот, відносно неадсорбованої кількості PRP-T в кінці. Не спостерігали якої-небудь відмінності кількості неадсорбованого PRP-T, таким чином, демонструючи, що важливими є тільки катіонні амінокислоти. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 20 25 30 35 1. Спосіб отримання рідкої вакцинної комбінації, яка містить щонайменше: оксигідроксид алюмінію (АlOОН), один поверхневий антиген гепатиту В (HBsAg), один антиген Haemophilus influenzae типу b (Hib), який складається із капсулярного полісахариду, кон'югованого із білком-носієм, у якій поверхневий антиген гепатиту В зберігається адсорбованим на АlOОН, тоді як антиген Hib зберігається неадсорбованим, згідно із яким: поверхневий антиген гепатиту В адсорбують на АlOОН для отримання комплексу АlOОН/HBsAg, вказаний комплекс АlOОН/HBsAg змішують із антигеном Hib у присутності катіонних амінокислот у концентрації щонайменше 100 мг/л і фосфатних іонів в концентрації 35 до 45 ммоль/л. 2. Спосіб за п. 1, де антиген HBsAg адсорбують на алюмінії змішуванням суспензії АlOОН із суспензією HBsAg при перемішуванні протягом щонайменше 4 годин, переважно щонайменше 12 годин, переважно від 20 до 24 годин. 3. Спосіб за будь-яким із пп. 1 або 2, який відрізняється тим, що катіонні амінокислоти додають до вказаного комплексу АlOОН/HBsAg до змішування із антигеном Hib. 10 UA 113000 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 4. Спосіб за будь-яким із пп. 1 або 2, який відрізняється тим, що катіонні амінокислоти додають до вказаного антигену Hib до змішування із комплексом АlOОН/HBsAg. 5. Спосіб за будь-яким із пп. 1-4, який відрізняється тим, що фосфатні іони додають до вказаного комплексу АlOОН/HBsAg до змішування із антигеном Hib. 6. Спосіб за будь-яким із пп. 1-5, який відрізняється тим, що рН препарату, який містить комплекс АlOОН/HBsAg, доводять до 7,1±0,1 до змішування із антигеном Hib. 7. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що він також включає: отримання композиції, яка містить щонайменше один антиген, вибраний із антигенів дифтерії, правця, поліомієліту і коклюшу, а також оксигідроксид алюмінію, і змішування вказаного комплексу АlOОН/HBsAg із вказаною композицією до проведення змішування із антигеном Hib. 8. Спосіб за п. 7, який відрізняється тим, що він включає отримання вказаної композиції шляхом послідовного додавання кожного з антигенів до суспензії оксигідроксиду алюмінію і перемішування між кожним додаванням антигенів. 9. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що: HBsAg адсорбують на частковій кількості АlOОН, що представляє третину від загального АlOОН, що міститься в кінцевій композиції, протягом періоду від 20 до 24 годин для отримання комплексу АlOОН/HBsAg, паралельно на додатковій кількості АlOОН послідовно адсорбують: дифтерійний токсин D, правцевий токсин Т, очищений токсин PTxd Bordetella pertuss, своєю чергою, заздалегідь адсорбований на АlOОН, і фімбріальний гемаглютинін FHA Bordetella pertussis, своєю чергою, заздалегідь адсорбований на АlOОН, потім до них додають фосфатні іони, потім до них додають комплекс АlOОН/HBsAg, знову додають фосфатні іони у кількості, яка забезпечує отримання концентрації у кінцевій композиції 40 ммоль/л, додають щонайменше одну катіонну амінокислоту у кількості, яка забезпечує отримання концентрації у кінцевій композиції щонайменше 100 мг/л, рН доводять до 7,1±0,1, додають антигени поліомієліту у формі інактивованих вірусів 1 типу і/або 2 типу, і/або 3 типу, додають антиген Hib, рН доводять до 7,1±0,1, композицію, яка отримується, розподіляють у шприци або у флакони. 10. Спосіб за будь-яким із пп. 1-9, який відрізняється тим, що у промисловому масштабі отримують щонайменше 250 л вакцинної композиції. 11. Вакцинна композиція, яка отримана способом за будь-яким із пп. 1-10 і містить щонайменше поверхневий антиген гепатиту В (HBsAg) і антиген Hib, який складається із полірибозилрибітолфосфату, кон'югованого із правцевим білком (PRP-T). 12. Вакцинна композиція за п. 11, яка відрізняється тим, що вона додатково містить антигени дифтерії, правця, поліомієліту і коклюшу. 13. Вакцинна композиція за будь-яким із пп. 11 або 12, яка відрізняється тим, що вона містить щонайменше: поверхневий антиген гепатиту В, HBsAg, антиген дифтерії у формі дифтерійного токсину D, антиген правця у формі правцевого токсину Т, антигени коклюшу у формі очищеного токсину (PTxd) і фімбріального гемаглютиніну (FHA), антиген Haemophilus influenzae типу b у формі полірибозилрибітолфосфату, кон'югованого із правцевим білком (PRP-T), антигени поліомієліту у формі інактивованих вірусів, які вибирані із типів 1, 2 i 3. 14. Вакцинна композиція за п. 13, яка відрізняється тим, що вона містить щонайменше: від 10 до 30 мкг HBsAg/мл, переважно 20 мкг/мл, від 40 до 80 Lf D/мл, переважно від 50 до 70 Lf/мл, від 10 до 50 Lf Т/мл, переважно від 10 до 30 Lf/мл, від 40 до 60 мкг FHA/мл, переважно 50 мкг/мл, від 40 до 60 мкг PTxd/мл, переважно 50 мкг/мл, від 2 до 60 мкг PRP/мл, переважно 20-24 мкг/мл у формі кон'югату PRP-T, від 1 до 2 мг АlOОН/мл, переважно 1,2 мг АlOОН/мл, від 35 до 45 ммоль/л, переважно від 38 до 42 ммоль/л фосфатних іонів, від 100 до 1000 мг/л катіонних амінокислот, переважно від 400 до 800 мг/л, 1, 2 і 3 типи полівірусу в інактивованій формі у відповідній кількості 80, 16 і 64 DU/мл. 60 11 UA 113000 C2 Комп’ютерна верстка І. Скворцова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 12