Поживне середовище для укорінення резистентних до бактеріальних хвороб рослин кормових буряків

Винахід відноситься до біотехнології, зокрема методів клітинної селекції і може бути використаний в процесі укорінення та адаптації до ґрунтових, нестерильних умов рослин-регенерантів кормових буряків, стійких до бактеріальних хвороб для забезпечення прискореного отримання нового вихідного селекційного матеріалу. При мікроклональному розмноженні шляхом проліферації калюсу часто значні ускладнення викликає етап укорінення отриманих in vitro пагонів. Для подолання проблем, що виникають при укоріненні рослинрегенерантів використовують додавання в поживні середовища різних біологічно активних речовин. Відомі поживні середовища, які містять в якості стимуляторів ризогенезу регулятори росту ауксинової природи [Свирщевская A.M., Бормотов В.Е. Культура тканей сахарной свеклы, Минск, 1994, 141 с.]. Проте при використанні середовищ, які включали нафтилоцтову, індолілмасляну та 2,4 -дихлорфеноксіоцтову кислоти у концентраціях від 0,1 до 2,0 мг/л як окремо, так і в комплексі укорінення пагонів кормових буряків, стійких до стресових факторів довкілля, зокрема збудника бактеріозу ( Pseudomonas syringaepv. aptata) не відбувалося. Відоме поживне середовище для укорінення рослин-регенерантів кормових буряків, резистентних до збудника бактеріальної плямистості листя [Губанова Н.Я., Дубровная О.В., Чугункова Т.В. Особенности ризогенеза у регенерантов кормовой свеклы, устойчивых к стрессовым факторам // Физиол. и биохим. культурных растений.- 2002.- 33, №1 .- С. 32-38.]. Проте значним недоліком даного середовища (прототипу) є низький відсоток укорінених пагонів, який не перевищує 8 - 18%, що не забезпечує отримання достатньої кількості рослин-регенерантів для залучення в подальші генетико-селекційні дослідження. В основу винаходу поставлена задача створення поживного середовища для підвищення частоти ризогенезу у регенерантів кормових буряків в умовах in vitro для прискореного отримання та збільшення кількості рослин, стійких до бактеріальної плямистості листя. Поставлена задача вирішується тим, що в поживному середовищі для укорінення резистентних пагонів, за основу якого взято середовище Фрейтага [Freytag A.H., Anand S.C., Rao-Arelli A.P., Owens L.D. An improved medium for adventitions shoot formation and callus induction in Beta vulgaris L. in vitro II Plant Cell Rep. - 1988. - 7, N1. - P.30-34.] зменшують удвічі кількість макросолей та сахарози, збільшують в 2 рази вміст хлориду кальцію, вилучають амінокислоти та додатково вводять спиртову витяжку зародків кормових буряків при таких співвідношеннях компонентів, мг/л: амоній азотнокислий- 1650,0; калій азотнокислий-1900,0; кальцій хлористий- 880,0; магній сірчанокислий - 370,0; калій фосфорнокислий, однозаміщений- 170,0; залізо сірчанокисле-27,95; етилендіамінтетраацетат натрію - 37,23; борна кислота - 6,2; марганець сірчанокислий 22,3; цинк сірчанокислий -8,6; калій йодистий- 0,83; натрій молібденове кислий - 0,25; мідь сірчанокисла 0,025; кобальт хлористий -0,025; Р - амінобензойна кислота - 0,2; аскорбінова кислота- 0,4; Д-біотин-0,00025; холін-хлорид- 0,2; ніацин-0,5; фолієва кислота - 0,015; Д-пантотенова кислота - 0,4; піридоксин- НСl - 0,5; тіамін-НСІ - 0,5 ; рібофлавін -0,015; бензиламінопурин - 0,4; індолілмасляна кислота -0,1; нафтилоцтова кислота-1,0; бетастимулін - 0,01; спиртова витяжка зародків кормових буряків -30,0 мл; сахароза -12500,0; агар-агар-9000,0; бідистильована вода - до 1 літру. Запропоноване середовище суттєво відрізняється від прототипу (таблиця 1, середовище 1) удвічі зменшеною кількістю макросолей, збільшеним в 2 рази вмістом хлориду кальцію, відсутністю амінокислот та наявністю спиртової витяжки зародків кормових буряків. На відміну від відомого середовища для індукції ризогенезу, при використанні якого утворення коренів спостерігається протягом 4-6 тижнів, кількість укорінених рослин не перевищує 8- 18%, що значно подовжує процес отримання достатньої кількості регенерантів з розвиненою кореневою системою, при використанні запропонованого поживного середовища процес коренеутворення скорочується до 2- 3 тижнів, укоріненість пагонів зростає в 3 рази, що суттєво збільшує вихід резистентних рослин, які можливо пересаджувати в ґрун т. Новою, відмінною від прототипу ознакою, є введення в поживне середовище для укорінення спиртової витяжки зародків кормових буряків у кількості - 30,0 мл/л, при зменшенні удвічі кількості макросолей і сахарози, вилученні амінокислот та збільшенні в 2 рази вмісту хлориду кальцію. Використання даного поживного середовища дозволяє збільшити відсоток укорінення пагонів у 2 - 3 рази, поліпшити розвиток кореневої системи рослин, скоротити процес ризогенезу на 3 тижні, а також підвищити приживлюваність рослин в ґрунті при висадці у нестерильні умови. Це сприяє отриманню в більш короткі терміни значно більшої кількості регенерантів кормових буряків, резистентних до збудника бактеріозу для застосування їх в селекції на стійкість до бактеріальних хвороб і таким чином забезпечує скорочення біотехнологічного процесу та зменшує матеріальні затрати для його виконання. Це стало можливим здійснити на основі даних, які були одержані в результаті проведення попередніх досліджень. Як видно з таблиць 2 та 3 розроблене поживне середовище сприяє збільшенню частота укорінення токсинрезистентних пагонів на 16-34% (2-3 рази), приживлюваності в ґрун ті на 20-35 % у порівнянні з відомим середовищем. Поживне середовище готується наступним чином: В бідистильовану воду вносять компоненти в указаних концентраціях ( таблиця 1, середовище 2). Об'єм розчину доводять до 1л, встановлюють рН -5,8. Середовище для укорінення розливають у мірні колби, куди попередньо добавляють агар-агар та автоклавірують при температурі 120°С протягом 20 хвилин (тиск 1,05 атм). Для приготування спиртової витяжки беруть зародки насіння буряків, механічно їх подрібнюють і заливають 70° спиртом у співвідношенні 1: 10 ( 1 частина зародків: 9 частин спирту) та витримують протягом двох тижнів у темноті. Отриманий розчин двічі фільтрують або центрифугір ують 5 хвилин при 8 - 10 тис. оборотах. Зберігають у темному посуді в холодильнику при температурі 4°С не більше 6 місяців. У відповідному об'ємі (30 мл на 1 літр) додають у поживне середовище перед стерилізацією. Порівняльний аналіз заявленого технічного рішення з прототипом свідчить, що заявлене поживне середовище відрізняється від уже відомого тим, що у його склад входить спиртова витяжка зародків кормових буряків у концентрації 30,0 мл/л, при зменшеній удвічі кількості макросолей і сахарози, повному вилученні амінокислот та збільшеній в 2 рази кількості хлориду кальцію. Заявлене технічне рішення прискорює процес укорінення на 3 тижні, збільшує кількість укорінених резистентних рослин у 2- 3 рази і таким чином забезпечує скорочення біотехнологічного процесу і зменшення матеріальних затрат для його виконання. Заявлене поживне середовище для укорінення резистентних рослин кормових буряків дозволяє прискорити процеси ризогенезу у токсинрезистентних рослин та збільшити кількість укорінених регенерантів чим і обумовлена ефективність його застосування. Використання заявленого середовища забезпечує поліпшення розвитку кореневої системи та прискорення коренеутворення на початкових етапах культивування, що дозволяє скоротити процес укорінення і відповідно весь біотехнологічний процес отримання вихідного матеріалу та зменшити матеріальні витрати на його виконання. Може бути використане для укорінення резистентних рослин-регенерантів в біотехнології та селекції кормових буряків. Таблиця 1 Концентрація компонентів поживного середовища, мг/л Компоненти Амоній азотнокислий Калій азотнокислий Кальцій хлористий Магній сірчанокислий Калій фосфорнокислий, однозаміщений Залізо сірчанокисле Етилендіамінтетраацетат натрію Борна кислота Марганець сірчанокислий Цинк сірчанокислий Калій йодистий Натрій молібденове кислий Мідь сірчанокисла Кобальт хлористий Р- амінобензойна кислота Аскорбінова кислота Д-біотин Холін-хлорид Ніацин Фолієва кислота Д- пантотенова кислота Піридоксин - НСl Тіамін-НСІ Рібофлавін L-аргінін L-глютамін L-аспарагін L-гліцин L-фенілаланін L-тріптофан Бензиламінопурин Індолілмасляна кислота Спиртова витяжка зародків кормових буряків Сахароза Агар-агар Нафтилоцтова кислота Бетастимулін Бідистильована вода Середовище 1, РВ-9 (прототип) 1650,0 1900,0 440,0 370,0 170,0 27,95 37,23 6,2 22,3 8,6 0,83 0,25 0,025 0,025 0,2 0,4 0,00025 0,2 0,5 0,015 0,4 0,5 0,5 0,015 40,0 60,0 40,0 20,0 20,0 40,0 0,40 0,1 25000,0 9000,0 1,0 0,01 до 1 літру Середовище2, РВ-11 (заявлене) 825,0 950,0 880,0 185,0 85,0 27,95 37,23 6,2 22,3 8,6 0,83 0,25 0,025 0,025 0,2 0,4 0,00025 0,2 0,5 0,015 0,4 0,5 0,5 0,015 0,40 0,1 30мл 12500,0 9000,0 1,0 0,01 до 1 літру Таблиця 2 Ефективність укорінення резистентних пагонів на середовищах різного складу Лінія Середовище 3 8 11 3 8 РВ-9 РВ-9 РВ-9 РВ-11 РВ-11 Кількість висаджених Кількість укорінених пагонів, шт. пагонів, шт. 50 4 50 6 50 9 50 12 50 20 Відсоток укорінення 8,0±3,8 12,0±4,6 18,0±5,6 24,0±6,0 40,0±6,9 11 РВ-11 50 26 52,0±7,0 Таблиця 3 Приживлюваність рослин-регенерантів, вирощених на середовищах різного складу, після висадки в нестерильні умови Лінія Середовище 3 РВ-9 8 РВ-9 11 РВ-9 3 РВ-11 8 РВ-11 11 РВ-11 Висаджено рослин, шт. 4 6 9 12 20 26 Приживилось рослин, шт. 1 2 4 7 13 19 Відсоток приживлених рослин 25,0±21,7 33,3±19,2 44,4±16,6 58,3±14,2 65,0±10,7 73,1±8,7