Цирковірус свиней 2 типу (цвс2), імуногенна композиція, що містить його, набір для аналізу та їх застосування

Реферат: Винахід належить до штаму цирковірусу свиней 2 типу (ЦВС2), який був депонований у Китайському центрі колекції типових культур (ССТСС) під номером доступу V201117. Винахід також передбачає імуногенні композиції, що містять новий штам ЦВС2, набір для аналізів на ЦВС2 і застосування нового штаму ЦВС2. UA 110632 C2 (12) UA 110632 C2 UA 110632 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Галузь винаходу Даний винахід стосується галузі ветеринарії, зокрема, нового штаму цирковірусу свиней 2 типу (ЦВС2), імуногенної композиції, що містить штам вірусу, набору для аналізу на ЦВС2 і застосування штаму вірусу. Передумови винаходу Уперше цирковірус свиней (ЦВС) був виявлений у клітинній лінії нирок свині (PK-15, ATCC CCL33). Незважаючи на те, що цирковірус свиней може постійно контамінувати клітини PK-15, вірус не викликає цитопатичний ефект (CPE) на контаміновані клітини PK-15. Більше того, ЦВС, отриманий з PK-15, вважається непатогенним. Незважаючи на те, що цирковірус свиней може інфікувати свиней, він не викликає патологічних змін у інфікованих свиней. Цирковірус свиней являє собою вірус ікосаедричної форми з одноланцюговою ДНК та кільцевим геномом з 1759 пар основ (п.о.). ЦВС, отриманий з PK-15, в 1995 році був віднесений до родини Circoviridae. В 1991 році в Канаді у свиней уперше був зареєстрований синдром мультисистемного виснаження після відлучення (PMWS). PMWS вражає поросят віком від 5 до 12 тижнів. Клінічно він характеризується такими симптомами, як прогресуюча втрата ваги, задишка, блідість і періодична жовтяниця. Характерні для нього мікроскопічні осередки ушкодження включають виснаження лімфоїдної тканини з гістіоцитарними інфільтратами в межах лімфоїдних органів, пневмонію, гранульоматозне запалення, гепатит та нефрит. Після спалаху 1991 року в Канаді про PMWS повідомляли в багатьох країнах Північної Америки, Європи та Азії. Пізніше зі свиней з PMWS був виділений новий цирковірус. Оскільки морфологія цирковірусу свиней, виділеного при PMWS, дуже подібна морфології ЦВС, отриманого з РК-15, два цирковірусу свиней мають тільки 68%-76% гомології в їхніх геномних послідовностях. Непатогенний ЦВС, отриманий з PK15, і патогенний ЦВС, отриманий при PMWS, були додатково ідентифіковані як цирковірус свиней 1 типу (ЦВС1) і цирковірус свиней 2 типу (ЦВС2), відповідно. Цирковірус свиней 2 типу (ЦВС2) також належить до родини Circoviridae. ЦВС2 являє собою вірус без оболонки, ікосаедричної форми, діаметром 17 нм з одноланцюговою кільцевою ДНК і відомий як один із найменших вірусів тварин. Кільцевий геном ЦВС2 містить точку початку реплікації зі структурою типу "стебло-петля", яка є загальною характеристикою цирковірусів. Геном ЦВС2 включає 1767 або 1768 нуклеотидів і, як передбачається, має 11 потенційних відкритих рамок зчитування (ORF). Серед 11 ORF ORF 1 та ORF 2, імовірно, є найбільш важливими генами, які кодують реплікацію білків (Rep та Rep’) та капсидний білок (Cap), відповідно. Капсидний білок (Cap), який кодується геном ORF2 ЦВС2, цілком імовірно, буде являти собою антиген, який індукує вироблення нейтралізуючих антитіл. Інфекція ЦВС2 поширена на більшості свиноферм у світі. Було виявлено, що ЦВС2 є причиною низьких рівнів виживання та низьких коефіцієнтів конверсії корму (FCR) в інфікованих свиней і призводить до великих економічних втрат у свинарстві. Отже, важливо розробити набори для аналізів на ЦВС2 і вакцину проти ЦВС2. Короткий опис винаходу Перший аспект даного винаходу стосується штаму ЦВС2, який був виділений зі свиней, у котрих проявлялись клінічні симптоми синдрому мультисистемного виснаження після відлучення (PMWS), та в подальшому досліджений та підтверджений як новий штам ЦВС2 (штам ЦВС2 H). Позитивний (+) ланцюг геному штаму ЦВС2 (штаму ЦВС2 H) має послідовність ДНК SEQ ID No: 1. Новий штам ЦВС2 був депонований у Китайському центрі колекції типових культур (CCTCC) 5 листопада 2011 року під номером доступу V201117. Другий аспект даного винаходу стосується імуногенної композиції, що містить новий штам ЦВС2 (штам ЦВС2 H). В одному переважному варіанті здійснення імуногенна композиція являє собою вакцину, що містить інактивований вірус або атенуйований вірус нового штаму ЦВС2 (штаму ЦВС2 H) і фармацевтично прийнятний носій. Однак типи вакцини включають без обмеження інактивовану вакцину, живу (атенуйовану) вакцину (через ослаблення вірусу), субодиничну вакцину, ДНК-вакцину та інші вакцини, отримані та вироблені на основі нового штаму ЦВС2 (штаму ЦВС2 H) або з ДНК або амінокислотних послідовностей нового штаму ЦВС2 (штаму ЦВС2 H). Спосіб інактивації (або обробка, яка інактивує) даного винаходу включає без обмеження обробку інактивуючим реагентом, теплову обробку та інші способи обробки, відомі фахівцеві в даній галузі. Інактивуючі реагенти включають без обмеження формальдегід, параформальдегід, бета-пропіолактон (BPL), бінарний етиленімін (BEI) або інші інактивуючі реагенти, придатні для даного винаходу. Фармацевтично прийнятні носії включають без обмеження розчинник, емульгатор, суспендуючу речовину, деструктор, зв’язувальну речовину, наповнювач, стабілізатор, хелатоутворювач, розріджувач, загусник, консервант, змащувальну речовину, поверхнево 1 UA 110632 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 активну речовину, ад’ювант або інші придатні носії. Ад’ювант включає без обмеження масляний ад’ювант (такий як мінеральне масло, рослинна олія, тваринний жир, повний ад’ювант Фрейнда, неповний ад’ювант Фрейнда і т.д.), водний ад’ювант (такий як гідроксид алюмінію), двофазний ад’ювант для утворення емульсій (такий як “вода в маслі у воді”, в/м/в, емульсійний ад’ювант), біологічний ад’ювант (такий як CpGoлігодеоксинуклеотид і токсоїд) і т.д. Двофазний ад’ювант для утворення емульсій включає поверхнево-активну речовину та маслянисту речовину. Поверхнево-активна речовина являє собою одну або декілька речовин, вибраних із групи, що включає складний ефір сорбіту та жирної кислоти; концентрат складного ефіру сорбіту і жирної кислоти та етиленоксиду (або пропіленоксиду); складний ефір маніту та жирної кислоти; концентрат складного ефіру маніту і жирної кислоти та етиленоксиду (або пропіленоксиду); складний ефір модифікованого маніту і жирної кислоти з гідрофільною групою, яка являє собою одну або декілька груп, вибраних з групи, що включає карбонову кислоту, амін, амід, спирт, поліол, простий ефір та оксид; складний ефір ангідроманіту та жирної кислоти; складний ефір модифікованого ангідроманіту та жирної кислоти з гідрофільною групою, яка являє собою одну або декілька груп, вибраних із групи, що включає карбонову кислоту, амін, амід, спирт, поліол, простий ефір та оксид; складний ефір сахарози та жирної кислоти; концентрат складного ефіру сахарози і жирної кислоти та етиленоксиду (або пропіленоксиду); складний ефір гліцерину та жирної кислоти; концентрат складного ефіру гліцерину і жирної кислоти та етиленоксиду (або пропіленоксиду); концентрат жирної кислоти та етиленоксиду (або пропіленоксиду); концентрат жирного спирту та етиленоксиду (або пропіленоксиду) і гліцерофосфоліпід. Масляниста речовина являє собою одну або декілька речовин, вибраних із групи, що включає мінеральне масло, рослинну олію та тваринний жир. Імуногенна композиція даного винаходу додатково містить щонайменше один антиген патогену. Антигени патогенів включають без обмеження антиген вірусу свинячого грипу (SIV), антиген вірусу репродуктивно-респіраторного синдрому свиней (PRRSV), антиген мікоплазми, антиген парвовірусу свиней (PPV), антиген бешихи свиней та антиген вірусу псевдосказу (хвороби Ауески). Типи антигенів патогенів включають без обмеження рекомбінантні білки, субодиничні білки, патогени з дефектом гена, антигени інактивованих патогенів і т.д. Третій аспект даного винаходу стосується способу захисту свиней від інфекції ЦВС2, який включає введення імунологічно ефективної дози зазначеної імуногенної композиції ЦВС2 свині для підвищення її імунітету проти інфекції ЦВС2, зменшення тяжкості вірусемії та клінічних симптомів, а також підвищення рівня виживання та маси тіла. Четвертий аспект даного винаходу стосується антитіла до ЦВС2, отриманого з нового штаму ЦВС2 (штаму ЦВС2 H). Антитіло включає без обмеження моноклональні антитіла, поліклональні антитіла та отримані способами генної інженерії антитіла. В одному переважному варіанті здійснення антитіло являє собою поліклональне антитіло, отримане через ін’єкцію тварині нового штаму ЦВС2 (штаму ЦВС2 H). В іншому переважному варіанті здійснення антитіло являє собою моноклональне антитіло, отримане через скринінг бібліотеки гібридом моноклональних антитіл. П'ятий аспект даного винаходу стосується фрагментів ДНК нового штаму ЦВС2 (штаму ЦВС2 H). Фрагменти ДНК мають нуклеотидні послідовності SEQ ID No: 1, 2, 4 та 6. Застосування фрагментів ДНК включають без обмеження виробництво ДНК-вакцини та субодиничної вакцини та конструювання праймерів або зондів для виявлення ЦВС2 у зразку. В одному переважному варіанті здійснення фрагмент ДНК являє собою послідовність повнорозмірного геному (SEQ ID No: 1) нового штаму ЦВС2 (штаму ЦВС2 H). В іншому переважному варіанті здійснення фрагменти ДНК являють собою відкриті рамки зчитування (ORF) нового штаму ЦВС2 (штаму ЦВС2 H), які включають без обмеження відкриту рамку зчитування 1 (ORF1), що має нуклеотидну послідовність SEQ ID No: 2, яка кодує амінокислотну послідовність SEQ ID No: 3, відкриту рамку зчитування 2 (ORF2), що має нуклеотидну послідовність SEQ ID No: 4, яка кодує амінокислотну послідовність SEQ ID No: 5, та відкриту рамку зчитування 3 (ORF3), що має нуклеотидну послідовність SEQ ID No: 6, яка кодує амінокислотну послідовність SEQ ID No: 7. Шостий аспект даного винаходу стосується набору для аналізу на ЦВС2. Набір для аналізу застосовується для виявлення ЦВС2 або антитіл до ЦВС2 у досліджуваному зразку. Набір для аналізу містить без обмеження (1) антиген нового штаму ЦВС2 (штаму ЦВС2 Н), в одному переважному варіанті здійснення, антиген нанесений на планшет з антигеном та інактивований інактивуючим реагентом; (2) моноклональне або поліклональне антитіло, отримане з нового штаму ЦВС2 (штаму ЦВС2 Н); (3) отриманий(е) способами генної інженерії антиген або 2 UA 110632 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 антитіло, одержані з послідовності повнорозмірного геному (SEQ ID No: 1) або нуклеотидних фрагментів (SEQ ID No: 2, 4 і 6) нового штаму ЦВС2 (штаму ЦВС2 Н); і (4) полінуклеотид, отриманий з послідовності повнорозмірного геному (SEQ ID No: 1) або нуклеотидних фрагментів (SEQ ID No: 2, 4 та 6) нового штаму ЦВС2 (штаму ЦВС2 Н). Полінуклеотид включає без обмеження праймери та зонди. В одному переважному варіанті здійснення полінуклеотид являє собою праймер, який може бути застосований для виявлення нового штаму ЦВС2 (штаму ЦВС2 Н), і при цьому праймери мають нуклеотидні послідовності SEQ ID No: 8-11. Типи набору для аналізу включають без обмеження набір для твердофазного імуносорбентного аналізу (ELISA), набір з мікрочіпом, набір для імунофлуоресцентного аналізу (IFA), набір для полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) та інші набори для аналізів, отримані на основі нового штаму ЦВС2 (штаму ЦВС2 Н). В одному переважному варіанті здійснення набір для аналізу містить щонайменше планшет з антигеном, який включає новий штам ЦВС2 (штам ЦВС2 Н), і при цьому набір для аналізу може застосовуватися для виявлення антитіл до ЦВС2 у досліджуваному зразку. Новий штам ЦВС2 (штам ЦВС2 Н) даного винаходу включає всі субкультивовані пасажі та мутанти, які мають подібні вірусні характеристики, геном або патогенність, як у нового штаму ЦВС2 (штаму ЦВС2 Н). Вирази “ДНК (нуклеїнова кислота)”, “полінуклеотид”, “амінокислота”, “пептид”, “поліпептид” у даному винаході можуть зустрічатися в природному, виділеному, рекомбінантному або синтетичному стані. Вирази “попередження”, “захист” і “проти” стосуються результатів спостереження, які порівнювали з результатами спостереження стосовно невакцинованих розкритою імуногенною композицією тварин, при цьому вакциновані розкритою імуногенною композицією тварини можуть мати підвищену здатність протистояти інфекції ЦВС2 і спорідненим захворюванням, що виникли в результаті інфекції ЦВС2. Значення технічних і наукових виразів, як описано в даному документі, може бути чітко зрозумілим фахівцем в даній галузі. Даний винахід більш докладно описаний в нижченаведених ілюстративних прикладах. Хоча приклади можуть представляти тільки вибрані варіанти здійснення даного винаходу, слід розуміти, що нижченаведені приклади є ілюстративними, а не обмежуючими. Короткий опис графічних матеріалів Фігура 1A: неінфіковані клітини PK-15, культивовані протягом 4 днів (масштаб (100×)); фігура 1B: клітини PK-15, інфіковані штамом ЦВС2 Н, культивовані протягом 4 днів (масштаб (100×)). Фігура 2: філогенетичний аналіз геномної послідовності штаму ЦВС2 Н. Фігура 3: вирівнювання амінокислотної послідовності ORF2 (SEQ ID No: 5) штаму ЦВС2 Н та трьох інших амінокислотних послідовностей, які мають найбільшу схожість послідовностей з амінокислотною послідовністю ORF2 штаму ЦВС2 Н у базі даних Genbank Національного центру біотехнологічної інформації (NCBI). Фігура 4: вирівнювання амінокислотної послідовності ORF2 штаму ЦВС2 Н та амінокислотної послідовності ORF2 (доступ в Genbank: ADD25772) прототипу ЦВС2 2d (доступ в Genbank: ZJ0955b). Фігура 5: результати ELISA ЦВС2 зразків сироватки, взятих у різні моменти часу в мишей, вакцинованих інактивованою вакциною на основі штаму ЦВС2 Н. Фігура 6: результати IFA ЦВС2 зразків сироватки, взятих у різні моменти часу в поросят, вакцинованих інактивованою вакциною на основі нового штаму ЦВС2 Н. Фігура 7: маси тіл поросят, вакцинованих інактивованою вакциною на основі штаму ЦВС2 Н. Докладний опис переважних варіантів здійснення Приклад 1. Виділення та ідентифікація ЦВС2 1. Джерело та виділення посівного вірусу Зразки тканини відбирали з легенів та лімфовузлів поросят на свинофермі в Синьчжу, Тайвань. У даних поросята 8-тижневого віку проявлялися клінічні симптоми синдрому мультисистемного виснаження після відлучення (PWMS). Зразки легенів та лімфовузлів збирали та заморожували при -70 °C. Для виділення вірусів зразки тканин гомогенізували, та 0,2 мл кожного гомогенату інокулювали в моношар клітин PK-15 або їх похідні клітинні лінії, які не містять цирковірус свиней (ЦВС), вірус класичної чуми свиней (CSFV), аденовірус свиней, парвовірус свиней, вірус репродуктивно-респіраторного синдрому свиней (PRRSV), вірус псевдосказу (PRV), вірус везикулярної хвороби свиней (SVDV), мікоплазму та бактерії. Після інкубування протягом 1 години при 37 °C, 5% CO2, клітини три рази відмивали стерильним фосфатно-буферним сольовим розчином (PBS). Потім протягом 4 годин клітини інкубували в середовищі MEM, яке 3 UA 110632 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 містило 2% FBS, при 37 °C, 5% CO2. Після цього середовище MEM видаляли та клітини інкубували з 300 мM D-глюкозаміну протягом 30 хвилин. Потім клітини три рази відмивали стерильним PBS та інкубували протягом 72 годин у середовищі MEM, яке містило 8% FBS, при 37 °C, 5% CO2. Наприкінці культури клітин досліджували на ЦВС2 за допомогою імунофлуоресцентного аналізу (IFA). Протокол IFA описаний наступним чином. По-перше, клітини зразків три рази відмивали стерильним PBS, 5 хвилин щоразу, і фіксували за допомогою 75 мкл 80% ацетону протягом 30 хвилин при 4 °C. Потім ацетон видаляли та клітини відмивали три рази стерильним PBS, 5 хвилин щоразу. Після цього клітини інкубували з 75 мкл противірусної поліклональної імунної сироватки до цирковірусу свиней (VMRD) (первинне антитіло, розведення 1:1500 в PBS) протягом 30 хвилин при 37 °C. Потім видаляли імунну сироватку та клітини відмивали три рази стерильним PBS, 5 хвилин щоразу. Після цього клітини інкубували з 75 мкл кон’югату FITC-IgG кроля до антитіла свині (ціла молекула) (Sigma, F1638) (вторинне антитіло, розведення 1:1000 в PBS) протягом 30 хвилин при 37 °C. Потім антитіло видаляли та клітини відмивали три рази стерильним PBS, 5 хвилин щоразу. Наприкінці кожний зі зразків клітин в 96-лунковому культуральному планшеті поміщали в 200 мкл PBS для флуоресцентного мікроскопічного дослідження. Вірус, який інфікував клітини та дав найбільшу кількість позитивних результатів IFA, вибирали в якості посівного вірусу. Потім визначали геномну послідовність посівного вірусу, як зазначено в SEQ ID No: 1. Послідовність вирівнювали, аналізували та наприкінці затверджували в якості нового штаму ЦВС2 (аналізи та результати вирівнювання послідовності описані нижче). Даний новий штам ЦВС2 назвали штамом ЦВС2 Н. 2. Пересівання посівного вірусу Свіжоотримані клітини PK-15 або їх похідні клітинні лінії інокулювали новим штамом ЦВС2 (штамом ЦВС2 Н), та вірус, отриманий з інокульованих клітин, являв собою пасаж 1 (P 1) штаму ЦВС2 Н. Супернатант культури клітин, який містив P1 штаму ЦВС2 Н, збирали, розводили (1:2) та інокулювали у свіжоотримані клітини PK-15 або їх похідні клітинні лінії. Після цього інокульовані клітини інкубували протягом 3 днів, супернатант культури клітин, який містив пасаж 2 (P2) штаму ЦВС2 Н, збирали, розводили (1:2) та інокулювали у свіжоотримані клітини PK-15 або їх похідні клітинні лінії. Інокульовані клітини інкубували протягом 3 днів і надалі збирали супернатант культури клітин, який містив пасаж 3 (P3) штаму ЦВС2 Н. Процес повторювали ще три рази для одержання пасажу 6 (P6) штаму ЦВС2 Н. Під час процесу культивування клітин PK-15 або їх похідних клітинних ліній, які інокульовані штамом ЦВС2 Н, в інокульованих клітинах спостерігали цитопатичний ефект (CPE), як показано на фіг. 1B. Крім того, на фіг. 1A показана морфологія та ріст неінокульованих клітин PK-15 через 4 дні культивування (100x), тоді як на фіг. 1B показана морфологія та ріст інокульованих штамом ЦВС2 Н клітин PK-15 через 4 дні культивування (100x). Подібним чином, CPE, спостережуваний у похідних клітинних лініях PK-15, які інокульовані штамом ЦВС2 Н, на фіг. 1B може бути наведений для порівняння. 3. Ідентифікація посівного вірусу Геном штаму ЦВС2 Н, виділеного в даному винаході, має нуклеотидну послідовність SEQ ID No: 1. Нуклеотидну послідовність SEQ ID No: 1 порівнювали з послідовностями в базі даних Genbank Національного центру біотехнологічної інформації (NCBI). Результати порівняння показали, що штам ЦВС2 Н був на 99% гомологічним деяким послідовностям ЦВС2 (таблиця 1), але в базі даних не було послідовності, ідентичної (гомологічної на 100%) геномній послідовності штаму ЦВС2 Н (SEQ ID No: 1). Таким чином, на підставі результатів вирівнювання показано, що вірус, виділений у даному винаході, штам ЦВС2 Н, належить до родини ЦВС2 і є новим штамом. На підставі філогенетичного аналізу геномної послідовності штаму ЦВС2 Н, представленого на фіг. 2, показано, що штам ЦВС2 Н є членом підгрупи ЦВС2 2d. 50 4 UA 110632 C2 Таблиця 1 Результати порівняння геномної ДНК штаму ЦВС2 Н та послідовностей у базі даних Genbank NCBI із застосуванням NCBI BLAST Номер доступу HM038017.1 GU001710.1 EF675230.1 GU083583.1 GQ359002.1 FJ644929.1 FJ426398.1 HM038030.1 HM161710.1 5 10 15 20 25 30 35 Максимальний показник Максимальна ідент. 3236 99% 3236 3236 99% 3236 3236 99% 3230 3230 99% 3230 3230 99% 3230 3230 99% 3230 3230 99% 3229 3229 99% 3225 цирковірус свиней 2, штам BDH цирковірус свиней 2, ізолят BJ0901b цирковірус свиней 2, штам GXHZ-1 цирковірус свиней 2, ізолят ЦВС2C53 цирковірус свиней 2, штам GX0839 цирковірус свиней 2, ізолят GL08 цирковірус свиней 2, штам GXWZ-1 цирковірус свиней 2, штам AH цирковірус свиней 2, ізолят BX-2 Сумарний показник 3236 Опис 3225 99% Аналіз показує, що штам ЦВС2 Н даного винаходу має відкриті рамки зчитування (ORF) 1, 2 та 3. ORF1 має нуклеотидну послідовність SEQ ID No: 2, яка кодує амінокислотну послідовність SEQ ID No: 3. ORF2 має нуклеотидну послідовність SEQ ID No: 4, яка кодує амінокислотну послідовність SEQ ID No: 5. ORF3 має нуклеотидну послідовність SEQ ID No: 6, яка кодує амінокислотну послідовність SEQ ID No: 7. Оскільки капсидний білок, який кодується геном ORF2 ЦВС2, цілком імовірно, був би антигеном, який індукує вироблення нейтралізуючих антитіл, то нуклеотидну послідовність (SEQ ID No: 4) та амінокислотну послідовність (SEQ ID No: 5) ORF2 штаму ЦВС2 Н порівнювали з послідовностями в базі даних Genbank NCBI. Результати порівняння показали, що в базі даних Genbank NCBI немає послідовності, ідентичної (гомологічної на 100%) нуклеотидній послідовності (SEQ ID No: 4) або амінокислотній послідовності (SEQ ID No: 5) ORF2 штаму ЦВС2 Н. Найбільша гомологія між амінокислотною послідовністю ORF2 штаму ЦВС2 Н (SEQ ID No: 5) і послідовностями в базі даних Genbank складає 98%. На фіг. 3 показане вирівнювання амінокислотної послідовності ORF2 штаму ЦВС2 Н (SEQ ID No: 5) і верхні три послідовності з найбільшою гомологією, при цьому вирівнювання вказує на те, що 6 амінокислот SEQ ID No: 5 відрізняються від верхніх трьох послідовностей. Амінокислотну послідовність (SEQ ID No: 5) ORF2 штаму ЦВС2 Н додатково порівнювали з амінокислотною послідовністю (доступ в Genbank: ADD25772) ORF2 прототипу ЦВС2 підгрупи 2d (доступ в Genbank: ZJ0955b), і результати, показані на фіг. 4, вказують на те, що у двох послідовностях відрізняються 7 амінокислот, і дві послідовності мають гомологію 97%. На додаток, нуклеотидні послідовності (SEQ ID No: 2 і 6) та амінокислотні послідовності (SEQ ID No: 3 і 7) ORF1 та ORF3 штаму ЦВС2 Н порівнювали з послідовностями в базі даних Genbank NCBI. Результати порівняння показали, що в базі даних Genbank NCBI немає послідовності, ідентичної (гомологічної на 100%) нуклеотидним послідовностям або амінокислотним послідовностям ORF1 або ORF3 штаму ЦВС2 Н. Дослідження вказують на те, що штам ЦВС2 Н даного винаходу є новим штамом цирковірусу свиней 2 типу (ЦВС2). Новий штам ЦВС2 був депонований у Китайському центрі колекції типових культур (CCTCC) 5 листопада 2011 року під номером доступу V201117. Приклад 2. Одержання вакцини на основі штаму ЦВС2 Н 1. Культивування вірусу Клітини PK-15, які не містили цирковірус свиней (ЦВС), вірус класичної чуми свиней (CSFV), аденовірус свиней, парвовірус свиней, вірус репродуктивно-респіраторного синдрому свиней (PRRSV), вірус псевдосказу (PRV), вірус везикулярної хвороби свиней (SVDV), мікоплазму та 5 UA 110632 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 бактерії, культивували в ростовому середовищі для культур клітин (середовище MEM, що містило 5% FBS, pH 7,2±0,2) при 37 °C, 5% CO2. Після утворення моношару клітин PK-15 клітини PK-15 розділяли 0,2% трипсином-ЕДТА та суспендували в підтримуючому середовищі для культур клітин (середовище MEM, що містило 2% FBS, pH 7,4±0,2) для підрахунку клітин. Потім клітини розбавляли ростовим середовищем для культури клітин до кінцевої концентрації 5 3,0×10 клітин/мл та розподіляли по ролер-флаконам для культивування протягом 3~4 днів при 37 °C, щоб досягти моношару, що злився. Після цього середовище для культур клітин видаляли з ролер-флаконів і клітини відмивали PBS. Вихідний розчин вірусу штаму ЦВС2 Н розводили 4,0 підтримуючим середовищем для культур клітин до кінцевої концентрації 10 TCID50/мл та інокулювали ним моношари клітин РK-15 у ролер-флаконах. Для культивування вірусу інфіковані клітини інкубували протягом 48~96 годин при 37 °C. Титр вірусу штаму ЦВС2 Н контролювали за допомогою імунофлуоресцентного аналізу (IFA). Потім для отримання розчину 6,0 вірусу штаму ЦВС2 Н збирали супернатант культур клітин, коли титр вірусу досягав 10 TCID50/мл або вище, або коли цитопатичний ефект (CPE) досягав 70% ~ 80%. 2. Спосіб інактивації Тридцять сім відсотків (37%, за вагою) формальдегіду додавали до розчину вірусу штаму ЦВС2 Н, отриманого на вищевказаному етапі, до кінцевої концентрації 0,2% (вага/об’єм), а потім вірус інактивували шляхом безперервного струшування з формальдегідом протягом щонайменше 24 годин, переважно 48 годин, при 37 °C. Після того, як вірус був повністю інактивований, розчин вірусу штаму ЦВС2 Н, що містив формальдегід, центрифугували для видалення формальдегіду. Потім центрифугований розчин вірусу суспендували в буферному розчині, такому як дистильована вода або фосфатно-буферний сольовий розчин (PBS), і суспендований розчин вірусу, що являв собою інактивований вихідний розчин антигену інактивованої вакцини на основі штаму ЦВС2 Н, зберігали при 4 °C для подальшого застосування. 3. Одержання інактивованої вакцини на основі штаму ЦВС2 Н Стерилізований двофазний ад’ювант для утворення емульсій, такий як масляний ад’ювант TM вакцини MONTANIDE ISA 206 для емульсії вода в маслі у воді (в/м/в), додавали до інактивованого вихідного розчину антигену інактивованої вакцини на основі штаму ЦВС2 Н до кінцевої концентрації 50% (об’єм/об’єм) в резервуарі для емульсії для змішування та емульгування. Емульгований продукт являє собою інактивовану вакцину на основі штаму ЦВС2 Н з маслом-ад’ювантом. Інші придатні ад’юванти для інактивованої вакцини ЦВС2 даного винаходу, відомі фахівцям у даній галузі, також можуть застосовуватися в даному винаході в якості ад’ювантів. Двофазний ад’ювант для утворення емульсій (такий як емульсійний ад’ювант вода в маслі у воді), застосовуваний у даному прикладі, може бути замінений без обмеження масляним ад’ювантом (таким як мінеральне масло, рослинна олія, тваринний жир, повний ад’ювант Фрейнда, неповний ад’ювант Фрейнда і т.д.), водним ад’ювантом (таким як гідроксид алюмінію) або біологічним ад’ювантом (таким як CpG-олігодеоксинуклеотид та токсоїд). Приклад 3. Одержання набору для аналізу на ЦВС2 - 1 Набір для аналізу на ЦВС2 у даному прикладі являє собою планшет з антигеном, що містить вірусний антиген штаму ЦВС2 Н. По-перше, клітини PK-15 або їх моноклональні клітинні лінії культивували, трипсинізували та повторно суспендували в середовищі для культур клітин при 5 кінцевій концентрації 2×10 клітин/мл. П'ятдесят мікролітрів (мкл) клітин PK-15 та 50 мкл 3 вихідного розчину вірусу штаму ЦВС2 Н (1×10 TCID50/мл) додавали в кожну лунку 96-лункового планшета для культур клітин (плоске дно) та інкубували протягом 72 годин при 37 °C, 5% CO2. Клітини, інфіковані штамом ЦВС2 Н, двічі відмивали стерильним PBS та фіксували 80% ацетоном протягом 15 хвилин при кімнатній температурі. Потім видаляли ацетон і три рази відмивали клітини стерильним PBS. Після цього планшет перевертали і потім просушували в термостаті при 37 °C. Просушений планшет являє собою планшет з антигеном, що містить вірусний антиген штаму ЦВС2 Н, і може бути використаний в аналізі ELISA для визначення кількості антитіл до ЦВС2 у зразку сироватки. Потім планшет зберігали при -20 °C для подальшого застосування (Tischer зі співавт., 1995). Приклад 4. Одержання набору для аналізу на ЦВС2 - 2 Набір для аналізу на ЦВС2 у даному прикладі являє собою планшет з антигеном, що містить рекомбінантний капсидний білок штаму ЦВС2 Н. Рекомбінантний капсидний білок являє собою антиген планшета з антигеном. Капсидний білок кодується геном ORF2 штаму ЦВС2 Н та має амінокислотну послідовність SEQ ID No: 5. Нуклеотидну послідовність ORF2 штаму ЦВС2 Н спочатку ампліфікували шляхом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Вірусну ДНК штаму ЦВС2 Н застосовували в якості 6 UA 110632 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 матричної ДНК у реакції ПЛР. Прямий праймер і зворотний праймер конструювали для ампліфікації нуклеотидної послідовності ORF2. Прямий праймер у даному прикладі має сайт розщеплення HindIII, а зворотний праймер у даному прикладі має сайт розщеплення Xho I. Праймери можуть бути сконструйовані фахівцями в даній галузі згідно нуклеотидної послідовності ORF2 (SEQ ID No: 4) даного винаходу. Для реакції ПЛР ПЛР-суміш, що містила 8 мкл матричної ДНК, 5 мкл 10x буфера ПЛР (MDBio, Inc.), 8 мкл dNTP (кожного по 1,25 мM), 1 мкл кожного праймера (кожного по 50 мкM) і 0,5 мкл Pfu ДНК-полімерази (MDBio, Inc.), у кінцевому об’ємі 50 мкл поміщали в реактор GeneAmp PCR System 2400 (Applied Biosystems). Реакцію ПЛР починали з вихідного етапу попереднього нагрівання ПЛР-суміші при 95 °C протягом 5 хвилин та ампліфікацію ДНК виконували за 25 циклів при наступних параметрах: денатурування при 95 °C протягом 30 секунд, відпалювання при 55 °C протягом 30 секунд і подовження при 72 °C протягом 30 секунд. Реакцію ПЛР завершили етапом кінцевого добудування протягом 5 хвилин при 72 °C. Продукти ПЛР очищали за допомогою набору для PCR-M Clean Up (Viogen). Після очищення продукти ПЛР вбудовували у вектор експресії pET24a. Очищені продукти ПЛР та вектор експресії pET24a (Novagen) розщеплювали двома ферментами рестрикції (New England Biolabs), Hind III і Xho I, відповідно, протягом 8 годин при 37 °C. Після реакції розщеплення ферментами рестрикції розщеплені продукти ПЛР та вектор експресії pET24a очищали за допомогою набору для PCR-M Clean Up (Viogen), відповідно. Очищені продукти ПЛР пришивали до очищеного вектора експресії pET24a і продукт зшивання трансформували в клітину-хазяїна (E. coli). Відбирали трансформанти, а клон з відповідною послідовністю ідентифікували шляхом секвенування ДНК і позначили як рET24a-ORF2. Бактерії з pET24a-ORF2 культивували в 2 мл бульйону LB протягом 16-18 годин при 37 °C, а потім культуру додавали у свіжий бульйон LB, що містив 25 мкг/мл канаміцину, у співвідношенні 1:50 і культивували при 37 °C, 200 об./хв. Коли оптична густина культури при довжині хвилі 600 нм (OD600) досягала 0,6, то в культуру додавали ізопропіл--D-тіогалактозид (IPTG) до кінцевої концентрації 1 мM та інкубували культуру ще протягом 6 годин при 37 °C, 200 об./хв. Один мілілітр культури центрифугували (10000 x g) і потім за допомогою B-PERTM Bacterial Protein Extraction (Pierce Protein Research Produces) визначали, були рекомбінантні білки розчинними білками чи вірусним включенням. Сорок мікролітрів (мкл) реагенту додавали до центрифугованих бактерій та збовтували на вихровій мішалці протягом 1 хвилини. Суміш потім центрифугували при 10000 x g. Білки, суспендовані в супернатанті, являли собою розчинні білки, тоді як білки в нижній частині (осад) являли собою вірусні включення. Розчинні білки розчиняли в 1x буфері для зразка для аналізу SDS-PAGE, тоді як вірусні включення змішували з 2x буфером для зразка для аналізу SDS-PAGE. Обидва зразки кип'ятили протягом 20 хвилин і потім центрифугували. Білки в супернатанті обох зразків розділяли за допомогою 15% SDSPAGE для аналізу експресії рекомбінантного капсидного білка штаму ЦВС2 Н. Після аналізів рекомбінантні капсидні білки штаму ЦВС2 Н застосовували для отримання планшетів з антигеном. Рекомбінантний капсидний білок штаму ЦВС2 Н розводили PBS (pH 9,6) до кінцевої концентрації 10 мкг/мл. Розведений рекомбінантний білок наносили на 96-лунковий планшет для культури клітин (плоске дно) (100 мкл/лунка) при 37 °C протягом 2 годин та потім при 4 °C протягом ночі. Після цього кожну лунку планшета відмивали три рази PBS протягом 3-5 хвилин і додавали 200 мкл 0,15% блокувального розчину BSA для блокування рекомбінантного білка протягом 2 годин при 37 °C. Потім кожну лунку планшета відмивали PBS і планшет зберігали при 4 °C для подальшого застосування. Приклад 5. Одержання антитіл до штаму ЦВС2 Н 1. Поліклональні антитіла до штаму ЦВС2 Н Інактивований штам ЦВС2 Н з достатнім титром вірусу змішували з придатним ад’ювантом, таким як повний ад’ювант Фрейнда. Насамперед сумішшю заражали тварин, таких як миші, свині, кози та кролики, а за необхідності після відповідного періоду часу (такого як 2-3 тижні) можна було провести другу імунізацію. Після ще одного відповідного періоду часу (такого як 2-3 тижні) сироватку заражених тварин збирали як поліклональні антитіла до штаму ЦВС2 Н. За необхідності поліклональні антитіла до штаму ЦВС2 Н можуть бути кон’юговані з хромогенними або флуоресцентними репортерами. За необхідності заражені тварини можуть бути додатково вакциновані для підвищення титру антитіл після першої або другої імунізації. Тварини, які можуть бути заражені для вироблення поліклональних антитіл до штаму ЦВС2 Н, включають без обмеження мишей, кроликів, птахів (яйця), свиней, кіз, велику рогату худобу та водних тварин. 7 UA 110632 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2. Моноклональні антитіла до штаму ЦВС2 Н Інактивованим штамом ЦВС2 Н з достатнім титром вірусу або специфічним фрагментом антигену (наприклад, ORF2) штаму ЦВС2 Н в першу чергу заражали тварину (таку як миша). За необхідності інактивований вірус або фрагмент антигену може бути змішаний з придатним ад’ювантом, таким як повний ад’ювант Фрейнда. Також за необхідності після відповідного періоду часу (такого як 2-3 тижні) може бути проведена друга імунізація. Після ще одного відповідного періоду часу (такого як 2-3 тижні) сироватку зараженої тварини брали для оцінки, чи були клітини селезінки тварини придатними для вироблення моноклональних антитіл до штаму ЦВС2 Н. Злиття придатних клітин селезінки, взятих у заражених тварин, і клітин мієломи (таких як клітинна лінія FO та клітинна лінія NS) здійснювали із застосуванням поліетиленгліколю (PEG, такого як PEG1500). Гібридоми, які виробляють антитіла відповідної специфічності, відбирали зі злитих клітин і потім субклонували для того, щоб вони стали гібридомами, які придатні для вироблення моноклональних антитіл до штаму ЦВС2 Н. Моноклональні антитіла до штаму ЦВС2 Н можна застосовувати в наборах для аналізів, при лікуванні або в харчовій або кормовій добавці для підвищення імунітету у тварин. Приклад 6. Випробування ефективності інактивованої вакцини на основі ЦВС2 - 1 1. Протокол вакцинації та забір зразків Мишей Balb/c п’ятитижневого-шеститижневого віку без особливих патогенів (SPF) довільно розподіляли на 4 групи по 15 мишей у кожній. Аналіз ELISA показав, що всі 60 мишей були негативні відносно антитіл до ЦВС2. Мишам з 3 вакцинних груп (груп 1-3) робили внутрішньом’язову ін’єкцію інактивованої вакцини на основі штаму ЦВС2 Н по 0,2 мл з 3 різних партій, відповідно. Через два тижні після першої імунізації (p.i.) мишей з 3 вакцинних груп повторно імунізували такою самою дозою вакцини з 3 різних партій. Мишей із групи 4 не вакцинували, і вони служили в якості негативного контролю. На 2, 3, 4 та 5 тижні після першої імунізації (p.i.) випадково відбирали по 5 мишей з кожної групи для забору зразків сироватки. Усі зразки сироватки аналізували за допомогою ELISA. 2. Виявлення антитіл до ЦВС2 за допомогою ELISA Планшети з антигеном, отримані в прикладі 3 або 4, у даному прикладі можуть застосовуватися в якості планшетів для ELISA. Планшети для ELISA промивали 3 рази 50 ммоль/л PBS (pH 7,2), що містив 500 мкл/л Tween-20 (тобто PBST), щоразу протягом 3-5 хвилин. Для блокування планшетів для ELISA у кожну лунку планшетів для ELISA додавали по 200 мкл 0,15% блокувального розчину BSA, а потім планшети для ELISA інкубували протягом 2 годин при 37 °C. Після цього планшети для ELISA промивали PBS. Зразки сироватки мишей розводили в п'ятдесят разів (1:50) за допомогою PBS, а потім виконували послідовні 2-разові розведення. Розведені зразки сироватки додавали в лунки планшетів для ELISA (100 мкл/лунка) і планшети інкубували протягом 1 години при 37 °C. Після інкубування планшети промивали PBS. Потім у лунки додавали вторинне антитіло (таке як вторинне антитіло кролика до антитіла миші), кон’юговане з пероксидазою хріну (HRP). Після інкубування протягом 1 години при 37 °C планшети промивали PBS. Для візуалізації результатів у лунки додавали 3,3’,5,5’тетраметилбензидин (TMB). Після інкубування реакцію зупиняли шляхом додавання 2 мM H2SO4. Результати представляли як співвідношення позитивних-негативних (P/N). Співвідношення P/N розраховували шляхом ділення оптичної густини при 450 нм (OD 450) даного досліджуваного зразка на OD450 стандартного негативного контролю. Співвідношення P/N ≥ 2,1 вважали позитивними. Максимальними значеннями розведень співвідношень P/N ≥ 2,1 вважали титри антитіл з ELISA зразків сироватки. На додаток до HRP і TMB у даному прикладі також можна застосовувати інші хромогенні репортери або флуоресцентні мітки з такою самою функцією, такі як лужна фосфатаза (AP), 4метилумбеліферилфосфат (4-MUP) та флуоресцеїнізотіоціанат (FITC). 3. Результати Через 2 тижні після першої імунізації (p.i.) антитіла до штаму ЦВС2 Н виявили у всіх вакцинованих мишей. Після другої імунізації титри антитіл з ELISA у вакцинованих мишей досягали 1800-2000 на 35-й день після першої імунізації (d.p.i.) (фіг. 5). Отже, результати вказували на те, що інактивована вакцина на основі штаму ЦВС2 Н даного винаходу була здатна ефективно індукувати імунні відповіді в мишей. Приклад 7. Випробування ефективності інактивованої вакцини на основі ЦВС2 - 2 1. Протокол вакцинації та забір зразків Двом здоровим поросятам 5-6-тижневого віку робили внутрішньом’язову ін’єкцію 1 мл інактивованої вакцини на основі штаму ЦВС2 Н, відповідно. Через три тижні після першої імунізації (p.i.) поросят повторно імунізували такою самою дозою вакцини. Зразки сироватки брали в обох поросят перед першою імунізацією (5-6-тижневий вік), перед другою імунізацією 8 UA 110632 C2 5 10 15 20 25 (8-9-тижневий вік) і через 2 тижні після другої імунізації (10-11-тижневий вік). Обох поросят зважували в ті самі моменти часу, у які брали сироватку. Усі зразки сироватки аналізували за допомогою ELISA. 2. Виявлення антитіл до ЦВС2 за допомогою ELISA Планшети з антигеном, отримані в прикладі 3 або 4, у даному прикладі можуть застосовуватися в якості планшетів для ELISA. Планшети для ELISA промивали 3 рази 50 ммоль/л PBS (pH 7,2), що містив 500 мкл/л Tween-20 (тобто PBST), щоразу протягом 3-5 хвилин. Для блокування планшетів для ELISA у кожну лунку планшетів для ELISA додавали по 200 мкл 0,15% блокувального розчину BSA, а потім планшети для ELISA інкубували протягом 2 годин при 37 °C. Після цього планшети для ELISA промивали PBS. Зразки сироватки свиней розводили в п'ятдесят разів (1:50) за допомоги PBS, а потім виконували послідовні 2-разові розведення. Розведені зразки сироватки додавали в лунки планшетів для ELISA (100 мкл/лунка) і планшети інкубували протягом 1 години при 37 °C. Після інкубування планшети промивали РBS. Потім у лунки додавали вторинне антитіло (таке як вторинне антитіло кози до антитіла свині), кон’юговане з пероксидазою хріну (HRP). Після інкубування протягом 1 години при 37 °C планшети промивали PBS Для візуалізації результатів у лунки додавали 3,3’,5,5’тетраметилбензидин (TMB). Після інкубування реакцію зупиняли шляхом додавання 2 мM H2SO4. Результати представляли як співвідношення позитивних-негативних (P/N). Співвідношення P/N розраховували шляхом ділення оптичної густини при 450 нм (OD 450) даного досліджуваного зразка на OD450 стандартного негативного контролю. Співвідношення P/N ≥ 2,1 вважали позитивними. Максимальними значеннями розведень співвідношень P/N ≥ 2,1 вважали титри антитіл з ELISA зразків сироватки. 3. Результати Через 3 тижні після першої імунізації (p.i.) антитіла до штаму ЦВС2 Н виявили в обох вакцинованих поросят. Через 2 тижні після другої імунізації титри антитіл з ELISA у вакцинованих поросят складали більше 11000 (таблиця 2). Отже, результати вказували на те, що інактивована вакцина на основі штаму ЦВС2 Н даного винаходу була здатна ефективно індукувати імунні відповіді в мишей. Таблиця 2 Титри антитіл у вакцинованих поросят згідно ELISA Момент часу Перед першою імунізацією Перед другою імунізацією забору зразків (5-6-тижневий вік) (8-9-тижневий вік) Порося 1 Порося 2 1 1 8,490 10,263 Через 2 тижні після другої імунізації (10-11-тижневий вік) 11,728 13,065 30 35 40 Приклад 8. Випробування ефективності інактивованої вакцини на основі ЦВС2 - 3 1. Протокол вакцинації та забір зразків Сорок здорових поросят 2-тижневого віку випадково розподіляли на 4 групи по 10 поросят у кожній. У віці 3 тижнів поросятам з 3 вакцинних груп (груп 1-3) робили внутрішньом’язову ін’єкцію інактивованої вакцини на основі штаму ЦВС2 Н по 1 мл із 3 різних партій, відповідно. Через три тижні після першої імунізації (p.i.) поросят повторно імунізували такою самою дозою вакцини. Поросят із групи 4 не вакцинували, і вони служили в якості негативного контролю. Зразки сироватки брали у всіх поросят за 1 тиждень до першої імунізації (2-тижневий вік) і на 1, 2, 3 та 5 тижнях після першої імунізації (4-, 5-, 6- та 8-тижневий вік, відповідно). Всіх поросят зважували у віці 3, 4, 5, 6 та 8 тижнів. Усі зразки сироватки аналізували за допомогою ELISA. 9 UA 110632 C2 Таблиця 3 Схема вакцинації та забору зразків Вік (тижні) 2 3 4 5 6 8 Перша вакцинація Друга вакцинація Тест 1 Взяття крові, IFA Взяття крові, IFA Взяття крові, IFA Взяття крові, IFA Взяття крові, IFA Тест 2 Вакцинація 5 10 15 20 Зважування Зважування Зважування Зважування Зважування 2. Виявлення антитіл до ЦВС2 за допомогою IFA Планшети з антигеном, отримані в прикладі 3, застосовували в даному прикладі. Планшети з антигеном брали з -20 °C для відтавання та просушували при 37 °C. Зразки сироватки свиней розводили в п'ятдесят разів (1:50) за допомогою PBS, а потім виконували послідовні 2-разові розведення. Розведені зразки сироватки додавали в лунки планшетів з антигеном (50 мкл/лунка) і планшети інкубували протягом 30 хвилин при 37 °C. Після інкубування планшети промивали 3 рази PBS для видалення необ'єднаних антитіл. Потім у лунки додавали п'ятдесят мікролітрів (50 мкл) IgG кролика до антитіла свині, кон’югованого з FITC (1:100, Sigma). Після інкубування в темряві протягом 30 хвилин планшети промивали 3 рази PBS і розглядали під флуоресцентним мікроскопом для підрахунку титру антитіл до штаму ЦВС2 Н (Rodriguez-Arrioja зі співавт., 2000). 3. Результати 3.1 Титр антитіл Через 2 тижні після першої імунізації (p.i.) зразки сироватки вакцинованих поросят (у віці 5 тижнів) згідно IFA мали титри приблизно 600, тоді як зразки сироватки контрольної групи згідно IFA мали титри приблизно 200 (таблиця 4 та фіг. 6). Після другої імунізації згідно IFA титри у вакцинованих поросят (у віці 6 тижнів) різко підвищувалися (згідно IFA титри складали більше 13000). У вакцинованих поросят у віці 8 тижнів титри згідно IFA складали більше 46000, тоді як у невакцинованих поросят титри згідно IFA були дуже низькими, приблизно 170. Таблиця 4 Титри антитіл до штаму ЦВС2 Н у вакцинованих поросят згідно IFA Вік (тижні) 4 5 6 8 група 1 800 200 600 13440 48640 група 2 1680 230 620 20800 46720 група 3 1100 220 650 18660 49760 група 4 (контроль) 25 2 1880 210 190 300 170 3.2. Приріст маси Вакциновані поросята мали більш високий приріст маси, ніж невакциновані поросята в контрольній групі (таблиця 5 і фіг. 7). У віці 8 тижнів вакциновані поросята були приблизно на 2 кг важчими за невакцинованих поросят. 10 UA 110632 C2 Таблиця 5 Маси тіл невакцинованих поросят (кг) Вік (тиждень) 25 30 35 40 45 8 8,4461 9,9512 12,4207 16,1756 20,5284 7,3718 9,064 11,7594 15,2267 20,3755 7,9564 9,5413 12,3461 15,8561 20,4345 група 4 (контроль) 20 6 група 3 15 5 група 2 10 4 група 1 5 3 7,5906 8,9899 11,724 12,9102 18,6059 Отже, результати вказували на те, що інактивована вакцина на основі штаму ЦВС2 Н даного винаходу була здатна ефективно індукувати імунні відповіді у свиней, підвищувати імунітет у свиней і, таким чином, збільшувати приріст маси у свиней. Приклад 9. Випробування ефективності інактивованої вакцини на основі ЦВС2 - 4 1. Протокол вакцинації та інфікування ЦВС2 Поросят у віці чотирнадцяти-шістнадцяти днів випадково розподіляли на 4 групи по 5 поросят у кожній. Усі 20 поросят були негативні відносно антитіл до ЦВС2. Поросятам з 3 вакцинних груп (груп 1-3) робили внутрішньом’язову ін’єкцію інактивованої вакцини на основі штаму ЦВС2 Н по 1 мл з 3 різних партій, відповідно. Через два тижні після першої імунізації (p.i.) поросят повторно імунізували такою самою дозою вакцини. Поросята із групи 4 були невакцинованими та служили в якості негативного контролю. Через 5 тижнів після першої імунізації проводили контрольне зараження всіх поросят вихідним розчином вірусу штаму ЦВС2 6,0 6,0 Н (вірулентного штаму) у дозі 10 дозу зараження 50% культури тканини на мл (10 TCID50/мол). Проводили контрольне зараження кожного поросяти інтраназально 1 мл вихідного розчину вірусу та внутрішньом’язово 2 мл вихідного розчину вірусу. Зразки сироватки та мазків з носа відбирали через 7, 11, 19 і 25 днів після контрольного зараження для виявлення вірусемії ЦВС2 за допомогою ПЛР. 2. Виявлення вірусемії ЦВС2 за допомогою ПЛР Рівні вірусної ДНК у взятих після контрольного зараження ЦВС2 зразках сироватки свиней визначали із застосуванням ПЛР. Вірусну ДНК виділяли за допомогою реагенту DNAzol®. Спершу до 200 мкл сироватки додавали 400 мкл реагенту DNAzol® і суміш центрифугували при 12000 об./хв. протягом 15 хвилин. Супернатант змішували з подвійним об’ємом абсолютного етанолу для преципітації ДНК. Потім суміш центрифугували при 12000 об./хв. протягом 15 хвилин і видаляли супернатант. Осад ДНК відмивали 75% етанолом, центрифугували при 12000 об./хв. протягом 15 хвилин для видалення етанолу та зрештою розчиняли у 8 мM NaOH. Праймери для ПЛР, застосовувані для виявлення вірусемії ЦВС2, мають наступні послідовності ЦВС2-F1:5’ GTGAAGTGGTATTTTGGTGCC 3’ (SEQ ID No: 8), ЦВС2-R1:5’ GTCTTCCAATCACGCTTCTGC 3’ (SEQ ID No: 9). Праймери ЦВС2-F1 (прямий) і ЦВС2-R1 (зворотний) застосовували для ампліфікації фрагмента з 284 п.о. із ORF1 ЦВС2. ПЛР-суміш із кінцевим об’ємом 25 мкл містила 1 мкл 2+ прямих праймерів, 1 мкл зворотних праймерів, 1,5 мкл 25 мM Mg , 2,0 мкл 2,5 мM dNTP, 2,5 2+ мкл 10× буфера, що не містив Mg , 0,2 мкл Taq ДНК-полімерази, 11,8 мкл дистильованої води та 5 мкл матричної ДНК. Реакцію ПЛР починали з вихідного етапу попереднього нагрівання ПЛР-суміші при 95 °C протягом 5 хвилин та ампліфікацію ДНК виконували за 38 циклів при наступних параметрах: денатурування при 94 °C протягом 30 секунд, відпалювання при 55 °C протягом 30 секунд і подовження при 72 °C протягом 30 секунд. Реакцію ПЛР завершили етапом кінцевого добудування протягом 5 хвилин при 72 °C і потім зберігали при 4 °C. Продукти ПЛР потім аналізували в 1% агарозному гелі та візуалізували за допомогою забарвлювання бромідом етидію. Крім того, інша пара праймерів для ПЛР, застосовувана для виявлення вірусемії ЦВС2, мала наступні послідовності ЦВС2-F2:5’ TGTTGGCGAGGAGGGTAATG ’3 (SEQ ID No: 10), ЦВС2-R2:5’ TGGGACAGCAGTTGAGGAGT ’3 (SEQ ID No: 11). Праймери ЦВС2-F2 (прямий) і ЦВС2-R2 (зворотний) застосовували для ампліфікації 11 UA 110632 C2 5 10 фрагмента з 676 п.о. із ЦВС2. 3. Розтин і дослідження на патології На 25 день після контрольного зараження поросят умертвляли та розтинали для дослідження патологічних порушень в органах і забору зразків лімфатичних вузлів і легенів. Зразки тканин фіксували в 4% формальдегіді, заливали в парафін і потім робили зрізи. Зрізи тканин забарвлювали гематоксиліном та еозином (H&E) і розглядали під мікроскопом. 4. Результати 4.1. Оцінка вірусемії Результати ПЛР показали, що через 25 днів після контрольного зараження випадків вірусемії у вакцинованих поросят (групи 1-3) було на 40% - 60% менше, ніж випадків вірусемії в невакцинованих поросят (група 4) (таблиця 6). Результати показали, що інактивовані вакцини на основі штаму ЦВС2 Н даного винаходу були здатні індукувати імунітет у свиней, зменшувати тяжкість та тривалість вірусемії у свиней і захищати свиней від інфікування ЦВС2. Таблиця 6 Вірусемія в сироватці свиней, визначувана за допомогою ПЛР Група група 1 група 2 група 3 група 4 (контроль) До зараження 0/5 0/5 0/5 0/5 Дні після контрольного зараження 11 19 2/5 1/5 1/5 0/5 2/5 1/5 7 2/5 2/5 3/5 4/5 a 3/5 4/5 25 1/5 0/5 1/5 3/5 a Знаменники представляють кількості підданих випробуванню поросят, а чисельники представляють кількості поросят з вірусемією. 15 20 4.2. Гістопатологічне дослідження Через 25 днів після контрольного зараження поросят умертвляли та розтинали. Збільшення пахових, середостінних і брижових лімфовузлів виявили в 2 невакцинованих поросят, і зрізи лімфатичних вузлів були бліді. В іншого невакцинованого поросяти були не спалі, тверді легені, набряк легенів і покриті білими плямами нирки. У всіх вакцинованих поросят не виявили важких патологічних порушень (таблиці 7 та 8). Таблиця 7 Патологічні порушення у вакцинованих і невакцинованих поросят Патологічне порушення Група група 1 група 2 група 3 група 4 (контроль) Набряк легенів Покриті білими плямами нирки 0/5 0/5 0/5 a 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 Слабке збільшення селезінки 0/5 0/5 0/5 2/5 1/5 1/5 1/5 Збільшення лімфовузлів Інше b порушення 0/5 0/5 0/5 0/5 a Знаменники представляють кількості розітнутих поросят, а чисельники представляють кількості поросят з патологічними порушеннями. b Інше порушення включає слабке збільшення печінки або жовчного міхура та кишковий метеоризм. 25 У таблиці 8 показані результати мікроскопічного гістопатологічного дослідження зрізів тканин і результати оцінки вірусемії ЦВС2 за допомогою ПЛР. Практично у всіх невакцинованих поросят (група 4) спостерігали гістопатологічні зміни в лімфовузлах, такі як лімфопенію та інфільтрацію макрофагами, і всі взяті зразки лімфовузлів від невакцинованих поросят були позитивні на вірусемію РСV2. Крім того, в 3 невакцинованих поросят спостерігали 12 UA 110632 C2 5 гістопатологічні зміни в легенях, такі як інфільтрацію клітинами запалення, і 2 взятих зразка тканин легенів від невакцинованих поросят були позитивні на вірусемію ЦВС2. У порівнянні з невакцинованими поросятами у вакцинованих поросят проявлялося значне зменшення гістопатологічних змін та вірусемії ЦВС2. Гістопатологічні зміни у лімфовузлах спостерігали тільки в 1 вакцинованого поросяти (свиня № A4) з 15 (групи 1-3), і взяті зразки лімфатичних вузлів від вакцинованого поросяти (свиня № A4) були єдиними позитивними на вірусемію ЦВС2 лімфовузлами. Результати показали, що інактивована вакцина на основі штаму ЦВС2 Н даного винаходу була здатна захищати свиней від інфікування ЦВС2, і ступінь захисту складав 80% ~ 100%. 10 Таблиця 8 Мікроскопічне гістопатологічне дослідження зрізів тканин і оцінка вірусемії РCV2 за допомогою ПЛР після контрольного зараження ЦВС2 Лімфатичні вузли Свиня Важкі Інфільтрація Група Лімфо№ патологічні макрофапенія зміни гами A1 A2 A3 A4 + + Група 1 A5 Проміжний 1/5 1/5 0/5 підсумок B1 B2 B3 B4 Група 2 B5 Проміжний 0/5 0/5 0/5 підсумок C1 C2 C3 C4 Група 3 C5 Проміжний 0/5 0/5 0/5 підсумок D1 + + + D2 + + + D3 + + Група 4 D4 + + (контроль) D5 + Проміжний 2/5 5/5 4/5 підсумок Легені Частота Ступінь захворюВажкі Інфільтрація захисту вань ПЛР патологічні клітинами ПЛР (%) PWMS зміни запалення + + 1/5 0/5 0/5* 0/5* 1/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 + + + + + + + + + + + + + + + + 5/5 1/5 3/5 2/5 80 5/5 100 100 * Знаменники представляють кількості розітнутих поросят, а чисельники представляють кількості поросят з патологічними порушеннями. 15 На підставі всіх результатів інактивована вакцина на основі штаму ЦВС2 Н даного винаходу ефективно індукує імунітет у свиней, захищає вакцинованих свиней від інфікування ЦВС2, зменшує тяжкість та тривалість вірусемії у свиней, зводить до мінімуму клінічні симптоми та збільшує приріст маси тіла. Зрозуміло, що багато змін і модифікації вищеописаного варіанта здійснення даного винаходу можуть бути виконані без відхилення від його сутності. Відповідно, винахід розкритий для сприяння прогресу в науці та корисних галузях техніки та повинен обмежуватися тільки обсягом формули винаходу. 20 13 UA 110632 C2 14 UA 110632 C2 15 UA 110632 C2 16 UA 110632 C2 17 UA 110632 C2 18 UA 110632 C2 19 UA 110632 C2 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 5 10 15 20 25 30 35 1. Цирковірус свиней 2 типу (ЦВС2), який містить геномну послідовність SEQ ID NО:1. 2. Цирковірус свиней 2 типу (ЦВС2) за п. 1, який був депонований у Китайському центрі колекції типових культур (ССТСС) під номером доступу V201117. 3. Цирковірус свиней 2 типу (ЦВС2) за п. 1, де ЦВС2 здатний викликати цитопатичний ефект (СРЕ) у клітинній лінії РК-15 або її похідних клітинних лініях. 4. Імуногенна композиція, яка містить цирковірус свиней 2 типу (ЦВС2) за п. 1. 5. Імуногенна композиція за п. 4, яка додатково містить фармацевтично прийнятний носій. 6. Імуногенна композиція за п. 5, де носій являє собою ад'ювант. 7. Імуногенна композиція за п. 4, де ЦВС2 оброблений способом інактивації. 8. Імуногенна композиція за п. 4, де ЦВС2 є атенуйованим; або з ЦВС2 за п. 1 отримані або вироблені субодиниця, ДНК. 9. Імуногенна композиція за п. 4, яка додатково містить щонайменше один патогенний антиген, вибраний із групи, що включає антиген вірусу свинячого грипу (SIV), антиген вірусу репродуктивно-респіраторного синдрому свиней (PRRSV), антиген мікоплазми, антиген парвовірусу свиней (PPV), антиген бешихи свиней та антиген вірусу псевдосказу. 10. Спосіб захисту свині від інфікування цирковірусом свиней 2 типу, що включає етап, на якому проводять зараження свині імуногенною композицією за п. 4 для підвищення імунітету проти ЦВС2 у свині. 11. Полінуклеотид, який містить нуклеотидну послідовність, що кодує поліпептид ЦВС2 за п. 1, при цьому поліпептид має послідовність SEQ ID NО:5. 12. Полінуклеотид за п. 11, де нуклеотидна послідовність містить послідовність SEQ ID NО:4. 13. Набір для аналізу на цирковірус свиней 2 типу (ЦВС2), що містить елемент для виявлення, який являє собою одне або декілька, вибраних із групи, що включає вірусний антиген вірусу за п. 1, полінуклеотид за п. 11 і фрагмент нуклеїнової кислоти, що виявляє послідовність SEQ ID NО:1. 14. Набір для аналізу на цирковірус свиней 2 типу (ЦВС2) за п. 13, де вірусний антиген осаджений на планшет. 15. Набір для аналізу на цирковірус свиней 2 типу (ЦВС2) за п. 14, де вірусний антиген оброблений способом інактивації. 16. Набір для аналізу на цирковірус свиней 2 типу (ЦВС2) за п. 13, де полінуклеотид містить послідовність SEQ ID NО:4. 17. Набір для аналізу на цирковірус свиней 2 типу (ЦВС2) за п. 13, де фрагмент нуклеїнової кислоти містить щонайменше одну з SEQ ID NО:8, SEQ ID NО:9, SEQ ID NО:10 та SEQ ID NО:11. 20 UA 110632 C2 21 UA 110632 C2 22 UA 110632 C2 23 UA 110632 C2 24 UA 110632 C2 25 UA 110632 C2 Комп’ютерна верстка О. Гергіль Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 26