Спосіб оцінки впливу стресових світлових факторів на вищі та нижчі рослини

Винахід відноситься до галузі сільського господарства, зокрема рослинництва, плодоовочівництва, агроекології, дистанційного зондування сільськогосподарських угідь. Відомий спосіб аналізу ви щих та нижчих рослин у стресових умовах заснований на реєстрації спектрів випромінювання флуоресценції хлорофілу зелених зразків вищих рослин та водоростей [Холл Д., Фотосинтез. Μ.: Мир, 1983.-132с.). Під час функціонування фотосинтетичного апарату випромінювання флуоресценції хлорофіла a складає 2¸5% поглинутої енергії і залежить від типу хлоропласта, віку, фізіологічного стану рослини, стресових умов, інтенсивності та довжини хвилі збуджуючого випромінювання. Спектр флуоресценції зеленого зразка характеризується максимумами при 440-450нм (синя область), 690 та 740нм (червона область). Саме максимуми флуоресценції при 690 та 740нм і пов'язані з хлорофілом. Основна ідея вимірювань полягає в тому, що флуоресценція хлорофілу суттєво пов'язана із швидкістю фотосинтезу, яка в свою чергу залежить від стану пігментного апарату та впливу на нього різноманітних стресових факторів. Відношення максимумів F690/F740 використовують як флуоресцентний індекс, що корелює зі змінами стану листка під впливом цих факторів. Недоліком відомого способу є те, що процес реєстрації спектру випромінювання флуоресценції триває певний час (близько декількох хвилин), протягом якого відбувається зміна інтенсивності флуоресценції (так звана "індукція флуоресценції"). Через це відношення максимумів F690/F740 теж змінюється з часом, що спотворює результати вимірювань. Найбільш близьким до засобу, що замовляється, є спосіб реєстрації індукції флуоресценції, який дає можливість спостерігати часову кінетик) інтенсивності флуоресценції попередньо адаптованого до темноти зеленого листа. При освітленні зеленого зразка, який знаходився 15¸20 хвилин у темряві, в останньому флуоресценція хлорофілу набуває індукційну кінетику (відому як "ефект Каутського" [Kautsky Η, Hirsch Α., Das Fluoreszenzverhalten gruner Pflanzen, Biochem.Z., 1931, V.274, P.422). Індукцію флуоресценції можна пояснити порушенням зв'язку між фотосистемами І і II у темряві і переходом фотосинтетичного апарату із стану І у стан II при освітленні. Функції флуоресцентних індексів можуть виконувати деякі флуоресцентні параметри, які використовуються для кількісної оцінки тих змін, що набуває рослина внаслідок стресових умов. Такими параметрами можуть бути максимальна флуоресценція ¦m; стаціонарна флуоресценція ¦s; зменшення флуоресценції ¦d = ¦m-¦s ; індекс життєздатності R¦d = ¦d/¦s, який вимірюють на двох довжинах хвиль: R¦d(690) і R¦d(740); відношення ¦m(690)/ ¦m(740) і ¦s(690)¦s(740); індекс адаптації до стресів Ap = 1-[R¦d(740) + 1]/[R¦d(690)+1]. Техніка безпосередньої реєстрації індукції флуоресценції зеленого зразка не позбавлена певних недоліків - залежності сигнала, що реєструється, від інтенсивності випромінювання збудження, впливу оточуючого осві тлення. Завданням винаходу, що пропонується, є підвищення точності та якості аналізу стану вищи х та нижчих рослин в стресових світлови х умовах. Поставлене винаходом завдання досягається тим, що у способі оцінки впливу стресових світлових факторів на вищі та нижчі рослини збуджують флуоресценцію хлорофілу зеленого зразка, реєструють флуоресцентний параметр (індекс) та згідно винаходу використовують амплітудно-модульовану флуориметрію, принцип дії якої полягає в збудженні флуоресценції серією світлових імпульсів, інтенсивності яких недостатньо, щоб викликати фотосинтез, але достатньо для стимулювання сигналу флуоресценції, що відповідає початковому рівню F0, після чого зразок освітлюють інтенсивним світловим імпульсом, який викликає "насичення" реакційних центрів та їх запирання, що відповідає збільшенню інтенсивності флуоресценції до максимального рівня Fm¢, а для кількісної оцінки ефективності фотосинтезу в стресових умовах використовують такі параметри як фотосинтетична ефективність, що визначається як лінійна ділянка залежності відносної швидкості електронного транспорту ETR від інтенсивності діючого світла І, а також фотосинтетична здатність, що відповідає максимальному значенню відносної швидкості електронного транспорту ETRmax, або насиченню світлової кривої ETR=¦(I). Спосіб містить такі операції: 1. Освітлюють рослинний зразок діючим світлом (650нм), інтенсивність якого поступово збільшують від 16 до 700мкмоль×м -2×с-1 ; 2. Оцінюють ефективний квантовий вихід фотосинтезу Yеф за виразом: Yеф = (F m¢ - F)/F m¢ = DF/F m¢ , дe Fm¢ - максимальна інтенсивність флуоресценції освітленого зразка, F - інтенсивність флуоресценції в певний момент часу, DF = Fm¢ - F; 3. Оцінюють відносну швидкість електронного транспорту EFR за виразом: ETR = Yеф ×ФАР = DF/F m¢×ФАР, де ФАР - густина квантового потоку фотосинтетично активного випромінювання, що вимірюється у мкмоль×м -2×с-1; 4. Будують світлову криву - залежність відносної швидкості електронного транспорту ETR від інтенсивності діючого світла І; 5. Оцінюють фотосинтетичну ефективність, що визначається як лінійна ділянка залежності ETR=¦(l відносної швидкості електронного транспорту від інтенсивності світла) і характеризується нахилом fмакс, кривої ETR =¦(І); 6. Оцінюють фотосинтетичну здатність, що відповідає максимальному значенню відносної швидкості електронного транспорту ETR max, або насиченню кривої ETR = ¦(І). На Фіг.1 пояснюється принцип амплітудно-модульованої флуориметрії. В зеленому зразку збуджують флуоресценцію серією світлових імпульсів. Інтенсивності цих імпульсів недостатньо, щоб викликати фотосинтез, але достатньо для стимулювання сигналу флуоресценції, що відповідає початковому рівню F0. Момент включення такого "вимірювального" імпульсу позначен літерою А для адаптованого до темряви зразка і літерою А для адаптованого до світла зразка (Фіг.1). Далі зразок освітлюють інтенсивним світловим імпульсом, який викликає "насичення" реакційних центрів та їх запирання. Закриті реакційні центри відновлюються і беруть участь у фото хімічних реакціях. В цьому разі інтенсивність флуоресценції збільшується до максимального рівня Fm¢ для адаптованих у темряви зразків та до Fm для зразків, що опромінюються діючим світлом (точки В і В¢, Фіг.1). Імпульси насичення, які повторюються через кожні 10 с, повністю ослаблюють первинний акцептор QA ФСІІ; таким чином, ланцюг перенесення електронів між двома фотосистемами швидко переривається. Більш того, внаслідок дії насичуючого імпульсу фотохімічне гасіння флуоресценції сходить нанівець, тоді як нефотохімічне гасіння продовжується (Фіг.1). Якщо освітлювати зразок світлом високої інтенсивності, реакційний центр ФСІІ бере участь у поглинанні світла, захопленні енергії та перенесенні електронів - всі ці процеси тривають певний час, протягом якого реакційний центр є "закритим". Чим більше реакційних центрів закрито, тим менша ефективність фотосинтеза. Для кількісної оцінки ефективності фотосинтеза використовують такий параметр як ефективний квантовий вихід фотосинтезу Yеф і відносну швидкість електронного транспорту ETR: Yeф = (Fm¢ -F)/Fm¢ =DF/F m¢; ETR = Yеф ×ФАР = DF/F m¢×ФАР, де ФАР - швидкість потоку фо тонів фотосинтетично активного випромінювання. Залежність відносної швидкості електронного транспорту (ETR) від освітленості характеризуються світловими кривими. Аналіз характеру цих світлови х кривих дає можливість оцінити процес фотосинтезу за допомогою таких параметрів як фотосинтетична ефективність, що визначається як лінійна ділянка залежності відносної швидкості електронного транспорту ETR від інтенсивності діючого світла l, а також фотосинтетична здатність, що відповідає максимальному значенню відносної швидкості електронного транспорту ETRmax, або насиченню кривої ETR=¦(I). Розглянемо конкретний приклад застосування способу, а саме дослідження впливу інтенсивного світла на фотосинтетичну активність зеленої водорості Ulna pertusa. Освітлення таломів Ulna pertusa білим світлом високої (1800мкмоль×м-2×с-1) інтенсивності призводить до фотоінгібування фотосинтезу: величина ефективного квантового виходу Yеф спадає до 33% відносно величини, що притаманна неосвітленим зразкам, за період часу близько 2 годин. Експериментальні дані дозволяють побудува ти світлові криві - залежність флуоресцентних параметрів від інтенсивності світла (Фіг.2). Тут: Yеф - величина ефективного квантового виходу; ETR - відносна швидкість електронного транспорт); ФАР густина квантового потоку фотосинтетично активного випромінювання (мкмоль×м -2×с-1); А,а - 25мкмоль×м-2×с-1; В, b - 100мкмоль×м-2×с-1; С,с - 500мкмоль×м -2×с-1. Характер цих кривих суттєво залежить від рівня освітленості зразка: збільшення інтенсивності світла від 25мкмоль×м-2×с-1 до 500мкмоль×м -2×с-1 викликає відповідне зменшення величин фотосинтетичної ефективності (лінійної частини світлової кривої) і фотосинтетичної здатності ETRmax (Фіг.2). Розглянемо типову світлову криву, отриману в даних експериментах (Фіг.3). На перших етапах фотосинтез зростає лінійно із збільшенням інтенсивності світла; ця залежність носить лінійний характер і характеризується максимальною фотосинтетичною активністю (нахил fмакс кривої ETR=¦(I) на Фіг.3). При високих інтенсивностях світла залежність становиться нелінійною і фотосинтетична активність зменшується. В решті решт, світлова крива набуває характеру насичення (крива l), коли швидкість фотосинтезу не змінюється при збільшенні інтенсивності світла, а фотосинтетична активність зменшується. Стале значення швидкості фотосинтезу свідчить про зменшення частки поглинутого світла, яка використовується для фотохімічних реакцій, за рахунок того, що збільшується швидкість, з якою поглинута енергія витрачається антенами ФСІІ у теплоту. Таке світло-індуковане гасіння поглинутою енергією можна пов'язати із зменшенням pH в тилакоїдному просторі. Згідно сучасним уявленням, таке витрачання надлишку енергії збудження є своєрідним механізмом захисту реакційних центрів ФСІІ від руйн ування. На Фіг.3 область А між лінійною ділянкою кривої ETR=¦(l), екстрапольованою до перетину з рівнем насичення, та самою кривою відповідає кількості поглинутого світла, яка може бути в принципі використана для фотосинтезу, але губиться завдяки внутрішнім процесам, що відбуваються у фотосинтетичному апараті. Під впливом високої інтенсивності світла відбувається процес фоіоінгібування фотосинтез}, який характеризується зменшенням величини ефективного квантового виходу Yeф (крива 2). Площа між двома кривими ETR=¦(I), зареєстрованими при оптимальних та надлишкових інтенсивностях світла, відповідає утратам енергії за рахунок фотоінгібування (область В). Площа С на Фіг.3 відповідає зменшеній внаслідок фотоінгібування поглинутій світловій енергії.