Експресуючі вектори, що містять ie2-промотор mcmv

1. Експресуючий вектор, що містить коровий промотор mCMV-ІЕ2-гена, що простягається від нуклеотиду 1 до нуклеотиду 39 в послідовності SEQ ID No: 1, де (і) експресуючий вектор не містить ніякого повного гена mCMV; і (іі) вказаний промотор mCMV-ІЕ2-гена оперативно зв’язаний з ДНК-послідовністю, що кодує поліпептид. 2. Вектор за п. 1, що додатково містить промотор, який відрізняється від вказаного mCMV-ІЕ2промотору. 2 (19) 1 3 88138 4 14. Вектор за будь-яким з попередніх пунктів, що (фосфоноацетил)-L-аспартату (CAD), пуроміцинадодатково включає в себе один або більше регуцетилтрансферази (РАС), галактокінази, людських ляторних елементів, вибраних з 5'UTR, інтронів, рецепторів фолату або відновлених носіїв фолату. 3'UTR, 3'-кінцевих процесуючих мРНК24. Вектор за пп. 12-23, де репортерний білок вибпослідовностей, сайтів поліаденілування та посліраний з люциферази, зеленого флуоресціюючого довностей внутрішнього зв’язування рибосом білка, лужних фосфатаз і пероксидази хріну або з (IRES). їх поєднань. 15. Вектор за п. 14, де регуляторний елемент яв25. Експресуючий вектор, що містить промотор ляє собою IRES, що додатково містить ДНКmCMV-ІЕ2-гена, де вказаний промотор складаєтьпослідовність, яка кодує щонайменше одну поліся з послідовності, вибраної з групи, яка складацистронну мРНК. ється з 16. Вектор за будь-яким з попередніх пунктів, що (і) корового ІЕ2-промотору, що простягається від додатково включає в себе один або більше ДНКнуклеотиду 1 до нуклеотиду 39 в послідовності елементів, вибраних з інсуляторів, пограничних SEQ ID NO: 1; елементів, ділянок контролю локусу (LCR), ділянок (іі) послідовності, що містить коровий ІЕ2прикріплення до матриксу (MAR) і елементів для промотор, що простягається від нуклеотиду 1 до рекомбінації та касетного обміну. нуклеотиду 39 в послідовності SEQ ID NO: 1, і по17. Вектор за будь-яким з пп. 8-16, де ДНКслідовності від 100 до 200 нуклеотидів ліворуч від послідовність, що кодує поліпептид, оперативно вказаного корового промотору; і зв'язана з першим промотором, і ДНК(ііі) послідовності SEQ ID NO: 1. послідовність, що кодує поліпептид, оперативно 26. Вектор за п. 25, де вказаний промотор операзв'язана з другим промотором, кодує той самий тивно зв’язаний з ДНК-послідовністю, що кодує поліпептид. поліпептид. 18. Вектор за будь-яким з пп. 8-16, де ДНК27. Вектор за п. 26, де вказаний поліпептид вибрапослідовність, що кодує поліпептид, оперативно ний з FSH, LH, CG, TSH, гормону росту, інтерфезв'язана з першим промотором, і ДНКрону, білка I, зв’язуючого TNF, білка II, зв’язуючого послідовність, що кодує поліпептид, оперативно TNF, Raptiva®, IL-18BP або їх мутеїнів, фрагментів, зв'язана з другим промотором, кодує різні поліпепфункціональних похідних і їх злитих білків. тиди. 28. Клітина-хазяїн, трансфекована вектором за 19. Вектор за п. 18, де ДНК-послідовність, що кобудь-яким з попередніх пунктів. дує поліпептид, оперативно зв'язана з першим 29. Клітина-хазяїн за п. 28, що є клітиною СНО. промотором, кодує першу субодиницю димерного 30. Спосіб одержання поліпептиду, що включає в або мультимерного білка, і ДНК-послідовність, що себе стадію трансфекції клітини-хазяїна щонаймекодує поліпептид, оперативно зв'язана з другим нше одним вектором за будь-яким з пп. 1-27. промотором, кодує другу субодиницю димерного 31. Спосіб за п. 30, де трансфекція являє собою або мультимерного білка. стійку трансфекцію. 20. Вектор за п. 19, де одна субодиниця являє 32. Спосіб одержання поліпептиду, що включає в собою альфа-ланцюг, а інша субодиниця являє себе стадію культивування клітини-хазяїна за п. 28 собою бета-ланцюг гормону, вибраного з FSH люабо п. 29 в умовах, що забезпечують можливість дини, LH людини, TSH людини і CG людини. експресії поліпептиду. 21. Вектор за п. 19, де одна субодиниця являє 33. Спосіб за п. 30 або п. 31, що додатково вклюсобою важкий ланцюг, а інша субодиниця являє чає в себе стадію виділення поліпептиду з клітинисобою легкий ланцюг імуноглобуліну. хазяїна або з супернатанта клітинної культури. 22. Вектор за будь-яким з пп. 10-21, де білок, що 34. Застосування вектора за будь-яким з пп. 1-27 представляє інтерес, вибраний з FSH, LH, CG, для експресії гена, що представляє інтерес. TSH, гормону росту, інтерферону, білка I, 35. Застосування вектора за будь-яким з пп. 1-27 зв’язуючого TNF, білка II, зв’язуючого TNF, для селекції клонів, які експресують високі кількосRaptiva®, IL-18BP або їх мутеїнів, фрагментів, фунті гена, що представляє інтерес. кціональних похідних і їх злитих білків. 36. Застосування вектора за будь-яким з пп. 4-24 23. Вектор за будь-яким з пп. 11-22, де маркерний для одночасної експресії двох і більше генів або білок вибраний з аденозиндезамінази (ADA), аміДНК, що представляють інтерес. ноглікозидфосфотрансферази (nео), дигідрофола37. Застосування вектора за будь-яким з поперетредуктази (DHFR), гігроміцин-Вдніх пунктів для виробництва лікарського засобу, фосфотрансферази (НРН), тимідинкінази (tk), ксапризначеного для ДНК-терапії. нтин-гуанінфосфорибозилтрансферази (gpt), гена 38. Застосування клітини-хазяїна за п. 28 або п. 29 множинної лікарської стійкості (MDR), орнітиндедля виробництва лікарського засобу для клітинної карбоксилази (ODC) та стійкості до Nтерапії. Даний винахід відноситься до експресуючих векторів, що містять ІЕ2-промотор mCMV-гена, або його фрагмент, що стимулює функціональну експресію, а також і/або ІЕ2-енхансер гена mCMV, або його фрагмент, що посилює функціональну експресію, де вказаний експресуючий вектор не містить якого-небудь цілого гена mCMV, до хазяйських клітин, що містять такі вектори, до способів 5 88138 6 отримання необхідних поліпептидів з використанпротилежному напрямку від мРНК першого ІЕ2ням даних експресуючих векторів, а також до вигена. Цей другий передранішній ген назвали ІЕ2, а користання вказаних експресуючих векторів. його промоторну послідовність визначили як ІЕ2Відповідно до даного винаходу, експресуючі промотор [Messerle et al., 1991]. вектори, що містять промотор mCMV IE2 і промоВказана ІЕ2-ділянка з mCMV досі не використор mCMV IE1, необов'язково разом з новим енхатовувалася у векторах для експресії гетерологічнсером mCMV ІЕ2, є переважними, особливо якщо них білків. обидва промотори складають елементи однієї Даний винахід оснований на даних, відповідно структури та є різноспрямованими. до яких вектор, що має ДНК-елемент, який містить В останні десятиріччя експресуючі вектори виІЕ2-промоторну ділянку з mCMV, може ефективно користовують як носії для експресії генів або кДНК, запускати експресію гена, що представляє інтерес, що кодують поліпептиди або білки в хазяйських в трансфікованих хазяйських клітинах. клітинах, які цікавлять. Сильні вірусні або клітинні Крім того, даний винахід оснований на даних промотори та енхансери використовують для випо ідентифікації нового енхансера на ІЕ2-ділянці сокорівневої експресії гена, що представляє інтеmCMV, який в даному описі називають IЕ2рес, за допомогою тимчасової або постійної (стійенхансер mCMV. Даний енхансер задовольняє кої) трансфекції рекомбінантної ДНК у відповідні критерій, що пред'являється до визначення енханхазяйські клітини. Показано, що в цьому відносера, тобто посилює експресію, незалежно від (1) шенні особливо придатна передранішня (IE) ділярозміщення, (2) орієнтації, і від (3) посилення екснка цитомегаловірусу людини (hCMV), а експрепресії з гетерологічного промотору. суючі вектори, що містять генні елементи, Тому перший аспект даного винаходу відноотримані з даної ділянки, відомі, наприклад, з ситься до експресуючого вектора, що містить ІЕ2ЕР0323997В1. промотор mCMV-гена, або до його фрагмента, До останнього часу генні регуляторні послідоякий посилює функціональну експресію, а тавності з мишачого цитомегаловірусу (mCMV) викокож/або до ІЕ2-енхансера mCMV-гена, або до його ристовують рідко, незважаючи на те, що, як було фрагмента, що посилює функціональну експресію, показано, отримані з mCMV регуляторні елементи де вказаний експресуючий вектор не містить ніякоє дуже потужними, навіть сильнішими за аналогічні го цілого гена mCMV. копії вірусу людини [Kim et al., 2002]. Другий аспект даного винаходу відноситься до У патенті США №4963481 (de Villiers) описані хазяйської клітини, що містить вектор відповідно експресуючі вектори, що містять ДНК, яка кодує до даного винаходу. гетерологічний білок під транскрипційним контроТретій аспект даного винаходу відноситься до лем ДНК-фрагментів, отриманих з IR-генної ділянспособу отримання поліпептиду, який представляє ки mCMV, що містить фрагмент розміром приблиінтерес, що включає в себе стадію трансфекції зно 2270 пар основ (п.о.), виділений хазяйської клітини вектором відповідно до даного рестрикційною ендонуклеазою Pstl з даного вірусвинаходу. ного геному. Неповний варіант даного фрагмента Четвертий аспект даного винаходу відносить1387 п.о. істотно поліпшує ефективність вказаного ся до способу отримання поліпептиду, який предДНК-фрагмента як промотору для експресії вищеставляє інтерес, що включає в себе стадію кульзазначеного гетерологічного білка. тивування хазяйської клітини згідно з винаходом. У патенті США №4968615 (Kozinowski) описані П'ятий аспект даного винаходу відноситься до молекули рекомбінантної ДНК, що містить трансвикористання вектора відповідно до даного винакрипційні енхансери з мишачого цитомегаловірусу ходу для експресії одного або декількох генів або (MCMV), які можна використовувати для посиленкДНК, що представляють інтерес. ня транскрипції структурних генів еукаріотичних Шостий аспект даного винаходу відноситься клітин. Показано, що даний mCMV-енхансер роздо використання вектора згідно з винаходом для ташований в межах 2,27 т.п.о. Pstl-фрагмента, селекції клонів, які експресують великі кількості ідентифікованого de Villers (патент США гена, що представляє інтерес. №4963481). Сьомий аспект відноситься до використання Manning and Mocarski (1988) проаналізували вектора відповідно до даного винаходу для ДНКфункціональну значущість ІЕ2-ділянки mCMV для терапії. реплікації мишачого цитомегаловірусу. Для цього На Фіг.1 представлена послідовність двоспрясконструювали рекомбінантний вірус, який містив мованого ДНК-елемента, отриманого з IE-ділянки репортерний ген lacZ під транскрипційним контроmCMV, для використання в експресуючих конструлем ІЕ-енхансера/промотору mCMV, що розриває, кціях. Вказані, відповідно, +1-сайти і ТАТА-бокси тим самим, цей ІЕ2-ген. Дійсно, експресія ІЕ2-гена промоторів ІЕ2 і ІЕ1. Корові промотори обох генів не спостерігалася, а вірус реплікувався нормальвиділені в чотирикутнику. Сайта рестрикції НраІ і но. Тому ці автори зробили висновок, що даний Xhol виділені жирним шрифтом. Положення -682 ІЕ2-ген, який не зберігається у таких цитомегаловказане відносно +1 ІЕ1. вірусах як mCMV і hCMV, не є істотним для репліНа Фіг.2 представлені репортерні конструкції кації вірусу. Manning and Mocarski не змогли виA-G. Люциферазний репортерний ген представлезначити або підтвердити особливу користь у ний у вигляді жирної лінії, а промотори вказані у наявності енхансер/промоторної ІЕ2-ділянки. вигляді світлих стрілок. В останніх публікаціях показана додаткова А: Негативний безпромоторний контроль відмінність між IE-ділянкою CMV миші та людини. (pGL3 Головний). Мишачий локус експресує другу основну мРНК у 7 88138 8 В: SV40-промотор/енхансерний запуск люцино-сірий овал використаний для нового ІЕ2феразного репортерного вектора (pGL3 Контроль). енхансера. С: Експресія люциферази, керована ІЕ1Η: Двоспрямована конструкція з ІЕ2промотором (pmCMV-люцифераза, керована ІЕ1). промотором керує експресією люциферази; D: Експресія люциферази, керована ІЕ2І: Експресією люциферази керує ІЕ2-промотор, промотором (prevmCMV-люцифераза, керована а ІЕ1-промотор видалений; ІЕ2). J, К, L, Μ, Ν: конструкції, що містять укорочені Е: Експресія люциферази, керована промотоmCMV-промотори, цифрами вказані положення, ром ІЕ2, IE1-промотор видалений (prevmCMVщо відповідають числу пар основ для mCMVp відносно +1 ІЕ2: люцифераза (DXhoI), керована ІЕ2, ІЕ1 відсутній). J: починаючи від -1076 F: Експресія люциферази, керована IE1К: починаючи від - 783 промотором, при тому що ІЕ2-промотор видалеL: починаючи від - 587 ний (рВS.МСМV3-люцифераза, керована ІЕ1 (1.4 М: починаючи від - 387 т.п.о.), ІЕ2 відсутній). N: починаючи від -189. G: Скорочений варіант запуску експресії люНа Фіг.10(b) показана експресія в RLU для рециферази під IE1-промотором (р-680-люцифераза, портерних конструкцій H-N відповідно до Фіг.10(а), керована ІЕ1 (скорочений варіант, 0,68 т.п.о.)). після тимчасової трансфекції клітин CHO-S, які На Фіг.3 представлена двоспрямована консвирощують в безсироватковому середовищі. трукція, подібна конструкції С на Фіг.2 (конструкція На Фіг.11(а) представлені додаткові конструкС-2), з послідовністю, що кодує IL-18BP (жирна ції O-Y, в яких об'єднані новий ІЕ2-енхансер (сірий лінія), приєднаною до ІЕ2-промотору. Таким чиовал) з SV40-промотором. Вказаний сірий овал ном, в даній конструкції IE1-промотор запускає відповідає ІЕ2-енхансеру від -587 до -189, половиекспресію mCMV-люциферази, і одночасно ІЕ2на сірого овалу відповідає ІЕ2-енхансеру від -387 промотор mCMV запускає експресію IL-18BP. Тридо -189. Стрілки вище даного ІЕ2-енхансера вкакутник: інтрон. Чорні овали: роlуА. зують напрям енхансерної послідовності. ЛюциНа Фіг.4 показана експресія люциферазного феразний репортерний ген представлений у вирепортерного гена в різних репортерних конструкгляді жирної лінії, SV40-промотор вказаний ціях, які зображені на Фіг.2, конструкції A-G. Клітисвітлою стрілкою. Чорний овал: polyА. ни СНО-S, вирощені на безсироватковому середоО: довгу ІЕ2-енхансерну послідовність (-587/вищі (SFM), були випадковим чином трансфіковані 189) клонують по 5'-кінцю SV40-промоторa; конструкціями A-G або псевдотрансфіковані. АктиΡ: коротку ІЕ2-енхансерну послідовність (вність люциферази виражена у відносних світло387/-189) клонують по 5-кінцю SV-промотору; вих одиницях (RLU). Q: довгу ІЕ2-енхансерну послідовність (-587/На Фіг.5 представлена експресія люциферази, 189) клонують по 5'-кінцю SV40-промоторa в звовиміряна в RLU в стабільних групах CHO-S-клітин. ротній орієнтації; Дані клітини вирощують в SFM після трансфекції R: коротку ІЕ2-енхансерну послідовність (конструкціями D, С, F і Е, як зображено на Фіг.2. 387/-189) клонують по 5'-кінцю SV40-промоторa в Експресію люциферази визначають після 21 дня зворотній орієнтації; селекції. S: довгу ІЕ2-енхансерну послідовність (На Фіг.6 показані результати вимірювання в 587/189) клонують по 3'-кінцю люциферазного геRLU після тимчасової трансфекції з допомогою на; 900, 500, 300 і 100нг двоспрямованої конструкції Т: коротку ІЕ2-енхансерну послідовність (-387/С-2, представленої на Фіг.3. 189) клонують по 3'-кінцю люциферазного гена; На Фіг.7 показані кількості IL-18BP в нг/л в суU: довгу ІЕ2-енхансерну послідовність (-587/пернатантах культури клітин, отримані в експери189) клонують по 3'-кінцю люциферазного гена в менті з тимчасовою трансфекцією, відповідно до зворотній орієнтації; Фіг.6 (конструкція С-2). V: коротку ІЕ2-енхансерну послідовність (На Фіг.8 представлене співвідношення кілько387/-189), клонують по 3'-кінцю люциферазного сті IL-18BP і люциферази, виміряної відповідно до гена в зворотній орієнтації; експериментів на Фіг.6 і 7. W: Контроль, SV40-промотор і SV40-енхансер На Фіг.9 представлені кількості люциферази в в 3'-кінці кодуючої послідовності люциферази; RLU (на лівій у-осі) та IL-18BP в нг/мл (на правій уX: Контроль, експресія люциферази, керована осі), експресовані в 48 індивідуальних клонах, які SV-промотором без якого-небудь енхансера; були відібрані через 8 днів після трансфекції двоY: негативний контроль, скрізь без промотору. спрямованою конструкцією С-2 (як показано на На Фіг.11(b) представлена експресія люцифеФіг.3). Межа виявлення люциферази складала рази з репортерними конструкціями O-Y, як покаприблизно 500 RLU, і 2,5нг/мл - для IL-18BP. Кожзано на Фіг.11(а). Клітини CHO-S, вирощені в безний крок на осі X відповідає одному одиничному сироватковому середовищі (SFM), трансфікують клону. випадковим чином за допомогою конструкцій O-Y. На Фіг.10(а) показані репортерні конструкції HЛюциферазну активність зображують у вигляді N. Люциферазний репортерний ген (Luc) виділескладеної стрічки, довжина якої визначена відносний жирною лінією, а відповідні промотори ІЕ1 і но контролю X (значення 1), тобто відносно ексІЕ2 вказані світлими стрілками. Енхансери предпресії, керованої SV40-промотором без якогоставлені у вигляді сірих овалів: світло-сірий овал небудь енхансера. Світлі чотирикутники: довгий використаний для відомого ІЕ1-енхансера, а темІЕ2-енхансер (-587/-189), заштриховані прямокут 9 88138 10 ники: короткий ІЕ2-енхансер (-387/-189). Х-вісь би) в нг/мл (права у-вісь). Кожний крок на осі x відявляє собою логарифмічну шкалу. повідає індивідуальному прото-клону. Прото-клони На Фіг.12 представлений експеримент порівстворюються СНО-клітинами, стійко трансфиціконяння нового ІЕ2-енхансера з відомим hCMVваними конструкцією #26, і відбираються в присутенхансером. Клітини трансфікують за допомогою ності пуроміцину. контрольної конструкції A (pGL3 основна, див. На Фіг.19: Те саме, що і на Фіг.18, але протоФіг.2, з відсутністю промотору), контрольної консклони створюються клітинами, трансфікованими трукції В (pGL3 контрольна, див. Фіг.2, SV40конструкцією #140. промотор з SV40-енхансерною послідовністю в 3'Фіг.20: Прото-клони, трансфіковані будь-якою кодуючій ділянці люциферази), контрольної консконструкцією, #26 або #140, аналізують на предтрукції X (SV-Luc+, див. Фіг.11а, SV40-промотор мет експресії люциферази в 96-ямковому планшебез енхансера), а також за допомогою конструкцій ті, інвертованому за допомогою пристрою O-Q (див. Фіг.11а) або за допомогою конструкцій ChemiDoc. O-2 і Q-2, в яких ІЕ2-енхансерну послідовність (доВідповідно до даного винаходу, несподівано вгий варіант, від -587 до -189) заміняють відомою виявилося, що промотор передранішнього другого hCMV-енхансерною послідовністю (SEQ ID NO: 2). (ІЕ2) гена мишачого цитомегаловірусу (mCMV) Люциферазу вимірюють в RLU (х-вісь). Заштриховиявився ефективним для стимуляції експресії вані прямокутники: з відомим hCMV-енхансером. поліпептиду, що представляє інтерес, який, власПрямокутники сірого кольору: з новим ІЕ2не, не є ІЕ2-білком mCMV, тобто гетерологічним енхансером. поліпептидом або білком. Даний експресуючий На Фіг.13 показаний двоспрямований вектор, вектор за припущенням не є власне мишачим цищо використовується для одночасної експресії ILтомегаловірусом або ж таким, що містить будь-які 18BP і люциферази. Промотори ІЕ1 та ІЕ2 вказані повні гени вірусу mCMV, але являє собою вектор світлими стрілками. Трикутник являє собою інтрон для експресії рекомбінантного білка. А з IE-ділянки hCMV, а овал сірого кольору - сигВнаслідок цього даний винахід відноситься до нал поліаденілування. Чорний квадрат відповідає експресуючого вектора, що містить ІЕ2-промотор сигнальному пептиду. mCMV-гена, або до його фрагмента, який стимуКонструкція #26: Люцифераза експресується лює функціональну експресію, де даний експресупід IE1-промотором, a IL-18BP експресується під ючий вектор не містить будь-якого повного гена ІЕ2-промотором. Послідовність між обома промоmCMV. торами як в конструкції Η на Фіг.10(а), Крім цього, в ІЕ2-ділянці mCMV був ідентифіКонструкція #140. Люцифераза експресується кований новий енхансер, який називається тут ІЕ2під ІЕ2-промотором, a IL-18BP експресується з енхансер mCMV, або ІЕ2-енхансер. Даний енханIE1-промотору. Між цими двома промоторами розсер посилює експресію незалежно від його локаліташовується ІЕ2-енхансер (від -587 до -189). зації або орієнтації відносно даного гена, а також На Фіг.14 представлені дані про кількості експосилює експресію з гетерологічних промоторів, пресованої люциферази (RLU, ліва Y-вісь) та ILвідповідаючи, таким чином, основному критерію 18BP (нг/мл, права Y-вісь) після тимчасової енхансера. трансфекції СНО-клітин, що вирощуються в безУ зв'язку з цим даний винахід відноситься тасироватковому середовищі, за допомогою будькож до експресуючого вектора, що містить вказаякої конструкції, #26 або #140, відповідно до ний ІЕ2-енхансер mCMV-гена, або до його фрагФіг.13. Прямокутники: експресія люциферази; чормента, що посилює функціональну експресію, де ні ромби: експресія IL-18BP. експресуючий вектор не містить будь-якого повноНа Фіг.15 представлені дані по експресії люго гена mCMV. циферази (RLU, ліва Y-вісь) і IL-18ВР (нг/мл, права Фахівцям в даній галузі техніки очевидно, що Y-вісь) в стійких групах, трансфікованих за доповектор згідно з винаходом може містити лише могою будь-якої конструкції, #26 або #140, відповіодин ІЕ2-промотор mCMV або ІЕ2-промотор у подно до Фіг.13. Експресію вимірюють через 7 днів єднанні з будь-яким придатним відомим енхансепісля трансфекції. Клітини відбирають у присутнором. Фахівцям в даній галузі також очевидно, що сті пуроміцину (+puro) або ж відбирають протягом вектор згідно з винаходом може містити лише 3-х тижнів без пуроміцину (-puro). Прямокутники: один ІЕ2-енхансер mCMV або ІЕ2-енхансер у поекспресія люциферази, чорні ромби: експресія ILєднанні з будь-яким придатним промотором. Крім 18BP. того, вектор згідно з винаходом може містити ІЕ2На Фіг.16 показана тривалість експресії люципромотор mCMV у поєднанні з ІЕ2-енхансером ферази як в експерименті на Фіг.15. На осі x відmCMV. кладений час у тижнях. Дані, представлені на Сам ІЕ2-ген mCMV відомий, [наприклад, з пуФіг.15, відповідають 3 тижневим даним на Фіг.16. блікації Messerie et al., 1991p.]. Чорний ромб: #26+puro, маленький квадрат: Термін "промотор", що використовується тут, #140+puro, чорний трикутник: #26-puro, великий відноситься до ділянки ДНК, функції якої полягаквадрат: #140-puro. ють у контролі транскрипції однієї або декількох На Фіг.17 показана тривалість експресії ILДНК-послідовностей і який структурно ідентифіку18BP відповідно до експериментів Фіг.16. Познається за наявністю сайта зв'язування ДНКчення - як на Фіг.16. залежної РНК-полімерази і за наявністю інших На Фіг.18 представлені результати аналізу ДНК-послідовностей, що впливають на регуляцію прото-клонів відносно експресії люциферази (квапромоторної функції. Функціонально експресуючий драти) в RLU (ліва у-вісь) і експресії IL-18BP (ромпосилюючий фрагмент промотору представляє 11 88138 12 неповну або усічену промоторну послідовність, що від -387 до -189 з лівої ІЕ2-ділянки mCMV, і нумезберігає активність як промотор. Промоторну акрація нуклеотидів здійснюється відносно положентивність можна виміряти будь-яким методом, віня +1 ІЕ2-гена. Даний фрагмент має енхансерну домим в даній галузі, наприклад, репортерним функцію та називається тут коротким варіантом методом з використанням люциферази як репоренхансера ІЕ2. терного гена [Wood, 1991; Seliger and McElroy, Ще в одному переважному варіанті здійснення I960; de Wet et al., (1985) або комерційно придатданого винаходу даний вектор складається з фрагмента, що містить нуклеотиди від -587 до -189 ної люциферази від PromegaÒ). лівої ІЕ2-ділянки mCMV, і нумерація нуклеотидів Відповідно до даного винаходу, ІЕ2-промотор здійснюється відносно +1 ІЕ2-гена. Даний фрагможе, наприклад, включати в себе послідовність мент має енхансерну функцію та називається тут від положення +1 до ТАТА-боксу, як зазначено на довгим варіантом ІЕ2-енхансера. Фіг.1. ІЕ2-промотор може також включати в себе Вектор згідно з винаходом може також вклюпослідовність, що називається тут "коровий прочати в себе ще й додатковий ІЕ-енхансер mCMV, мотор", що тягнеться від нуклеотиду 1 до нуклеоабо його посилюючий функціональну експресію тиду 39 в послідовності, зображеній на Фіг.1 (чотифрагмент, що називається тут "ІЕ1-енхансер рикутник). Фахівцям в даній галузі відомо, що mCMV". послідовність ІЕ2-промотору mCMV може бути Такий IE1-енхансер mCMV відомий в даній гадовшою або коротшою даного корового промотору лузі, наприклад, з патенту США №4968615. Він, доти, поки він запускає транскрипцію ДНКнаприклад, може тягнутися в послідовності, предпослідовності, оперативно з ним зв'язаної. Наприставленій на Фіг.1, від положення -587 до -147 або клад, ІЕ2-промотор може також включати в себе від положення -682 до -147, нумерація яких здійс100-200 пар основ ліворуч від даного корового нюється відносно положення +1 IE1-гена. IE1промотору. Така промоторна ділянка називається енхансер mCMV, який може бути використаний також "проксимальним промотором". Фахівцям в відповідно до даного винаходу, може додатково даній галузі повинно бути також очевидно, що тевключати в себе послідовність, що тягнеться від рміни "промотор" та "енхансер" (див. нижче) точно пари основ -1330 до -488 відносно положення +1 в не визначаються, і тому даний промотор може ІЕ1 на Фіг.1. Дана енхансерна ділянка може також включати в себе енхансерні ділянки або енхансервключати в себе весь промотор або його частину. ні ділянки можуть включати в себе промоторні Завдяки використанню mCMV-енхансера в доділянки, залежно від термінології та контексту. повнення до ІЕ2-промотору, можна ще більше підТермін "вектор" відноситься до будь-якого новищити експресію поліпептиду, що представляє сія екзогенної ДНК або РНК, який придатний для інтерес. переміщення екзогенної ДНК в хазяйську клітину Відповідно до даного винаходу, вказаний векдля реплікації і/або для відповідної експресії екзотор додатково містить промотор, який відрізняєтьгенної ДНК за допомогою даної хазяйської клітини. ся від ІЕ2-промотору mCMV, або його фрагмент, Під терміном "оперативно зв'язаний", що викощо посилює функціональну експресію. ристовується тут, мається на увазі функціональне У переважному варіанті здійснення даного визлиття промотору зі структурним геном чи кДНК, находу вектор згідно з винаходом включає в себе або з іншою послідовністю ДНК, яка знаходиться перший і другий промотор вірусного, клітинного під контролем даного промотору. Тому, термін або штучного походження, або його фрагмент, що "оперативно зв'язаний", що використовується тут, посилює функціональну експресію. не обмежується прямим злиттям ДНКТому в переважному варіанті здійснення данопослідовностей. го винаходу даний вектор включає в себе ІЕ2Термін "повний ген mCMV" відноситься до віпромотор mCMV у поєднанні з другим промоторусного гена мишачого цитомегаловірусу, який ром, або його фрагментом, що посилює функціомає свої власні (ендогенні, вірусні) 5'- і 3'нальну експресію. Приклади додаткових придатрегуляторні елементи. них промоторів включають в себе hCMV-промотор, "Енхансерна ділянка" відноситься до ділянки металотіонеїновий промотор (МТ), SV40-промотор ДНК, функція якої полягає в підвищенні рівня або штучний промотор. Переважно, другий промотранскрипції одного або декількох генів. Зокрема, тор являє собою додаткову копію ІЕ2-промотору під терміном, "енхансер", що використовується mCMV. Такі додаткові промотори можуть посилити тут, мається на увазі регуляторний ДНК-елемент, конститутивну або регуляторну експресію. Регуякий посилює, збільшує, поліпшує або підвищує льована експресія може бути такою, що індукуєтьякість експресії гена незалежно від його місцерозся або репресується, або і тією й іншою. ташування та орієнтації відносно експресуючого Переважно, коли такий другий промотор являє гена, і який може бути таким, що посилює, збільсобою промотор IE1-гена mCMV або його фрагшує, поліпшує, підвищує якість або перевищує мент, що посилює функціональну експресію. Тому експресію більш ніж одного промотору. Переважособливо переважно, щоб перший промотор являв но, якщо даний енхансер посилює експресію одсобою ІЕ2-промотор mCMV або його фрагмент, що ночасно більше ніж з одного промотору. Фрагмент посилює функціональну експресію, а другий проенхансера, що посилює функціональну експресію, мотор являв собою ІЕ1-промотор mCMV або його являє собою неповну або усічену енхансерну пофрагмент, що посилює функціональну експресію. слідовність, що зберігає дану посилюючу здатIE1-промотор mCMV відомий, наприклад, з ність. WO 87/03905. Він може включати в себе коровий Вектор згідно з винаходом переважно складапромотор, що містить останні 47 п.о. з послідовноється з фрагмента, що включає в себе нуклеотиди 13 88138 14 сті на Фіг.1 (в рамці), або додаткові 100-200 п.о. Під терміном "репортерний ген" або "репортеліворуч від послідовності (тобто проксимальний рний білок", що використовується тут, мається на промотор), або він може включати в себе цілу міжувазі ген, який кодує генний продукт, що можна генну ділянку аж до положення -1330 (відносно ідентифікувати з використанням простих, недороположення +1 в ІЕ1, див. Фіг.1). гих способів або реактивів і який можна оперативУ переважному варіанті здійснення даного вино зв'язати з ділянкою промотору згідно з винахонаходу вектор складається з ДНК-послідовності дом або з його активним фрагментом. SEQ ID NO: 1, що включає в себе і ІЕ1-, і ІЕ2Репортерний ген можна використовувати для випромотор, а також IE1-енхансер і новий ІЕ2значення транскрипційної активності в скринуючих енхансер, або будь-який його фрагмент, що посианалізах [див., наприклад, Goeddel (ред.) Methods лює функціональну експресію. Enzymol., Vol. 185, San Diego. Academic Press, Inc. У найбільш переважному варіанті здійснення (1990)], наприклад з використанням люциферази даного винаходу у векторі, що використовується як репортерного гена [Wood, 1991; Seliger and відповідно до даного винаходу, промотор або його McErloy, 1960; de Wet et al., (1985) або комерційно фрагмент, який посилює функціональну експресію, доступного від PromegaÒ]. оперативно зв'язаний з ДНК-послідовністю, що Приклади вибрані з люциферази, зеленого кодує щонайменше один поліпептид. У додаткофлуоресціюючого білка, лужних фосфатаз, Oвому варіанті здійснення даного винаходу енхангалактозидази, або пероксидази хріну або з внутсер згідно з винаходом присутній в експресуючому рішньомолекулярних поєднань з іншими білками, векторі разом з ДНК-послідовністю, що кодує щотакими, наприклад, як Зелений Флуоресціюючий найменше один поліпептид. Білок (GFP) або поліпшений GFP (EGFP) з пуроміПереважно, щоб вказана ДНК-послідовність циновим ацетилтрансферазним геном [Abbate et кодувала білок, що представляє інтерес. al., 2001], або з їх поєднання. Вельми переважно, якщо ДНК-послідовність Експериментальні дані згідно з винаходом оскодує маркерний білок або вона являє собою ампновані на тому, що ефективну , одночасну експреліфікований ген. сію поліпептидів, що цікавлять, можна здійснити з Переважно також, якщо вказана ДНКІЕ2- і ІЕ1-промотору, обидва з яких представлені в послідовність кодує репортерний білок. одній і тій самій плазміді. У зв'язку з цим в додатЯкщо вектор згідно з винаходом містить більковому переважному варіанті здійснення даного ше одного промотору, то будь-яке поєднання або винаходу обидва промотори, ІЕ2-промотор mCMV частина поєднання білка, що представляє інтерес, і IE1-промотор mCMV, або їх фрагменти, що посимаркера, репортера, ампліфікованого гена тощо люють функціональну експресію, відповідно, опеможе експресуватися з однієї і тієї самої плазміди. ративно зв'язують з поліпептидом. Відповідно до даного винаходу, поліпептид, Високі рівні експресії можуть бути здійснені, що представляє інтерес, може являти собою будьякщо обидва промотори представлені в двоспряякий поліпептид, який відрізняється від власне ІЕ2мованій структурі. Тому ІЕ2-промотор mCMV, або поліпептиду, може бути позаклітинним білком, тайого фрагмент, що посилює функціональну екским як пептидні гормони, або трансмембранним пресію, і промотор, зокрема, ІЕ1-промотор mCMV, білком, таким як рецептори фактора росту або або його фрагмент, що посилює функціональну гормональні рецептори, або внутрішньоклітинним експресію, розташовують в двох напрямках. білком, таким як кінази, фосфатази або ДНКПід терміном "розташований в двох напрямзв'язуючі білки, залежно від передбачуваного виках", що використовується тут, мається на увазі, користання поліпептиду, що цікавить, або від хащо дані промотори запускають транскрипцію в зяйської клітини, в якій він експресується. протилежних напрямках. Дана схема розташуванВідповідно до даного винаходу, придатні марня плазмідної ДНК називається також "двоспрямокерні білки являють собою, наприклад, негативні ваною структурою" даного вектора. або позитивні селективні маркери або ампліфікоПромотори ІЕ1 або ІЕ2 mCMV-гени або їх фравані гени. Приклади включають в себе білки, вибгменти, що посилюють функціональну експресію, рані з аденозиндезамінази (ADA), аміноглікозидабо будь-який новий промотор, який можна викофосфотрансферази (neo), дигідрофолатредуктази ристовувати у поєднанні з ІЕ2-промотором mCMV (DHFR), гігроміцин-В-фосфотрансферази (НРН), або у поєднанні з ІЕ2-енхансером, може також тимідинкінази (tk), ксантинвключати в себе сигнал ініціації трансляції. гуанінфосфорибозилтрансферази (gpt), фактора В іншому переважному варіанті здійснення множинної лікарської стійкості (MDR), орнітиндеданого винаходу ІЕ2-промотор mCMV-гена або карбоксилази (ODC) та фактора Nйого фрагмент, що посилює функціональну екс(фосфоноацетил)-L-аспартатрезистентності пресію, або ІЕ2-енхансер mCMV сполучаються з (CAD), або пуроміцинацетилтрансферази (РАС). іншими елементами, що регулюють або впливаДодаткові приклади включають в себе гени, що ють на транскрипцію. Такі елементи можуть впливикористовуються для селекції при використанні вати на процесинг, стабільність або трансляційну окремих метаболічних шляхів, такі як галактокінаефективність РНК. Приклади придатних елементів за [Schumperli et al., 1982], рецептор фолієвої кисвибрані з групи, що складається з 5'-UTR, інтронів, лоти [Zhu et al., 2001] або носій відновленого фо3'-UTR [див., наприклад, Mazumder et al., 2003], 3'лату [Assarafetal., 1992]. кінцевих процесуючих послідовностей мРНК (наЩе в одному переважному варіанті здійснення приклад, сайти поліаденілування) та IRESданого винаходу поліпептид, що представляє інпослідовностей для експресії поліцистронної мРНК терес, являє собою продукт репортерного гена. [див., наприклад, Mountford and Smith, 1995]. 15 88138 16 Переважно використовувати IRES-елемент від сили промоторів, що використовуються. Потім для експресії поліцистронних мРНК, в яких кодуючі ці субодиниці можна зібрати в одній і тій самій кліпослідовності відділені за допомогою IRES. У цьотині для створення зрілого білка. му випадку перевагою є те, що деякі поліпептиди, Переважні приклади димерних білків, придатякі представляють інтерес, можуть експресуватися них для експресії з використанням вектора згідно з з однієї і тієї самої мРНК, і отже, з одного і того винаходом, являють собою альфа-ланцюг і бетасамого промотору. ланцюг пептидного гормону, такого як FSH людиЩе в одному переважному варіанті здійснення ни, LH людини, TSH людини і CG людини. Відповіданого винаходу лише один ІЕ2-промотор mCMVдно до даного винаходу, будь-яку з двох субодигена або у поєднанні з IE1-промотором mCMVниць можна приєднати до промотору, переважно гена, або будь-який інший природний або штучний до ІЕ2-промотору mCMV. Фахівцям в даній галузі промотор або ІЕ2-енхансер можуть бути приєднані потрібно мати на увазі, що, відповідно до даного до додаткових послідовностей, посилючим ексвинаходу, в рівній мірі можна використовувати пресію, таких як інсулятори, граничні елементи, гормони інших видів тварин, таких як кінь або свиLCR [описані, наприклад, у Blackwood and Kadonga ня, а також бичачі гормони, залежно від мети ви(1998)] або ділянки, зв'язані з матриксом/клітинним користання даного рекомбінантного поліпептиду. каркасом [описані, наприклад, у Li et al., 1999]. В іншому варіанті здійснення даного винаходу Фахівці в даній галузі братимуть до уваги і те, перша субодиниця являє собою важкий ланцюг, а що вектор згідно з винаходом може також містити друга субодиниця являє собою легкий ланцюг імудодаткові енхансери, такі, наприклад, як добре ноглобуліну, або навпаки. Переважним прикладом відомий SV40-енхансер або hCMV-енхансер. придатного імуноглобуліну є IgG. Для терапевтичВідповідно до даного винаходу, поліпептид, ного використання такі імуноглобуліни можуть, оперативно зв'язаний з першим промотором, пенаприклад, являти собою гуманізовані антитіла реважно з ІЕ2-промотором mCMV, і поліпептид, або людські антитіла. Найбільш переважним приоперативно зв'язаний з другим промотором, перекладом такого гуманізованого антитіла є гуманізоважно з IE1-промотором mCMV-, може бути одним ване анти-СВ11-антитіло з торговою назвою і тим самим. У цьому випадку дві копії одного і того RaptivaÒ. самого гена представлені в одному і тому самому Багато поліпептидів, що представляють інтевекторі, але під контролем двох різних промоторів. рес, можуть експресуватися з використанням векСаме тому представляється можливим досягнути тора згідно з винаходом. У переважних варіантах швидкості експресії, яка перевершує експресію здійснення даного винаходу поліпептид вибирають єдиної копії гена, що кодує поліпептид, який предз групи, що складається з хоріонічного гонадотроставляє інтерес. піну, фолікулостимулюючого гормону, лютеїнізуюВ альтернативному варіанті здійснення даного чого хоріонічного гонадотропного гормону, тиреотвинаходу поліпептид, оперативно зв'язаний з перропіну, людського соматотропіну, інтерферону шим промотором, переважно ІЕ2-промотором (наприклад, інтерферон бета-1а, інтерферон бетаmCMV, і поліпептид, оперативно зв'язаний з дру1b), рецепторів інтерферону (наприклад, рецептогим промотором, переважно ІЕ1-промотором ра гама-інтерферону), TNF-рецепторів р55 і р65, mCMV, відрізняються. Тому даний винахід містить інтерлейкінів (наприклад, інтерлейкіну-2, інтерлейефективний вектор для ко-експресії двох різних кіну-11), білків, що зв'язують інтерлейкін (наприполіпептидів, таких як селективні маркери або білклад, білка, що зв'язує інтерлейкін-18), антики, що представляють інтерес, ко-експресії двох CD11а-антитіл, а також мутеїнів, фрагментів, розабо більше субодиниць одного і того самого білка чинних форм, функціональних похідних, їх злитих або навіть різних доменів одного і того самого білбілків. ка, необхідних для їх роздільної експресії, але при Інші переважні поліпептиди, що представляцьому в одній і тій самій хазяйській клітині. ють інтерес, включають в себе, наприклад, еритФахівцям в даній галузі техніки потрібно мати ропоетин, гранулоцитарний колонієстимулюючий на увазі, що відповідно до даного винаходу одну і фактор, гранулоцитарно-макрофагальний колонієту саму клітину можна одночасно трансфікувати стимулюючий фактор, гіпофізарні пептидні гормодекількома експресуючими векторами, які слугуни, менопаузний гонадотропін, інсуліноподібні фають для експресії безлічі білків і/або субодиниць ктори росту (наприклад, соматомедин-С), фактор всього комплексу мультимерних білків. росту кератиноцитів, виділений з гліальних клітин Переважно, щоб вказаний поліпептид, операнейротропний фактор, тромбомодулін, основний тивно зв'язаний з першим промотором, наприклад, фактор росту фібробластів, інсулін, Фактор VIII, з ІЕ2-промотором mCMV, являв собою першу субсоматотропін, морфогенетичний білок кістки типу одиницю димерного або мультимерного білка, а 2, тромбоцитарний фактор росту, гірудин, еритрополіпептид, оперативно зв'язаний з другим промопоетин, рекомбінантний злитий білок LFA-3/IgG1, тором, переважно з IE1-промотором mCMV, являв глюкоцереброзидаза, а також мутеїни, фрагменти, собою другу субодиницю димерного або мультирозчинні форми, функціональні похідні, їх злиті мерного білка. Відповідно до даного винаходу, кобілки. експресія двох субодиниць димерного білка є пеДругий аспект даного винаходу відноситься до реважною. Ко-експресія двох субодиниць одного і хазяйської клітини, трансфікованої щонайменше того самого білка є особливо переважною, оскільодним вектором, описаним вище. Фахівцям в даній ки експресія з обох промоторів може призвести до галузі потрібно мати на увазі, що відповідно до утворення схожих кількостей субодиниць або заданого винаходу хазяйську клітину можна в рівній даних співвідношень обох поліпептидів, залежно 17 88138 18 мірі одночасно трансфікувати двома або декількоЗалежно від передбачуваного використання, ма векторами. сама клітина, яка має інтегрований поліпептид, Придатними клітинами, відповідно до даного може бути продуктом способу, що пропонується. винаходу, є багато хазяйських клітин, таких як пеТака клітина може, наприклад, використовуватися рвинні або стійкі клітинні лінії від самих різноманів клітинній терапії. тних еукаріот, включаючи рослинні та тваринні Четвертий аспект даного винаходу відноситьклітини, а також клітини ссавців або людини. Нася до способу отримання поліпептиду, що цікаприклад, придатні хазяйські клітини включають в вить, який включає в себе стадію культивування себе СНО-клітини, COS-клітини, СV1-клітини, михазяйських клітин відповідно до даного винаходу. шачі L-клітини, НТ1080-клітини, ВНК-21-клітини, У переважному варіанті здійснення даного виНЕК293-клітини, NIH-3Т3-клітини, LM-клітини, YIнаходу даний спосіб додатково включає в себе клітини, мишачі NSO та SP2/0 гібридомні клітини стадію виділення поліпептиду, що цікавить, з хата їм подібні, Namalwa-клітини, RPMI-8226-клітини, зяйських клітин або культурального супернатанта. Vero-клітини, WI-38-клітини, MRC-5-клітини, або Дана стадія дає особливу перевагу та полегшує інші іморталізовані і/або трансформовані клітини. здійснення секреції білків, які можна просто видіПереважно, якщо хазяйські клітини являють лити з клітинного супернатанта. Разом з тим, дана собою СНО-клітини, і більш переважно, якщо вони стадія також застосовна для виділення поліпептиявляють собою CHO-S-клітини, описані, напридів з клітинних мембран або з внутрішньоклітинних клад, Shotwell et al, [1982, J. Biol. Chem. 257:2974структур, які можна виділити з хазяйських клітин. 2980]. СНО-клітини вперше були отримані Puck [J. Даний спосіб можна використовувати у тимчаExp. Med. 108, 945, 1958] з біоптату яєчника самисовій, стійкій, епісомній або у вірусній експресуюці китайського хом'ячка. З даних початкових клітин чій системах. Як показано нижче в Прикладах, векбув отриманий ряд субліній з різними характеристор згідно з винаходом, отриманий у стійкій тиками. Одна з цих СНО-клітинних ліній, СНО-К1 є експресуючій системі, дає в результаті особливо пролінзалежною та диплоїдною по гену дигідросильну експресію необхідного білка. Тому в перефолатредуктази (DHFR). Інша лінія, отримана з важному варіанті здійснення даного винаходу даної клітинної лінії, являє собою дефіцитну по трансфекція, що використовується, являє собою DHFR СНО-клітинну лінію (СНО DUK В11) (PNAS стійку трансфекцію. 77, 1980, 4216-4220), яка характеризується втраУ п'ятому аспекті даного винаходу вектор відтою DHFR-функції внаслідок мутації одного з повідно до даного винаходу використовують для DFRH-гена і подальшою втратою іншого гена. експресії гена, що представляє інтерес. Такими Всі ці клітини можна трансфікувати за допомогенами можуть бути, наприклад, гени, що кодують гою векторів згідно з винаходом або тимчасово, будь-який з вищезгаданих поліпептидів. Вектор або частково стійко (наприклад, якщо вектор є згідно з винаходом можна також використовувати епісомним), або стійким (наприклад, інтегрованим для експресії маркерних генів, репортерних генів, в даний геном) способом. Стійка трансфекція є ампліфікованих генів тощо. переважною для визначення клонів, які безперерПереважно даний вектор використовують для вно експресують представляючий інтерес поліпеподночасної експресії двох або більше генів або тид. кДНК, що представляють інтерес. Його можна таІЕ2-промотор згідно з винаходом або ІЕ2кож використовувати для спільної експресії одного енхансер можна використовувати як регуляторні гена, представляє інтерес та одного маркерного елементи в рамках способу, що зветься "Ендогенгена або репортерного гена, або ампліфікованого на активація гена". Вектор згідно з винаходом могена, або інших подібних генів. же містити введений геномний локус, який, як вваУ рамках даного винаходу несподівано було жають, активується внаслідок гомологічної показано, що вектор згідно з винаходом, зокрема рекомбінації, оперативно зв'язуючи, таким чином, вектор, що містить ІЕ2-промотор, ІЕ2-енхансер, та дану регуляторну послідовність (ІЕ2-промотор ІЕ1-промотор, отриманий при ідентифікації клонів, і/або енхансер) з геном, що цікавить, експресія які вельми ефективно експресують репортерний якого потребує індукції або в посилення. Даний ген і ген, що представляє інтерес. У зв'язку з цим, спосіб описаний, наприклад, в WO 91/09955. шостий аспект даного винаходу відноситься до Третій аспект даного винаходу відноситься до використання вектора відповідно до даного винаспособу отримання поліпептиду, що цікавить, який ходу для селекції клонів, які експресують великі включає в себе стадію трансфекції хазяйської клікількості гена, що представляє інтерес. тини за допомогою вектора згідно з винаходом. У сьомому аспекті даний винахід відноситься Залежно від природи поліпептиду, що цікадо використання вектора згідно з винаходом у вивить, використання способу відповідно до даного робництві лікарського засобу, що використовуєтьвинаходу приводить до секретування білка або ся для плазмідної або ДНК-терапії, або генотераполіпептиду, який можна зібрати з супернатанта пії. даної клітинної культури, або до отримання білка У восьмому аспекті хазяйську клітину згідно з клітинної мембрани або внутрішньоклітинного білвинаходом використовують для виробництва ліка, який можна виділити з клітин за допомогою карського засобу для клітинної терапії. Якщо дана відомих способів. Відповідний поліпептид, що виклітинна терапія передбачається для лікування готовляється відповідно до даного винаходу, може людини, переважно, щоб хазяйська клітина являла служити для будь-чого, але переважно він являє собою клітину людини або клітинну лінію, більш собою терапевтичний білок, за припущенням для переважно, щоб клітина або клітинна лінія була введення людині або тваринам. отримана від пацієнта, якого лікують. 19 88138 20 Тепер, маючи в своєму розпорядженні повний Плазмідні ДНК, сконструйовані, як зазначено опис даного винаходу, фахівцям в даній галузі на Фіг.2 і 3, виділяють з стандартно вирощуваних потрібно мати на увазі, що це саме можна здійснинічних культур за допомогою набору Nucleobond ти в широких межах еквівалентних параметрів, PC 500, відповідно до протоколу виробника. концентрацій і умов, що не виходять за рамки суті Трансфекція та змісту даного винаходу та без зайвого експериЛіпофектамін (Invitrogen, Cat No 18324-012) ментування. Посуд: 24-ямкові планшети Хоча даний винахід описаний у зв'язку з конкКлітини: CHO-S клітини в експоненційній фазі ретними варіантами його здійснення, очевидно, росту пасивують 24год. перед трансфекцією. Щоб що він піддається додатковим модифікаціям. Під виключити стаціонарну фазу при низькій щільності даною заявкою мається на увазі внесення будьклітин, клітини розбавляють до концентрації яких змін, призначень або переробок даного вина0,75´106клітин/мл. Сумарна кількість для трансфеходу, які в загальному плані наслідують принципи кції становила 1,5´105 клітин, ресуспендованих в даного винаходу, і в тому числі таких відхилень від 100мкл безсироваткового середовища SFM II суті даного винаходу, які знаходяться в рамках (Invitrogen, Cat No 12052-114) на ямку, для 24відомої або звичайної практики в межах галузі, до ямкового планшета. якої відноситься даний винахід, і які можуть бути Трансфекційні суміші були наступними: застосовані до сформульованих вище істотних A) Ліпофектамін: 2мкл ознак, також як і в рамках нижченаведеної формуSFM II-середовище: 48мкл ли винаходу. Загальний об'єм дорівнює 50мкл Всі посилання, що цитуються тут, в тому числі B) Аліквоти ДНК: 1мкг (50нг експресуючого вежурнальні статті та реферати, опубліковані або ктора+950нг плазміди-носія, pBluescript II KS(+), неопубліковані патентні заявки США або іноземні, Stratagene, cat. 212205-01 видані патенти США або іноземні патенти, або SFM II-середовище: доповнювати до 50мкл. будь-які інші посилання повністю включені тут за Розчини А і В змішують та інкубують протягом допомогою посилань, включаючи всі дані, таблиці, 30хв. при кімнатній температурі. Дану суміш підкреслення та текст, представлені в посиланнях, ливають до 100мкл SFM II-середовища, що місщо цитуються. Крім того, повний зміст посилань, тить 1,5´105 клітин. Дані клітини знову ставлять в що цитуються, в рамках посилань, що цитуються інкубатор та інкубують при 37°С, 5% СО2 протягом тут, також повністю включений за допомогою по3год. Потім додають 400мкл SFM II-середовища силання. для розбавлення ліпофектаміну. Протягом подаПосилання на відомі стадії способу, традиційні льших 48год. клітини повторно інкубують перед стадії способу, відомі способи або традиційні сповідбором проб для аналізу. Кожну трансфекцію соби ніяким чином не повинні розцінюватися так, здійснюють тричі. що яким би то не був аспект, опис або варіант Вимірювання люциферази здійснення даного винаходу вже розкритий, відоАналітичну систему Bright-Glo Luciferase від мий або запропонований в даній галузі. Promega, Cat No E2610, використовують для виміПопередній опис конкретних варіантів здійсрювання люциферази, відповідно до вказівок винення даного винаходу повинен так повно виявляробника. ти основну природу даного винаходу, що інші, заКоротко, суспензію клітин гомогенізують, піпестосовуючи знання в рамках даної галузі (у тому туючи декілька разів, відбирають аліквоту в 50мкл числі зміст посилань, що цитуються тут), легко і вносять її в білий 96-ямковий планшет (Nunc, Cat зможуть модифікувати і/або адаптувати для різних no 236108). Потім додають перерозчинений Brightзастосувань такі конкретні варіанти здійснення Glo-реагент та інкубують протягом 5хв. при кімнатданого винаходу, без зайвого експериментування, ній температурі. Світлове випромінювання виміне виходячи за рамки загального задуму даного рюють за допомогою люмінометра Centro LB 960 винаходу. Тому під такими переробками та моди(Berthold Technologies) протягом 5сек. фікаціями мають на увазі в рамках значення та Результати діапазону рівноцінні варіанти здійснення даного Конструкції експресуючих векторів, що викоривинаходу, які розкриваються, що базуються на стовуються у тимчасовій експресуючій системі на вказівках і додержанні вказівок, представлених основі CHO-S-клітин, зображені на Фіг.2. У даній тут. Очевидно, потрібно мати на увазі, що фразесерії експериментів люциферазу використовують ологія або термінологія даного документа признаяк репортерний ген для оцінки генної експресії. чені для опису, але не обмежуються ним, так що Вектори, що не мають який-небудь промотор взатермінологія або фразеологія опису даного винагалі (конструкція А) або SV40-промотор/енхансер ходу призначаються для інтерпретації фахівцями в (конструкція В), яка не є дуже активною в CHO-Sданій галузі в світлі викладених тут вказівок, наріклітинах, використовують для контролю. вні з загальними відомостями фахівців в даній Результати експериментів по тимчасовій галузі. трансфекції з векторами A-G подані на Фіг.4. У Приклади конструкціях С і F експресія люциферази керуєтьПриклад 1: Оцінка придатності експресуючих ся промотором ІЕ1. Обидві конструкції забезпечувекторів для тимчасової трансфекції ють експресію люциферази. Конструкція С, що Матеріали і методи: додатково містить ІЕ2-промотор, розташовується Матеріали в двох протилежних напрямках по відношенню до Клітини: CHO-S, джерело Gibco/Invitrogen (Cat IE1-промотору. Дане двоспрямоване розташуванno 11619) ня зменшує ефективність експресії з IE1 21 88138 22 Методика відбору: промотору (конструкція С), у порівнянні з викорисЧерез 48год. після трансфекції здійснюють сетанням одного лише IE1-промотору (конструкція лекцію, змінюючи середовище та розбавляючи F). Короткий варіант в 0,68 п.о. ІЕ1-промотору (конструкція G) був менш ефективним, ніж його клітини до концентрації 1´106клітин/мл в середодовгий варіант (конструкція F). вищі EX-CELL 325, що містить 10мкг/мл пуроміциНезалежно від присутності або відсутності ну (Sigma, P-8833). Кожні два дні клітини підраходругого промотору в одній і тій самій конструкції, вують, центрифугують, і ресуспендують в свіжому ІЕ2-промотор ефективно запускає експресію люселективному середовищі до концентрації 1´108 циферази (конструкції D і Е), і тому може викорисживих клітин/мл. У ці самі дні здійснюють контроль товуватися як промоторний елемент в експресуюжиттєздатності. Після 21-35 днів селекцію заверчих векторах для експресії поліпептиду, що шують, і життєздатність клітин перевищує 80%. цікавить. Вимірювання люциферази У протилежність IE1-промотору, ІЕ2-промотор, За дві години до відбору культуральних проб взятий окремо (конструкція Е), менш ефективний, клітини підраховують і дану культуру розбавляють ніж при його використанні в двоспрямованій струкдо концентрації 0,2´108 живих клітин/мл. турі (конструкція D). Тому він особливо підходить Вимірювання люциферази здійснюють за додля використання в двоспрямованих експресуюпомогою аналітичної системи Bright-Glo Luciferase чих векторах. від Promega, Cat No E2610 відповідно до вказівок Приклад 2: Оцінка придатності експресуючих виробника. векторів у стійкій трансфекції Коротко, клітини суспендують шляхом неодноМатеріали і методи разового їх піпетування, після чого беруть аліквоту Методи в 50мкл і вміщують її в білий 96-ямковий планшет Клітини: CHO-S, від Gibco/Invitrogen (Cat no (Nunc, Cat no 236108). Приливають 50мкл пере11619) розчиненого Bright-Glo-реагенту та інкубують проПлазмідні ДНК (відповідно до Фіг.2) виділяють тягом 5хв. при кімнатній температурі. Люмінометз стандартно вирощуваних нічних культур за дором Centre LB 960 (Berthold Teclpologies) протягом помогою набору Nucleobond PC 500 (Macherey5сек. в досліді вимірюють світлове випромінюванNagel Cat. No 740574) відповідно до протоколу ня. виробника. Потім активність люциферази стандартизують Трансфекція шляхом підрахунку живих клітин в зразку, що виЛіпофектамін (Invitrogen, Cat No 18324-012) пробовується, тобто, як правило, 1´104 клітин. Для здійснення стійкої трансфекції використоРезультати вують колби Т75. Клітини СНО-S, що знаходяться Конструкції С, D, Ε і F (див. Фіг.2) тестують в в експоненційній фазі росту, пасивують за 24год. стійкій експресуючій системі. Отримані результати до трансфекції. Щоб виключити стаціонарну фазу зображені на Фіг.5. Конструкція Е, що містить тільпри низькій щільності клітин, останні розбавляють ки ІЕ2-промотор, приводить до найсильнішої екс6 до концентрації 0,75´10 клітин/мл. Сумарну кільпресії люциферази в даній системі. При спільній кість трансфікованих клітин, рівну 5´106, ресуспеприсутності IE1-промотору і ІЕ2-промотору, розміндують в 7мл середовища SFM II (Invitrogen Cat no щених в двох протилежних напрямках (конструкція 12052-114) в колбі Т75. D), ІЕ2-промотор все ще забезпечує експресію Використовували наступні суміші для транслюциферази, що перевищує експресію під промофекції: тором ІЕ1, або при окремій його присутності (консА) Ліпофектамін: 52,1мкл трукція F), або в двоспрямованому положенні з Середовище SFM II: 517,9мкл ІЕ2-промотором (конструкція С). Загальний об'єм становить 570мкл. Приклад 3: Ко-експресія двох поліпептидів, що В) Аліквоти ДНК: 10мг лінеаризованої плазміпредставляють інтерес, в двоспрямованих експредної ДНК (9мкг Luc-експресуючого вектора+1мкг суючих векторах. плазміди для селекції: SV40-промотор, що керує Матеріали і методи: геном стійкості до пуроміцину. Все плазміди лінеаТрансфекцию здійснюють так, як описано в ризують за допомогою Pvul). Прикладах 1 і 2. Коротко, CHO-S-клітини (в суОб'єм доводять до 570мкл середовищем SFM спензії, Gibco SFMII) були тимчасово трансфіковаII. ні за допомогою 900, 500, 300 і 100нг векторної Розчини А і В змішують та інкубують протягом ДНК (конструкція С-2, див. Фіг.3) в 24-ямкових 30хв. при кімнатній температурі. Підливають 7мл, планшетах (тричі для кожної обробки). Через два 6 що містять 5´10 клітин, і потім знову вміщують в дні після трансфекції здійснюють аналіз люцифеінкубатор при 37°С і 5% СО2 на 3год. Потім інкуборази з клітинними екстрактами в трьох повторах, вану культуру центрифугують при 800g протягом який виражають за допомогою RLU (відносні оди3хв., і клітинний осад ресуспендують в 5мл EXниці світла). Перед лізисом клітин були взяті супеCELL 325 (JRH, Cat no 14335-1000М), з додаванрнатанти з однієї і тієї самої ямки, об'єднані та ням 1Х НТ і 4,5мМ L-глутаміну (100Х НТ, проаналізовані на IL18BP за допомогою ІФА (див. Invitrogen, Cat. no 11067-030, 200мМ L-глутаміну, нижче). Sigma, G-7513). 5мл EX-CELL 325 додають безпоІФА IL-18BP середньо в колбу Т75 для того, щоб ресуспендуКількість рекомбінантного людського IL-18BP вати прилиплі клітини, які додаються до наявної (rhIL-18BP) в супернатанті вимірюють за допомосуспензії. У результаті, в 10мл середовища EXгою стандартного ІФА з використанням виділених CELL 325 знаходиться 5´106 клітин. очищенням білком G моноклональних анти-rh-ІL 23 88138 24 18ВР-антитіл, кон'югованих з біотином. ЕкстравіНа Фіг.9 представлені результати даного ексдін-HRP (Sigma) використовують як детектуючий перименту. Всі 48 клонів експресують люциферазу реагент. і IL-18BP, хоч і в різній кількості. На Фіг.9 показані кількості IL-18BP в нг/мл і Приклад 4: Визначення мінімальної енхансерлюциферази в RLU, експресовані в 48 клонах на ної послідовності 90-й день після стійкої трансфекції за допомогою Матеріали і методи двоспрямованої mCMV-промоторної конструкції ПлазмідніДНК (див. Фіг.3). Межа виявлення для люциферази Набір векторів, що містять укорочені mCMVскладає приблизно 500 RLU, і 2,5нг/мл - для ILпромотори, створений з використанням ПЛР (по18BP. лімеразна ланцюгова реакція) та специфічних для Результати mCMVp праймерів (Таблиця). У даній серії експериментів проаналізована Умови ПЛР були наступними: експресія двох генів, що знаходяться в конструкції Суміш: С-2, зображеній на Фіг.3. Маркерний ген (Люцифе10нг плазмідної ДНК (prevmCMV-Luciferase раза) експресується з ІЕ2-промотору, а ген, що (DΧhοΙ), конструкція Ε на Фіг.2) представляє інтерес, ген IL-18BP, експресується з 50пкмоль смислового та антисмислового промотору ІЕ2. IL-18BP являє собою секретований праймера (див. нижче таблицю 1, звичайний антибілок. Промотори вбудовані в двоспрямовану смисловий праймер для всіх) структуру, тобто, обидва промотори одночасно 200мкМ кожного dNTP (dATP, dTTP, dGTP, запускають експресію в протилежних напрямках. dCTP) Результати даного дослідження зображені на 1x Dynazyme-буфер, що містить 1,5мМ MgCl2 Фіг.6-9. На Фіг.6 показана величина люциферазної 4 одиниці ДНК-полімерази Dynazyme II експресії, яка виміряна в RLU у тимчасовій екс(Finnzymes, cat. F-501S) пресуючій системі. У тій самій тимчасовій експреХарактеристика циклів: суючій системі за допомогою ІФА вимірюють IL95°С, 5і 18BP в супернатантах клітинних культур. На Фіг.7 2 цикли: показані результати секреції білка IL-18BP в нг/мл. 95°С, 30" На Фіг.8 показане співвідношення IL-18ВР і люци52°С,30" ферази в кожному експерименті. 72°С, 1'30 Як показано на Фіг.6-8, для трансфекції вико2 цикли: ристовують різні кількості плазмідної ДНК. Всі ви95°С, 30" користані кількості ДНК призводять до експресії як 54°С,30" люциферази, так і IL-18BP. Вражаюче, але най72°С, 1'30 кращі результати отримані при трансфекції най10 циклів: меншою кількістю ДНК, а саме 100нг векторної 95°С,30" ДНК, і цей результат однаковий і для IL-18BP, і 58°С,30" для люциферази. 72°С, 1'30 Більше того, цей стабільний показник (Фіг.8) 15 циклів: свідчить про константне співвідношення потенцій95°С, 30" ної експресії обох промоторів. 60°С, 30" Нарешті, ці дані демонструють, що обидва ге72°С, 1'30 ни експресуються одночасно з двох промоторних 5мкл ампліфікату з кожної ПЛР-реакції вміщуодиниць, показуючи також, що обидві експресуючі ють в 1%-вий агарозний гель. Перед клонуванням одиниці повністю функціональні в двоспрямованій вирізають смуги, що мають потрібну довжину, та промоторній структурі. піддають виділенню очищенням з використанням Далі, стійко трансфікують конструкцію С-2, а набору Qiagen Minilute Gel Extraction, cat. 28606. експресію люциферази і IL-18ВР аналізують в 48 незалежних клонах. Таблиця Стійку трансфекцію здійснюють відповідно до протоколу, описаного в прикладі 2, за тим винятПоложення Праймер ком, що середовище, яке використовується після -1076 CCGCTCGAGACCTTATGTACGTGCCA трансфекції, являє собою ProCho5 (Cambrex, cat. -783 CCGCTCGAGCTCCAATGGAACTTTCCTG 12766Q). -587 CCGCTCGAGACTTTCCTGTTGATTCACC Що стосується клонування поодинокої клітини, -387 CCGCTCGAGCAAAACCCAGTGGAAAGTC даний пул упорядковують в 384-ямковому план-189 CCGCTCGAGATGCCATATGAGTGTATTAG шеті (Nunc, cat. 164688) з щільністю 0,5 клітин на IE1-IE2as CGGAATTCGATATCCGCGGTCTC ямку (70мкл/ямку) з використанням диспенсера Multidrop (ThermoLabsysterns, cat. 5840150). Через Положення, що кореспондують з числом пар 8 днів випадковим чином відбирають 192 клона та основ, взятих з mCMVp, розглядаючи +1 з ІЕ2 як аналізують люциферазну експресію. Відбирають початок відліку, являють собою: -1076, -783, -587, 48 клонів з найвищою Luc-експресією, які переві387 і -189. ряють на експресію люциферази (люмінометром) Метод клонування для будь-якого промоторта на IL-18BP (неавтоматизований ІФА, див. виного фрагмента був одним і тим самим, ПЛР викоще). нують в повну довжину mCMVp (prevmCMVLuciferase (DXhoI), тобто, конструкція Ε на Фіг.2). 25 88138 26 Потім дані фрагменти обробляють за допомогою приводить до дії люциферазний ген, а також SV40XhoI/ExoRI, додають два сайта рестрикції по краях енхансер, локалізований на 3'-кінці даного гена специфічної праймерної послідовності. Потім з (конструкція W), і pGL3-Basic (Promega, Ε1751), що конструкції Ε видаляють промоторну послідовність не містить ні промотору, ні енхансера (конструкція шляхом обробки її за допомогою XhoI/EcoRI та Υ). укорочені варіанти вбудовують в той самий локус. Коротко, pGL3-ctrI розрізають за допомогою Оцінку конструкцій здійснюють за допомогою Notl/Xbal, щоб виділити фрагмент, що містить тимчасової трансфекції ліпофектаміном з подальSV40-промотор з подальшим люциферазним гешим вимірюванням люциферази. Додаткові матеном. Аналогічним способом розрізають pGL3 ріали і методи описані в Прикладі 1. SFMbasic за допомогою Notl/Xbal і виділяють векторсередовище, що використовується в даному приний кістяк без енхансера, але такий, що містить кладі, являє собою ProCho5, Cambrex, B-12766Q. poly Α-ділянку. У результаті об'єднання двох фраРезультати гментів отримують pSV-Luc (конструкція X). Вектори H-N (Фіг.10.а), що містять ІЕ25'-ділянка SV40-промоторy даного вектора промотор mCMV, що приводять в дію люциферазстворена шляхом клонування ІЕ2-енхансерної ний ген, були сконструйовані для того, щоб визнапослідовності (від -587 до -189) в обох орієнтаціях, чити мінімальні послідовності, необхідні для висоназвана p5'enh-SV-Luc (конструкція О), і р5'кого експресуючого рівня з ІЕ2-промотору. зворотньоорієнтованої послідовності enh-SV-Luc Сім конструкцій H-N експресуючих векторів ви(конструкція Q). Крім того, дану ІЕ2-енхансерну користовують для тимчасової експресуючої систепослідовність (від -587 до -189) також клонують в ми, заснованої на CHO-S-клітинах. Отримані реобох орієнтаціях в 3'-ділянці люциферазного гена. зультати зображені на Фігурі 10.b). Конструкція L Отримані вектори були названі p3'enh-SV-Luc+ являє собою найкоротшу конструкцію, що зберігає (конструкція S), і р3'-зворотньоорієнтований enhсильну експресію люциферази в даній системі. SV.Luc. (конструкція U). Конструкція Μ все ще призводить до експресії люТаку саму процедуру здійснюють з коротким циферази на рівні, відповідному 30% рівня експреваріантом ІЕ2-енхансером, а саме, таким, що засії, що досягаються за допомогою конструкцій H-L. ймає позицію від -387 до -189 замість положення Експресія люциферази, що отримується за доповід -587 до -189, і отримують конструкції Р, R, Τ і V, могою конструкції Ν, виявляється дуже низькою, див. Фіг.11а. але все ж істотною, що свідчить про базальну Конструювання О, Р: Реципієнтний вектор явпромоторну активність, чого і потрібно було очікуляє собою pSV-Luc+ (конструкція X з Фіг.11.а), лівати для продуктивного сайта ініціації транскрипнеаризований за допомогою обробки Nhel/Smal. ції, який містить ТАТА-бокс та ініціатор. Повнорозмірний енхансер виділяють шляхом обНарешті, дані експерименти визначають новий робки Ndel і подальшою реакцією затуплення по енхансер, розташований ліворуч від ІЕ2 mCMV, кінцях з використанням полімерази Кленова, з пощо називається тут ІЕ2-енхансер mCMV. У вищедальшим очищенням і обробкою Nhel. Такий сазгаданих експериментах ІЕ2-енхансер збільшує мий підхід застосовують для створення короткої транскрипцію з мінімального ІЕ2-промотору, що енхансерної конструкції. зберігається в конструкції N. Мінімальна послідовКонструювання Q, R: Реципієнтний вектор явність, необхідна для високої експресії репортерноляє собою pSV-Luc+ (конструкція X з Фіг.11.а), ліго гена, знаходиться в межах фрагмента від -587 неаризований обробкою за допомогою Xhol/Smal. до -189 п.о. (конструкція L), і в межах конструкції, Повнорозмірний енхансер виділяють шляхом общо містить фрагмент від -387 до -189, що все ще робки за допомогою Ndel і подальшою реакцією посилює експресію люциферази (конструкція М). затуплення кінців з використанням полімерази Приклад 5: Новий ІЕ2-енхансер активує мініКленова, очищенням і обробкою за допомогою мальний SV40-промотор Xhol. Такий самий підхід застосовують для ствоДодаткові експерименти здійснюють для того, рення короткої енхансерної конструкції. щоб з'ясувати, чи дійсно новий ІЕ2-енхансер наКонструювання S, Т, U і V: Реципієнтний вексправді задовольняє всі критерії, необхідні для тор являє собою pSV-Luc+ (конструкція X з енхансерної активності, тобто, посилює експресію, Фіг.11.а), що розкривається обробкою за допомонезалежно від (1) місцерозташування, (2) орієнтагою ВатНІ, і подальшим затупленням кінців з викоції, і (3) промоторної ідентичності. Для цього були ристанням полімерази Кленова. Повнорозмірний сконструйовані конструкції O-V з метою з'ясувати, енхансер виділяють обробкою за допомогою чи може новий ІЕ2-енхансер посилювати експреNdel/Nhel, і подальшою реакцією затуплення кінців сію гетерологічного промотору, SV40-промоторy, з використанням полімерази Кленова. Клонування незалежно від орієнтації, відстані та положень (5' здійснюють в обох орієнтаціях, які ідентифікують або 3') відносно SV40-промоторa. Конструкції W, за допомогою рестрикційного аналізу. Обидві X, і Υ слугують контролем, W містить SV40конструкції з різними орієнтаціями залишають для енхансер, X містить SV40-промотор і не містить аналізу. Такий самий підхід застосовують для якого-небудь енхансера, a Y не містить ні енханстворення короткої енхансерної конструкції. сера, ні промотору. Конструювання pGL3-Basic (конструкція Y) Конструкція вектора слугує як контроль відсутності експресії. PGL3ctrI Вектор, що називається pSV-Luc (конструкція (конструкція W) слугує як SV40X на Фігурі 11(а)), який містить лише SV40промотор/енхансерний вектор. PSV-Luc є контропромотор, був сконструйований з pGL3-CtrI лем, що має тільки SV40-промотор (конструкція X). (Promega, E 1741), що містить SV40-промотор, що 27 88138 28 Вимірювання трансфекції та люциферази Приклад 6: порівняння довгого IЕ2здійснюють як попередні приклади. енхансерного варіанта (від -587 до -189) і hCMVРезультати енхансера. Результати, отримані для конструкцій O-Y з Протоколи експериментів по трансфекції ліФіг.11.а, зображені на Фіг.11.b. Конструкція, що пофектаміном з подальшим вимірюванням люцимістить SV40-промотор з відсутністю енхансерної ферази, описані в Прикладі 1. активності, взята як початковий рівень енхансерРезультати ної активності, яка додається, а активність, що У даному експерименті конструкції О та Q, що вимірюється за допомогою конструкції X, задаєтьмають довгий варіант нового ІЕ2-енхансера в обох ся у вигляді 1. Усі конструкції, що мають або довнапрямках в 5'SV40-промоторi, використовують гий, або короткий ІЕ2-енхансер, забезпечують ексдля порівняння з відомим сильним енхансером, пресію репортерного гена. Довгий варіант hCMV (людський цитомегаловірус)-енхансером. конструкції стійко забезпечує високу експресію На цьому кінці ІЕ2-послідовність mCMV заміняють репортерного гена з SV40-промоторy, яка виявляhCMV-енхансерною послідовністю (SEQ ID NO: 2) ється набагато вищою за ту, яку отримують при в конструкції О, отримуючи таким чином конструкоб'єднанні SV40-промоторa і SV40-енхансерa цію O-2. Те ж саме зроблено з конструкцією Q, (конструкція О). Внаслідок цього даний експериперетворюючи її в конструкцію Q-2. мент чітко визначає послідовність від -587 до -189 Використана для клонування послідовність і послідовність від -387 до 189 як справжніх енханhCMV-енхансера, що має фланкуючі Mlul-сайти серів, що активують гетерологічний промотор не(Mlul=acgcgt), має наступний вигляд: залежно від положення та орієнтації. SV-Luc+ розщеплюють за допомогою Mlul і обробляють лужною фосфатазою з кишечнику теляти для запобігання самолігування. Послідовність hCMV-промотору клонують в Mlul-сайт. Обидва різноорієнтовані клони зберігають для порівняння з еквівалентними ІЕ2-конструкціями. Результати по експресії люциферази представлені на Фіг.12. Рівень експресії люциферази, отриманий з новим ІЕ2-енхансером (довгий варіант), виявляється щонайменше вдвічі вищим за рівень експресії люциферази, отриманий за допомогою класичного hCMV-енхансера. Приклад 7: Характеристика ІЕ2-енхансера в двоспрямованій конструкції. Створені дві додаткові конструкції для тестування нового енхансера в двоспрямованій структурі, названі конструкціями #26 і #140, які зображені на Фіг.13. #26: Основу даного вектора складає послідовність mCMV-Luc+ (конструкція С, Фіг.3). Вона була створена за допомогою SacII/EcoRI. ІL-18ВРкасета взята з phCMV-IL18BP2. Шляхом розрізання даного вектора за допомогою SacII/EcoRI виділяють фрагмент, що містить інтрон А, за яким ідуть відкрита рамка зчитування IL-18BP і SV40роlуА-ділянка. #140: Основу даного вектора складає конструкція L з Фіг.10.а. Він створений за допомогою Xhol/Nhel, що відкривають даний вектор 5' ІЕ2енхансером. Вектор, експресуючий IL-18BP з IE 1промотору, названий pBS.I IL18BP(IE1).I, викорис товують для вбудування як донорного. Обробляючи даний вектор за допомогою Xhol/Spel, виділяють Xhol-фрагмент, що містить ІЕ1-промотор (див. Фіг.1), за якими іде касета інтрон A-IL18BPSV40polyA. В отриманій конструкції бракує послідовності між -589 і Xhol-сайтом початкової mCMVпромоторної послідовності. Стійку трансфекцію та вимірювання люциферази здійснюють, як описано в Прикладі 2, а ІФА IL18BP здійснюють, як описано в Прикладі 3. Однак конструкція #140 не є точним відображенням конструкції #26 відносно того, що промотори ІЕ1 і ІЕ2 знаходяться в протилежній орієнтації. Так, експресія люциферази запускається в конструкції #26 під промотором ІЕ1, а в конструкції #140 під промотором ІЕ2, експресія IL18BP запускається під промотором ІЕ2 в конструкції #26 і під промотором ІЕ1 в конструкції #140. Результати, отримані з обома конструкціями, представлені нижче, оскільки вони істотні для одночасної дії нового ІЕ2-енхансера двох різних промоторів в двоспрямованому експресуючому векторі (конструкція #140). На Фіг.14 зображені об'єднані результати по стійкій трансфекції клітин за допомогою конструкції #26 і #140 на прикладі експресії люциферази та IL18BP. Конструкція #140 забезпечує більш високу експресію і маркерного гена (люцифераза), і гена (IL-18BP), що представляє інтерес. Для того щоб визначити стабільність експресії люциферази і IL-18BP, сукупності клітин витриму 29 88138 30 ють в селективних умовах, а саме, або оброблябом. Експресію IL18BP виражають ОП-величиною. ють пуроміцином, або витримують протягом трьох Оскільки ІФА здійснюють у посуді з високою протижнів без селективного тиску (без пуроміцину). пускною здатністю, отримання % реальної кількісОтримані результати представлені на Фіг.15-17. ної оцінки рівнів IL-18BP неможливе. Однак, контРівні експресії репортерного гена люциферази та ролі з 2500нг/мл і 250нг/мл, а також холостий IL-18BP істотно не змінюються у часі, див. Фіг.16 і контроль включені в даний планшет для контролю 17. змінюваності. Таким чином, було продемонстровано, що На Фіг.20 показана експресія люциферази, обидві конструкції #26 і #140, показують аналогічні отримана за допомогою пристрою ChemiDoc. Дане рівні експресії у часі, в присутності або за відсутзображення дає CCD-камера (Biorad), що дозвоності селективного тиску. Тому, конструкції, що ляє отримувати сигнали хемілюмінесцентного помають новий ІЕ2-енхансер, придатні для стійкої й ходження (як на Фіг.20). Програмне забезпечення одночасної експресії двох генів. під назвою Quantity One 4.2.3 дозволяє управляти Оскільки вищенаведені результати були отризображенням інвертування сигналів, які були вимані для сукупностей, клони були отримані шлякористані тут. хом лімітуючого розведення в концентрації 0,5 Як випливає з результатів, представлених на клітин на ямку з обох сукупностей. Фіг.18-20, конструкція #140 дає групу неекспресоЩоб оцінити рівні клональної експресії, клони ваних клонів. Однак дивно, що невелика частина культивують при пуроміциновому відборі. Потім позитивних клонів експресується обома генами виділені клони розділяють у присутності і відсутнонадзвичайно сильно. сті пуроміцину, щоб згодом контролювати їх стійТому конструкція #140 дає можливість здійскість. Результати, представлені на Фіг.18 і 19, взяті нювати скринінг при дуже високій експресії на дудо розділення клонів на середовищі з відсутнісже ранніх стадіях клонування, і тим самим виклютю/присутністю пуроміцину. Результати, отримані чає необхідність тестування та доведення до кінця через 2 тижні після видалення пуроміцину, свідвеликого числа клонів, що зазвичай використовучать про незначну різницю між обома конструкціяється для ідентифікації невеликої кількості клонів з ми, підтверджуючи тим самим їх стійкість. Дане високою експресією двох генів, що цікавлять. дослідження було продовжене протягом подальСписок літератури ших 10-12 тижнів. 1. Abbate et al., Biotechniques 2001 Aug; 31(2):336Щоб оцінити експресію обох генів, використо40. вують посуд з високою пропускною здатністю, а 2. Assaraf et al., J Biol Chem 1992 Mar 25; саме 96-ямкові планшети: 267(9):5776-84. День 1: Розведення 1/2 клітин, що аналізують3. Blackwood EM, Kadonaga JT. Science 1998 Jul 3; ся, 100мкл культурального середовища (безсиро281(5373):61-3. ваткового) ProCho5+100мкл свіжого ProCho5, що 4. De Wet et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci USA 82, містить 5% навколоплідної сироватки теляти. У 7870. кінцевій концентрації 2,5% FBS клітини були здатні 5. Dorsch-Haesler, K. et al. (1985). Proc. Natl. Acad. прикріплюватися. Був зроблений щотижневий паSci. USA 82:8325-8329. саж підтримуючого планшета для фактора розве6. Goeddel Methods Enzymol., Vol. 185, San Diego. дення 1/20, кожний в ProCho5-середовищі. 7. Li Q, Harju S, Peterson KR. Trends Genet 1999 День 2: Видаляють середовище, одноразово Oct; 15(10):403-8. промивають 200мкл 1х PBS (Invitrogen, 100108. Manning WC and Mocarski, ES, Virology 167,477015), після чого додають 75мкл свіжого ProCho5, 484 (1988). що містить 5% FBS, та інкубують протягом 24год. 9. Mazumder B, Seshadri V, Fox PL. Trends Biochem День 3: 3 кожного супернатанта відбирають Sci 2003 Feb; 28(2):91-8. 50мкл і підливають 200мкл ІФА-буфера (1х PBS, 10. Messerle, M. et al. (1991). J. Virol. 65:1638-1643. 0,1% мас./об. BSA, 0,2% Твіна 20). Аліквоту в 11. Kim, S-Y et al. (2002). J. Biotech. 93:183-187. 100мкл аналізують за допомогою ІФА на IL-18BP. 12. Mountford PS, Smith AG. Trends Genet 1995 Ямка промиває 200мкл 1х PBS (відкинути) і May; 11(5): 179-84. приливають 100мкл Glo-лізуючого буфера 13. Sandford and Burns, Virology 222, 310-317 (Promega, Е266а). Дану ямку інкубують протягом (1996). 30хв. при кімнатній температурі, щоб забезпечити 14. Schumperli et al., Proc Natl Aced Sci USA 1982 лізис клітин. Вимірювання люциферази здійснюJan; 79(2):257-61. ють з використанням 30мкл лізованих клітин, пе15. Seliger and McElroy (1960) Arch. Biochem. ренесених в білий 96-ямковий планшет+30мкл Biophys. 88,136. перерозчиненого Bright-Glo-реагенту. Світлове 16. Shotwell et al., 1982, J. В. С 257(6), 2974-80. випромінювання замірюють люмінометром Centre 17. Wood et al., (1991) Biochme. Biophys. Res. LB960 протягом 5сек. експонування. Comm. 124, 592. Аналіз клонів, отриманий при стійкій трансфе18. Патент США №4963481. кції за допомогою конструкції #26, зображений на 19. Патент США №4968615. Фіг.18, а аналіз клонів при стійкої трансфекції за 20. Zhu et al., J Cell Biochem 2001 Mar 26; 81 допомогою конструкції #140 зображений на Фіг.19. (2):205-19. Клони, представлені на Фіг.18 і 19, оцінюють за їх люциферазним показником низхідним спосо 31 88138 32 33 88138 34 35 88138 36 37 88138 38 39 88138 40 41 88138 42 43 88138 44 В описі до патенту на винахід графічні зображення та текст подаються в редакції заявника Комп’ютерна верстка О. Гапоненко Підписне Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601