Спосіб зв’язування множини цікавлячих несуміжних послідовностей

1. Спосіб зв’язування множини цікавлячих несуміжних нуклеотидних послідовностей, який передбачає: а) ампліфікацію цікавлячих нуклеотидних послідовностей за допомогою множинної молекулярної ампліфікації з використанням матриці, одержаної з виділеної окремої клітини; і b) зв’язування цікавлячих нуклеотидних послідовностей, ампліфікованих на стадії а); в якому цікавлячі нуклеотидні послідовності містять послідовності, які кодують варіабельні ділянки, і в результаті зв’язування утворюється родинна пара послідовностей, які кодують варіабельні ділянки. 2. Спосіб за п.1, в якому цікавлячі нуклеотидні послідовності містять послідовності, які кодують варіабельні ділянки імуноглобуліну, і в результаті зв’язування утворюється родинна пара, що складається з послідовності, яка кодує варіабельну ділянку легкого ланцюга, і зв'язаної з нею послідовності, яка кодує варіабельну ділянку важкого ланцюга. 3. Спосіб за п.1, в якому цікавлячі нуклеотидні послідовності є послідовностями, які кодують варіабельні ділянки Т-клітинного рецептора, і в результаті зв’язування утворюється родинна пара, що складається з послідовності, яка кодує варіабельну ділянку альфа-ланцюга, і зв'язаної з нею послідовності, яка кодує варіабельну ділянку бета-ланцюга, або послідовності, яка кодує варіабельну ділянку гама-ланцюга, і зв'язаної з нею послідовності, яка кодує варіабельну ділянку дельта-ланцюга. 4. Спосіб за п.1, в якому сімейство нуклеотидних UA (21) a200604286 (22) 17.09.2004 (24) 10.03.2010 (86) PCT/DK2004/000633, 17.09.2004 (31) 60/504,455 (32) 18.09.2003 (33) US (31) 60/504,589 (32) 18.09.2003 (33) US (31) PA 2003 01867 (32) 17.12.2003 (33) DK (31) PA 2004 00782 (32) 15.05.2004 (33) DK (46) 10.03.2010, Бюл.№ 5, 2010 р. (72) ОЛЕКСІЄВІЧ МАРТІН Б., DK, НІЛЬСЕН ЛАРС С., DK, АНДЕРСЕН ПЕТЕР С., DK, ХАНСЕН МАРГІТ Х., DK (73) СІМФОГЕН А/С, DK (56) WO A 9215678, 17.09.1992. WO A 9303151, 18.02.1993. WO A 9916904, 08.04.1999. EMBLETON M J ET AL: "IN-CELL PCR FROM MRNA AMPLIFYING AND LINKING THE REARRANGED IMMUNOGLOBULIN HEAVY AND LIGHT CHAIN V-GENES WITHIN SINGLE CELLS" NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 20, no. 15, 1992, pages 3831-3837, XP002309251 ISSN: 0305-1048. CORONELLA J A ET AL: "Amplification of IgG VH and VL (Fab) from single human plasma cells and B cells." NUCLEIC ACIDS RESEARCH. 15 OCT 2000, vol. 28, no. 20, 15 October 2000 (2000-10-15), pages E85.1-E85.7, XP002309252 ISSN: 1362-4962. BABCOOK J S ET AL: "A NOVEL STRATEGY FOR GENERATING MONOCLONAL ANTIBODIES FROM SINGLE, ISOLATED LYMPHOCYTES PRODUCING ANTIBODIES OF DEFINED SPECIFICITIES" PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF USA, NATIONAL ACADEMY OF SCIENCE. WASHINGTON, US, vol. 93, no. 15, 23 July 1996 (1996-07-23), pages 7843-7848, XP000608647 ISSN: 0027-8424. MULLINAX R L ET AL: "EXPRESSION OF A HETERODIMERIC FAB ANTIBODY PROTEIN IN ONE CLONING STEP" BIOTECHNIQUES, vol. 12, 2 (19) 1 3 послідовностей, які містять послідовності, що кодують варіабельні ділянки, ампліфікують, використовуючи множину праймерів. 5. Спосіб за п.1, в якому вказана множинна молекулярна ампліфікація являє собою ампліфікацію методом множинної RT-PCR. 6. Спосіб за п.5, в якому вказана ампліфікація методом множинної RT-PCR є двостадійним процесом, який передбачає окрему стадію зворотної транскрипції (RT), що виконується перед ампліфікацією методом множинної PCR. 7. Спосіб за п.5, в якому вказану ампліфікацію методом множинної RT-PCR здійснюють у вигляді однієї стадії, яка передбачає первинне введення в одну посудину всіх компонентів, необхідних для виконання як зворотної транскрипції (RT), так і ампліфікації методом множинної РCR. 8. Спосіб за п.1, в якому окрему клітину або популяцію генетично різних клітин одержують з фракції клітин, яка містить лімфоцити. 9. Спосіб за п.8, в якому фракція клітин, яка містить лімфоцити, входить до складу цільної крові, кісткового мозку, мононуклеарних клітин або лейкоцитів. 10. Спосіб за п.9, в якому фракція клітин, яка містить лімфоцити, збагачена клітинами Влімфоцитів. 11. Спосіб за п.10, в якому клітини з фракції клітин, яка містить лімфоцити, або лінія В-лімфоцитів збагачена плазматичними клітинами. 12. Спосіб за п.8, в якому клітини з фракції клітин, яка містить лімфоцити, лінії В-лімфоцитів або плазматичні клітини мають підвищену антигенну специфічність. 13. Спосіб за п.8, в якому фракція клітин, яка містить лімфоцити, збагачена клітинами Тлімфоцитів. 14. Спосіб за п.8, в якому антигенспецифічні Тклітини отримують шляхом стимуляції фракцій клітин, яка містить лімфоцити. 15. Спосіб за п.8, який додатково передбачає введення в вектор зв’язаних нуклеотидних послідовностей або бібліотеки родинних пар. 16. Спосіб за п.8, в якому перед виконанням стадії зворотної транскрипції і множинної молекулярної ампліфікації за рахунок інтенсивного ділення кожної виділеної окремої клітини отримують популяцію ізогенних клітин. 17. Спосіб за п.1, в якому вказане зв’язування цікавлячих нуклеотидних послідовностей виконують в тій же посудині, що і множинну молекулярну ампліфікацію. 18. Спосіб за будь-яким з пп.5-17, в якому вказане зв’язування цікавлячих нуклеотидних послідовностей виконують разом з ампліфікацією методом множинної PCR, використовуючи суміш множинних праймерів для подовження ланцюга шляхом перекривання. 19. Спосіб за будь-яким з пп.5-10, в якому вказане зв’язування цікавлячих нуклеотидних послідовностей виконують шляхом лігування. 20. Спосіб за п.1, в якому виконують додаткову молекулярну ампліфікацію, використовуючи суміш праймерів, адаптовану для ампліфікації цікавлячих зв'язаних послідовностей нуклеїнових кислот. 89761 4 21. Спосіб за п.18, в якому суміш множинних праймерів для подовження ланцюга шляхом перекривання містить набори праймерів, в яких принаймні один з праймерів набору містить кінцеву послідовність для подовження ланцюга за рахунок перекривання, здатного гібридизуватися з кінцевою послідовністю для подовження ланцюга за рахунок перекривання праймера другого набору праймерів. 22. Спосіб за п.18, в якому суміш множинних праймерів для подовження ланцюга шляхом перекривання включає: а) принаймні один праймер для CL або JL, комплементарний смисловому ланцюгу послідовності, яка кодує варіабельну ділянку легкого ланцюга імуноглобуліну; b) принаймні один 5'-кінцевий праймер для VL або праймер для VLL, комплементарний антисмисловій послідовності, яка кодує варіабельну ділянку легкого ланцюга імуноглобуліну, або лідерній послідовності варіабельної ділянки легкого ланцюга і здатний утворювати набір праймерів з праймером(ами) за пунктом а); с) принаймні один праймер для СН або JН, комплементарний смисловій послідовності, яка кодує константний домен важкого ланцюга імуноглобуліну, або послідовності, яка кодує зв'язуючу ділянку важкого ланцюга; і d) принаймні один 5'-кінцевий праймер для VН або праймер для VHL, комплементарний антисмисловому ланцюгу послідовності, яка кодує варіабельну ділянку важкого ланцюга імуноглобуліну, або лідерній послідовності варіабельної ділянки важкого ланцюга і здатний утворювати набір праймерів з праймером(ами) за пунктом с). 23. Спосіб за п.22, в якому праймери за пунктом b) є праймерами для VLL, послідовність яких принаймні на 90 % ідентична послідовності геноспецифічної ділянки, яка вибрана з SEQ ID NOs: 93-98, і праймери за пунктом d) є праймерами для VHL, послідовність яких принаймні на 90 % ідентична послідовності з геноспецифічною ділянкою, яка вибрана з SEQ ID NOs: 86-92. 24. Спосіб створення бібліотеки родинних пар, які містять зв'язані послідовності, які кодують варіабельні ділянки, причому вказані послідовності, які кодують варіабельні ділянки, є послідовностями суперсімейства імуноглобулінів, причому спосіб передбачає: а) одержання від донора фракції клітин, яка містить лімфоцити; b) необов'язкове збагачення певної популяції лімфоцитів вказаної фракції клітин; с) одержання популяції виділених окремих клітин, яке передбачає розподіл по одній клітині з вказаної фракції клітин в декілька посудин; і d) ампліфікацію і зв’язування послідовностей, які кодують варіабельні ділянки, що знаходяться у вказаній популяції виділених окремих клітин, способом за будь-яким з пп.1-24. 25. Спосіб за п.24, в якому перед виконанням ампліфікації і зв’язування (стадія d) за рахунок інтенсивного ділення кожної виділеної окремої клітини одержують популяцію ізогенних клітин. 26. Спосіб за п.24, в якому фракція клітин, яка міс 5 89761 6 тить лімфоцити, входить до складу цільної крові, кісткового мозку, мононуклеарних клітин або лейкоцитів. 27. Спосіб за п.26, в якому фракція клітин, яка містить лімфоцити, збагачена клітинами Влімфоцитів. 28. Спосіб за п.27, в якому фракція клітин, яка містить лімфоцити, або лінія В-лімфоцитів збагачена плазматичними клітинами. 29. Спосіб за п.24, в якому клітини з фракції клітин, яка містить лімфоцити, лінії В-лімфоцитів або плазматичні клітини мають підвищену антигенну специфічність. 30. Спосіб за п.24, в якому фракція клітин, яка містить лімфоцити, збагачена клітинами лінії Тлімфоцитів. 31. Спосіб за п.24, в якому антигенспецифічні Тклітини одержують шляхом стимуляції фракції клітин, яка містить лімфоцити. 32. Спосіб за п.24, який додатково передбачає введення у вектор зв'язаних нуклеотидних послідовностей або бібліотеки родинних пар. 33. Спосіб за п.32, в якому вказаний вектор вибирають з клонуючих векторів, шатл-векторів, векторних дисплеїв або векторів експресії. 34. Спосіб за п.32, в якому зв'язані нуклеотидні послідовності або окремі представники бібліотеки родинних пар є послідовностями, які кодують варіабельну ділянку важкого ланцюга імуноглобуліну, зв'язану з послідовностями, які кодують варіабельну ділянку легкого ланцюга, причому вказані послідовності вводять зі збереженням рамки зчитування у вектор, що вже містить послідовності, які кодують один або декілька константних доменів імуноглобуліну або їх фрагментів. 35. Спосіб за п.32, в якому зв'язані нуклеотидні послідовності або окремі представники бібліотеки родинних пар є послідовностями, які кодують варіабельну ділянку α-ланцюга Т-клітинного рецептора, зв'язану з послідовностями, які кодують варіабельну ділянку β-ланцюга, причому вказані послідовності вводять зі збереженням рамки зчитування у вектор, що вже містить послідовності, які кодують один або декілька константних доменів Т-клітинного рецептора або їх фрагментів. 36. Спосіб за п.24, який додатково передбачає створення підбібліотеки шляхом відбору підмножини родинних пар зв'язаних послідовностей варіабельних ділянок, які кодують зв'язуючі білки зі специфічністю до необхідної мішені, з утворенням бібліотеки мішеньспецифічних родинних пар послідовностей, які кодують варіабельні ділянки. 37. Спосіб за будь-яким з пп.34-36, який додатково передбачає перенесення вказаної родинної пари або бібліотеки мішеньспецифічних родинних пар послідовностей, які кодують варіабельні ділянки, в вектор експресії ссавця. 38. Спосіб за п.37, в якому вектор експресії ссавця кодує один або декілька доменів константної ділянки, вибираних з імуноглобуліну людини класів IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, легкого каппа-ланцюга або легкого лямбдаланцюга або з альфа-, бета-, дельта- і/або гамма-ланцюгів Т-клітинного рецептора людини. 39. Спосіб за п.32, який додатково передбачає стадії: а) введення вектора, що кодує сегмент зв'язаних нуклеотидних послідовностей, в клітину-хазяїна; b) культивування вказаних клітин-хазяїнів в умовах, адаптованих для експресії; і с) одержання білкового продукту, експресованого з вектора, введеного у вказану клітину-хазяїна. 40. Спосіб за п.39, в якому вказаний білковий продукт є моноклональним антитілом, що містить родинну пару варіабельної ділянки легкого ланцюга і варіабельної ділянки важкого ланцюга. 41. Спосіб за п.39, в якому вказаний поліпептидний продукт є моноклональним Т-клітинним рецептором, що містить родинну пару варіабельної ділянки альфа-ланцюга і варіабельної ділянки беталанцюга. Даний винахід належить до способу множинної молекулярної ампліфікації, здатної до зв'язування цікавлячих нуклеотидних послідовностей за допомогою ампліфікації, зокрема за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (множинна PCR). Спосіб є особливо ефективним для створення бібліотек родинних пар, а також комбінаторних бібліотек послідовностей, які кодують варіабельні області, імуноглобулінів, Т-клітинних рецепторів або В-клітинних рецепторів. Антигензв'язуючі білки, які беруть участь в імунній реакції, присутні в організмі ссавців у вигляді великого поліклонального набору, що являє собою широку різноманітність специфічності зв'язування. Подібна різноманітність створюється реаранжируванням генних послідовностей, які кодують варіабельні області вказаних зв'язуючих білків. Такі зв'язуючі білки, які мають варіабельні області, включають розчинні і мембранозв'язані форми В-клітинного рецептора (відомі також як імуноглобуліни або антитіла) і мембранозв'язані Т клітинні рецептори (TcR). Що стосується імуноглобулінів, то їх спорідненість посилюється після розпізнавання антигену рецептором антигену В-клітин внаслідок процесу, що іменується "дозріванням афінності", в який залучені цикли соматичної надмутації цих генів варіабельних областей. Крім того, імуноглобуліни або їх фрагменти, такі як Fab-фрагменти, Fv-фрагменти і одноланцюгові Fv-фрагменти (scFv), є предметом клонування і рекомбінантної експресії. Однак всі інші зв'язуючі білки, що·мають варіабельні області, в принципі можуть бути клоновані і експресовані так само, як і антитіла. Відомі методи виділення антитіл з необхідною специфічністю зв'язування частіше за все включають одержання гібридом у імунізованих хазяїнів з подальшим скринінгом специфічних клонів або створення комбінаторних бібліотек експресованих послідовностей в Е.соіі, що складаються з варіабельних доменів імуноглобулінів, які потім збага 7 чують за допомогою таких методів як, наприклад, фаговий дисплей. Головним обмеженням, пов'язаним із застосуванням технології гібридом для одержання терапевтичних антитіл, с відсутність лімфоми людини, яка може використовуватися як клітин, що зливаються, для В-лімфоцитів людини. Гетерогібридоми (тобто В-клітини людини, злиті з лімфомами миші) є, як відомо, не стійкими і, таким чином, рідко дозволяютьодержати прийнятні лінії клітин для цілей продукції антитіл. В-клітини людини, імморталізовані внаслідок інфікування вірусом Епштейна Барра, характеризуються такими ж ознаками нестійкості. Відсутність надійних клітинних методів одержання антитіл людини для лікувальних цілей може бути компенсована останніми досягненнями в галузі молекулярної біології. Застосування комбінаторних бібліотек і фагового дисплея дозволяє створити великий спектр клонів антитіл з потенційною різноманітністю, що перевищує 10 .3 вищезгаданого спектра можна вибрати тип зв'язування зі специфічною мішенню, створивши таким чином підбібліотеку. Таку підбібліотеку можна використати для створення поліклональних або моноклональних антитіл. Послідовності, які кодують варіабельні області (наприклад, послідовності, які кодують варіабельну область важкого ланцюга і варіабельну область легкого ланцюга імуноглобуліну), які утворюють бібліотеку, можна ампліфікувати з лімфоцитів, плазматичних клітин, гібридом або будь-якої іншої популяції клітин, експресуючої імуноглобулін. Сучасні методи створення комбінаторних бібліотек передбачають роздільне виділення з популяції клітин послідовностей, які кодують варіабельні області. Таким чином втрачається первинне спаровування послідовностей, кодуючих варіабельну область важкого ланцюга і варіабельну області легкого ланцюга імуноглобуліну. У комбінаторній бібліотеці вказані послідовності спаровуються довільно, і первинні комбінації вказаних варіабельних послідовностей утворюються лише випадково. Тому для виділення послідовностей, які кодують варіабельні області, що відповідають за необхідну специфічність зв'язування, необхідно зробити багатостадійний скринінг. Такий скринінг звичайно виконують в поєднанні з методами збагачення клонів, що мають необхідну специфічність, такими як фаговий або рибосомний дисплей. Навіть після того як різноманітність досягнута, вона може бути недостатньою для виділення пар послідовностей, які кодують варіабельні області, з метою одержання зв'язуючих білків, що мають таку ж високу спорідненість, яка може бути виявлена у вихідних клітинах. Крім того, методи збагачення, що звичайно застосовуються для скринінгу комбінаторних бібліотек, вносять значну стандартну помилку, наприклад, у випадку поліпептидів з особливо низькою токсичністю в Е.соlі, яка впливає на ефективність укладання ланцюга, сповільнюється швидкість виділення або гіршають інші параметри, що знаходяться в залежності від системи, що ще більше зменшує різноманітність бібліотеки. Крім цього, клони, одержані з таких комбінаторних бібліотек, частіше продукують зв'язуючі білки з перехресною 89761 8 реактивністю проти автоантигенів, оскільки вказані пари білків, на відміну від первинних пар (що далі іменуються родинними парами), не зазнають виникаючої in vivo негативної селекції на автоантигени, як це має місце у разі рецепторів В- і Тлімфоцитів на певних стадіях їх розвитку. Тому бажано клонувати первинні пари послідовностей, які кодують варіабельні області. Крім того, очікується, що частота стрівальності клонів, що мають необхідну специфічність зв'язування, буде значно вище в бібліотеці родинних пар, ніж в звичайній комбінаторній бібліотеці, особливо якщо клітини вихідного матеріалу взяті від донора з високою частотою стрівальності клітин, що кодують пари зі специфічним зв'язуванням, тобто у імунокомпетентних або імунізованих донорів. З вищевикладеного випливає, що бібліотека родинних пар необов'язково повинна бути такою ж великою, як комбінаторна бібліотека: бібліотека родинних пар, яка містить 104-105 клонів або навіть 10-10 клонів, одержаних від донора з відповідною імунною реакцією, може бути цілком достатньою для одержання зв'язуючих білків, що являють собою широку різноманітність необхідної специфічності зв'язування. Для створення бібліотек родинних пар необхідно зв'язати послідовності, що кодують варіабельні області, які були виділені з однієї клітини. У цей час описані два різних підходи, що забезпечують родинне спаровування послідовностей, які кодують варіабельні області. Внутрішньоклітинна PCR являє собою підхід, при якому забезпечують проникність фіксованої популяції клітин і здійснюють внутрішньоклітинне зв'язування послідовностей імуноглобулінів, які кодують варіабельну область важкого ланцюга і варіабельну область легкого ланцюга. Вказане зв'язування молена здійснити методом RT-PCR з перекриванням ланцюга (WO 93/03151) або шляхом рекомбінантного методу (Chapal, N. et al. 1997 Bio Techniques 23, 518-524). Процес ампліфікації, описаний у вказаних публікаціях, с три- або чотиристадійним процесом, що передбачає і) зворотну транскрипцію з використанням праймерів для константної області, утворюючих кДНК імуноглобуліну, іі) ампліфікацію методом PCR послідовностей, які кодують варіабельні області важкого і легкого ланцюга, з використанням наборів праймерів, з сайтами перекривання або рекомбінації, ііі) зв'язування шляхом рекомбінації, якщо вибраний даний метод, iv) здійснення гніздової PCR продуктів, утворюючих сайти рестрикції для клонування. Оскільки клітини є проникними, існує значний ризик виходу продуктів ампліфікації з клітин, внаслідок чого може статися перестановка послідовностей, які кодують варіабельну область важкого ланцюга і варіабельну область легкого ланцюга, що веде до втрати родинного спаровування. Тому такий метод передбачає стадії промивання після кожної реакції, що робить процес трудомістким і зменшує ефективність реакцій. Як правило, внутрішньоклітинна PCR є неефективною і приводить до низької чутливості. Тому метод зв'язування за допомогою внутрішньоклітинної PCR не знайшов широкого розповсюджен 9 ня, причому первинне дослідження неможливо було повторити з одержанням надійних результатів, підтверджуючих, що всередині клітини дійсно відбувається зв'язування. При цьому методі необхідно уникати перестановки послідовностей, які кодують варіабельну область важкого ланцюга і варіабельну область легкого ланцюга, внаслідок якої відбувається руйнування родинних пар. Інший внутрішньоклітинний метод описаний в WO 01/92291. Вказаний метод заснований на транссплайсингу РНК і при ньому досягається з'єднування VH- і VL-кодуючої мРНК всередині клітини. Вказаний підхід вимагає наявності конструкції ДНК, що здійснює транссплайсинг всередині клітин. Одноклітинна PCR являє собою інший метод родинного спаровування послідовностей, які кодують варіабельну область важкого ланцюга і варіабельну область легкого ланцюга (див., наприклад, публікації Coronella, J.A. et al. 2000 Nucleic Acids Res. 28, E85; Wang, X., et al. 2000 J. Immunol. Methods 20, 217-225). У вказаних публікаціях описаний метод, відповідно до якого популяцію імуноглобулінекспресуючих клітин розподіляють по пробірках, розводячи до щільності, відповідної одній клітині в одній реакційній суміші, внаслідок чого в процесі клонування усувається перестановка послідовностей, які кодують варіабельну область важкого ланцюга і варіабельну область легкого ланцюга. Описаний метод складається з трьох-чотирьох стадій, що включають і) зворотну транскрипцію з використанням оліго-dТ-праймерів, довільних гексамерних праймерів або праймерів для константної області, утворюючих кДНК, іі) фракціонування продукту кДНК в декількох пробірках і ампліфікацію за допомогою PCR окремих послідовностей, які кодують варіабельні області ланцюгів (в окремих пробірках), з використанням наборів праймерів, які містять сайти рестрикції для клонування, ііі) здійснення гніздової PCR продуктів, утворюючих сайти рестрикції для клонування (необов'язково), і iv) зв'язування послідовностей, які кодують варіабельну область важкого ланцюга і варіабельну область легкого ланцюга, з окремих пробірок шляхом клонування їх у відповідному векторі, що само по собі є багатостадійним процесом. У людини присутні легкі ланцюги двох типів: лямбда ( ) і каппа ( ). 3 цього випливає, що для кДНК, одержаної з кожної окремої клітини, необхідно виконати принаймні три окремі реакції PCR з подальшим аналізом і клонуванням відповідних фрагментів в одиничному векторі для досягнення родинного спаровування. Таким чином, вищеописаний метод одноклітинної PCR вимагає великого числа маніпуляцій для створення бібліотеки родинних пар. Хоч бібліотека родинних пар не обов'язково повинна бути такою ж великою, як комбінаторна бібліотека, для одержання зв'язуючих білків, які являють собою широку різноманітність специфічності зв'язування, створення бібліотеки, 4 5 що містить, наприклад, 10 -10 клонів, вищеописаним методом одноклітинної PCR як і раніше залишається трудомісткою задачею. Крім того, велике 89761 10 число маніпуляцій значно збільшує ризик забруднення і помилки, викликаної людським фактором. Для одержання зв'язуючих білків з високою спорідненістю, відповідною спорідненості, що звичайно спостерігається при виникненні імунної реакції, дуже перспективним є родинне спаровування послідовностей, які кодують варіабельні області, в поєднанні з їх ампліфікацією. Для створення бібліотеки з великою різноманітністю клонів необхідно розробити високоефективний метод клонування, який відрізняється мінімальним ризиком забруднення і перестановки послідовностей. Крім того, бажано скоротити число стадій клонування для досягнення високоефективного створення комбінаторних бібліотек. Даний винахід належить до ефективного способу зв'язування двох або декількох цікавлячих нуклеотидних послідовностей, тобто послідовностей, які кодують варіабельні області, застосовуючи множинну молекулярну ампліфікацію, таку як множинна RT-PCR з подовженням ланцюга шляхом перекривання або множинна RT-PCR з наступним зв'язуванням шляхом лігування або рекомбінації. Цей спосіб може бути виконаний в форматі однієї клітини, що робить можливим високоефективне клонування родинних пар. На Фіг.1 схематично зображені різні типи кінцевих сегментів подовження ланцюга шляхом перекривання. Жирні лінії відповідають геноспецифічній частині праймерів, а звичайні лінії відповідають перекриваючому кінцевому сегменту. Вертикальні лінії ілюструють комплементарні області. Праймери полегшують зв'язування двох цікавлячих нуклеотидних послідовностей. На Фіг.1 (І) показані два варіанти кінцевих сегментів подовження ланцюга шляхом перекривання типу I, де повністю або частково перекриваються тільки подовжуючі сегменти; на Фіг.1 (II) показані кінцеві сегменти подовження ланцюга шляхом перекривання типу II, де деякі 5'-кінцеві нуклеотиди подовжуючого сегмента першого праймеру комплементарні геноспецифічній частині сусіднього праймеру; на Фіг.1 (III) показані кінцеві сегменти подовження ланцюга шляхом перекривання типу III, де всі подовжуючі сегменти є комплементарними геноспецифічній області сусіднього праймеру. На Фіг.2 схематично зображена суміш множинних праймерів для подовження ланцюга шляхом перекривання, що використовується для зв'язування послідовностей, які кодують варіабельні області імуноглобуліну. Підлягаючі зв'язуванню кДНК, які кодують легкий ланцюг (LC) і варіабельну область важкого ланцюга (VH), зображені у вигляді трубок з позначенням 5'- і 3'-кінців смислових ланцюгів, а також передбачуваного розміру ампліфікованого продукту. Множинні набори праймерів для подовження ланцюга шляхом перекривання, які використовуються для ампліфікації кодуючих послідовностей, показані стрілками. Зігнуті стрілки з пунктирними краями, направлені у бік 5'-кінців, показують клонуючі кінцеві сегменти. Кінцеві сегменти подовження ланцюга шляхом перекривання зображені жирними лініями. Сайти рестрикції, присутні в . кінцевих сегментах, вказані поруч з кінцевим сегментом. Загальне число 11 праймерів в суміші множинних праймерів для подовження ланцюга шляхом перекривання дорівнює шістнадцяти і розділено на зовнішні праймери, які включають один праймер для С і один праймер для СН1 і праймери для подовження ланцюга шляхом перекривання, включаючи шість праймерів для VL i вісім праймерів для VH. Праймер для СH1 гібридизується з 5'-кінцем константного домену 1 важкого ланцюга. Передбачається, що продукт, який утворюється в результаті множинної RT-PCR з подовженням ланцюга шляхом перекривання, дорівнює приблизно 1070 п.о. і містить весь легкий каппа-ланцюг, що складається з константної області, J-гена і V-гена (С +JL+VL), і варіабельну область важкого ланцюга, що складається з Vгена, D-сегмента і J-гена (VH+D+JH). 5'- і 3'-кінці означають напрям відкритої рамки зчитування. Тільки невелика частина послідовності, що кодує СH1-область, ампліфікована множинною сумішшю праймерів для подовження ланцюга шляхом перекривання, оскільки положення гібридизації праймеру для СH1 знаходиться поруч з J-областю важкого ланцюга. На Фіг.3 зображено декілька схем, які показують різні напрями зв'язування продуктів, що одержуються в залежності від того, які праймери мають кінцевий зв'язуючий сегмент. Чорним кольором показана область перекривання. 5'- і 3'-кінці означають напрям відкритої рамки зчитування. На Фіг.3А зображена схема, що ілюструє орієнтацію продуктів "головний сегмент - головний сегмент". На Фіг.3В зображена схема, що ілюструє орієнтацію продуктів "кінцевий сегмент - кінцевий сегмент". На Фіг.3С зображена схема, що ілюструє орієнтацію "головний сегмент - - кінцевий сегмент", де першою є послідовність, яка кодує легкий ланцюг. На Фіг.3D зображена схема, що ілюструє орієнтацію "головний сегмент - кінцевий сегмент", де першою є послідовність, яка кодує важкий ланцюг. На Фіг.4 схематично зображений вектор експресії імуноглобуліну pLL113, де кодуючі послідовності знаходяться в орієнтації "головний сегмент кінцевий сегмент". Показаний вектор включає нижченаведені елементи: bla= промотор експресії гена стійкості до ампіциліну. Amp= ген, який кодує стійкість до ампіциліну. pUC ori= точка початку реплікації pUC. AdMLP= головний пізній промотор аденовірусу. Human IgG1= послідовність, яка кодує важкий ланцюг імуноглобуліну ізотипу G1 людини. hGH pA= полі-А-сигнальна послідовність гормону росту людини. bGH polyA= полі-А-послідовність гормону росту великої рогатої худоби. LC каппа людини= послідовність, яка кодує легкий каппаланцюг імуноглобуліну людини. FRT= сайт-мішень упізнавання Flp. Гігроміцин= ген, який кодує стійкість до гігроміцину. SV40 polyA= полі-А-сигнальна послідовність вакуолізуючого мавпячого вірусу. На Фіг.5А зображений гель після електрофорезу, що показує результати двостадійної множинної RT-PCR з подовженням ланцюга шляхом перекривання з подальшою напівгніздовою PCR. Продукти ампліфікації одержані з кДНК, виділеної з окремих клітин яєчника китайського хом'ячка (СНО) Flp-In pLL113. Смуги 1-12 означають зразки, а стрілки показують правильні продукти множинної 89761 12 гніздової RT-PCR з подовженням ланцюга шляхом перекривання довжиною 1076п.о.; М1 означає леддер довжиною 100п.о.; W означає воду, використану як негативний контрольний зразок. С означає позитивний контрольний зразок кДНК, виділений з лінії клітин НВ-8501. Окремо представлений менш контрастний винахід тих же самих смуг W, С і леддера довжиною 100п.о. для виділення окремих фрагментів ДНК. На Фіг.5В дано схематичне зображення гелю, показаного на Фіг.5А, яке ілюструє відповідні фрагменти гелю. На Фіг.6 показано декілька фотографій і дано графічне зображення гелів після електрофорезу, на яких представлені результати одностадійної множинної RT-PCR з подовженням ланцюга шляхом перекривання без додаткової ампліфікації методом PCR. У всіх блоках М1 означає леддер довжиною 100п.о., а М2 означає леддер довжиною 500п.о. На Фіг.6А зображений гель після електрофорезу з продуктами ампліфікації, виділеними з лізату, відповідного 100, 10, 1 або 0 клітин. Стрілка показує продукт подовження ланцюга шляхом перекривання. На Фіг.6В зображений схематичний вигляд гелю, показаного на Фіг.6А. На Фіг.6С показаний гель після електрофорезу, підтверджуючий наявність продукту, одержаного подовженням ланцюга шляхом перекривання, в смугах, відповідних 100 і 1 клітині, на Фіг.6A. На Фіг.6D зображений гель після електрофорезу, на якому видні розщеплення рестрикційними ферментами Nhel і Ncol продукту, одержаного подовженням ланцюга шляхом перекривання, зі смуги, що відповідає 1 клітині, на Фіг.6С. На Фіг.7 зображений гель після електрофорезу, на якому видні результати одностадійної множинної RT-PCR з подовженням ланцюга шляхом перекривання і подальшої ампліфікації методом напівгніздової PCR. МІ означає леддер довжиною 100п.о. і М2 означає леддер довжиною 500п.о. Вказані результати одержані при використанні сумішей множинних праймерів для подовження ланцюга шляхом перекривання, які містять праймер для СH1, СH2, СН3, СН4 або СН5 як зовнішній праймер при виконанні множинної RT-PCR з подовженням ланцюга шляхом перекривання. Вказані реакції виконували в клітинних лізатах, відповідних 100, 10, 1 або 0 клітин. Розмір продукту, одержаного подовженням ланцюга шляхом перекривання, показаний стрілкою. На Фіг.8 зображений гель після електрофорезу, на якому видні результати одностадійної множинної RT-PCR з подовженням ланцюга шляхом перекривання і подальшої ампліфікації методом напівгніздової PCR з використанням збагачених Влімфоцитів людини як матриці. М1 означає леддер довжиною 100п.о. Смуги 5 і 6 відповідають розміру продукту, одержаного подовженням ланцюга шляхом перекривання. На Фіг.9А схематично зображені експресуючі вектори ссавців (Em465/01P582/Em465/01P581), використані для одержання ліній клітин, експресуючих лямбда-ланцюг IgGl, де кодують послідовності знаходяться в орієнтації "головний сегмент головний сегмент". Вказані вектори включають нижченаведені елементи: Amp= ген, що кодує 13 стійкість до ампіциліну. pUC ori= точка початку реплікації pUC. AdMLP= головний пізній промотор аденовірусу. EFP= промотор фактора елонгації. Лідерна АР= лідерна послідовність лужної фосфатази. VH= послідовність, яка кодує варіабельну область важкого ланцюга. IgG1 НС= послідовність, яка кодує константну область важкого ланцюга імуноглобуліну ізотипу G1. rBG polyA= полі-Асигнальна послідовність бета-глобіну кролика. bGH polyA= полі-А-послідовність гормону росту великої рогатої худоби. Лідерна IgK= послідовність, яка кодує лідерну послідовність каппаланцюга миші. IgL (lb або 1с)= послідовність, яка кодує легкий лямбда-ланцюг імуноглобуліну сімейства lb або 1с. FRT= сайт-мішень упізнавання F1p. Гігроміцин= ген, що кодує стійкість до гігроміцину. SV40 роlуА= полі-А-сигнальна послідовність вакуолізуючого мавпячого вірусу. На Фіг.9В і 9С показані агарозні гелі, забарвлені бромідом етидію, які містять продукти PCR, виділені з ліній клітин СНО F1p-In/Em464/01P581 і CHOF1pIn/Em464/01P582, відповідно. Смуги 1-4 відповідають концентраціям матриці загальної РНК, що дорівнюють 50пг, 5пг, 0,5пг або 0пг, які були використані для виконання множинної RT-PCR з подовженням ланцюга шляхом перекривання. Μ означає леддер довжиною 100. (New England Biolabs, New England, USA). Стрілки показують продукт PCR з подовженням ланцюга шляхом перекривання. На Фіг.10 зображена блок-схема, яка показує стадії створення бібліотеки експресованих родинних антитіл, з якої можуть бути експресовані поліклональні або моноклональні антитіла. На Фіг.11 схематично зображений вектор JSK301 Е.соіі, що використовується для створення бібліотеки векторів експресії Fab-фрагментів шляхом введення у вектор фрагментів подовження ланцюга шляхом перекривання, які містять родинні послідовності, що кодують варіабельні області, на вказаних сайтах рестрикції Notl/Xhol. Вказаний вектор містить нижченаведені елементи: Amp і Amp pro= ген стійкості до ампіциліну і його промотор. pUC19 Ori= точка початку реплікації. СНІ людини = послідовність, яка кодує домен 1 важкого ланцюга імуноглобуліну гамма 1 людини. Вставка = вставка неродинної послідовності, яку вирізають при введенні фрагментів подовження ланцюга шляхом перекривання, tac Ρ і lac Z= бактеріальні промотори, які можуть бути вирізані на сайтах рестрикції Nhel і Ascl. На Фіг.12 зображена схема, яка ілюструє створення бібліотеки векторів експресії родинних Fabфрагментів. Стадія 1 ілюструє вставку родинних пар послідовностей, які кодують варіабельні області (VH1-VL1-VHx-VLx), у вектор JSK301 Е.соlі шляхом гідролізу Xhol-Notl. Стадія II ілюструє вставку кластеру бактеріального промотору і лідерної послідовності (лідерна послідовність ре1В і Ρ tacпромотор, стимулююча експресію VHx, Ρ lacпромотор і лідерна послідовність реlВ, стимулюючі експресію VLx), шляхом гідролізу Ascl-Nhel. На Фіг.13 показано зв'язування α-, β- і - субодиниць, які утворюють G-білок, за допомогою одностадійної множинної RT-PCR з подовженням 89761 14 ланцюга шляхом перекривання і додаткової ампліфікації за допомогою PCR. На зображеннях вказані розміри окремих кодуючих областей, а також розмір зв'язаного продукту. Для кінцевого продукту вказані сайти рестрикції, введені за допомогою кінцевих сегментів праймеру під час ампліфікації. На Фіг.14 показані точкові діаграми фарбування при виконанні FACS-аналізу (А) мононуклеарних клітин периферичної крові (РВМС), виділених з крові донора; (В) фракції немічених СО19негативних клітин, одержаних методом магнітного + сортування клітин, і (С) фракції CD19 клітин, одержаних методом магнітного сортування клітин. Для кожної фракції зображена діаграма розсіяння, діаграма CD19/CD38 і діаграма CD38/CD45. + На Фіг.15 показана фракція CD19 клітин, зображених на Фіг.9С, які заздалегідь зберігали в рідкому азоті, розморожували і забарвлювали антитілом проти CD 19, CD38 і CD45. Зображені точкові діаграми, відповідні показаним на Фіг.9С. На Фіг.16 показані діаграми збігів, що використовуються для сортування фракції CD 19+ клітин. Діаграма розсіяння і діаграма флуоресценції на основі CD38 і CD45 були використані для виділення високопродуктивних CD38 клітин (CD38hi) і проміжних CD45 клітин (CD45in). На Фіг.17 зображений гель після електрофорезу, на якому видно успішне виконання множинної RT-PCR з подовженням ланцюга шляхом перекривання з використанням проби крові, одержаної від донора ТТОЗ (ряд А, ямки 1-12 з восьми 96ямкових планшетів). Зразки наносили на агарозний гель в два ряди (А і В) по 48 зразків в кожному. Очікуваний розмір фрагмента подовження ланцюга шляхом перекривання становив приблизно 1070п.о. Передбачувані фрагменти подовження ланцюга шляхом перекривання відмічені стрілками. На Фіг.18 показаний аналіз ELISA периплазматичних екстрактів з планшета G060. Планшет для ELISA сенсибілізували антитілом кози проти каппа-ланцюга людини, при цьому захоплені Fabфрагменти були виявлені за допомогою HRPкон'югованого антитіла кози проти Fab-фрагмента людини. На Фіг.19 показаний аналіз ELISA периплазматичних екстрактів з планшета G060. Планшет для ELISA сенсибілізували 10мкг/мл овальбуміну (Sigma A-5503), при цьому захоплені Fabфрагменти були виявлені за допомогою HRPкон'югованого антитіла кози проти Fab-фрагмента людини. На Фіг.20 показаний аналіз ELISA периплазматичних екстрактів з планшета G060. Планшет для ELISA сенсибілізували правцевим токсином, при цьому захоплені Fab-фрагменти були виявлені за допомогою HRP-кон'югованого антитіла кози проти Fab-фрагмента людини. На Фіг.21 показаний одностадійний конкурентний аналіз ELISA периплазматичних екстрактів з планшета G060. Планшет на ELISA сенсибілізували правцевим токсином (ТТ) і в кожну ямку дода-7 вали розчинний ТТ в кількості 10 Μ для конкурентного зв'язування Fab-фрагментів бактеріальних супернатантів з іммобілізованим ТТ. Захоплені 15 Fab-фрагменти виявляли за допомогою HRPкон'югованого антитіла кози проти Fab-фрагмента людини. На Фіг.22 показаний порівняльний аналіз білкових послідовностей варіабельної області важкого ланцюга, одержаних з клонів, зв'язуючих ТТантиген, з планшета G060. Ступінь гомології послідовностей виражений різними відтінками; 100%, 80% і 60% гомологія зображена відповідно чорним, сірим і світло-сірим кольором. CDR1 знаходиться в порівнюваних положеннях 34-41. CDR2 знаходиться в порівнюваних положеннях 55-73. CDR3 знаходиться в порівнюваних положеннях 107-127. Незрілі термінуючі кодони позначені зірочкою. Результати порівняльного аналізу показані на восьми окремих Фіг.(a-h), розташованих в два ряди зліва направо, при цьому Фіг.22a-d знаходяться у верхньому ряду і Фіг.22e-h знаходяться в нижньому ряду. На Фіг.23 показаний порівняльний аналіз білкових послідовностей варіабельної області легкого ланцюга, одержаних з клонів, зв'язуючих ТТантиген, з планшета G060. Ступінь гомології послідовностей виражений різними відтінками; 100%, 80% і 60% гомологія зображена відповідно чорним, сірим і світло-сірим кольором. CDR1 знаходиться в порівнюваних положеннях 26-42 CDR2 знаходиться в порівнюваних положеннях 58-64. CDR3 знаходиться в порівнюваних положеннях 97106. Незрілі термінуючі кодони позначені зірочкою Результати порівняльного аналізу показані на восьми окремих Фіг.(a-h). розташованих в два ряди зліва направо, при цьому Фіг.23a-d знаходяться у верхньому ряду і Фіг.23e-h знаходяться в нижньому ряду. На Фіг.24 показаний конкурентний аналіз ELISA, виконаний для визначення уявної спорідненості відібраних клонів з планшета G060. Розчинний ТТ, розведений в концентраціях від 100нМ до 25пМ (чотирикратне розведення), додавали до Fab-фрагментів, викликаючи конкурентне зв'язування Fab-фрагментів з іммобілізованим ТТ. Ступені взаємодії виражені у вигляді співвідношення зв'язування, що спостерігається при даній концентрації розчинного ТТ зі зв'язуванням, виявленим без додавання розчинного ТТ до реакційних сумішей. На Фіг.25 представлена подвійна філогенетична гістограма, яка показує внутрішньогенетичний і міжгенетичний взаємозв'язок між послідовностями варіабельного домену важкого і легкого ланцюга антитіла. Філогенетичні групи з трьох VH- i VLпослідовностєй спарені на гістограмі для позначення дійсного спаровування конкретних V-генів. А) Клони, зв'язуючі ТТ-антиген, одержані з комбінаторної бібліотеки методом відображення на фагі. В) Клони, зв'язуючі ТТ-антиген, одержані з бібліотеки родинних пар способом за даним винаходом. Даний винахід належить до способу ампліфікації і зв'язування двох або декількох цікавлячих несуміжних нуклеотидних послідовностей, який забезпечує високоефективне клонування таких послідовностей. Вказаний результат досягається головним чином за рахунок зменшення числа ста 89761 16 дій, необхідних для ампліфікації і зв'язування клонованих послідовностей. Одним з об'єктів даного винаходу є спосіб зв'язування декількох несуміжних нуклеотидних послідовностей, який передбачає множинну молекулярну ампліфікацію цікавлячих нуклеотидних послідовностей з використанням матриці, одержаної з виділеної окремої клітини, популяції ізогенних клітин або популяції генетично різних клітин, і подальшого зв'язування ампліфікованих послідовностей. Якщо як матриця використана виділена окрема клітина або популяція ізогенних клітин, то в результаті зв'язування утворюється сегмент нуклеїнової кислоти, який містить родинні зв'язані цікавлячі нуклеотидні послідовності. Якщо як матриця використана популяція генетично різних клітин, то в результаті зв'язування утворюється бібліотека сегментів, в якій кожний сегмент містить довільно зв'язані цікавлячі послідовності нуклеїнової кислоти; така бібліотека іменується також комбінаторною бібліотекою. У одному з варіантів здійснення даного винаходу вищезгадана множинна молекулярна ампліфікація являє собою ампліфікацію методом множинної PCR, якій переважно передує стадія зворотної транскрипції. У переважному варіанті здійснення винаходу зворотну транскрипцію, ампліфікацію і зв'язування виконують у вигляді однієї стадії за допомогою множинної RT-PCR з подовженням ланцюга шляхом перекривання або, альтернативно, у вигляді двох стадій за допомогою множинної RT-PCR і подальшого зв'язування шляхом лігування або рекомбінації. Інший варіант здійснення даного винаходу належить до створення бібліотек родинних пар, які включають зв'язані послідовності, що кодують варіабельні області, зокрема послідовності, які кодують варіабельні області важкого і легкого ланцюга, або послідовності, які кодують альфаланцюг і бета-ланцюг Т-клітинного рецептора (TcR). Цей спосіб передбачає одержання лімфоцитвмісної фракції клітин принаймні у одного прийнятного донора і, необов'язково, збагачення певної популяції лімфоцитів у вказаній фракції, наприклад, В-лімфоцитів або Т-лімфоцитів, в залежність від того, які послідовності, кодуючі варіабельні області, бажано одержати з імуноглобулінів або TcR. Лімфоцитвмісну фракцію клітин або збагачену фракцію клітин розподіляють в декілька посудин, одержуючи одну клітину в кожній посудині. Декілька окремих клітин піддають зворотній транскрипції (RT) або альтернативній процедурі одержання кДНК, використовуючи як матрицю нуклеїнові кислоти, виділені з популяції окремих клітин. Після стадії зворотної транскрипції виконують множинну молекулярну ампліфікацію і зв'язування пар одержаних з кожної клітини послідовностей, які кодують варіабельні області, одним зі способів за даним винаходом. Способи клонування, описані в даному винаході, дозволяють уникнути трудомісткого і неефективного клонування і, крім того, зменшують ризик забруднення і втрату різноманітності протягом численних стадій клонування. 17 Іншим об'єктом даного винаходу є бібліотеки родинних пар, одержуваних в результаті множинної молекулярної ампліфікації і зв'язування. Початкова бібліотека родинних пар (первинна бібліотека), одержана способом за даним винаходом, може бути піддана скринінгу зі створенням підбіблютеки родинних пар, які кодують варіабельні домени мішенеспецифічних зв'язуючих білків або непроцесовані зв'язуючі білки. У іншому варіанті здійснення винаходу бібліотеки і підбібліотеки за даним винаходом можуть бути використані для експресії рекомбінантних моноклональних або поліклональних білків, в яких збережена властива донору первинна спорідненість і специфічність зв'язування. Визначення термінів Термін "родинна пара" означає первинну пару цікавлячих несуміжних нуклеїнових кислот, які знаходяться всередині окремої клітини або виділені з окремої клітини. У переважних варіантах здійснення винаходу родинна пара містить дві послідовності, що кодують варіабельні області, які разом кодують варіабельний домен зв'язуючого білка і мають генні послідовності, виділені з однієї і тієї ж клітини. Таким чином, при експресії у вигляді повного зв'язуючого білка або його стійкого фрагмента вони зберігають спорідненість і специфічність зв'язування зв'язуючого білка, первинно експресованого з даної клітини. Родинна пара, наприклад, може складатися з послідовності, яка кодує варіабельну область важкого ланцюга антитіла, зв'язаного з послідовністю, яка кодує варіабельну область легкого ланцюга, з тієї ж клітини, або послідовності, яка кодує α-ланцюг Т-клітинного рецептора, зв'язаної з послідовністю, яка кодує βланцюг, з тієї ж клітини. Бібліотека родинних пар являє собою колекцію таких родинних пар. Під терміном "полімераза, що активується при нагріванні" розуміють полімерази, які є неактивними або мають дуже низьку активність при температурах, що застосовуються для зворотної транскрипції. Для активації таких полімераз потрібні високі температури (90-95°С). Це є перевагою виконання одностадійних RT-PCR, оскільки при цьому не відбувається включення інтерференції полімерази в реакцію за участі зворотної транскриптази. Термін "ізогенна популяція клітин" означає популяцію генетично ідентичних клітин. Зокрема, особливий інтерес при здійсненні даного винаходу представляє ізогенна популяція клітин, одержана внаслідок клональної експансії однієї виділеної клітини. Термін "виділена окрема клітина" означає клітину, яка фізично відділена від популяції клітин і відповідає визначенню "одна клітина в одній посудині". Популяцію виділених окремих клітин одержують при розподілі популяції клітин в декілька посудин. Як зазначено в розділі, озаглавленому "Джерела матриці", число посудин з однією клітиною необов'язково повинно бути пропорційне 100%, щоб таку популяцію можна було назвати популяцією окремих клітин. Терміни "зв'язувати" або "зв'язування" застосовно до ампліфікації означає зв'язування цікав 89761 18 лячих ампліфікованих послідовностей нуклеїнових кислот в один сегмент. Застосовно до родинних пар сегмент містить послідовності нуклеїнових кислот, які кодують варіабельний домен, наприклад варіабельну область важкого ланцюга антитіла, зв'язану з послідовністю, яка кодує варіабельну область легкого ланцюга антитіла, одержаного з тієї ж клітини. Зв'язування може відбуватися одночасно з ампліфікацією або у вигляді стадії, що виконується відразу ж після ампліфікації. До форми або функціональності сегмента не пред'являється ніяких вимог, він може бути лінійним, кільцевим, одноланцюговим або дволанцюговим. Вказане зв'язування необов'язково повинно бути постійним, одна з цікавлячих послідовностей нуклеїнових кислот при бажанні може бути виділена з сегмента, наприклад, з сегмента родинної пари може бути виділена одна з послідовностей, які кодують варіабельну область. Однак доти, поки початкові варіабельні області, які утворюють родинну пару, не будуть замінені іншими варіабельними областями, вони як і раніше вважаються родинною парою, навіть не будучи зв'язаними разом в одному сегменті. Вказане зв'язування переважно являє собою зв'язування нуклеотидів фосфодіефірним зв'язком. Однак зв'язування може бути здійснене іншими хімічними методами перехресного зшивання. Термін "множинна молекулярна ампліфікація" означає одночасну ампліфікацію двох або більше заданих послідовностей в ході однієї реакції. Прийнятні методи ампліфікації включають полімеразну ланцюгову реакцію (PCR) (патент США №4683202), лігазну ланцюгову реакцію (LCR) (Wu and Wallace, 1989, Genomics 4, 560-9), ампліфікацію із заміною ланцюга (SDA) (Walker et al., 1992, Nucl. Acids Res. 20, 1691-6), автостійку реплікацію послідовності (Guatelli et al., 1990, Proc. Nat. Acad. Sci U.S.A., 87, 1874-8) і ампліфікацію послідовності на основі нуклеїнової кислоти (NASBA) (Compton J., 1991, Nature 350, 91-2). Два останніх методи ампліфікації передбачають виконання ізотермічних реакцій на основі ізотермічної транскрипції з утворенням як одноланцюгової РНК (ssPHK), так і дволанцюгової ДНК (dsДНК). Термін "множинна PCR" означає варіант PCR, при якому відбувається одночасна ампліфікація двох або декількох заданих послідовностей внаслідок введення в реакційну суміш декількох наборів праймерів, з яких, наприклад, один набір праймерів призначений для ампліфікації варіабельної області важкого ланцюга, а інший набір праймерів призначений для ампліфікації варіабельної області каппа-ланцюга в ході однієї реакції PCR. Крім того, з вищезгаданими наборами праймерів може бути об'єднаний набір праймерів, призначений для ампліфікації варіабельної області лямбдаланцюга. Термін "множинна RT-PCR" означає множинну PCR, якій передує стадія зворотної транскрипції (RT). Множинна RT-PCR може бути виконана у вигляді двостадійного процесу з окремою стадією RT, яку здійснюють перед множинною PCR, або у вигляді одностадійного процесу, при здійсненні 19 якого всі компоненти, необхідні для RT і множинної PCR, об'єднують в одній пробірці. Термін "множинна PCR з подовженням ланцюга шляхом перекривання" і "множинна RT-PCR з подовженням ланцюга шляхом перекривання" означає, що множинну PCR або множинну RT-PCR виконують, використовуючи суміш множинних праймерів для подовження ланцюга шляхом перекривання, призначену для ампліфікації заданих послідовностей, завдяки чому відбувається одночасна ампліфікація і зв'язування заданих послідовностей. Термін "декілька посудин" означає будь-який об'єкт (або сукупність об'єктів), які забезпечують фізичне розділення однієї клітини від популяції клітин. Такими посудинами можуть бути пробірки, багатоямкові планшети (наприклад, 96-ямкові планшети, 384-ямкові планшети, титраційні мікропланшети або інші багатоямкові планшети), матриці, мікроматриці, мікрочипи, гелі або гелева матриця. Вказаний об'єкт переважно використовують для ампліфікації методом PCR. Термін "поліклональний білок" або "поліклональність" у використовуваному тут значенні означає білок, до складу якого входять різні, але гомологічні білкові молекули, переважно, відібрані з надродини імуноглобулінів Таким чином, кожна білкова молекула гомологічна іншим молекулам в композиції, але містить один або декілька фрагментів варіабельної області поліпептидної послідовності, які відрізняються амінокислотною послідовністю від інших членів поліклонального білка. Відомі приклади таких поліклональних білків включають молекули антитіл або імуноглобулінів, Тклітинні рецептори і В-клітинні рецептори. Поліклональний білок може складатися з певної субпопуляції білкових молекул, які мають загальну ознаку, таку як загальна активність зв'язування необхідної мішені, наприклад, таким білком може бути поліклональне антитіло, яке характеризується специфічністю зв'язування необхідного антигену-мішені. Термін "популяція генетично різних клітин" у використовуваному тут значенні означає популяцію клітин, в якій окремі клітини відрізняються одна від одної на рівні геному. Популяцією генетично різних клітин є, наприклад, популяція клітин, одержаних від донора, або фракція таких клітин, зокрема фракція клітин, що містить В-лімфоцити або Т-лімфоцити. Термін "набір праймерів" або взаємозамінний термін "пари праймерів", означає два або декілька праймерів, які разом здатні ініціювати ампліфікацію цікавлячої нуклеотидної послідовності (тобто одного з членів родинної пари). Набір праймерів за даним винаходом може бути призначений для ініціації сімейства нуклеотидних послідовностей, які містять послідовності, що кодують варіабельні області. Прикладами різних сімейств є легкі каппаланцюги антитіла, легкі лямбда-ланцюги, варіабельні області важкого ланцюга і варіабельні області α-, β-, - або -ланцюга Т-клітинного рецептора. Набір праймерів для ампліфікації сімейства нуклеотидних послідовностей, які містять послідовності, що кодують варіабельні області, часто склада 89761 20 ється з декількох праймерів, частина яких може бути виродженими праймерами. Термін "ідентичність послідовностей" означає тотожність, виражену у відсотках, яка визначає ступінь ідентичності послідовностей нуклеїнових кислот протягом всієї довжини самої короткої з двох послідовностей. Ідентичність можна обчислити як (Nref-Ndif)x100/Nref, де Nref означає число залишків в більш короткій послідовності, Ndif означає загальне число неідентичних залишків в оптимально суміщеному числі залишків Nref двох послідовностей. Отже послідовність ДНК AGTCAGTC буде на 75% ідентична послідовності TAATCAATCGG (Ndif=2 і Nref=8) (підкреслені оптимально суміщені залишки і жирним шрифтом виділені два неідентичних залишки з 8). Терміни "довільно" або "довільний" застосовно до зв'язування означає зв'язування нуклеотидних послідовностей, виділених з різних клітин, але поперечнозв'язаних в популяції генетично різних клітин. Якщо цікавлячі нуклеотидні послідовності є послідовностями, які кодують варіабельні області, то буде створена комбінаторна бібліотека зв'язаних послідовностей. Якщо, з іншого боку, цікавлячі нуклеотидні послідовності кодують ідентичний гетеромерний білок, то довільно зв'язані послідовності, мабуть, будуть аналогічні послідовностям, зв'язаним в окремій клітині. Термін "матриця, одержана з виділеної окремої клітини" застосовно до зворотної транскрипції означає нуклеїнові кислоти такої виділеної клітини. Нуклеїнові кислоти можуть являти собою, наприклад, РНК, мРНК, ДНК або геномну ДНК. Нуклеїнові кислоти можуть бути виділені з клітини або знаходитися в клітині, яка може бути інтактною або лізованою. Спосіб ампліфікації і зв'язування Однією з відмітних ознак даного винаходу є зменшення числа пробірок, необхідних для ампліфікації цікавлячих нуклеотидних послідовностей, завдяки здійсненню варіанта PCR, в якому дві або декілька заданих послідовностей ампліфікують одночасно в одній пробірці шляхом введення декількох наборів праймерів, наприклад, всіх праймерів, необхідних для ампліфікації послідовностей, які кодують варіабельні області, в одну реакційну суміш. Подібний метод відомий як множинна полімеразна ланцюгова реакція (множинна PCR). Множинна PCR або множинна PCR з попереднім виконанням зворотної транскрипції (множинна RT-PCR) є добре відомими методами в галузі діагностики, застосовуваними, наприклад, при виконанні аналізу мутацій, делецій і поліморфізму ДНК, кількісних аналізів вмісту мРНК і ідентифікації вірусів, бактерій і паразитів (див. публікацію Markoulatos, P. et al. 2002, J. Clin. Lab. Anal. 16, 4751). Однак існує дуже мало прикладів ампліфікації послідовностей, які кодують варіабельні області легкого ланцюга, в одній посудині, а також послідовностей, які кодують варіабельні області важкого ланцюга імуноглобулінів, з використанням суміші множинних праймерів, що складається з більш ніж чотирьох праймерів і що включає набір праймерів для V і/або V разом з набором праймерів для VH (Chapal, N. et al. 1997, Bio Techniques 21 23, 518-524; Liu, A.H. et al. 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 7610-7614; Embleton, M.J. et al. 1992, Nucleic Acids Res. 20, 3831-3837). Причиною цього може бути той факт, що набори праймерів, які можуть використовуватися для ампліфікації послідовностей, які кодують варіабельні домени антигензв'язуючих білків, звичайно включають декілька вироджених праймерів для відповідності різноманітності послідовностей, які кодують варіабельні області. Таким чином, складність реакції PCR значно збільшується при виконанні ампліфікації послідовностей, які кодують варіабельні області, за допомогою множинної PCR. Іншою відмітною ознакою даного винаходу є зв'язування двох декількох заданих послідовностей, ампліфікованих за допомогою множинної PCR, відразу ж після виконання ампліфікації. Зокрема, вказаним способом зв'язують родинні пари послідовностей, які кодують варіабельні області. Один з варіантів здійснення даного винаходу належить до створення суміші множинних праймерів, призначеної для виконання PCR з подовженням ланцюга шляхом перекривання, внаслідок чого відбувається одночасна ампліфікація і зв'язування цікавлячих нуклеотидних послідовностей. Вказана множинна PCR з подовженням ланцюга шляхом перекривання дозволяє зменшити число реакцій, необхідних для виділення і зв'язування цікавлячих нуклеотидних послідовностей, зокрема родинних пар зв'язаних варіабельних областей. Інші варіанти здійснення даного винаходу належать до зв'язування шляхом лігування або рекомбінації як альтернативи множинній PCR з подовженням ланцюга шляхом перекривання У вказаних способах зв'язування виконують окремо від ампліфікації за допомогою множинної PCR, але відразу ж після ампліфікації. Однак зв'язування може бути виконане в тій же пробірці, що і множинна PCR. Для виконання множинної PCR з подовженням ланцюга шляхом перекривання необхідна наявність двох або декількох наборів праймерів (суміш множинних праймерів), в яких принаймні один праймер в кожному наборі має кінцевий сегмент подовження ланцюга шляхом перекривання. Кінцеві сегменти подовження ланцюга шляхом перекривання дозволяють проводити зв'язування продуктів, утворених кожним набором праймерів, в процесі ампліфікації. Така суміш праймерів іменується множинною сумішшю праймерів для подовження ланцюга шляхом перекривання. Множинна PCR з подовженням ланцюга шляхом перекривання відрізняється від звичайної PCR з подовженням ланцюга шляхом перекривання тим, що послідовності, що зв'язуються, утворюються одночасно в одній пробірці, завдяки чому відбувається негайне зв'язування заданих послідовностей під час ампліфікації без якого-небудь проміжного очищення. Крім того, при звичайній PCR з подовженням ланцюга шляхом перекривання потрібне виконання окремої реакції зв'язування за допомогою PCR з використанням зовнішнього набору праймерів або гніздового набору праймерів для одержання зв'язаного продукту (Horton, R.M. et al. 1989, Gene 77, 61-68). Така додаткова стадія ампліфікації є не 89761 22 обов'язковою при виконанні множинної PCR з подовженням ланцюга шляхом перекривання за даним винаходом. Іншою відмітною ознакою даного винаходу є стадія зворотної транскрипції (RT), яка передує ампліфікації множинної PCR або множинної PCR з подовженням ланцюга шляхом перекривання, з використанням матриці, одержаної з виділеної окремої клітини або популяції ізогенних клітин. Іншою відмітною ознакою даного винаходу є використання нуклеотидних послідовностей, одержаних з виділеної окремої клітини або популяції ізогенних клітин, як матриці для ампліфікації методом множинної PCR. PHK з окремої клітини, переважно, піддають зворотній транскрипції з утворенням кДНК перед виконанням множинної PCR. Для ампліфікації деяких цікавлячих послідовностей нуклеїнових кислот як альтернативу мРНК можна використати геномну ДНК. Використовуючи виділені окремі клітини або популяцію ізогенних клітин, одержану внаслідок клональної експансії виділеної окремої клітини, як джерело матриці, можна уникнути заміни нуклеотидних послідовностей, які кодують цікавлячий гетеромерний білок, нуклеотидними послідовностями, одержаними з інших клітин в популяції клітин. Це має важливе значення, якщо бажано одержати первинний склад цікавлячих послідовностей. Для утворення родинної пари послідовностей, які кодують варіабельні області, як джерело матриці важливо використати виділену окрему клітину або популяцію ізогенних клітин. Множинна PCR з подовженням ланцюга шляхом перекривання є рідко використовуваним методом. У публікації WO 99/16904 описано зв'язування екзонів з геномної послідовності при виконанні однієї реакції, внаслідок якої утворюється кДНК без застосування зворотної транскрипції. У описаному способі використаний один набір праймерів (що складається з двох праймерів) на один екзон, який підлягає зв'язуванню, при якому утворюється суміш множинних праймерів для подовження ланцюга шляхом перекривання. За допомогою кожного окремого набору праймерів можна подовжувати ланцюг шляхом перекривання з суміжним набором праймерів за допомогою комплементарних кінцевих сегментів подовження ланцюга шляхом перекривання. кДНК утворюється з матриці геномної ДНК внаслідок здійснення PCR з подовженням ланцюга шляхом перекривання з використанням суміші множинних праймерів для подовження ланцюга шляхом перекривання і подальшої гніздової PCR, яка відповідно до опису є необхідною стадією. Утворення кДНК з екзонів геномної ДНК, описане в WO 99/16904, не має відношення до клонування послідовностей, які кодують гетеромерні білки. Передусім, гетеромерні білки звичайно одержують з різних генів, в той час як зв'язування екзонів відповідно до опису, наведеного в публікації WO 99/16904, належить до зв'язування екзонів з одного гена. Крім того, даний винахід полегшує створення бібліотек цікавлячих зв'язаних послідовностей нуклеїнових кислот, зокрема комбінаторних бібліотек і бібліотек родинних пар варіабельних областей, що повністю відрізняється від 23 зв'язування серії екзонів з одного гена, внаслідок якого утворюється одна неваріабельна кДНК. У даному винаході використані нуклеїнові кислоти, виділені з окремих клітин, переважно, в формі РНК, яка не вимагає відділення від іншого вмісту клітини перед її використанням як матриці. У декількох публікаціях описана множинна RTPCR з подовженням ланцюга шляхом перекривання, що застосовується для зв'язування послідовностей, які кодують варіабельні області. Найбільш проста форма множинної RT-PCR з подовженням ланцюга шляхом перекривання описана для виділення послідовності, яка кодує scFvфрагмент, з лінії клітин гібридоми (Thirion, S. et al. 1996, Eur. J. Cancer Prev. 5, 507-511 and Mullinax, R.L. et al. 1992, BioTechniques 12, 864-869). Способи, описані в публікації Thirion і Mullinax, передбачають виконання зворотної транскрипції мРНК з використанням оліго-dТ-праймерів стосовно загальної РНК, екстрагованої з лінії клітин гібридоми, з подальшим виконанням окремої стадії зв'язування. Стадію зв'язування виконують з використанням в загальній складності чотирьох праймерів, що включають дві пари праймерів для ампліфікації послідовностей, які кодують відповідно варіабельну область важкого ланцюга і варіабельну область легкого ланцюга. Основний праймер для VL і зворотний праймер для VH або СH містять комплементарні кінцеві сегменти подовження ланцюга шляхом перекривання, що дозволяє одночасно проводити ампліфікацію і зв'язування послідовностей, які кодують варіабельну область важкого ланцюга і варіабельну область легкого ланцюга. У вказаних способах не застосовується гніздова PCR для підвищення чутливості способу зв'язування. Інший приклад множинної RT-PCR з подовженням ланцюга шляхом перекривання, що належить до зв'язування послідовностей, які кодують варіабельні області, описаний у вищезгаданій публікації WO 93/03151, в якій розглянутий спосіб клонування послідовностей, які кодують варіабельну область важкого ланцюга і варіабельну область легкого ланцюга, які були одержані з однієї клітини без виділення окремих клітин перед клонуванням. Спосіб, описаний в WO 93/03151, вимагає здійснення промивання між стадією RT і стадією множинної PCR з подовженням ланцюга шляхом перекривання. Крім того, однією з конкретних цілей публікації WO 93/03151 є розв'язання проблеми виділення окремих клітин для одержання родинних пар послідовностей, які кодують варіабельні області. Жоден з відомих методів множинної RT-PCR з подовженням ланцюга шляхом перекривання не призначений для здійснення на матриці, одержаній з виділеної окремої клітини. Крім того, жоден з відомих методів не може бути виконаний у вигляді одностадійних реакцій RT-PCR. Один з варіантів здійснення даного винаходу належить до зв'язування декількох цікавлячих несуміжних нуклеотидних послідовностей. Такий спосіб передбачає ампліфікацію за допомогою множинної PCR або множинній RT-PCR цікавлячих нуклеотидних послідовностей з використанням 89761 24 матриці, одержаної з виділеної окремої клітини або популяції ізогенних клітин, і зв'язування цікавлячих ампліфікованих нуклеотидних послідовностей. Крім того, спосіб передбачає необов'язкову стадію виконання додаткової ампліфікації зв'язаних продуктів. Інший варіант здійснення даного винаходу належить до способу створення бібліотеки родинних пар, що включає зв'язані послідовності, які кодують варіабельні області. Цей спосіб передбачає одержання від донора лімфоцитвмісної фракції клітин, яку, необов'язково, збагачують певною популяцією лімфоцитів з вказаної фракції клітин. Потім одержують популяцію виділених окремих клітин, розподіляючи клітини з лімфоцитвмісної фракції клітин або збагаченої фракції клітин в декілька посудин. Потім виконують множинну молекулярну ампліфікацію (ампліфікація методом множинної RT-PCR) послідовностей, які кодують варіабельні області, які знаходяться в популяції виділених окремих клітин, і зв'язування пар послідовностей, які кодують варіабельні області, при цьому окрему пару одержують з однієї клітини в популяції виділених окремих клітин. Крім того, цей спосіб передбачає дві необов'язкові стадії: на першій стадії відбувається поділ окремої клітини, виділеної з популяції окремих клітин, до утворення популяції ізогенних клітин перед виконанням ампліфікації методом множинної RT-PCR. Таким чином одержують декілька посудин з різною популяцією ізогенних клітин (одна популяція ізогенних клітин в одній судині). Друга необов'язкова стадія передбачає виконання додаткової ампліфікації зв'язаних послідовностей, які кодують варіабельні області. У переважних варіантах здійснення даного винаходу один з членів вказаної бібліотеки родинних пар, являє собою послідовність, яка кодує варіабельну область легкого ланцюга імуноглобуліну, зв'язану з послідовністю, яка кодує варіабельну область важкого ланцюга імуноглобуліну, які одержані з однієї клітини, або послідовності, які кодують домен зв'язування Т-клітинного рецептора, що складається з варіабельної області альфаланцюга, зв'язаної з варіабельною областю беталанцюга, або варіабельної області гамма-ланцюга, зв'язаної з варіабельною областю дельталанцюга, при цьому зв'язані варіабельні області одержують з однієї клітини. Ампліфікація методом множинної RT-PCR за даним винаходом може бути виконана у вигляді двостадійного способу, в якому зворотну транскрипцію (RT) здійснюють окремо від ампліфікації методом множинної PCR (або альтернативної множинної молекулярної ампліфікації), або у вигляді одностадійного способу, в якому стадії RT і ампліфікації методом множинної PCR виконують з використанням одних і тих же праймерів в одній пробірці. Зворотну транскрипцію (RT) виконують за допомогою ферменту, який має активність зворотної транскриптази, одержуючи при цьому кДНК із загальної РНК, мРНК або заданої специфічної РНК у виділеній окремій клітині. Праймери, які можуть бути використані для зворотної транскрипції, яв 25 ляють собою, наприклад, оліго-сіТ-праймери, довільні гексамери, довільні декамери, інші довільні праймери або праймери, специфічні до нуклеотидних послідовностей, які представляють інтерес. Двостадійний спосіб ампліфікації за допомогою множинної RT-PCR дозволяє розподілити кДНК, одержану на стадії RT, в декілька посудин для зберігання матричної фракції до виконання ампліфікації. Крім того, розподіл кДНК в декілька пробиров робить можливим виконання декількох ампліфікацій методом множинної PCR нуклеїнової кислоти, одержаної з однієї і тієї ж матриці. Хоч цей спосіб характеризується великим числом окремих реакцій, він дозволяє, при бажанні, спростити змішування множинних праймерів. Вказаний двостадійний спосіб, наприклад, може бути використаний для ампліфікації і зв'язування послідовностей, які кодують варіабельну область важкого ланцюга і варіабельну область легкого каппаланцюга, в одній пробірці і послідовностей, які кодують варіабельну область важкого ланцюга і варіабельну область легкого лямбда-ланцюга, в іншій пробірці з використанням однієї і тієї ж матриці. Окрема клітина звичайно експресує тільки один з легких ланцюгів. Однак часто набагато простіше виконувати реакції одночасно, не чекаючи результату однієї з реакцій, перш ніж почати виконання іншої реакції. Крім того, ампліфікація каппа-ланцюга і лямбда-ланцюга служить як внутрішній негативний контроль, оскільки потрібно чекати, що з окремої клітини може бути ампліфікований тільки каппа-ланцюг або лямбда-ланцюг. У одностадійному способі множинної RT-PCR зворотну транскрипцію і ампліфікацію за допомогою множинної PCR виконують в одній посудині. У посудини вводять всі компоненти, необхідні для виконання як зворотної транскрипції, так і множинної PCR в одній стадії, і потім здійснюють вказану реакцію. Як правило, не треба вводити додаткові компоненти після початку реакції. Перевагою одностадійного способу ампліфікації за допомогою множинної RT-PCR є скорочення числа стадій, необхідних для одержання зв'язаних нуклеотидних послідовностей за даним винаходом. Цей спосіб є особливо ефективним для виконання множинної RT-PCR з використанням цілого ряду окремих клітин, коли одна і та ж реакція повинна бути виконана в декількох посудинах. Одностадійний спосіб множинної RT-PCR виконують, використовуючи зворотні праймери, присутні в суміші множинних праймерів, необхідній для ампліфікації методом множинної PCR, також як праймерів для зворотної транскрипції. Композиція, необхідна для одностадійного способу множинної RT-PCR, містить матрицю нуклеїнової кислоти, фермент, який має активність зворотної транскриптази, фермент, який має активність ДНК-полімерази, суміш дезоксинуклеозидтрифосфатів (суміш dNTP, що містить dATP, dCTP, dGTP і dTTP) і суміш множинних праймерів. Матрицею нуклеїнової кислоти переважно є загальна РНК або мРНК, одержана з виділеної окремої клітини в очищеному вигляді, що міститься в лізаті клітини або знаходиться всередині інтактної клітини. Точний склад реакційної суміші звичайно вимагає деякої оптимізації кожної 89761 26 суміші множинних праймерів за даним винаходом. Це належить як до двостадійного, так і до одностадійного методу множинної RT-PCR. У альтернативних варіантах здійснення даного винаходу як матрицю може бути бажано використати геномну ДНК замість РНК. У таких випадках стадію зворотної транскрипції пропускають і інші стадії за даним винаходом виконують відповідно до наведеного опису. При виконанні деяких одностадійних множинних RT-PCR під час реакції може бути бажано ввести додаткові компоненти. Наприклад, після виконання стадії RT можна додати полімеразу. Інші компоненти можуть включати, наприклад, суміш dNTP або суміш множинних праймерів, можливо, з іншим складом праймерів. Такий спосіб може розглядатися як множинна RT-PCR, що виконується в одній пробірці, яка має такі ж переваги, що і одностадійний спосіб множинної RT-PCR, оскільки він також обмежує кількість пробірок, необхідних для одержання необхідних зв'язаних продуктів. Цікавлячі нуклеотидні послідовності, ампліфіковані за допомогою множинної RT-PCR, можуть бути зв'язані одна з одною різними способами, такими як множинна RT-PCR з подовженням ланцюга шляхом перекривання, лігування або рекомбінація, з використанням різних сумішей множинних праймерів. Ампліфікацію методом множинної RT-PCR і зв'язування здійснюють одностадійним або двостадійним способом. Однак зв'язування може бути також виконане шляхом багатостадійного процесу з використанням, наприклад, заповнюючого фрагмента, що служить для зв'язування цікавлячих послідовностей нуклеїнових кислот за допомогою PCR, лігування або рекомбінації. Такий заповнюючий фрагмент може містити циселементи, промоторні елементи, відповідну кодуючу послідовність або упізнавальну послідовність. У переважному варіанті здійснення винаходу зв'язування виконують в тій же посудині, що і ампліфікацію методом множинної RT-PCR. У одному з варіантів здійснення даного винаходу зв'язування декількох цікавлячих несуміжних нуклеотидних послідовностей здійснюють разом з ампліфікацією методом множинної PCR, використовуючи суміш множинних праймерів для подовження ланцюга шляхом перекривання. Такий спосіб дозволяє об'єднати ампліфікацію і зв'язування заданих послідовностей. Композиція, необхідна для виконання множинної PCR з подовженням ланцюга шляхом перекривання, звичайно містить матрицю нуклеїнової кислоти, фермент, що має активність ДНК-полімерази, суміш дезоксинуклеозидтрифосфатів (суміш dNTP, що містить dATP, dCTP, dGTP і dTTP) і суміш множинних праймерів для подовження ланцюга шляхом перекривання. У конкретному варіанті здійснення даного винаходу декілька цікавлячих несуміжних нуклеотидних послідовність зв'язують за допомогою множинної RT-PCR з подовженням ланцюга шляхом перекривання, використовуючи матрицю, одержану з виділеної окремої клітини або популяції ізогенних клітин. Крім того, цей спосіб передбачає необов'язкову стадію виконання додаткової молекулярної ампліфікації зв'язаних продуктів. Мно 27 жинну RT-PCR з подовженням ланцюга шляхом перекривання, переважно, виконують у вигляді одностадійної реакції в одній пробірці. Суміш множинних праймерів для подовження ланцюга шляхом перекривання за даним винаходом включає принаймні два набори праймерів, здатних ініціювати ампліфікацію і зв'язування принаймні двох послідовностей, які кодують варіабельні області, наприклад, ампліфікацію і зв'язування послідовностей з сімейств варіабельних областей важкого ланцюга імуноглобуліну з сімействами варіабельних областей легкої каппа- або лямбда-ланцюга, або ампліфікацію і зв'язування послідовностей з сімейств α-, β-, - або - ланцюгів Τ-клітинних рецепторів. У іншому варіанті здійснення даного винаходу декілька цікавлячих нуклеотидних послідовностей, ампліфікованих за допомогою множинної RT-PCR, зв'язують лігуванням. Для цього суміш множинних праймерів, що використовується для множинної RT-PCR, створюють з таким розрахунком, щоб ампліфіковані задані послідовності можна було розщепити відповідними рестрикційними ферментами і зробити ковалентне зв'язування шляхом лігування ДНК (створення праймерів описане в розділі "Суміші праймерів і їх створення"). Після ампліфікації методом множинної RT-PCR з використанням такої суміші множинних праймерів до реакційної суміші разом з лігазою додають рестрикційні ферменти, необхідні для утворення сумісних кінців заданих послідовностей. Продукти PCR перед цією стадією можна не очищати, хоч таке очищення може бути зроблене. Температура реакції для об'єднаного рестрикційного розщеплення і лігування знаходиться в межах від близько 0 до 40°С. Однак, якщо в суміші все ще присутня полімераза, що використовується в множинній PCR, переважною є температура інкубації нижче кімнатної температури, найбільш переважними є температури від 4 до 16°С. У іншому варіанті здійснення даного винаходу декілька цікавлячих нуклеотидних послідовностей, ампліфікованих методом множинної RT-PCR, зв'язують рекомбінацією. У цьому випадку ампліфіковані задані послідовності можуть бути зв'язані з використанням ідентичних сайтів рекомбінації. Зв'язування виконують, додаючи рекомбінази, які полегшують рекомбінацію. Деякі прийнятні системи рекомбіназ включають F1p-рекомбіназу з декількома сайтами FRT, Cre-рекомбіназу з декількома сайтами lox, інтегразу ФС31, яка здійснює рекомбінацію між сайтом attP і сайтом attB, систему з шести β-рекомбіназ, а також систему Gin-gix. Зв'язування рекомбінацією було показане на прикладі двох нуклеотидних послідовностей (зв'язування VH з VL) (публікація Chapal, N. et al. 1997, Bio Techniques 23, 518-524, включена в даний опис винаходу як посилання). У переважному варіанті здійснення даного винаходу цікавлячі нуклеотидні послідовності включають послідовності, які кодують варіабельні області, при цьому внаслідок зв'язування утворюється родинна пара послідовностей, які кодують варіабельні області. Така родинна пара може містити одну або декілька послідовностей, 89761 28 які кодують константні області крім варіабельних областей. У ще більш переважному варіанті здійснення даного винаходу цікавлячі нуклеотидні послідовності включають послідовності, які кодують варіабельні області імуноглобуліну, при цьому внаслідок зв'язування утворюється родинна пара послідовностей, які кодують варіабельну область легкого ланцюга і варіабельну область важкого ланцюга. Така родинна пара може містити одну або декілька послідовностей, які кодують константні області крім варіабельних областей. Крім того, така родинна пара може бути виділена з матриці, одержаної з клітин лінії В-лімфоцитів, збагачених з лімфоцитвмісної фракції клітин, такої як цільна кров, мононуклеарні клітини або лейкоцити. У такому ж переважному варіанті здійснення даного винаходу цікавлячі нуклеотидні послідовності включають послідовності, які кодують варіабельні області TcR, при цьому внаслідок зв'язування утворюється родинна пара послідовностей, які кодують варіабельну область α-ланцюга і варіабельну область β-ланцюга, або послідовностей, які кодують варіабельну область -ланцюга і варіабельну область -ланцюга. Така родинна пара може містити одну або декілька послідовностей, які кодують константні області крім варіабельних областей. Крім того, така родинна пара може бути виділена з матриці, одержаної з клітин лінії Тлімфоцитів, збагачених з лімфоцитвмісної фракції клітин, такої як цільна кров, мононуклеарні клітини або лейкоцити. Іншим об'єктом даного винаходу є застосування множинної RT-PCR з використанням як джерела матриці популяції генетично різних клітин. Більшість послідовностей, які кодують гетеромерні білки, є однаковими в різних клітинах на відміну від послідовностей, які кодують варіабельні області, в зв'язуючих білках. Таким чином, при застосуванні даного винаходу для клонування таких послідовностей, які кодують неваріабельні області гетеромерних білків, не треба проводити первинне виділення окремих клітин. У цьому варіанті здійснення даного винаходу декілька цікавлячих несуміжних нуклеотидних послідовностей довільно зв'язують способом, який передбачає ампліфікацію методом множинної RTPCR цікавлячих нуклеотидних послідовностей з використанням матриці, одержаної з популяції генетично різних клітин, і зв'язування цікавлячих ампліфікованих нуклеотидних послідовностей. Крім того, цей спосіб передбачає необов'язкову стадію виконання додаткової ампліфікації зв'язаних продуктів. Як і у разі способу на основі окремої клітини, зв'язування можна виконувати за допомогою суміші множинних праймерів для подовження ланцюга шляхом перекривання, що використовується для ампліфікації, або, альтернативно, лігуванням або рекомбінацією. Матриця, одержана з популяції клітин, переважно знаходиться всередині клітин. Популяція клітин, наприклад, може бути лізована. Застосування способу довільного зв'язування до популяції клітин, експресуючих варіабельні області зв'язуючих білків, дозволяє спростити ство 29 рення комбінаторних бібліотек послідовностей, які кодують варіабельні області. Популяція клітин, переважно, містить клітини, експресуючі варіабельні області зв'язуючих білків, такі як В-лімфоцити, Т-лімфоцити, клітини гібридоми, плазматичні клітини або суміш вказаних клітин. Популяція клітин у вищезгаданому варіанті здійснення, наприклад, може бути зроблена проникною або лізована без додаткового очищення, або матричні нуклеїнові кислоти можуть бути виділені з клітин стандартними методами. Переважним є одностадійний спосіб множинної RT-PCR. Однак в даному варіанті здійснення винаходу можна також використати двостадійний спосіб. Даний винахід також належить до комбінаторній бібліотеки, що включає зв'язані пари послідовностей, які кодують варіабельну область легкого ланцюга і варіабельну область важкого ланцюга імуноглобуліну. Ефективним способом підвищення специфічності, чутливості і виходу продукту при здійсненні множинної RT-PCR і зв'язування є виконання додаткової молекулярної ампліфікації зв'язаних нуклеотидних послідовностей, одержаних в результаті множинної RT-PCR, з подальшим зв'язуванням шляхом лігування або рекомбінації або за допомогою множинної RT-PCR з подовженням ланцюга шляхом перекривання. Додаткову ампліфікацію, переважно, виконують за допомогою PCR, використовуючи суміш праймерів, для ампліфікації цікавлячи зв'язаних послідовностей нуклеїнових кислот. Суміш праймерів може включати зовнішні праймери з суміші множинних праймерів або суміші множинних праймерів для подовження ланцюга шляхом перекривання, зокрема праймери, гібридизуючі з 5'-кінцем і 3'-кінцем смислового ланцюга зв'язаних послідовностей, які кодують варіабельні області, що дозволяє проводити ампліфікацію усього зв'язаного продукту. Зовнішні праймери також можна визначити як праймери з суміші множинних праймерів для подовження ланцюга шляхом перекривання, які не містять кінцевих сегментів подовження ланцюга шляхом перекривання. Альтернативно, для додаткової ампліфікації зв'язаних нуклеотидних послідовностей можна використати набір праймерів для гніздової або напівгніздової PCR. Така гніздова PCR особливо ефективна для підвищення специфічності способу, а також для збільшення кількості зв'язаного продукту. Відповідно до цілей даного винаходу напівгніздова PCR (описана в розділі, озаглавленому "Суміші праймерів і їх створення") вважається такою ж ефективною, що і гніздова PCR. Таким чином, бажаною, хоч і необов'язковою, умовою для даного винаходу, є виконання додаткової ампліфікації за допомогою PCR зв'язаних продуктів, одержаних в результаті множинної RT-PCR з подовженням ланцюга шляхом перекривання, або продуктів, зв'язаних шляхом лігування або рекомбінації, методом гніздової PCR або напівгніздової PCR. Додаткову ампліфікацію можна виконати, безпосередньо використовуючи фракцію або весь продукт, одержаний в результаті множинної RTPCR з подовженням ланцюга шляхом перекриван 89761 30 ня, продукт, одержаний лігуванням або рекомбінацією, фракцію будь-кого з вказаних продуктів або частково очищені зв'язані продукти, одержані внаслідок будь-якої з вказаних реакцій, наприклад, за допомогою електрофорезу в агарозному гелі і вирізування фрагмента, відповідного передбачуваному розміру зв'язаних послідовностей, які кодують варіабельні області. Для продуктів, зв'язаних за допомогою множинної RT-PCR з подовженням ланцюга шляхом перекривання, додаткову ампліфікацію переважно виконують безпосередньо у фракції, одержаній в результаті множинної RTPCR з подовженням ланцюга шляхом перекривання, оскільки це сприяє зв'язуванню окремих заданих послідовностей, які не були зв'язані в ході першої реакції. Цікавлячі послідовності Цікавлячі нуклеотидні послідовності за даним винаходом можуть бути вибрані з послідовностей, які кодують різні субодиниці або домени, внаслідок експресії яких утворюється білок або частина білка. Такі білки, що складаються принаймні з двох неідентичних субодиниць, відомі як гетеромерні білки. Гетеромерні білки присутні у всіх біологічних видах. Деякими класами, до яких належать такі білки, є, наприклад, ферменти, інгібітори, структурні білки, токсини, каналоутворюючі білки, G-білки, рецепторні білки, білки надродини імуноглобулінів, транспортуючі білки і т.д. Нуклеотидні послідовності, які кодують такі гетеромерні білки, є несуміжними, з чого випливає, наприклад, що вони утворюються різними генами або різними молекулами мРНК. Однак термін "несуміжні" в значенні, що використовується в даному винаході, може також означати нуклеотидні послідовності, які кодують домени одного білка, в якому вказані домени розділені не цікавлячими нуклеотидними послідовностями. У одному з варіантів здійснення даного винаходу цікавлячі нуклеотидні послідовності включають послідовності, які кодують варіабельні області, з надродини імуноглобулінів, таких як імуноглобуліни (антитіла), В-клітинні рецептори і Т-клітинні рецептори (TcR). Особливо цікавими є послідовності, які кодують варіабельні області імуноглобулінів. Такі послідовності, що кодують варіабельні області, включають непроцесовані антитіла, а також Fab-, Fv-, scFv-фрагменти і комбінації фрагментів послідовностей, які кодують варіабельні області, наприклад, гіперваріабельні ділянки (CDR), Jгени або V-гени або їх поєднання. Як правило, даний винахід належить до будь-яких комбінацій послідовностей, які кодують варіабельні області, і до поєднання їх фрагментів. У даній заявці розглянуто зв'язування всього легкого ланцюга з варіабельним доменом важкого ланцюга. Однак даний винахід також належить до зв'язування тільки варіабельних доменів важкого і легкого ланцюгів, які утворюють Fv- або scFv-кодуючі послідовності, або до зв'язування всього легкого ланцюга з варіабельною областю важкого ланцюга, доменом константної області СНІ і частинами шарнірної області, які утворюють Fab, Fab' або F(ab) 2. Крім того, до варіабельної області важкого ланцюга можна додати будь-яку область доменів констант 31 ної області важкого ланцюга, внаслідок чого будуть одержані процесовані антитілокодуючі послідовності або непроцесовані антитілокодуючі послідовності. У іншому варіанті здійснення даного винаходу послідовності, які кодують варіабельні області, включають послідовність, яка кодує легкий ланцюг (каппа або лямбда) імуноглобуліну, одного типу і одну послідовність, яка кодує варіабельну область важкого ланцюга імуноглобуліну. Крім того, представляють інтерес послідовності, які кодують варіабельні області, які були одержані з Т-клітинних рецепторів (TcR). Такі TcRкодуючі послідовності включають кодуючі послідовності для непроцесованих альфа- і бета-ланцюгів або гамма- і дельта-ланцюгів, а також розчинні TcR або тільки варіабельні домени вказаних ланцюгів або їх одноланцюгові злиті білки (наприклад, одиночний αβ-ланцюг або одиночний -ланцюг). Джерела матриці Однією з відмітних ознак даного винаходу є можливість зв'язувати нуклеотидні послідовності, одержані з виділеної окремої клітини, популяції ізогенних клітин або генетично різної популяції клітин, які не були розподілені по окремих посудинах. Клітини, що використовуються в даному винаході, можуть бути, наприклад, бактеріальними клітинами, дріжджовими клітинами, грибними клітинами, клітинами комах, рослинними клітинами, клітинами ссавців або фракціями таких клітин. Клітини крові ссавців є одним прикладом фракції клітин, які можуть бути використані в даному винаході. Переважною відмітною ознакою даного винаходу є використання виділених окремих клітин або популяції ізогенних клітин як джерела матриці, оскільки таким чином можна уникнути заміни цікавлячих послідовностей нуклеїнових кислот, зокрема послідовностей, які кодують варіабельні області. Це має особливо важливе значення в тому випадку, якщо бажано одержати первинну пару послідовностей, які кодують варіабельні області. Іншою переважною відмітною ознакою даного винаходу є одержання окремої клітини або популяції окремих клітин з лімфоцитвмісної фракції клітин, такої як В-лімфоцити, Т-лімфоцити, плазматичні клітини і/або лінії вказаних клітин на різних стадіях розвитку. Для одержання окремих клітин також можна використати інші популяції клітин, експресуючих зв'язуючі білки з надродини імуноглобулінів. У даному винаході можна також використати такі лінії клітин як клітини гібридоми, лінії клітин В-лімфоцитів або Т-лімфоцитів, іммобілізовані лінії клітин вірусів або клітини, одержані від донора, які беруть участь в збудженні імунної реакції. Фракції лімфоцитвмісних клітин, одержаних від донора, можна виділити з природних тканин або рідин з великим вмістом таких клітин, наприклад, з крові, кісткового мозку, лімфатичних вузлів, тканини селезінки, тканини мигдалини, з інфільтратів всередині і навколо пухлин або з інфільтратів запальної тканини. Прийнятними донорами клітин за даним винаходом можуть бути хребетні з надбаною імунною системою. Донорами можуть бути індивідууми, що не зазнавали раніше якого 89761 32 небудь впливу або гіперімунізовані проти необхідної мішені. Для виділення антигензв'язуючих білків, що мають специфічність зв'язування до певної мішені, переважними є гіперімунізовані донори. Такими гіперімунізованими донорами можуть бути донори, імунізовані антигеном-мішенню або його фрагментами, видужуючі або хворі індивідууми, у яких виникає природна імунна реакція на антигенмішень, наприклад, індивідууми, страждаючі на автоімунні захворювання, рак або інфекційні хвороби, такі як ВІЛ-інфіковані індивідууми, індивідууми, страждаючі гепатитом А, В або С, важким гострим респіраторним синдромом (SARS) і тому подібне, або індивідууми, страждаючі хронічними захворюваннями. При використанні рекомбінантних білків в лікувальних цілях бажано, що вони були виділені з послідовностей, які характеризуються видовою ідентичністю з індивідуумом, який підлягає лікуванню, (наприклад, для лікування людей повинні бути використані людські послідовності). Передусім тому, що рекомбінантні білки, виділені з чужорідної послідовності (тобто відмінні від людських), будуть розпізнані імунною системою, внаслідок чого виникне імунна реакція з участю поліклональних антибілкових антитіл. Вказані антибілкові антитіла можуть блокувати дію лікарського засобу, зайнявши активний сайт, прискорити виведення лікарського засобу і викликати шкідливі реакції, зокрема алергічні реакції при повторному впливі. Імуногенність, проте, також може спостерігатися в тих випадках, коли рекомбінантний білок виділений з послідовності, яка характеризується видовою ідентичністю. Така імуногенність, наприклад, може бути індукована посттрансляційними модифікаціями, які можуть відрізнятися від спостережуваних in vivo. Комбінаторні бібліотеки послідовностей, які кодують варіабельні області, також можуть викликати імуногенність, оскільки вони складаються зі створених in vitro довільних пар послідовностей, які кодують варіабельні області. Правила, що визначають утворення in vivo пар послідовностей, які кодують важкі і легкі ланцюги антитіла (або Т-клітинних рецепторів), ще повністю не вивчені. З вищевикладеного випливає, що деякі утворені in vitro пари можуть бути розпізнані імунною системою як чужорідні, навіть якщо обидві послідовності, які утворюють пару, належать людині. Зв'язуючі білки, одержані з бібліотек родинних пар, з іншого боку, не утворюють таких аномальних комбінацій і тому є потенційно менш імуногенними, ніж зв'язуючі білки, одержані з комбінаторних бібліотек. Це не означає, що продукти, одержані з комбінаторних бібліотек, не придатні для лікування, вони просто вимагають більш ретельного контролю з метою виявлення вищезгаданих побічних ефектів. Відповідно до даного винаходу донори клітин переважно повинні належати до такого ж біологічного виду, що і індивідууми, які підлягають лікуванню продуктами, одержаними зі зв'язаних нуклеотидних послідовностей за даним винаходом. Донором клітин переважно є свійська тварина, кімнатна тварина, людина або трансгенна тварина. Трансгенні тварини, які несуть локуси імуног 33 лобуліну людини, описані в патенті США №6111166 і в публікації Kuroiwa, Y. et al. Nature Biotechnology; 2002; 20: 889-893. Такі трансгенні тварини можуть продукувати імуноглобуліни людини. Таким чином, повністю людські антитіла проти специфічної мішені можуть бути одержані звичайними методами імунізації таких трансгенних тварин. Це дозволяє створити бібліотеки, які кодують зв'язуючі білки, що мають специфічність відносно більш важких мішеней, таких як антигени людини, відносно яких у людини відсутня або існує обмежена природна гуморальна імунна реакція. Аналогічним чином можуть бути створені трансгенні тварини, продукуючі Т-клітинні рецептори людини. У іншому варіанті здійснення даного винаходу лімфоцитвмісна фракція клітин складається з цільної крові, кісткового мозку, мононуклеарних клітин або лейкоцитів, одержаних від донора. Мононуклеарні клітини можуть бути виділені з крові, кісткового мозку, лімфатичних вузлів, селезінки, інфільтратів навколо ракових клітин і запальних інфільтратів. Мононуклеарні клітини можуть бути виділені методами центрифугування в градієнті густини, наприклад, в градієнтах фіколу. При виділенні мононуклеарних клітини із зразків тканини, тканину, що використовується, руйнують до виконання центрифугування в градієнті щільності. Тканина може бути зруйнована механічними методами, такими як, наприклад подрібнення, електропорацією і/або хімічними методами, такими як обробка ферментами. Лейкоцити можна виділити безпосередньо у донорів за допомогою лейкоферезу. У даному винаході можна також використати неочищені препарати кісткового мозку або тканини, що містять лімфоцити. Такі препарати необхідно зруйнувати, наприклад, вищеописаними методами, для полегшення розподілу окремих клітин. Іншою відмітною ознакою даного винаходу є збагачення лімфоцитвмісної фракції клітин, наприклад, цільної крові, мононуклеарних клітин, лейкоцитів або кісткового мозку, відносно певної популяції лімфоцитів, такої як клітини з ліній Влімфоцитів або Т-лімфоцитів. Збагачення Влімфоцитів можна здійснити, наприклад, за допомогою сортування клітин методом магнітних гранул або сортування клітин із збудженням флуоресценції (FACS), використовуючи специфічні до даної лінії маркерні білки клітинної поверхні, такі як CD19 або інші маркери, специфічні до лінії Вклітин. Збагачення Т-лімфоцитів можна здійснити, наприклад, за допомогою маркера клітинної поверхні, такого як CD3, або інших маркерів, специфічних до лінії Т-клітин. Переважною відмітною ознакою даного винаходу є додаткове сортування збагачених Влімфоцитів для одержання плазматичних клітин до розподілу окремих клітин в декілька посудин. Плазматичні клітини звичайно виділяють за допомогою сортування методом FACS, використовуючи поверхневі маркери, такі як CD38, можливо, в поєднанні з CD45. Крім того, можна використати інші поверхневі маркери, специфічні до плазматичних клітин, або їх комбінації, наприклад, CD138, CD20, 89761 34 CD21, CD40, CD9, HLA-DR або CD62L, причому вибір маркера залежить від джерела плазматичних клітин, такого як мигдалини, кров або кістковий мозок. Плазматичні клітини можна також виділити з незбагаченої лімфоцитвмісної популяції клітин, одержаної з будь-яких вищезгаданих джерел. Плазматичні клітини, виділені з крові, іноді називають ранніми плазматичними клітинами або лімфобластами. У даному винаході вказані клітини також іменуються плазматичними клітинами, хоч вони є СD19-позитивними клітинами на відміну від плазматичних клітин, що знаходяться в кістковому мозку. Для виділення родинних пар послідовностей, які кодують імуноглобуліни, бажано використовувати плазматичні клітини, оскільки при більш високій частоті стрівальності вказані клітини продукують антигенспецифічні антитіла, які відображають надбаний імунітет до необхідного антигену, при цьому більшість вказаних клітин зазнали соматичної надмутації і тому кодують високоафінні антитіла. Крім того, в плазматичних клітинах підвищені рівні мРНК в порівнянні з іншою популяцією В-лімфоцитів, завдяки чому зворотна транскрипція виявляється більш ефективною при використанні окремих плазматичних клітин. Як альтернатива виділенню плазматичних клітин з лімфоцитвмісної фракції клітин можна виділити Вклітини пам'яті, використовуючи маркер клітинної поверхні, такий як CD22. Альтернативною відмітною ознакою даного винаходу є відбір збагачених В-лімфоцитів відносно антигенної специфічності до розподілу клітин в декілька посудин. Антигенспецифічні В-лімфоцити відбирають, здійснюючи контактування збагачених В-лімфоцитів з необхідним антигеном або антигенами, внаслідок якого відбувається зв'язування антигену з поверхневим імуноглобуліном, і подальше виділення зв'язаних клітин. Вищезгаданий відбір можна зробити шляхом нанесення на магнітні гранули необхідного антигену або антигенів і шляхом сортування клітин методом магнітних гранул, FACS, введення антигенів в колонку і виконання афінної хроматографії, скринінгу на фільтрі або інших методів, відомих в даній галузі. При бажанні, відбору на антигенну специфічність можна піддати плазматичні клітини, а також В-лімфоцити, незбагачені мононуклеарні клітини, лейкоцити, цільну кров, кістковий мозок або препарати тканини. Іншою відмітною ознакою даного винаходу є сортування збагачених Т-лімфоцитів (наприклад, СD3-позитивних клітин) з використанням поверхневих маркерів CD45R0 і/або CD27 для одержання фракції Т-клітин пам'яті. Т-лімфоцити можна також відібрати з урахуванням МНС-антигенної специфічності, використовуючи комплекси МНС-пептид (див., наприклад, публікації Callan, M.F et al. 1998, J. Exp. Med. 187, 1395-1402; Novak, E.J. et al. 1999, J. Clin. Invest. 104, R63-R67). Іншою відмітною ознакою даного винаходу є імморталізація будь-яких вищеописаних виділених фракцій клітин (наприклад, В-лімфоцитів, плазматичних клітин, клітин пам'яті або Т-лімфоцитів). Імморталізація може бути, наприклад, виконана за допомогою вірусу Епштейна Барра (Traggiai, Ε. et 35 al., 2004, Nat. Med. 10, 871-875) перед розподілом клітин по пробірках. Альтернативно, виділені окремі клітини можуть бути імморталізовані і розмножати до виконання зворотної транскрипції. (Traggiai et al., Nat. Med. 2004 Aug; 10(8): 871-5). Іншою відмітною ознакою даного винаходу є розподіл популяції необхідних клітин (наприклад, клітин гібридоми, ліній клітин В-лімфоцитів або Тлімфоцитів, клітин цільної крові, клітин кісткового мозку, мононуклеарних клітин, лейкоцитів, Влімфоцитів, плазматичних клітин, антигенспецифічних В-лімфоцитів, В-клітин пам'яті, Т-лімфоцитів, антиген/МНС-специфічних Т-лімфоцитів або Тклітин пам'яті) в декілька посудин для одержання популяції виділених окремих клітин. Виділення окремих клітин означає фізичне відділення клітин від популяції клітин таким чином, щоб в одній посудині знаходилася одна клітина, або нанесення клітин на мікроматрицю, чип або гелеву матрицю з можливістю одержання окремих клітин. Клітини можна розподілити безпосередньо в декілька посудин, що знаходяться поруч, методом обмеженого розведення. Посудини, що використовуються в даному винаході, переважно, аналогічні посудинам, що застосовуються для виконання PCR (наприклад, пробірки для PCR, 96-ямкові або 384ямкові планшети для PCR або більш великі масиви посудин). Однак також можна використати інші посудини. При розподілі окремих клітин у велике число окремих посудин (наприклад, 384-ямкові планшети) одержують популяцію окремих клітин. Розподіл можна зробити шляхом дозованого введення певного об'єму в окрему посудину, в якій середня концентрація клітин дорівнює однієї, 0,5 або 0,3 клітини, внаслідок чого одержують посудини, що в середньому містять одну клітину або менше. Оскільки розподіл клітин методом обмеженого розведення є статистичним методом, то частина посудин буде пуста, основна частина посудин буде містити одну клітину і незначна частина посудин буде містити дві або декілька клітин. При знаходженні в посудині двох або декількох клітин може статися деяка перестановка послідовностей, які кодують варіабельні області, з клітин, присутніх в посудині. Однак, оскільки такий результат є неістотним, він не буде впливати на загальну застосовність даного винаходу. Крім того, поєднання послідовностей, які кодують варіабельні області, які не мають необхідної спорідненості і специфічності зв'язування, мабуть, не будуть відібрані і, отже, будуть виключені в процесі скринінгу. Тому незначні випадки перестановки послідовностей не будуть істотно впливати на кінцеву бібліотеку за даним винаходом. Існують альтернативи розподілу клітин методом обмеженого розведення, наприклад, клітинні сортери, такі як FACS або роботи, які можуть бути запрограмовані на точний розподіл окремих клітин в окремі посудини. Подібні альтернативні методи більш переважні, оскільки вони є менш трудомісткими і більш ефективними для досягнення однорідного розподілу окремих клітин в окремі посудини. Вищеописані методи збагачення, сортування і виділення клітин виконують таким чином, щоб більшість клітин залишалася інтактними. Руйнуван 89761 36 ня клітин під час збагачення або сортування може призвести до перестановки послідовностей, які кодують варіабельні області. Однак дана проблема не повинна мати серйозних наслідків, оскільки передбачається, що частота руйнування клітин буде низькою. Завдяки промиванню і можливій обробці клітин РНКазою до їх розподілу в окремі посудини буде видалена будь-яка РНК, що виділилася з клітин. Крім того, при ознайомленні з наведеним вище описом розподілу клітин для одержання популяції окремих клітин в декількох окремих посудинах вказану вимогу не можна інтерпретувати як абсолютно необхідну відмітну ознаку, відповідно до якої в кожній посудині повинна знаходитися одна клітина. Вищезгадана ознака швидше передбачає, що в більшості посудин повинні знаходитися окремі клітини, наприклад, число посудин з двома або більше клітинами складає менше 25% від загальної кількості розподілених клітин або навіть менше 10%. Іншою відмітною ознакою даного винаходу є виконання зворотної транскрипції з використанням матриці, одержаної з клітин, розподілених по одній в декілька посудин. Відповідно до цілей зворотної транскрипції (RT) за даним винаходом нуклеїнові кислоти в окремій клітині, яка повинна служити джерелом матриці для RT, повинні бути одержані з однієї клітини, хоч вони, необов'язково, повинні бути відділені від іншого вмісту даної окремої клітини. Після остаточного розподілу окремих клітин по окремих посудинах окремі клітини можуть бути розмножені для одержання популяції ізогенних клітин до виконання зворотної транскрипції. Таким чином збільшується вихід мРНК, яка використовується як матриця, що може мати важливе значення при ампліфікації і зв'язуванні рідкої мішені. Однак клітини повинні залишатися генетично ідентичними відносно гена-мішені під час розмноження. Ізольовані клітини або популяція ізогенних клітин можуть бути інтактними або лізованими, якщо при цьому не вироджується матриця для зворотної транскрипції. Клітини переважно лізують, щоб полегшити подальшу зворотну транскрипцію і ампліфікацію методом PCR. У іншому варіанті здійснення даного винаходу описаний метод множинної RT-PCR з подовженням ланцюга шляхом перекривання або множинної RT-PCR з подальшим зв'язуванням шляхом лігування або рекомбінації також може бути виконаний на матриці, одержаній з генетично різної популяції клітин, які не були розподілені по окремих посудинах і залишаються разом у вигляді пулу клітин. Вказаний метод може бути використаний для створення комбінаторних бібліотек. Такий метод не вимагає розподілу окремих клітин. Однак клітини, які можуть бути використані при здійсненні даного методу, повинні бути аналогічні клітинам, що застосовуються в методі з використанням окремих клітин, і являти собою, наприклад, популяцію (пул) сортованих В-лімфоцитів або Тлімфоцитів. При виконанні одностадійної множинної RT-PCR з подовженням ланцюга шляхом перекривання або одностадійної множинної RT-PCR з 37 подальшим зв'язуванням шляхом лігування або рекомбінації в такій популяції клітин бажано лізувати клітини до здійснення реакції, при цьому при бажанні з лізату може бути виділена загальна РНК або мРНК. Чутливість одностадійної множинної RT-PCR з подовженням ланцюга шляхом перекривання за даним винаходом дозволяє використати дуже невелику кількість матриці. Як показано в прикладах 2 і 3, одностадійна множинна RT-PCR з подовженням ланцюга шляхом перекривання може бути виконана на матриці, кількість якої відповідає лізату окремої клітини. Суміші праймерів і їх створення Суміші праймерів за даним винаходом включають принаймні чотири праймери, які утворюють набори праймерів, що містять по два праймери в кожному, які здатні ампліфікувати принаймні дві цікавлячі різні задані послідовності. Суміші двох або декількох таких наборів праймерів утворюють суміш множинних праймерів. Суміш множинних праймерів, переважно, містить принаймні 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 або 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140 або 150 наборів праймерів (пар праймерів). Зокрема, для ампліфікації послідовностей, які кодують варіабельні області, окремі набори праймерів в складі суміші множинних праймерів містять більше двох праймерів. Окремий набір праймерів, переважно, містить принаймні 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 220, 240, 260, 280 або 300 праймерів. Загальне число праймерів в суміші множинних праймерів, переважно, складає принаймні 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150 або 200 і найбільше 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375 або 400 праймерів. Всі праймери за даним винаходом містять геноспецифічну область, і, переважно, всі праймери додатково мають кінцевий сегмент біля 5'-кінця праймеру, тобто 5'-кінцеві некодуючі послідовності, які злиті з 3'-кінцем геноспецифічної частини праймеру. Такий кінцевий сегмент праймеру містить приблизно від 6 до 50 нуклеотидів, але при бажанні може бути довшим. У процесі ампліфікації кінцеві сегменти праймеру приєднуються до заданих послідовностей. Кінцеві сегменти праймеру за даним винаходом є, наприклад, клонуючими і зв'язуючими кінцевими сегментами, кінцевими сегментами, адаптованими для зв'язування лігуванням, кінцевими сегментами, адаптованими для зв'язування рекомбінацією, або кінцевими сегментами подовження ланцюга шляхом перекривання. Клонуючі кінцеві сегменти можуть містити 6-20 або більше число нуклеотидів і містити сайти рестрикції і/або сайти рекомбінації, які можуть використовуватися для вставки зв'язаного продукту у відповідний вектор. Для зв'язування лігуванням набори праймерів в складі суміші множинних праймерів створюють таким чином, щоб одна частина (основний або зворотний праймер) першого набору праймерів мала зв'язуючий кінцевий сегмент, що містить сайт 89761 38 рестрикції, який при розщепленні повинен бути сумісним з сайтом рестрикції, розташованим в зв'язуючому кінцевому сегменті однієї частини другого набору праймерів. Для зв'язування більше двох заданих послідовностей друга частина другого набору праймерів містить сайт рестрикції, який при розщепленні повинен бути сумісним з сайтом рестрикції, розташованим в одній частині третього набору праймерів. Другий сайт рестрикції, розташований у другому наборі праймерів, повинен бути несумісним з вищезгаданим сайтом рестрикції першого набору праймерів. Завдяки подібному створенню наборів праймерів можна зв'язати значне число заданих послідовностей. У заданих послідовностях повинні бути вибрані сайти рестрикції, що рідко зустрічаються або взагалі відсутні. Крім того, бажано, щоб сумісні сайти рестрикції не були ідентичними, щоб сайт лігування був стійкий до розщеплення певними рестрикційними ферментами, що використовуються. Завдяки цьому реакція повинна бути направлена на зв'язування першої заданої послідовності з другою заданою послідовністю, оскільки зв'язок між ідентичними заданими послідовностями буде розщеплюватися рестрикційними ферментами. Прийнятними парами сайтів рестрикції є, наприклад, Spel і ХbаІ (альтернативно Nhel або Avrll можуть замінювати один або обидва вказаних ферменти), Ncol і BspHI, EcoRI і Mfel або PstI і Nsil. Для здійснення зв'язування Spel може знаходитися, наприклад, в першій заданій послідовності, ХbаІ може знаходитися у другій заданій послідовності, Ncol може знаходитися біля іншого кінця другої заданої послідовності, BspHI може знаходитися в третій заданій послідовності і так далі. Для подальшого полегшення процесу бажано використати вказані рестрикційні ферменти в одному буфері. Для зв'язування рекомбінацією набори праймерів в суміші множинних праймерів можуть бути, наприклад, створені відповідно до опису, наведеного в статті Чапала (Chapal, 1997, Bio Techniques 23, 518-524), яка включена в даний опис винаходу як посилання. Для зв'язування цікавлячих нуклеотидних послідовностей на одній стадії з ампліфікацією методом множинної PCR принаймні до одного праймеру в кожному наборі праймерів суміші множинних праймерів додають кінцеві сегменти, адаптовані для PCR з подовженням ланцюга шляхом перекривання, внаслідок чого одержують суміш множинних праймерів для подовження ланцюга шляхом перекривання. Кінцеві сегменти подовження ланцюга шляхом перекривання звичайно є більш довгими, включаючи від 8 до 75 нуклеотидів, і можуть містити сайти рестрикції або сайти рекомбінації, які забезпечують подальшу вставку регуляторних елементів, таких як промотори, сайти зв'язування рибосом, термінуючі послідовності або лінкерні послідовності, як, наприклад, в scFv. Кінцевий сегмент подовження ланцюга шляхом перекривання може також при бажанні містити термінуючий кодон. Звичайно існують три типи кінцевих сегментів подовження ланцюга шляхом перекривання, як показано на Фіг.1. Кінцеві сегменти подовження ланцю 39 га шляхом перекривання типу І в двох наборах праймерів перекривають тільки один одного. Всі нуклеотиди двох кінцевих сегментів подовження ланцюга шляхом перекривання необов'язково є комплементарними один одному. Відповідно до одного об'єкта даного винаходу комплементарні нуклеотиди становлять 60-85% кінцевого сегмента подовження ланцюга шляхом перекривання. У кінцевих сегментах подовження ланцюга шляхом перекривання типу II 4-6 5'-кінцевих нуклеотидів є комплементарними геноспецифічній області суміжної заданої послідовності. У кінцевих сегментах подовження ланцюга накладенням типу III всі перекриваючі нуклеотиди є комплементарними суміжної заданої послідовності. Кінцеві сегменти подовження ланцюга шляхом перекривання типу І і II є переважними при подальшому введенні регуляторних і подібних елементів між зв'язаними заданими послідовностями. Кінцеві сегменти подовження ланцюга шляхом перекривання типу II є переважними, якщо задані послідовності повинні бути зв'язані певним лінкером, як це має місце у випадку scFv. Кінцеві сегменти подовження ланцюга шляхом перекривання типу III є переважними, якщо задані послідовності повинні бути зв'язані один з одним в рамці зчитування. Створення кінцевих сегментів подовження ланцюга шляхом перекривання залежить від відмітних ознак послідовності, таких як довжина, відносний вміст GC (GC%), наявність сайтів рестрикції, паліндроми, температура плавлення, геноспецифічна частина, з якою вони зв'язані, і т.д. Довжина кінцевих сегментів подовження ланцюга шляхом перекривання повинна дорівнювати 8-75 нуклеотидам, переважно 15-40 нуклеотидам. Довжина таких сегментів ще переважніше дорівнює 22-28 нуклеотидам. Використання дуже довгих кінцевих сегментів подовження ланцюга шляхом перекривання (50-75 нуклеотидів) може сприяти зв'язуванню продуктів, продукованих кожним набором праймерів. Однак при використанні дуже довгих кінцевих сегментів подовження ланцюга шляхом перекривання необхідно відрегулювати співвідношення між довжиною кінцевого сегмента подовження ланцюга шляхом перекривання і геноспецифічною областю. Вибір значення GC% залежить від довжини кінцевого сегмента подовження ланцюга шляхом перекривання. Оскільки більш короткі кінцеві сегменти мають меншу площу, то в тих випадках, коли вони є комплементарними, необхідне більш високе значення GC% для посилення взаємодії, ніж при використанні більш довгих кінцевих сегментів. Необхідно дотримуватися інших принципів створення праймерів, наприклад, потрібно мінімізувати димеризацію праймерів і утворення "шпильок". Праймери не повинні викликати помилкову ініціацію. Крім того, відомо, що Taq ДНК-полімераза часто додає аденозин (А) до 3'кінця щойно синтезованого ланцюга ДНК, і це повинно бути враховано при створенні кінцевого сегмента подовження ланцюга шляхом перекривання шляхом адаптації кінцевих сегментів подовження ланцюга шляхом перекривання до нематричного додавання аденозину до 3'-кінця. 89761 40 Вибір праймерів, несучих зв'язуючий кінцевий сегмент, наприклад, кінцевий сегмент подовження ланцюга шляхом перекривання, кінцевий сегмент, адаптований для зв'язування лігуванням, або кінцевий сегмент, адаптований для зв'язування рекомбінацією, визначає порядок і напрям зв'язування заданих послідовностей. Для даного винаходу неважливо, чи є праймери, що мають зв'язуючий кінцевий сегмент, основними або зворотними праймерами в наборі праймерів або, можливо, як верхніми, так і нижніми праймерами. Однак даному питанню необхідно приділити увагу, оскільки порядок і напрям заданих послідовностей в кінцевому продукті може мати певне значення, наприклад, для вставки регуляторних елементів, таких як промотори і термінуючі послідовності, або для зв'язування окремих заданих послідовностей всередині рамки зчитування. Для зв'язування двох цікавлячих нуклеотидних послідовностей зв'язуючий кінцевий сегмент може бути доданий до зворотних абo основних праймерів в кожному наборі праймерів, що використовується для ампліфікації методом PCR кожної заданої послідовності. У даному винаході описане додавання кінцевих сегментів подовження ланцюга шляхом перекривання і кінцевих сегментів, адаптованих для зв'язування лігуванням, до основних праймерів для VH і VL в кожному наборі (див. відповідно Фіг.1 і приклад 9). У цьому випадку зв'язування продуктів відбувається в напрямі від 5'-кінця до 5-кінця (головний сегмент з головним сегментом і двонаправлене зв'язування). Однак зв'язуючі кінцеві сегменти можуть бути також додані до зворотних праймерів в кожному наборі (наприклад, праймери для С і/або C в першому наборі і праймери для СH або JH у другому наборі). У цьому випадку зв'язування продуктів відбувається в напрямі від 3'-кінця до 3'-кінця (кінцевий сегмент з кінцевим сегментом і двонаправлене зв'язування). Третім варіантом є додавання зв'язуючих кінцевих сегментів до зворотних праймерів в першому наборі праймерів (наприклад, праймери для С і/або C ) і до основних праймерів у другому наборі праймерів (наприклад, праймери для VH) або навпаки. Таким чином, одержують орієнтацію в напрямі від 3'-кінця до 5'-кінця (головний сегмент з кінцевим сегментом і однонаправлене зв'язування). На Фіг.3 показані можливі напрями, які можуть бути одержані в залежності від того, які праймери в кожному наборі праймерів мають зв'язуючий кінцевий сегмент. При зв'язуванні більше двох цікавлячих нуклеотидних послідовностей в деяких наборах праймерів зв'язуючі кінцеві сегменти повинні бути як у основних, так і у зворотних праймерів, при цьому один кінцевий сегмент є комплементарним кінцевому сегменту попереднього набору праймерів і інший кінцевий сегмент єкомплементарним одному з праймерів в наступному наборі праймерів. Цього принципу потрібно дотримуватися відносно всіх наборів праймерів, що служать для ампліфікації заданих послідовностей, призначених для зв'язування між двома іншими заданими послідовностями. 41 При створенні геноспецифічної частини праймсру звичайно необхідно дотримуватися відомих правил створення праймерів, таких як мінімізація димеризації праймерів, утворення "шпильок" і неспецифічної гібридизації. Крім того, по можливості необхідно уникати декількох нуклеотидів G і С як основи 3'-кінця. Температура плавлення (Тm) геноспецифічних областей в наборі праймерів переважно повинна бути однаковою плюс/мінус 5°С. У даному винаході бажані значення Тm в інтервалі від 45°С до 75°С, при цьому для більшості застосувань оптимальними є значення Тm близько 60°С. Праймер може бути спочатку створений за допомогою комп'ютерних програм, розроблених для виконання даної задачі. Однак створення праймеру звичайно вимагає лабораторної перевірки і оптимізації. Таку перевірку можна зробити, аналізуючи розмір і поліморфізм довжини рестрикційних фрагментів (RFLP) і секвенуючи продукти ампліфікації, одержані з використанням створених наборів праймерів. Можна успішно використати вироджені положення в праймерах для ампліфікації послідовностей з варіабельними областями або для пошуку нових членів сімейства, що належать до встановленого класу білків. Число вироджених положень може також потребувати оптимізації. Даний винахід належить до вдосконалених наборів праймерів, які можуть бути використані разом в дуже складній суміші. Як основа був використаний набір праймерів, описаний в публікації de Haard (de Haard, H.J. et al., 1999 J. Biol. Chem. 274, 18218-18230), який був модифікований шляхом обрізання 3'-кінців праймерів для зменшення неспецифічних взаємодій і додавання кінцевих сегментів подовження ланцюга шляхом перекривання або кінцевих сегментів, адаптованих для зв'язування лігуванням. Однією з відмітних ознак даного винаходу є суміші праймерів, що складаються принаймні з двох наборів праймерів, здатних ініціювати ампліфікацію і стимулювати зв'язування принаймні двох цікавлячих нуклеотидних послідовностей. Суміші праймерів за даним винаходом можуть ініціювати ампліфікацію принаймні двох субодиниць або доменів в гетеромерних білках, наприклад, що належать до класу ферментів, інгібіторів, структурних білків, токсинів, каналоутворюючих білків, G-білків, рецепторних білків, білків надродини імуноглобулінів, транспортуючих білків і т. д. Іншою відмітною ознакою даного винаходу с суміш множинних праймерів для подовження ланцюга шляхом перекривання, що включає набори праймерів, в яких принаймні один праймер в кожному наборі праймерів має кінцевий сегмент подовження ланцюга шляхом перекривання, здатний гібридизувати з кінцевим сегментом подовження ланцюга шляхом перекривання одного праймеру в іншому . наборі праймерів. Кінцеві сегменти подовження ланцюга шляхом перекривання роблять можливим негайне зв'язування цікавлячих нуклеотидів в процесі ампліфікації методом множинної PCR з подовженням ланцюга шляхом перекривання завдяки тому, що до кожного продукту, що утворюється за допомогою наборів праймерів, додається кінцевий сегмент, 89761 42 комплементарний продукту, що приєднується. З вищевикладеного, однак, не випливає, що зв'язування обов'язково станеться під час першої ампліфікації методом PCR. У залежності від характеру реакції велика частина фактичного зв'язування може статися під час додаткової ампліфікації за допомогою зовнішніх праймерів, що використовуються в першій ампліфікації методом PCR (ампліфікація методом множинної PCR). Іншою відмітною ознакою даного винаходу є набір праймерів, призначений для ампліфікації сімейства нуклеотидних послідовностей, які містять послідовності, що кодують варіабельні області. Прикладами таких сімейств є легкі каппаланцюги (наприклад VKI-VI у людини), легкі лямбда-ланцюги (наприклад VL1-10 у людини) і варіабельні області важких ланцюгів (наприклад VH1-7 у людини і VH1-15 у мишей) імуноглобулінів, а також варіабельні області α-, β-, - або -ланцюгів TcR. Набір праймерів для ампліфікації сімейства нуклеотидних послідовностей, які містять послідовності, що кодують варіабельні області, часто включає декілька праймерів, частина яких може бути виродженими праймерами. Ампліфікацію послідовностей, які кодують варіабельні області легкого ланцюга сімейств імуноглобулінів, наприклад, виконують за допомогою набору праймерів, що містить декілька праймерів, комплементарних 5'-кінцю варіабельної області каппа-ланцюга (праймеру для VL ) або лідерної послідовності каппа-ланцюга (праймер для VL L) і/або лямбдаланцюга (праймер для VL ) або лідерної послідовності лямбда-ланцюга (праймер для VL L) (основні праймери), разом з декількома праймерами для константної області каппа-ланцюга (праймер для С ) і/або лямбда-ланцюга (праймер для С ) (зворотні праймери). Альтернативно праймери для з'єднувальної області легкого ланцюга (праймери для JL і/або JL ) можна використати як зворотні праймери замість праймерів для константної області. Альтернативно основні праймери гібридизують з областю UTR, яка передує лідерній послідовності варіабельної області легкого ланцюга. Послідовності, які кодують варіабельну область важкого ланцюга сімейств імуноглобулінів, можуть бути також ампліфіковані за допомогою одного набору праймерів з використанням різних комбінацій праймерів. Наприклад, декілька праймерів, комплементарних 5'-кінцю варіабельної області важкого ланцюга (праймер для VH) або лідерної послідовності даної області (праймер для VHL) (основні праймери), можна використати разом з декількома праймерами для з'єднувальної області важкого ланцюга (праймер для JH) або праймерами для константної області важкого ланцюга (зворотні праймери). Праймер для СH може бути ізотипспецифічним, і в принципі можна використати будь-який праймер для СH (наприклад, СН1, СН2, СН3 або СН4), а також праймер, який дозволить одержати непроцесований важкий ланцюг. Альтернативно, основні праймери гібридизують з областю UTR, яка передує лідерній послідовності варіабельної області важкого ланцюга. Використання основних праймерів, гібридизуючих з лідерною послідовністю замість 5'-кінця 43 варіабельної області, є особливо корисним при виявленні перехресної гібридизації праймерів для варіабельної області, оскільки мутації, виникаючі внаслідок перехресної гібридизації, будуть видалені з кінцевого білка внаслідок відщеплення лідерних послідовностей під час процесингу білка всередині клітини. У прикладі 9 описане створення праймерів для лідерних послідовностей варіабельної області важкого ланцюга і легкого каппаланцюга антитіла. Те, що сайт ініціації знаходиться в 3'-кінці послідовності, яка кодує лідерну послідовність (С-кінцева), є перевагою в порівнянні з раніше відомими праймерами для лідерної послідовності антитіла, оскільки це дозволяє переносити ампліфіковані послідовності між бактеріальними і еукаріотичними експресуючими векторами з одержанням функціональних лідерних послідовностей в обох системах. Система, описана в прикладі 9, може бути легко застосована до легких лямбдаланцюгів антитіла, а також до α-, β-, - або ланцюгів TcR. Однією з відмітних ознак даного винаходу є праймери, гібридизуючі з 3'-кінцем послідовності, що кодує лідерну послідовність, яка передує послідовності, що кодує варіабельну область, і їх застосування для ампліфікації послідовностей, що кодують варіабельні області. Переважною відмітною ознакою даного винаходу, є застосування праймерів, які характеризуються принаймні 90% ідентичністю послідовностей (переважно принаймні 95% ідентичністю) з геноспецифічною областю SEQ ID NO: 86-92, які відповідають праймерам, гібридизуючим з С-кінцем послідовностей, що кодують лідерну послідовність важкого ланцюга (праймер для VHL). Геноспецифічна послідовність вказаних SEQ ID NO, відповідає 18-тій основі в напрямі 3'-кінця вказаних послідовностей (див. також таблицю 11). Іншою переважною відмітною ознакою даного винаходу є застосування праймерів, які характеризуються принаймні 90% ідентичністю послідовностей (переважно принаймні 95% ідентичністю) з геноспецифічною областю SEQ ID NO: 93-98, які відповідають праймерам, гібридизуючим з Скінцем послідовностей, що кодують лідерні послідовності легкого каппа-ланцюга (праймер для VLkL). Геноспецифічна послідовність вказаних SEQ ID NO відповідає 25-тій основі в напрямі 3'-кінця вказаних послідовностей (див. також таблицю 11). У одному варіанті здійснення даного винаходу суміш множинних праймерів для подовження ланцюга шляхом перекривання, що використовується для виконання множинної PCR з подовженням ланцюга шляхом перекривання і, можливо, для здійснення стадії зворотної транскрипції, включає також а) принаймні один праймер для CL або JL, комплементарний смисловому ланцюгу послідовності, яка кодує область легкого ланцюга імуноглобуліну; b) принаймні один 5'-кінцевий праймер для VL або праймер для лідерної послідовності VL, комплементарний антисмисловому ланцюгу послідовності, яка кодує варіабельну область легкого ланцюга імуноглобуліну, і здатну утворювати набір праймерів з праймерами за пунктом а); с) принаймні один праймер для СH або JH, комплементарний 89761 44 смисловому ланцюгу послідовності, яка кодує константний домен важкого ланцюга імуноглобуліну, або з'єднувальної області важкого ланцюга; і d) принаймні один 5'-кінцевий праймер для VH або праймер для лідерної послідовності VH, комплементарний антисмисловому ланцюгу послідовності, яка кодує варіабельну область важкого ланцюга імуноглобуліну, і здатну утворювати набір праймерів з праймерами за пунктом с). Набори праймерів за даним винаходом, наприклад, можуть являти собою VL +С , VL +C , VL +JL , VL +JL , VL L+C , VL L+C , VL L+JL , VL L + JL , VH+JH, VH+CH, VHL+JH, VHL+СH або їх комбінації, здатні ампліфікувати задану послідовність, яка кодує варіабельну область. У іншому варіанті здійснення винаходу використані праймери для CL (JL) і праймери для VL (VLL), адаптовані для ампліфікації послідовностей, що включають варіабельні області легкого каппаланцюга або варіабельні області легкого лямбдаланцюга. У переважному варіанті здійснення даного винаходу використані праймери для CL (JL) і праймери для VL (VLL), адаптовані для ампліфікації послідовностей, які кодують варіабельні області як легких каппа-ланцюгів, так і легких лямбдаланцюгів. У ще більш переважному варіанті здійснення даного винаходу використані основні праймери для ампліфікації легких ланцюгів VLL, що характеризуються принаймні 90% ідентичністю послідовностей (переважно принаймні 95% ідентичністю) з геноспецифічною областю SEQ ID NO: 93-98, і основні праймери для ампліфікації важких ланцюгів VHL, Що характеризуються принаймні 90% ідентичністю (переважно принаймні 95% ідентичністю) з геноспецифічною областю SEQ ID NO: 86-92. У іншому варіанті здійснення даного винаходу праймери для VL/VLL і VH/VHL імуноглобуліну мають зв'язуючі кінцеві сегменти, переважно в формі комплементарних кінцевих сегментів подовження ланцюга шляхом перекривання. Вказані праймери дозволяють одержати послідовності, які кодують варіабельні області, які зв'язані в напрямі "головний сегмент - головний сегмент". Для зв'язування послідовностей, які кодують варіабельні області, в напрямі "головний сегмент - кінцевий сегмент" праймери для CL/JL і VH/VHL містять зв'язуючі кінцеві сегменти або праймери для VL/VLL і СH/JH містять зв'язуючі кінцеві сегменти переважно в формі комплементарних кінцевих сегментів подовження ланцюга шляхом перекривання. Для зв'язування послідовностей, які кодують варіабельні області, в напрямі "кінцевий сегмент - кінцевий сегмент" праймери для CL/JL і CH/JH мають зв'язуючі кінцеві сегменти переважно в формі комплементарних кінцевих сегментів подовження ланцюга шляхом перекривання (Фіг.3). Суміші множинних праймерів, в тому числі суміші множинних праймерів для подовження ланцюга шляхом перекривання за даним винаходом включають два набори праймерів. Таким чином, суміш множинних праймерів включає принаймні чотири різних праймери. Відповідно до іншого об'єкта даного винаходу суміш множинних прай 45 мерів включає більше чотирьох різних праймерів. Суміш множинних праймерів за даним винаходом використовують для ампліфікації заданих послідовностей в одній посудині. Наприклад, в одній посудині можна ампліфікувати всі варіабельні області каппа-, лямбда-ланцюгів і важких ланцюгів. Одна суміш множинних праймерів за даним винаходом містила 16 різних вироджених праймерів, розподілених таким чином: вісім праймерів для VH, один праймер для СH1, шість праймерів для VL і один праймер для С (Фіг.2). Інший набір праймерів включав 19 вироджених праймерів, розподілених таким чином: вісім праймерів для VH, чотири праймери для JH, шість праймерів для VL і один праймер для С . Третій набір праймерів включав 22 вироджені праймери, розподілені таким чином: вісім праймерів для VH, один праймер для СH1, одинадцять праймерів для VL і два праймери для С . Четвертий набір праймерів включав 27 вироджених праймерів, розподілених таким чином: вісім праймерів для VH, один праймер для СH1, шість праймерів для VL , один праймер для С , одинадцять праймерів для VL і два праймери для С . Даний винахід належить також до праймерів для додаткової ампліфікації методом PCR зв'язаних продуктів, одержаних за допомогою множинної RT-PCR з подальшим зв'язуванням шляхом лігування або рекомбінації або за допомогою множинної RT-PCR з подовженням ланцюга шляхом перекривання. Додаткову ампліфікацію методом PCR можна виконати, використовуючи суміш праймерів, адаптовану для ампліфікації зв'язаних заданих послідовностей. Така суміш праймерів може містити зовнішні праймери суміші множинних праймерів або суміші множинних праймерів для подовження ланцюга шляхом перекривання, які є праймерами, гібридизуючими з крайнім 5'-кінцем і 3'-кінцем смислового ланцюга зв'язаних нуклеотидних послідовностей, роблячи можливою ампліфікацію усього зв'язаного продукту. Одним прикладом праймерів, які можуть бути використані як зовнішні праймери в даному винаході, є праймери для C /J і/або C /J які утворюють набір праймерів з праймерами для JH або СH. Додаткова ампліфікація звичайно служить для збільшення кількості зв'язаного продукту, одержаного в результаті множинної RT-PCR з подальшим зв'язуванням шляхом лігування або рекомбінації або в результаті множинної RT-PCR з подовженням ланцюга шляхом перекривання. Альтернативно, для додаткової ампліфікації зв'язаних нуклеотидних послідовностей можна використати набір праймерів, який є гніздовим в порівнянні із зовнішніми праймерами, які використовуються при виконанні первинної реакції множинної RT-PCR або множинної RT-PCR з подовженням ланцюга шляхом перекривання. У даному винаході такий набір праймерів іменується гніздовим набором праймерів. Гніздові праймери звичайно створюють відповідно до таких же правил, що і раніше описані геноспецифічні праймери, за винятком того, що вони ініціюють 3'-кінець в положенні гібридизації зовнішніх праймерів, які використовуються в множинній RT-PCR або множинній RT-PCR з подовженням ланцюга шляхом перекри 89761 46 вання. Тому продукт, який утворюється в результаті гніздової PCR, є коротше зв'язаного продукту, одержаного в результаті множинної RT-PCR з подальшим зв'язуванням шляхом лігування або рекомбінації або в результаті множинної RT-PCR з подовженням ланцюга шляхом перекривання. Крім збільшення кількості зв'язаного продукту, гніздова PCR служить також для підвищення загальної специфічності, особливо методу множинної RTPCR з подовженням ланцюга шляхом перекривання. Однак потрібно зазначити, що не всі вищеописані суміші множинних праймерів/суміші множинних праймерів для подовження ланцюга шляхом перекривання придатні для використання в комбінації з гніздовим набором праймерів при виконанні додаткової ампліфікації. У таких випадках для додаткової ампліфікації можна використати зовнішні праймери суміші множинних праймерів/суміші множинних праймерів для подовження ланцюга шляхом перекривання або виконати напівгніздову PCR, яка буде описана нижче. У одному з варіантів здійснення даного винаходу як гніздові праймери для додаткової ампліфікації зв'язаних послідовностей, які кодують варіабельні області імуноглобуліну, використовують праймери для JL і JH. Гніздові набори праймерів за даним винаходом можуть також включати зворотні (або основні) зовнішні праймери з першої суміші множинних праймерів/суміші множинних праймерів для подовження ланцюга шляхом перекривання і другої гніздової суміші праймерів, які ініціюють 3'-кінець в положенні гібридизації основних (або зворотних) зовнішніх праймерів першої суміші множинних праймерів/суміші множинних праймерів для збільшення ланцюга шляхом перекривання. Використання такого набору праймерів для додаткової ампліфікації методом PCR відоме як напівгніздова PCR. Напівгніздова PCR може бути виконана, наприклад, в тому випадку, якщо важко створити гніздовий праймер в одній специфічній області, наприклад, для послідовностей, які кодують варіабельні області, (праймери для V і J), оскільки такий праймер повинен гібридизувати з гіперваріабельними ділянками (CDR). Крім того, напівгніздову PCR можна використати в тих випадках, коли бажано зберегти інтактним один кінець зв'язаних послідовностей, наприклад, для клонування. Відповідно до однієї з відмітних ознак даного винаходу послідовність, яка кодує константну область легкого ланцюга, залишається інтактною в процесі додаткової ампліфікації. (Зворотні) праймери для CL, що використовуються для додаткової ампліфікації, лише трохи модифікуються в порівнянні із зовнішніми праймерами, які використовуються для первинної реакції (множинна RT-PCR або множинна RT-PCR з подовженням ланцюга шляхом перекривання). Модифікація включає додавання декількох основ до 3'-кінця праймерів для CL, що використовуються для первинної ампліфікації. Крім того, до гніздових праймерів для CL може бути доданий інший клонуючий кінцевий сегмент. Основні праймери, що використовуються для додаткової ампліфікації, є повністю гніздовими 47 89761 в порівнянні із зовнішніми праймерами, специфічними до константної областіважкого ланцюга, що використовуються в первинній реакції. Об'єднане використання зовнішніх праймерів в первинній реакції і незначно модифікованих гніздових праймерів для CL разом з повністю гніздовими основними праймерами в реакції додаткової ампліфікації спричиняє збільшення специфічності, порівнянне з тим, що досягається при виконанні гніздової PCR з використанням повністю гніздового набору праймерів. У переважному варіанті здійснення даного винаходу гніздову PCR виконують з використанням праймерів для JH і модифікованих праймерів для CL, до 3'-кінця яких додають від 2 до 10 геноспецифічних пар основ в порівнянні з першими праймерами для CL в суміші множинних праймерів/суміші множинних праймерів для подовження ланцюга шляхом перекривання. Оптимізація множинної PCR зподовженням ланцюга шляхом перекривання Параметри множинної PCR з подовженням ланцюга шляхом перекривання як у двостадійному методі, так і в одностадійному методі можуть бути оптимізовані в декількох відношеннях (див., наприклад, публікації Henegariu, О. et al. 1997, BioTechniques 23, 504-511; Markoulatos, P. et al. 2002, J. Clin. Lab. Anal. 16, 47-51). Звичайно в множинній RT-PCR використовують однаково оптимізовані параметри, хоч співвідношення між зовнішніми і внутрішніми праймерами має менш важливе значення для такої реакції. а. Концентрація праймерів Концентрація праймерів, що мають кінцевий сегмент подовження ланцюга шляхом перекривання (наприклад, праймери для VH і VL), переважно є нижчою за концентрацію зовнішніх праймерів, що не мають кінцевого сегмента подовження ланцюга шляхом перекривання (наприклад, праймери для JH і каппа-ланцюга). Денатурація: Гібридизація: Подовження ланцюга: Число циклів: Кінцеве подовження ланцюга: 10-30сек. 30-60сек. 1хв.x EPL 30-80 10хв. 48 Якщо одна із заданих послідовностей ампліфікується менш ефективно, ніж інші послідовності, наприклад внаслідок більш високого значення GC%, можна врівноважити ефективність ампліфікації. Такий результат можна одержати, збільшуючи концентрацію набору праймерів, яка менш ефективно опосередковує ампліфікацію, або зменшуючи концентрацію іншого набору праймерів. Наприклад, послідовності, які кодують варіабельні області важкого ланцюга, характеризуються більш високим значенням GC% і, отже, більш низькою ефективністю ампліфікації в порівнянні з варіабельними областями легкого ланцюга. З вищевикладеного випливає, що праймер для VL потрібно використовувати в меншій концентрації, ніж праймер для VH. Крім того, при використанні великого числа праймерів може виникнути проблема з визначенням загальної концентрації праймерів. Верхню межу визначають експериментально шляхом титрування. Для системи PCR "AmpliTaq Gold" компанії Applied Biosystems верхня межа концентрації всіх олігонуклеотидів встановлена рівною 1,1мкМ, хоч для інших систем верхня межа може досягати 2,4мкМ. Така верхня межа концентрації всіх олігонуклеотидів впливає на максимальну концентрацію окремих праймерів. Дуже низька концентрація окремого праймеру викликає погану чутливість PCR. Було також встановлено, що якість олігонуклеотидних праймерів має важливе значення для множинної PCR а подовженням ланцюга шляхом перекривання. Кращі результати були одержані при використанні олігонуклеотидів, очищених ВЕРХ. b. Умови циклізації PCR Умовами циклізації переважно є нижченаведені значення: 94°С 50-70°С 65-72°С Приблизно на 5°С нижче Тm праймерів EPL означає очікувану довжину продукту в т.п.о. 65-72°С Для одностадійної множинної RT-PCR з подовженням ланцюга шляхом перекривання в програму циклізації були введені нижченаведені стадії до вищезгаданої циклізації ампліфікації: Зворотна транскрипція: Активація полімерази: 30хв. 42-60°С 10-15хв. 95°С Всі вищезгадані параметри можна оптимізувати. Особливо важливе значення мас температура гібридизації. Таким чином, всі окремі набори праймерів, які повинні утворювати кінцеву суміш праймерів, необхідно випробувати окремо, щоб встановити оптимальну температуру і час гібридизації, а також час елонгації і денатурації. Завдяки цьому буде визначений діапазон, всередині якого вказані параметри можуть бути оптимізовані для Вказані умови використовують також при виконанні окремої зворотної транскрипції Полімерази, що активуються при нагріванні, є переважними в одностадійній RT-PCR. Активацію виконують відповідно до інструкцій виробника. суміші множинних праймерів для подовження ланцюга шляхом перекривання. Проблеми, пов'язані з поганою чутливістю PCR, наприклад, внаслідок низької концентрації праймерів або матриці, можна подолати, використовуючи велике число теплових циклів. Велике число теплових циклів включає 35-80 циклів, переважно близько 40 циклів. 49 Крім того, більш тривалий час подовження ланцюга може підвищити ефективність множинної PCR з подовженням ланцюга шляхом перекривання. Тривалий час подовження ланцюга дорівнює 1,5-4 хвилинам EPL в порівнянні з нормальним часом подовження ланцюга, що дорівнює 1 хвилині. с. Застосування ад'ювантів Ефективність реакції множинної PCR можна значно поліпшити, використовуючи добавку для PCR, таку як ДМСО, гліцерин, формамід або бетаїн, які релаксують ДНК, полегшуючи таким чином денатурацію матриці. d. dNTP і MgCl2 Якість і концентрація дезоксинуклеозидтрифосфату (dNTP) мають важливе значення для множинної PCR з подовженням ланцюга шляхом перекривання. Краща концентрація dNTP складає від 200 до 400 мкМ кожного dNTP (dATP, dCTP, dGTP i dTTP), при перевищенні якої відбувається швидке інгібування ампліфікації. Більш низькі концентрації dNTP (100мкМ кожного dNTP) є достатніми для ампліфікації методом PCR. Запаси dNTP чутливі до циклів розморожування/заморожування. Після трьох-п'яти таких циклів множинна PCR часто виявляється неефективною. Щоб уникнути таких проблем можна одержувати невеликі аліквоти dNTP і тримати їх замороженими при -20°С. Оптимізація концентрації Mg2+ має важливе значення, оскільки велика частина ДНК-полімераз являє собою магнійзалежні ферменти. Крім ДНКполімерази Mg2+ зв'язують праймери для матричної ДНК і dNTP. Тому оптимальна концентрація Mg2+ буде залежати від концентрації dNTP, матричної ДНК і складу буфера для зразка. Якщо праймери і/або буфери для матричної ДНК містять хелатори, такі як EDTA або EGTA, оптимальна 2+ концентрація Mg може бути змінена. Надмірна концентрація Mg2+ стабілізує подвійний ланцюг ДНК і запобігає повній денатурації ДНК, внаслідок чого зменшується вихід продукту. Надмірна кон2+ центрація Mg може також стабілізувати помилкову гібридизацію праймеру з неправильними сайтами матриці, що зменшує специфічність. З іншого 2+ боку, недостатня концентрація Mg скорочує кількість продукту. Хороший баланс між dNTP і MgCl2 дорівнює приблизно 200-400мкМ dNTP (кожного) на 1,5-3мМ MgCl2. e. Концентрація буфера для PCR Буфери на основі KСl звичайно задовольняють вимогам множинної PCR з подовженням ланцюга шляхом перекривання; однак буфери на основі інших компонентів, таких як (NH4)2SO4, MgSO4, тріс-НСІ, або їх комбінацій також можуть бути оптимізовані для використання в множинній PCR з подовженням ланцюга перекриванням. Пари праймерів, що беруть участь в ампліфікації більш довгих продуктів, діють краще при більш низьких концентраціях солей (наприклад, 20-50мМ KСl), в той час як пари праймерів, що беруть участь в ампліфікації коротких продуктів, діють краще при більш високих концентраціях солей (наприклад, 80-100мМ KСl). Двократне збільшення концентрації буфера замість однократного збіль 89761 50 шення може підвищити ефективність множинної реакції. f. ДНК-полімераза Даний винахід описаний на прикладі використання Taq полімерази. Альтернативно можна використати інші типи теплостійких ДНК-полімераз, що включають, наприклад, Pfu, Phusion, Pwo, Tgo, Tth, Vent, Deep-vent. Полімерази, що не мають або мають активність 3'-5'-кінцевої екзонуклеази, можуть бути використані окремо або в комбінації одна з одною. Вектори і бібліотеки Внаслідок зв'язування цікавлячих нуклеотидних послідовностей за даним винаходом утворюється нуклеотидний сегмент, який включає цікавлячі зв'язані нуклеотидні послідовності. Крім того, способами за даним винаходом одержують бібліотеки таких цікавлячих зв'язаних послідовностей нуклеїнових кислот, зокрема, бібліотеки послідовностей, які кодують варіабельні області. Однією з відмітних ознак даного винаходу є введення в прийнятні вектори сегмента, що містить цікавлячі зв'язані нуклеотидні послідовності, або бібліотеки цікавлячих зв'язаних нуклеотидних послідовностей, одержаних способом за даним винаходом. Вказані бібліотеки можуть бути комбінатоними бібліотеками або бібліотеками родинних пар послідовностей, які кодують варіабельні області. Сайти рестрикції, утворені зовнішніми праймерами, гніздовими праймерами або напівгніздовими праймерами, переважно повинні бути сумісні з відповідними сайтами рестрикції вибраного вектора. Цікавлячі зв'язані послідовності нуклеїнових кислот можна також ввести у вектори шляхом рекомбінації, якщо один з напівгніздових, гніздових або зовнішніх праймерів має прийнятний сайт рекомбінації і вибраний вектор містить такий же сайт. В основному не існує обмежень відносно векторів, які можна використати як носії продуктів, одержані одним зі способів виконання множинної RT-PCR і зв'язування за даним винаходом. Вибрані вектори можуть використовуватися для ампліфікації і експресії в клітинах, що включають, наприклад, бактеріальні клітини, дріжджові клітини, клітини інших грибів, клітини комах, рослинні клітини або клітини ссавців. Такі вектори можуть бути використані для полегшення подальших стадій клонування, перенесення між векторними системами, відображення продукту, введеного у вектор, експресії введеного продукту і/або вбудовування в геном клітини-хазяїна. Клонуючі вектори і шатл-вектори, переважно, є бактеріальними векторами. Однак в процесі клонування і перенесення можна також використати вектори інших типів. Векторні дисплеї можуть бути, наприклад, фаговими векторами або фагмідними векторами, одержаними з ниткоподібних бактеріофагів класу fd, M13 або f1. Такі вектори здатні полегшити дисплей білків, включаючи, наприклад, зв'язуючий білок або його фрагмент, на поверхні ниткоподібного бактеріофага. У даній галузі відомі також векторні дисплеї, які можуть бути використані для дисплея на рибосомах, ДНК, дріжджових клітинах або клітинах ссавців. Вказані вектори включають, 51 наприклад, вірусні вектори або вектори, які кодують химерні білки. Експресуючі вектори існують для всіх вказаних видів, і вибір вектора повністю залежить від експресованого білка. Деякі експресуючі вектори додатково здатні вбудовуватися в геном клітинихазяїна внаслідок довільної інтеграції або сайтспецифічної інтеграції з використанням відповідних сайтів рекомбінації. Експресуючі вектори можуть мати додаткові кодуючі послідовності, які при введенні зв'язаного продукту у вказані послідовності в рамці зчитування можуть експресувати більш довгий білок, наприклад, непроцесоване моноклональне антитіло, у відповідній клітині-хазяїні. Таке введення в рамці зчитування може також полегшити експресію химерних білків, що в свою чергу полегшує відображення на поверхні ниткоподібного бактеріофага або клітини. У системі дисплея на основі бактеріофага цікавлячі зв'язані нуклеотидні послідовності можуть бути введені в рамці зчитування в послідовність, яка кодує білок оболонки, такої як рІII або pVIII (Barbas, C.F et al. 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 7978-7982; Kang, A.S. et al. 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 4363-4366). У одному з варіантів здійснення даного винаходу окремі сегменти цікавлячих зв'язаних нуклеотидних послідовностей включають послідовність, яка кодує варіабельну область важкого ланцюга імуноглобуліну, що зв'язана з послідовністю, яка кодує варіабельну область легкого ланцюга. Вказані зв'язані послідовності переважно вводять у вектор, що містить послідовності, які кодують один або декілька константних доменів імуноглобуліну. Вставку здійснюють таким чином, щоб зв'язані послідовності, які кодують варіабельну область важкого ланцюга і/або варіабельну область легкого ланцюга, знаходилися в рамці зчитування послідовностей, які кодують константні області. Внаслідок такої вставки може бути створений, наприклад, вектор експресії Fab-фрагмента, вектор експресії непроцесованого антитіла або експресуючий вектор, який кодує фрагмент непроцесованого антитіла. Такий вектор переважно є експресуючим вектором, придатним для скринінгу (наприклад, вектори на основі Е.соlі, фагоміду або вектора ссавця), при цьому послідовності, які кодують константну область важкого ланцюга, вибирають з імуноглобуліну людини класів IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD або IgE, внаслідок чого відбувається експресія Fab-фрагмента або непроцесованого рекомбінантного антитіла. Крім послідовностей, які кодують константну область важкого ланцюга, вказаний вектор може також містити послідовність, яка кодує константну область легкого ланцюга, яку вибирають з лямбдаабо каппа-ланцюгів людини. Такий підхід є обґрунтованим в тих випадках, коли зв'язані нуклеотидні послідовності кодують тільки послідовності, яка кодують варіабельну область імуноглобуліну (Fvфрагменти). У іншому варіанті здійснення даного винаходу окремі сегменти зв'язаних нуклеотидних послідовностей включають послідовність, яка кодує варіабельну область α-ланцюга TcR, який зв'язаний з послідовністю, яка кодує варіабельну область β 89761 52 ланцюга, або послідовність, яка кодує варіабельну область -ланцюга, який зв'язаний з послідовністю, яка кодує варіабельну область -ланцюга. Вказані зв'язані послідовності переважно вводять у вектор, який містить послідовності, які кодують один або декілька константних доменів TcR. Вставку здійснюють таким чином, щоб введені зв'язані послідовності, які кодують варіабельні області, знаходилися в рамці зчитування відповідних послідовностей, які кодують константні області TcR. У іншому варіанті здійснення винаходу такий вектор є химерним експресуючим вектором, що включає послідовності, які кодують лейциновий зіпер, в рамці зчитування константних областей TcR. Встановлено, що такі конструкції збільшують стійкість розчинних TcR (Willcox, B.E. et al. 1999, Protein Sci. 8, 2418-2423). Бібліотеки родинних пар за даним винаходом можуть бути введені у вектори двома різними способами. Відповідно до першого способу в прийнятний вектор вводять окремі родинні пари. Така бібліотека векторів може знаходиться в розрізненому або об'єднаному вигляді. У відповідності з другим способом всі родинні пари об'єднують до введення у вектор і потім всі разом вводять в прийнятні вектори з утворенням об'єднаної бібліотеки векторів (ілюстрація на Фіг.12). Така бібліотека векторів містить велику різноманітність пар послідовностей, які кодують варіабельні області. Одним об'єктом даного винаходу є бібліотека родинних пар зв'язаних послідовностей, які кодують варіабельні області. Окремі родинні пари бібліотеки переважно включають послідовність, яка кодує варіабельну область легкого ланцюга імуноглобуліну, зв'язану з послідовністю, яка кодує варіабельну область важкого ланцюга. Інша переважна бібліотека родинних пар містить зв'язані послідовності, які кодують області TcR, в яких кожна окрема послідовність, яка кодує область TcR, включає послідовність, яка кодує варіабельну область альфа-ланцюга, зв'язану з послідовністю, яка кодує варіабельну область бета-ланцюга, і/або послідовність, яка кодує варіабельну область гамма-ланцюга TcR, зв'язану з послідовністю, яка кодує варіабельну область дельта-ланцюга. Один варіант здійснення даного винаходу належить до підбібліотеки родинних пар зв'язаних послідовностей, які кодують варіабельні області, які визначають необхідну специфічність зв'язування відносно певної мішені. Вказані родинні пари переважно включають зв'язані послідовності, які кодують варіабельну область легкого ланцюга і варіабельну область важкого ланцюга імуноглобуліну, послідовності, які кодують варіабельну область альфа-ланцюга і варіабельну область беталанцюга TcR, і/або послідовності, які кодують варіабельну область гамма-ланцюга і варіабельну область дельта-ланцюга TcR. Інший варіант здійснення винаходу належить до підбібліотеки, відібраної з вихідної бібліотеки родинних пар послідовностей, які кодують варіабельні області, за даним винаходом. Переважний варіант здійснення даного винаходу належить до бібліотеки або підбібліотеки, що 53 кодує родинні пари непроцесованих імуноглобулінів, відібраних з імуноглобуліну людини класів IgA1, IgA2 IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 або IgM. Іншою переважною відмітною ознакою даного винаходу є бібліотека або підбібліотека, що кодує розчинні і стійкі родинні пари TcR. Відмітною ознакою даного винаходу є різноманітність вказаних бібліотек, які включають принаймні 5, 10, 20, 50, 100, 1000, 104, 105 або 106 різних родинних пар. У іншому варіанті здійснення даного винаходу вказані бібліотеки родинних пар зв'язаних послідовностей, які кодують варіабельні області, одержують способом, що включає вищеописані стадії. Така бібліотека іменується також вихідною бібліотекою. Скринінг і відбір Можна передбачити, що початкова бібліотека пар зв'язаних послідовностей, які кодують варіабельні області, що були одержані від донора одним зі способів за даним винаходом, повинна являти собою різноманітність зв'язуючих білків, частина яких виявиться непридатною, тобто не буде зв'язуватися з необхідною мішенню, що є особливо вірним для комбінаторних бібліотек. Тому в об'єм даного винаходу входять збагачення і скринінг для одержання підбібліотеки, що кодує підмножину специфічності зв'язування, направленої проти певної мішені. Що стосується бібліотек родинних пар, то різноманітність бібліотеки приблизно відповідає різноманітності матеріалу донора при наявності незначного числа довільно зв'язаних варіабельних областей. Таким чином, в бібліотеці, що складається з родинних пар, стадія збагачення може бути необов'язковою до скринінгу мішенеспецифічної спорідненості зв'язування. У іншому варіанті здійснення даного винаходу спосіб створення бібліотеки пар зв'язаних послідовностей, які кодують варіабельні області, далі включає створення підбібліотеки шляхом відбору підмножини пар зв'язаних послідовностей варіабельних областей, які кодують зв'язуючі білки з необхідною специфічністю до мішені. Такий відбір зв'язаних послідовностей, які кодують варіабельні області, іменується також бібліотекою мішенеспецифічних родинних пар. Переважний варіант здійснення даного винаходу належить до бібліотеки мішенеспецифічних родинних пар послідовностей, які кодують варіабельні області, які введені в експресуючий вектор ссавця. Відбір послідовностей, які кодують варіабельні області мішенеспецифічних імуноглобулінів, звичайно проводять за допомогою імунологічних аналізів. Такі аналізи добре відомі в даній галузі і включають, наприклад, ELISPOTS, ELISA, мембранні аналізи (наприклад, вестерн-блотинги), матриці на фільтрах або FACS. Вказані аналізи можуть бути виконані безпосередньо з використанням поліпептидів, одержаних з послідовностей, які кодують варіабельні області імуноглобуліну. Альтернативно імуноаналізи можуть бути виконані в комбінації або після збагачення такими методами як відображення на фагах, рибосомах, бактері 89761 54 альній поверхні, дріжджах, еукаріотичних вірусах і РНК або ковалентне відображення (див. FitzGerald, K., 2000, Drug Discov. Today 5, 253-258). Як показано на Фіг.10, скринінгу можуть бути піддані як бібліотеки експресованих родинних Fabфрагментів, так і бібліотеки експресованих родинних непроцесованих антитіл, внаслідок чого буде створена підбібліотека позитивних клонів. Такі методи скринінгу і збагачення придатні також для Fv- або scFv-фрагментів або комбінаторних бібліотек зв'язаних варіабельних областей. У переважному варіанті здійснення даного винаходу відбір підбібліотеки мішенеспецифічних родинних пар або комбінаторних пар послідовностей, які кодують варіабельні області, виконують методом високоефективного скринінгу. Методи високоефективного скринінгу включають, не обмежуючись ними, аналізи ELISA, що виконуються за допомогою напівавтоматичного і автоматичного обладнання. Можуть бути також використані мембранні аналізи, при виконанні яких бактерії автоматично збирають і помішують на відповідну мембрану поверх агарових пластинок з утворенням масивів колоній, експресуючих антигензв'язуючі молекули. Вказані молекули проникають через мембрану на другу розташовану нижче мембрану, сенсибілізовану антигеном, яка може бути виявлена і використана для ідентифікації клонів, секретуючих антигензв'язуючі молекули до необхідної мішені (de Wildt, R.M., et al. 2000, Nat. Biotechnol. 18, 989-994). Після відбору відповідним методом підбібліотеки родинних пар або комбінаторних пар антигензв'язуючих клонів можуть бути виконані додаткові аналізи шляхом секвенування ДНК зв'язаних послідовностей, які кодують варіабельну область легкого ланцюга і варіабельну область важкого ланцюга імуноглобуліну. По-перше, таке секвенування ДНК дозволяє одержати інформацію про різноманітність бібліотеки, таку як походження зародкової лінії, розподіл сімейства і дозрівання на гіперваріабельних ділянках. Такий аналіз дозволяє відібрати клони, що характеризуються широкою різноманітністю, і видалити клони, що повторюються. Подруге, секвенування ДНК дозволяє виявити мутації, що виникли в процесі виділення. При аналізі послідовностей, які кодують варіабельні області, необхідно розглянути три типи мутацій, перш ніж ухвалити рішення про прийнятність мутації: і) мутації типу, що найчастіше зустрічається, виникають внаслідок перехресного зв'язування всередині сімейства, коли праймери для V-гена зв'язуються з неправильною підмножиною в одному конкретному сімействі V-генів. Введені зміни є головним чином замінами природних кодонів в одному конкретному положенні. Через високий ступінь гомології послідовностей в сімействі Vгенів такі заміни можуть розглядатися як консервативні і прийнятні заміни; іі) мутації, що менш часто зустрічаються, виникають внаслідок перехресного зв'язування між сімействами (наприклад, праймер для сімейства VH3 ініціює послідовність, що кодує сімейство VH1) і викликають більш значні структурні зміни, що іноді не мають природного варіанта. Такі зміни потенційно можуть впливати 55 на імуногенність варіабельної області внаслідок створення нових епітопів. Такі зміни можна легко ідентифікувати і потім усунути стандартними методами молекулярної біології або виключити виявлені клони з бібліотеки; ііі) помилки, викликані Taq ДНК-полімеразою, легше усього ідентифікувати в послідовностях, які кодують константні області, після чого їх можна легко усунути. Однак мутації, індуковані Taq полімеразою, безсумнівно будуть також присутні в послідовностях, які кодують варіабельні області, де їх неможливо відрізнити від природних соматичних мутацій, які також є результатом довільних мутацій в послідовностях, які кодують варіабельні області. Враховуючи, що вказані мутації не є системними і по-різному впливають тільки на певні пари, здається обґрунтованим не брати до уваги такі зміни. Крім того, аналіз послідовностей можна використати для ідентифікації ступеня перестановки послідовностей в бібліотеці родинних пар, як показано в таблиці 20 для VH групи Н4. Як описано в прикладі 9, мутації, розглянуті в пунктах і) і іі), можуть бути усунені в бібліотеці експресованих послідовностей при використанні праймерів, гібридизуючих з лідерним пептидом послідовностей, які кодують варіабельні області, замість праймерів, гібридизуючих з 5'-кінцем варіабельних областей. У іншому варіанті здійснення даного винаходу підбібліотеку мішенеспецифічних і, можливо, підданих аналізу пар зв'язаних послідовностей, які кодують варіабельну область легкого ланцюга і варіабельну область важкого ланцюга імуноглобуліну, переносять в експресуючий вектор ссавця. Таке перенесення можна здійснити будь-якими векторами, описаними в попередньому розділі, які дозволяють експресувати непроцесоване рекомбінантне антитіло. Якщо скринінг виконують у відношенні бібліотеки родинних пар експресованих пепроцесованих антитіл, таке перенесення може бути не потрібне. У іншому варіанті здійснення даного винаходу вихідну бібліотеку створюють з лімфоцитвмісної фракції клітин, збагаченої Т-лімфоцитами. Пари зв'язаних послідовностей, які кодують варіабельні області, що утворюють початкову бібліотеку, можна відібрати з урахуванням кодування підмножини пар зв'язаних послідовностей варіабельних областей, що складаються з альфа- і бета-ланцюгів і/або гамма- і дельта-ланцюгів, що кодують зв'язуючі білки з необхідною специфічністю до мішені, внаслідок чого буде створена підбібліотека родинних пар або комбінаторних пар. Антигенспецифічні Т-клітинні рецептори потім можуть бути ідентифіковані в пулі трансфекованих клітин стандартними методами, такими як фарбування тетрамерними комплексами МНС-пептид (див., наприклад, публікації Callan, M.F. et al. 1998, J. Exp. Med. 187, 13951402; Novak, E.J. et al. 1999, J. Clin. Invest. 104, R63-R67), вимірювання клітинних реакцій у вигляді вивільнення IL-2, або більш складними методами, такими як методи відображення на дріжджах або ретровірусах. Клітини-хазяїни і експресія 89761 56 Бібліотеки за даним винаходом можна перенести у вектори, придатні для експресії і продукування білків, кодованих представляючими інтерес зв'язаними послідовностями нуклеїнових кислот, зокрема зв'язуючих білків, що містять варіабельні області, або їх фрагментів. Такі вектори описані в розділі "Вектори і бібліотеки" і застосовуються для експресії, наприклад, непроцесованих антитіл, Fab-фрагментів, Fv-фрагментів, scFv-фрагментів, мембранозв'язаних або розчинних TcR або фрагментів TcR вибраного виду. Однією з відмітних ознак даного винаходу є введення в клітину-хазяїна бібліотеки або підбібліотеки векторів, що містять родинні пари зв'язаних послідовностей, які кодують варіабельні області, або одиничний клон, що включає родинну пару зв'язаних послідовностей, які кодують варіабельні області, для ампліфікації і/або експресії. Клітинихазяїни можуть бути вибрані з бактеріальних клітин, дріжджових клітин, клітин інших грибів, клітин комах, рослинних клітин або клітин ссавців. Для експресії переважними є клітини ссавців, такі як клітини яєчника китайського хом'ячка (СНО), клітини COS, клітини ВНК, мієломні клітини (наприклад, клітини Sp2/0, NS0), NIH 3Т3, фібробласти або імморталізовані клітини людини, такі як клітини HeLa, клітини НЕК 293 або PERC6. Введення векторів в клітини-хазяїни здійснюють за допомогою цілого ряду методів трансформації або трансфекції, відомих фахівцям в даній галузі, які включають осадження фосфатом кальцію, електропорацію, мікроін'єкції, злиття з ліпосомами, злиття з гомолізованими еритроцитами, злиття з протопластами, вірусну інфекцію і тому подібні. Добре відомі методи одержання моноклональних непроцесованих антитіл, Fab-фрагментів, Fv-фрагментів і scFv-фрагментів. Продукування рекомбінантних поліклональних антитіл, призначених для використання в лікувальних цілях, є новим. Спосіб одержання рекомбінантних поліклональних антитіл описаний в заявці РСТ WO 2004/061104. Вказаний спосіб включає створення колекції клітин, придатної для використання як лінії продукуючих клітин. Нижченаведений опис даного способу належить до бібліотеки родинних пар, хоч він може бути застосований також до комбінаторної бібліотеки. Окремі клітини в колекції клітин можуть експресувати один член рекомбінантного поліклонального зв'язуючого білка, наприклад, з бібліотеки родинних пар. Для гарантії експресії окремими клітинами однієї родинної пари, а не декількох родинних пар поліклонального зв'язуючого білка, послідовності нуклеїнових кислот, кодуючі родинні пари, вводять в один специфічний сайт геному кожної окремої клітини. Це є важливою особливістю колекції клітин, оскільки запобігає перестановці важких і легких ланцюгів, експресованих кожною клітиною, а також дозволяє одержати клітини, по суті ідентичні одна одній, за винятком невеликих відмінностей варіабельних областей окремих родинних пар. Дана особливість робить можливим незміщений ріст колекції клітин протягом періоду часу, необхідного для продукування. Для гарантії одиничної сайтспецифічної інтеграції необхідно використати 57 комерційно доступну лінію клітин-хазяїнів, що мають тільки один сайт інтеграції, наприклад, клітини СНО Flp-Іn компанії Invitrogen, що містять один сайт FRT. Вектори, придатні для даної лінії клітин, містять відповідний сайт FRT і вбудовуються в геном за допомогою Flp-рекомбінази. Існує декілька інших відомих рекомбіназ, наприклад, Сrе, бета-рекомбіназа, Gin, Pin, PinB, PinD, R/RS, лямбдаінтеграза або фагова інтеграла ФС31, які можуть бути використані в комбінації з відповідними сайтами рекомбінації. Крім того, прийнятні вектори містять селектований маркер, який дозволяє зробити вибір сайтспецифічних інтегрантів. Створення лінії поліклональних продукуючих клітин і продукування рекомбінантного поліклонального білка такою лінією клітин може бути зроблено декількома різними методами трансфекції і продукування. Одним з методів є використання бібліотеки векторів, змішаних з утворенням однієї композиції, призначеної для трансфекції лінії клітин-хазяїнів, що мають в одній клітині один сайт інтеграції. Даний метод іменується масовою трансфекцією. Раніше описана структура вектора і клітини-хазяїна гарантує, що внаслідок відповідного відбору повинна бути одержана лінія поліклональних клітин, що характеризуються незміщеним ростом. Необхідно створити заморожений запас лінії поліклональних клітин до початку продукування рекомбінантного поліклонального білка. Іншим методом є використання для трансфекції бібліотеки векторів, розділених на частини, що містять в композиції приблизно 5-50 окремих векторів бібліотеки. Одна частина бібліотеки переважно містить 10-20 окремих векторів. Кожну композицію потім трансфекують в одну аліквоту клітинхазяїнів. Даний метод іменується напівмасовою трансфекцією. Число трансфекованих аліквот залежить від розміру бібліотеки і числа окремих векторів в кожній частині. Якщо бібліотека включає, наприклад, 100 окремих родинних пар, розділених на частини, що містять в композиції 20 окремих членів, необхідно трансфекувати 5 аліквот клітинхазяїнів композицією бібліотеки, яка є окремою частиною вихідної бібліотеки. Аліквоти клітинхазяїнів відбирають з урахуванням сайтспецифічної інтеграції. Різні аліквоти переважно відбирають окремо. Однак вони можуть бути також об'єднані до селекції. Вказані аліквоти можуть бути піддані аналізу відносно їх клональної різноманітності, причому для створення запасу бібліотеки поліклональних родинних пар використовують тільки аліквоти, які характеризуються достатньою різноманітністю. Для одержання необхідної лінії поліклональних клітин аліквоти можуть бути змішані до створення замороженого запасу, відразу ж після їх одержання із запасу або після нетривалого періоду проліферації і адаптації. Аліквоти клітин знаходяться окремо в процесі продукування, і поліклональний білок одержують, об'єднуючи продукти всіх аліквот, а не аліквоти клітин до продукування. Третім методом є високоефективний метод, в якому клітини-хазяїни трансфекують окремо, використовуючи окремі вектори, що складають бібліо 89761 58 теку родинних пар. Такий метод іменується індивідуальної трансфекцією. Індивідуально трансфековані клітини-хазяїни переважно відбирають окремо з урахуванням сайтспецифічної інтеграції. Окремі клони клітин, одержані внаслідок відбору, можуть бути піддані аналізу для визначення часу проліферації, причому для створення запасу бібліотеки поліклональних родинних пар переважно використовують клітини, що характеризуються однаковими швидкостями росту. Окремі клони клітин можуть бути змішані для одержання необхідної лінії поліклональних клітин до створення запасу, відразу ж після їх одержання із запасу або після нетривалої проліферації і адаптації. Такий підхід дозволяє усунути будь-яке можливе зміщення послідовностей залишків під час трансфекції, інтеграції і відбору. Альтернативно окремо трансфековані клітини-хазяїни змішують до виконання відбору, що дозволяє контролювати зміщення послідовностей внаслідок трансфекції. Загальною відмітною ознакою вищеописаних методів є те, що всі окремі родинні пари, утворюючі рекомбінантний поліклональний білок, можуть бути одержані в одному або обмеженій кількості біореакторів. Єдиною відмінністю є стадія, на якій відбирають колекцію клітин, яка утворює лінію поліклональних продукуючих клітин. Один з варіантів здійснення даного винаходу належить до популяції клітин-хазяїнів, утворюючих бібліотеку родинних пар або підбібліотеку зв'язаних пар послідовностей, які кодують варіабельні області. Інший варіант здійснення даного винаходу належить до популяції клітин-хазяїнів, утворюючих бібліотеку, одержану з популяції виділених окремих клітин, що включають лімфоцити, з використанням для зв'язування родинних пар методу множинної RT-PCR з подальшим зв'язуванням шляхом лігування або рекомбінації або множинної RT-PCR з подовженням ланцюга шляхом перекривання за даним винаходом. Інший варіант здійснення даного винаходу належить до популяції клітин-хазяїнів, утворюючих комбінаторну бібліотеку або підбібліотеку зв'язаних пар послідовностей, які кодують варіабельні області. Популяція клітин-хазяїиів за даним винаходом включає популяцію різних клітин, відповідних різноманітності бібліотеки, використаної для трансформації і трансфекції клітин. Кожна клітина в популяції клітин переважно утворює тільки одну родинну пару зі всієї бібліотеки родинних пар, і жоден член бібліотеки родинних пар не перевищує більше 50%, більш переважно 25% або найбільш переважно 10% від загального числа окремих членів, експресованих з популяції клітин-хазяїнів. У переважному варіанті здійснення даного винаходу популяція клітин-хазяїнів включає клітини ссавців. Вищеописану популяцію клітин-хазяїнів можна використати для експресії рекомбінантного поліклонального зв'язуючого білка, оскільки окремі клітини популяції утворюють різні послідовності, які кодують варіабельні області. 59 Один з варіантів здійснення даного винаходу належить до рекомбінантного поліклонального білка, експресованого популяцією клітин-хазяїнів, що включають бібліотеку векторів, що містять різні родинні пари зв'язаних послідовностей, які кодують варіабельні області, яка була створена способом за даним винаходом. Рекомбінантний поліклональний білок за даним винаходом звичайно включає 2, 5, 10, 20, 50, 100, 1000, 104, 105 або 106 білків, що складаються з різних родинних пар. Переважний варіант здійснення даного винаходу належить до рекомбінантного поліклонального імуноглобуліну, експресованому популяцією клітин-хазяїнів, що включають бібліотеку векторів, що містять різні родинні пари послідовностей, які кодують варіабельну область важкого ланцюга і варіабельну область легкого ланцюга. Інший переважний варіант здійснення даного винаходу належить до рекомбінантного поліклонального TcR, експресованого популяцією клітинхазяїнів, що включають бібліотеку векторів, що містять різні родинні пари послідовностей, які кодують варіабельну область альфа-ланцюга TcR, зв'язану з варіабельною областю бета-ланцюга, і/або послідовностей, які кодують варіабельну область гамма-ланцюга, зв'язану з варіабельною областю дельта-ланцюга. Інший варіант здійснення даного винаходу належить до клітини-хазяїна, придатної для продукування моноклонального білка. Зокрема, моноклонального антитіла, що містить родинну пару варіабельної області легкого ланцюга і варіабельну область важкого ланцюга, або моноклопального TcR, що містить родинну пару варіабельної області альфа-ланцюга і варіабельну область беталанцюга або варіабельну область дельта-ланцюга і варіабельну область гамма-ланцюга. Така лінія клітин, продукуючих моноклональний білок, переважно не є лінією клітин гібридоми. Таке моноклональне антитіло або TcR можуть бути одержані внаслідок додавання нижченаведених стадій до способу зв'язування декількох цікавлячих несуміжних нуклеотидних послідовностей: а) введення у вектор вказаних зв'язаних послідовностей нуклеїнових кислот; b) введення вказаного вектора в клітину-хазяїна; с) культивування вказаних клітин-хазяїнів в умовах, придатних для експресії; і d) одержання білкового продукту, експресованого вектором, введеним у вказану клітинухазяїна. Вектор, введений в клітину-хазяїна, переважно містить окрему родинну пару послідовностей, які кодують варіабельні області. Застосування винаходу Основним застосуванням даного винаходу є зв'язування родинних пар послідовностей, які кодують варіабельні області, зокрема послідовностей, які кодують варіабельні області важкого і легкого ланцюга імуноглобуліну, або послідовностей, які кодують варіабельні області альфа- і беталанцюга або гамма- і дельта-ланцюга TcR, за допомогою високоефективного способу створення бібліотек родинних пар. Крім створення бібліотек родинних пар, множинну RT-PCR з подальшим зв'язуванням шляхом лігування або рекомбінації або множинну RT-PCR з подовженням ланцюга 89761 60 шляхом перекривання за даним винаходом можна використати для створення комбінаторних бібліотек для популяції генетичних різних клітин, клітинних лізатів з такої популяції клітин або РНК, виділеної з такої популяції клітин. Бібліотеки, підбібліотеки або одиничні клони з однієї з таких бібліотек полегшують експресію поліклональних або моноклональних білків. З бібліотек за даним винаходом можуть бути одержані, зокрема, моноклональні або поліклональні антитіла. Добре відоме застосування рекомбінантних моноклональних антитіл для діагностики, лікування і профілактики захворювань. Рекомбінантні моноклональні і поліклональні антитіла, одержані способом за даним винаходом, мають таке ж застосування, що і антитіла, одержані існуючими методами. Зокрема, способом за даним винаходом може бути одержана фармацевтична композиція, яка містить як активний інгредієнт поліклональний рекомбінантний імуноглобулін, об'єднаний принаймні з одним фармацевтично прийнятним наповнювачем. Більш переважними є фармацевтичні композиції, в яких поліклональний рекомбінантний імуноглобулін містить родинні пари послідовностей, які кодують варіабельні області. Фармацевтичні композиції на основі поліклональних рекомбінантних імуноглобулінів можуть бути використані як лікарські засоби. Поліклональний рекомбінантний імуноглобулін, що входить до складу композиції, може бути специфічним до заздалегідь визначеного захворювання, тому така композиція може бути використана для лікування, зменшення інтенсивності або профілактики таких захворювань як рак, інфекційні захворювання, запальні захворювання, алергії, астма і інші респіраторні захворювання, автоімунні захворювання, порушення функції імунної системи, серцевосудинні захворювання, захворювання центральної нервової системи, захворювання обміну речовин і ендокринні захворювання, відторгнення трансплантата або небажана вагітність у ссавців, таких як людина, свійські або кімнатні тварини. Подальше застосування даного винаходу не має аналогів серед сучасних методів на основі моноклональних химерних антитіл. Коли захисні антигени погано досліджені або абсолютно невідомі, як це має місце у разі появи нових інфекційних захворювань, неможливо знайти моноклональне антитіло, що захищає від даного захворювання. Однак даний винахід дозволяє одержати антитілоекспресуючі клітини безпосередньо у донорів з виробленою гуморальною імунною реакцією, наприклад у видужуючих індивідуумів, і використати вихідний матеріал, одержаний у вказаних індивідуумів, для створення бібліотеки родинних пар послідовностей, які кодують варіабельні області важкого і легкого ланцюгів імуноглобуліну. У тих випадках, коли, наприклад, вірус відомий, але невідомі захисні антигени, можна створити підбібліотеку родинних пар генів антитіла з широкою реактивністю відносно антигенних структур вірусу. Рекомбінантне поліклональне антитіло, одержане з такої підбібліотеки, мабуть, буде містити захисні антитіла