Спосіб оцінки рослин пшениці з vrn-d1 генотипом

Винахід відноситься до біотехнології і може мати використання при проведенні оцінки рослин пшениці з Vrn-Dl генотипом. Спадкова мінливість пшениці в період індивідуального розвитку значною мірою обумовлена особливістю експресії генів Vrn, які відповідають за чутливість до яровизації. У зв'язку з тим, що основним завданням селекції є підвищення урожайності культурних рослин, успіх роботи у даному напрямку має зв'язок з результативністю відбору, який спрямований на оптимальний рівень тривалості онтогенезу, отже і на добір ефективніших Fra-генотипів. Цілеспрямоване використання у селекційних програмах домінантних та рецесивних генів Vrn стримується складністю визначення генотипів за фенотиповим проявом зазначених ознак. Оцінка генотипу за цими генами за фенотипом рослини складна, тривала і працемістка. У зв'язку з цим виникає необхідність, поряд із традиційними методами генетичного аналізу використовувати методи визначення молекулярно-генетичного поліморфізму ДНК рослин. В сучасних селекційних програмах і генетичних дослідженнях використується відомий метод визначення чутливості до яровізації за терміном колосіння, який розрізняється у рослин пшениці з різними Vrn генотипами. Прототипом методу, що заявлено, є метод генетичного аналізу за типом та швидкістю розвитку [1].Розподіл фенотипів рослин F2 проводиться шляхом аналізу за швидкістю та типом розвитку при весіннєму посіві. Насіння F2 отримане у наслідку схрещування батьківських форм, що розрізняються за алельним станом Vrn, зокрема Vrn-D1, висівають на польовної ділянці та вирощують до періоду колосіння. Рослини F2 аналізують за типом розвитку, розділяя на ярі (колосіння до 85 діб) та озимі (відсутність колосіння за 100 діб) [2-4]. Достовірність співвідповідношення фактичного розщеплення теоретично очикуваному визначають методом Ҳ2 [5]. Умовно генетичним ефектам генів Vrn для домінантних гомозигот характерною рисою є прискорення терміну колосіння при порівнянні з гетерозиготами. Для виявлення домінантних гомозигот необхідно проводити генетичний аналіз рослин популяції F3. У даному випадку відсутність розщеплення серед окремих сімей F3 дозволяє проводити відбір рослин домінантно гомозиготних за певним Vrn. Недоліками цього методу являються: - термін визначення рослин з певним Vrn генотипом досить тривалий за часом (2 роки); - використання методу пов'язано з витратами на обробку дослідної ділянки. В основу винаходу поставлено задачу оцінки рослин пшениці з Vrn-D1 генотипом шляхом використання ДНК-маркерів. Поставлене завдання вирішується в способі оцінки рослин пшениці з Vrn-D1 генотипом ярих сортів та ліній пшениці, який здійснюють на рослинної ДНК методом ПЛР-аналізу з праймерами, що виявляють фрагменти ДНК, тісно зчеплені з геном Vrn-Dl. Вихідною теоретичною передумовою для використання ПЛР-аналізу є поліморфізм ДНК пшениці та можливість детекції цього поліморфізму на різних таксономічних рівнях, а також можливість отримання ДНК-маркерів, які тісно зчеплені з конкретними генами. Наявність ДНК-маркерів не залежить від біотичних чи абіотичних факторів оточуючого середовища, від особливості тканин, з яких вилучається ДНК (паростки, листя, коріння). Використання ДНК-маркера дозволяє усун ути майже усі недоліки класичного генетичного аналізу, який обрано за прототип методу, що заявляється. Відмінними від прототипу ознаками в винаході, що заявляється, є: - Vrn-D1 генотипи визначаються за наявністю ДНК-маркерів до зазначеного гена. Спосіб здійснюється наступним чином: 1. Виділення рослинної ДНК. ДНК виділяли з етиольованих триденних паростків (зелене листя, насіння). Паростки (100мг) розтирали в епендорфі з 0,5мл лізуючого буферу (1,4 МNaCl; 20mM Na3EDTA; 100тМ TrisHCl, pH8,0 (25°С); 2% СТАВ). Інкубували на водяній бані протягом 1 години при 60° С Депротеїнізацію проводили рівним об'ємом суміші хлороформ-ізоаміловий спирт (24:1). Центрифугували протягом 5хв. у центрифузі Eppendorf 5415 при 12000об/хв, водяну фаз у (не зачіпаючи інтерфази) переносили в інший епендорф. ДНК екстрагували рівним об'ємом ізопропанолу з наступним центрифугуванням протягом 5хв. при 12000об./хв. Надосадову рідину обережно зливали. Осад промивали 1мл 70% етанолу. Отриманий осад ДНК розчиняли в 500мкл розчину ТЕ (10mM Tris-HCl, pH8,0; 1тМ Na 3EDTA) з 1мкг/мл РНК-азою А. Концентрацію ДНК вимірювали на флуориметрі ТКО Hoefer-ЮО у розчині 1 х TNE (10mM Tris-HCl pH7.4 (25°С); 100mM NaCl; lmM Na3EDTA) з 100мкг/мл інтеркалюючого барвника Hoechst 33258. 2. Умови ПЛР, гель-електрофорез, візуалізація ампліконів. Реакційний буфер для ампліфікації з довільними праймерами (RAPD) містив: 50тМ КС1; 20тМ Тріс-НСІ, рН8,4; 2,5mM MgCl 2; 0,01% Tween-20; 0,15тМ кожного dNTP; 0,2mkM праймера; 20нг ДНК і 1од. Taq-полімерази. ПЛР проводили при температурі відпалу 55°С. Для тестування продуктів ампліфікації застосовували 2,0% агарозні гелі. Гелі з ПЛР-продуктами забарвлювали бромистим етидієм і фотографували в УФ-світлі на фотоплівку «Мікрат 300». Ампліфікацію із парою спрямованих праймерів (STS) проводили при температурі відпалу 57°С. Реакційний буфер містив: 50mM KC1; 20тМ Тріс-НСІ, рН8,4; 1,5mM MgCl2; 0,01% Tween-20; 0,15тМ кожного dNTP; 0,2mkM праймера; 20нг ДНК і 1.5од. Taq-полімерази. Кількість циклів ампліфікації для всіх ПЛРметодів - 35. Продукти ампліфікації фракціонували в 10% ПААГ, візуалізували фарбуванням гелів сріблом. Реакцію ампліфікації проводили на приладах «Терцик», Росія, Москва. 3. RAPD аналіз. Використання RAPD-ПЛР з довільним праймером WMS 159L: GGGCCAAC ACTGGAACAC дозволило виявити фрагмент-маркер до гену Vrn-D1. Поліморфний фрагмент величиною 657п. н. детектується у гібридів F2; які є ярими рослинами. Зіставлення результатів розчеплення популяції за методами генетичного та RAPD-аналізів відповідають теоретично очікуваним (табл.1). Таблиця 1 Розщеплення за типом, розвитку (ярі:озимі) популяції F2 від схрещування Миронівська 808 Vrn-D1(яра)хМиронівська 808 (рецесив, озима), отримане гібридологічним, RAPD- аналізами Метод аналізу Фактично спостережене Теоретично очікуване c2* Генетичний RAPD 42:10 41:11 39:13 39:13 0,92* 0,41* Примітки: *c23:1