Рослина кукурудзи і насіння, які відповідають трансгенному випадку mon89034, і способи його виявлення і застосування

Реферат: Винахід належить до трансгенної рослини кукурудзи MON89034, яка є стійкою до комах ряду Lepidoptera, її клітини, насіння та способів її вирощування. Винахід також належить до послідовностей нуклеїнових кислот, що забезпечує стійкість трансгенної рослини кукурудзи MON89034 до комах ряду Lepidoptera. Винахід також належить до композиції, що містить нуклеотидні послідовності, які є діагностичними відносно вказаної трансгенної рослини кукурудзи, зондів і праймерів, що використовуються для виявлення нуклеотидних послідовностей, які забезпечують стійкість трансгенної рослини кукурудзи MON89034 до комах ряду Lepidoptera. UA 98770 C2 (12) UA 98770 C2 UA 98770 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 За даною заявкою запитується пріоритет попередньої заявки на патент США № 60/808834, поданої 26 травня 2006 року. Даний винахід належить до випадку трансгенної кукурудзи MON89034 і частин рослини і її насіння. Цей випадок виявляє стійкість до зараження комахами ряду Lepidoptera. Даний винахід також належить до способів застосування рослин і насіння, що містять ДНК, яка є діагностичною відносно присутності трансгенного випадку при зондуванні на присутність унікальних нуклеотидних послідовностей трансгенного випадку, і способів виявлення присутності вказаного випадку кукурудзи в біологічному зразку по виявленню специфічних нуклеотидних послідовностей, унікальних для трансгенного випадку. Даним винаходом надаються унікальні нуклеотидні послідовності цього випадку. Даний винахід належить до стійкого ряду Lepidoptera (лускокрилих) трансгенного сорту рослин кукурудзи (Zea mays), що згадується в даному описі як випадок MON89034, і присутньої унікальної послідовності ДНК, яка при виявленні в будь-якому зразку або сорті кукурудзи є діагностичною відносно присутності випадку трансгенної рослини кукурудзи MON89034 в зразку або сорті, і також належить до виявлення області трансгену/геномної вставки в кукурудзі MON89034 і рослин потомства і насіння, що походить з них. Випадок рослини кукурудзи MON89034, зокрема, стійкий до комах ряду Lepidoptera, таких як осінній похідний черв'як (Spodoptera frugiperda), кукурудзяний метелик (Ostrinia nubilalis), бавовняна совка (Helicoverpa zea), південно-західна кукурудзяна вогнівка (Diatraea grandiosella) і совка іпсилон (Agrotis ipsilon) і т.п., всі з яких є агрономічно важливими комахами-шкідниками. Кукурудза є важливою сільськогосподарською культурою і основним харчовим джерелом в багатьох областях світу. Способи біотехнології використовували для кукурудзи з метою поліпшення агрономічних ознак і якості продукту. Однією з таких агрономічних ознак є стійкість до комах, наприклад, генетично створена стійкість до видів лускокрилих і жорсткокрилих, яка виникає в рослинах кукурудзи, генетично створених так, що вони містять один або декілька генів, що кодують інсектицидні агенти (див., наприклад, патент США № 6489542 і патент США № 6620988). Корисне виявлення присутності конкретного трансгенного випадку в біологічному зразку для визначення того, чи містить одне або декілька потомств від статевого схрещування трансгенний матеріал. Наприклад, виявлення випадку в зразку є важливим для цілей ліцензування, для встановлення і підтримки стандартів ступеня чистоти, важливим для підпорядкування регуляторним органам, для відповідності стандартам для харчових інгредієнтів, для застосування в судочинстві для встановлення того, що один або декілька конкретних індивідуумів або організацій використали конкретний випадок без ліцензії від власника або ліцензіата будь-яких патентів, направлених на трансгенний випадок, і для гарантії відповідності різним постановам уряду і/або законам. Крім того, способи, що дозволяють виявити конкретну рослину, були б корисні при підпорядкуванні регламентам, що вимагають передпродажного дозволу і маркування продуктів, що отримується з рекомбінантних рослин сільськогосподарських культур. Індивідууми або організації, резистентні до присутності трансгенного випадку в зразку, також хочуть мати надійні способи виявлення присутності трансгену в зразку для здійснення ними можливості капіталізації свого бізнесу, в якому використовується перевага відсутності трансгену в їх продуктах. Незважаючи на ці переваги, можливо, що комахи зможуть розвинути опір рослинам, що експресують тільки один -ендотоксин B.thuringiensis. Такий опір, при його широкому поширенні, безсумнівно, обмежить комерційну цінність зародкової плазмі, що містить тільки гени Bt. Одним можливим способом збільшення ефективності інсектицидних агентів, що надаються через трансгенні рослини і направлені на контролювання цільових комах-шкідників, і одночасного зниження імовірності появи комах-шкідників, стійких до таких інсектицидних агентів, могло б бути забезпечення експресії трансгенними сільськогосподарськими культурами високих рівнів цих інсектицидних агентів, таких як дельта-ендотоксини Bacillus thuringiensis (McGaughey and Whalon (1992), Science 258: 1451-55; Roush (1994) Biocontrol. Sci. Technol. 4: 501-516). Крім того, наявність депо інсектицидних генів, які є ефективними проти груп комахшкідників і виявляють свої дії через різні принципи дії, може захистити проти розвитку стійкості. Виникнення стійкості можна було б значною мірою відстрочити внаслідок надання сільськогосподарської культури, яка експресує дві або більше інсектицидних активності, виявляючи токсичність, що перекривається відносно одного і того ж виду комах. Одним з способів досягнення таких подвійних принципів дії могло б бути надання рослини, що експресує ген Bt, токсичний відносно конкретного виду комахи, разом з длРНК, яку надають з метою супрессії істотного гена того ж виду комахи, на який направлений токсин Bt, при цьому длРНК індукує реакцію інтерференційної РНК при проковтуванні цільовим шкідником, що надає способи дублювання у випадку розвитку у комахи стійкості або до длРНК, або до гена Bt. В 1 UA 98770 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 альтернативному випадку коекспресія в рослині двох або більше інсектицидних токсинів, обидва з яких токсичні відносно одного і того ж виду комахи, але кожний виявляє різний принцип здійснення своєї активності по знищенню, особливо при експресії обох на високих рівнях, забезпечує спосіб ефективного управління стійкістю. Приклади таких інсектицидів, застосовних в таких комбінаціях, включають, але без обмеження, токсини Bt, інсектицидні білки видів Xenorhabdus або Photorhabdus, десенсибілізовані і деглікозильовані білки пататину і/або пермутеїни, лектини рослин і т.п. Відомо, що на експресію чужорідних генів в рослинах впливає їх хромосомну місцерозташування, можливо внаслідок структури хроматину (наприклад, гетерохроматину) або близькості регулюючих транскрипцію елементів (наприклад, енхансерів) до сайту інтеграції (Weising et al. (1980 Ann. Rev. Genet 22: 421-477). З цієї причини часто необхідно скринувати велику кількість випадків для ідентифікації випадку, що характеризується оптимальною експресією представляючого інтерес введеного гена. Навіть тоді, коли в руках є дюжини або навіть сотні різних трансгенних випадків, немає впевненості в успішному ідентифікуванні одного трансгенного випадку, який забезпечує оптимальні рівні експресії принаймні двох різних токсинів або інсектицидних агентів і не має будь-яких небажаних агрономічних недоліків або фітотоксичних ефектів, або внаслідок вставки в деяку суттєву або частково суттєву область геному рослини, або внаслідок токсичних ефектів, викликаних рівнями експресії трансгенів. Наприклад, в рослинах і в інших організмах спостерігали, що серед випадків може бути широка варіація рівнів експресії введеного гена. Також можуть бути відмінності в просторових або часових характерах експресії, наприклад, відмінності у відносній експресії трансгену в різних тканинах рослини, які можуть не відповідати характерам, очікуваним на основі регулюючих транскрипцію елементів, присутніх в конструкції гена, що вводиться. З цієї причини зазвичай отримують від декількох сотень до декількох тисяч різних випадків і скринують випадки відносно одного, випадку, який має бажані для комерційних цілей рівні і характери експресії трансгену. Випадок, який має бажані рівні або характери експресії трансгену, застосовуваний для інтрогресії трансгену в інше генетичне середовище з допомогою статевого ауткросингу, використовуючи загальноприйняті способи схрещування. Потомство від таких схрещувань зберігає характеристики експресії трансгену початкового трансформанту. Цю стратегію використовують для забезпечення надійної експресії гена в ряді сортів, які відповідним чином адаптовані до специфічних локальних умов росту. Можна виявити присутність трансгену за допомогою будь-якого добре відомого способу виявлення нуклеїнової кислоти, такого як полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) або гібридизація ДНК, використовуючи зонди у вигляді нуклеїнових кислот. Ці способи виявлення, як правило, фокусуються на часто використовуваних генетичних елементах, таких як промотори, термінатори, маркерні гени або навіть послідовності, що кодують білок, або длРНК, що представляють інтерес, експресовані з трансгену(ів) і т.п. В результаті такі способи не можна використовувати для проведення відмінностей між різними випадками, зокрема тими випадками, які були отримані з використанням однієї і тієї ж ДНК-конструкції, якщо не відома послідовність хромосомної ДНК, що примикає до вставленої ДНК ("фланкуюча ДНК"). Залежно від способу, що використовується для введення трансгену(ів) в геном рослини, можуть спостерігатися аберантні або незвичайні ефекти, які часто суттєво ускладнюють ідентифікацію послідовностей геному рослини, фланкуючих трансгенну ДНК, яка була призначена для введення в рослину. Часто перебудови вставленої ДНК, перебудови фланкуючої геномної ДНК або перебудови вставленої ДНК, і фланкуючої геномної ДНК переважають і ускладнюють аналіз випадку вставки, що оцінюється. Тому корисно мати спосіб відбору, ідентифікації і гарантії чистоти і характеристик конкретного трансгенного випадку в зразку, і єдиним способом виконання цього є ідентифікація однієї або декількох унікальних послідовностей, пов'язаних тільки з бажаним трансгенним випадком, і присутність таких послідовностей в біологічному зразку, що містить ДНК виду рослини, в яку вставлена трансгенна ДНК для створення цього випадку, діагностує, таким чином, цей випадок в такому зразку. Даний винахід належить до трансгенної рослини кукурудзи, позначеної MON89034, і її потомству, які не відрізняються від випадку кукурудзи MON89034 (до такої міри, що вони також містять принаймні одну алель, яка відповідає вставленій трансгенній ДНК), що має насіння, яке депоноване 28 березня 2006 р. в Американську колекцію типових культур (АТСС) під номером надходження РТА-7455. Іншим аспектом даного винаходу є рослини потомства або насіння, або регенеровані частини рослини і насіння випадку кукурудзи MON89034, яке містить полінуклеотид, вибираний з групи, що складається з SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 і SEQ ID NO:5. Даний винахід також включає частини рослини випадку кукурудзи MON89034, які включають, але без обмеження, пилок, насінний зачаток, квіти, паростки, 2 UA 98770 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 коріння, стебло, шовк, вінички, колоски і листя, поки ці частини містять принаймні полінуклеотиди, визначені вище. Нові генетичні склади, що містяться в геномі MON89034 і продуктах з MON89034, таких як борошно крупного помелу, борошно, масло, м'якушка і біомаса, що залишається на полі рослин кукурудзи, що відповідають є випадку MON89034, є аспектом цього винаходу. Даним винаходом надається стійка до комах рослина кукурудзи, що має всі фізіологічні і морфологічні властивості випадку кукурудзи MON89034. Відповідно до одного аспекту даного винаходу надаються композиції і способи для виявлення присутності області трансгену/вставки в геном з нової рослини кукурудзи, позначеної MON89034. Надаються послідовності ДНК, які включають принаймні одну послідовність стику випадку MON89034, що вибирається з групи, яка складається з SEQ ID NО:1 (розташованої з положеннях 2051-2070 в SEQ ID NO:5) і SEQ ID NO:2 (розташовану в положеннях 11295-11314) і їх комплементів; причому послідовність стику охоплює стик між гетералогічною ДНК, вставленою в геном, і ДНК клітини кукурудзи, ідо фланкує сайт вставки, і діагностує цей випадок (фіг.). Випадок кукурудзи MON89034 і насіння, включаючи ці молекули ДНК, і аспектами цього винаходу. Послідовності ДНК, які включають область нового трансгену/вставку в геном. SEQ ID NO:3 і SEQ ID NO:4 (фіг.) з випадку кукурудзи MON89034, є аспектами цього винаходу. Рослина кукурудзи і насіння, включаючи ці молекули, є також венетами цього винаходу. Відповідно до іншого аспекту даного винаходу надаються дві молекули ДНК для застосування в способі виявлення ДНК, причому перша молекула ДНК включає принаймні 11 або більше безперервних полінуклеотидів будь-якої частник області трансгену молекули ДНК SEQ ID NO:3, а інша молекула ДНК має схожу довжину будь-якої частини області 5' фланкуючої геномної ДHК кукурудзи SEQ ID NO:3, причому ці молекули ДНК при застосуванні разом придатні як ДНК-праймери в способі ампліфікації ДНК, за допомогою якого утворюється амплікон. Амплікон, утворений з використанням цих ДНК-праймерів в способі ампліфікації ДНК. діагностує випадок кукурудзи MON89034, коли амплікон містить SEQ ID NО:1. Будь-який амплікон, утворений за допомогою ДНК-праймерів, гомологічних або комплементарних будьякій частині SEQ ID NO:3, і будь-який амплікон, який включає SEQ ID NO:1, є аспектом даного винаходу. Відповідно до іншого аспекту даного винаходу надаються дві молекули ДНК для застосування в способі виявлення ДНК, причому перша молекула ДПК включає принаймні 11 або більше безперервних полінуклеотидів будь-якої частини області трансгену молекули ДНК SEQ ID NО:4, а інша молекула ДНК має схожу довжину будь-якої частини 3' фланкуючої геномної ДНК кукурудзи SEQ ID NO:4, причому ці молекули ДНК придатні як ДНК-праймерів в способі ампліфікації ДНК. Амплікон, утворений з використанням них ДНК-праймерів в способі ампліфікації ДНК, діагностує випадок кукурудзи MON89034, коли амплікон містить SEQ ID NО:2. Будь-який амплікон, утворений і допомогою ДНК-праймерів, гомологічних aбо комплементарних будь-якій частині SEQ ID NО:4, і будь-який амплікон, який включає SEQ ID NО:2, є аспектом даного винаходу. Відповідно до іншого аспекту даного винаходу надаються способи виявлення присутності ДНК, що відповідає випадку кукурудзи MON89034, в зразку. Такі способи включають (а) приведення в контакт зразка, що включає ДНК, з набором праймерів, який при використанні в реакції ампліфікації нуклеїнової кислоти з геномною ДНК з випадку кукурудзи МОN89034 призводить до утворення амплікону, який є діагностичним відносно випадку кукурудзи MON89034; (b) проведення реакції ампліфікації нуклеїнової кислоти, утворюючи тим самим амплікон: і (с) виявлення амплiкону, причому вказаний амплікон включає SEQ ID NО:1 або SЕQ ID NО:2. Надається рослина кукурудзи або насіння, або продукт, що отримується; рослини або насіння MON89034, причому геномна ДНК включає молекулу ДНК, по суті що складається з SEQ ID NO:5 і її комплементів. Надається рослина кукурудзи або насіння, або продукт, що отримується з рослини або насіння MON89034, в яких геномна ДHК, виділена з рослини кукурудзи або насіння, або продукту, включає молекулу ДНК. що включає нуклеотиди 206111305 SEQ 1D NO:5, і їх комплементи. Надається рослина кукурудзи або насіння, або продукт, що отримується з рослини або насіння MON89034, в яких геномна ДНК, виділена з рослини кукурудзи або насіння, або продукту, призводить до утворення амплікону в способі ампліфікації ДНК, причому в способі ампліфікації ДІІК використовуються молекули ДНК-праймерів SEQ ID NO:6 і SEQ ID NО:7. Відповідно до іншого аспекту даного винаходу надаються способи виявлення присутності ДНК, що відповідає випадку MON89034, в зразку, при цьому такі способи включають (а) 3 UA 98770 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 приведення в контакт зразка, що включає ДНК, із зондом, яким гібридизується в жорстких умовах гібридизації з геномною ДНК з випадку кукурудзи MON89034 і не гібридизується в жорстких умовах гібридизації з ДНК контрольної рослини кукурудзи; (b) піддавання зразка і зонда жорстким умовам гібридизації; і (с) виявлення гібридизації зонда з ДНК випадку кукурудзи MON89034, причому вказаний зонд включає SEQ ID NО:1 і SEQ ID NО:2. Іншим аспектом даного винаходу є спосіб визначення зиготності потомства випадку кукурудзи MON89034, що включає (а) приведення в контакт зразка, що включає ДНК кукурудзи, з набором праймерів, що включає SQ2842 (SEQ ID NO:6), SQ2843 (SEQ ID NO:7), SQ6523 (SEQ ID NO:10), SQ6524 (SEQ ID NO:11), PB880 (SEQ ID NO:14) і РВ2931 (SEQ ID NO:15), який при використанні в реакції ампліфікації нуклеїнової кислоти з геномною ДНК з випадку кукурудзи MON89034 призводить до утворення першого амплікону, який є діагностичним відносно випадку кукурудзи MON89034; і (b) проведення реакції ампліфікації нуклеїнової кислоти, утворюючи тим самим перший амплікон; і (с) виявлення першого амплікону; і (d) приведення в контакт зразка, що включає ДНК кукурудзи, з вказаним набором праймерів, який при використанні в реакції ампліфікації нуклеїнової кислоти з геномною ДНК з рослин кукурудзи призводить до утворення другого амплікону, що включає кукурудзяну геномну ДНК, що зустрічається в природі, гомологічну кукурудзяній геномній області вставки трансгену, що ідентифікується як випадок кукурудзи MON89034; і (e) проведення реакції ампліфікації нуклеїнової кислоти, утворюючи тим самим другий амплікон; і (f) виявлення другого амплікону; і (g) порівняння першого і другого ампліконів в зразку, причому присутність обох ампліконів вказує на те, що зразок є гетерозиготним за вставкою трансгену. Одним аспектом даного винаходу є забезпечення в їжі лускокрилого шкідника інсектицидно ефективної кількості випадку кукурудзи MON89034. Іншим аспектом даного винаходу є надання композиції або біологічного зразка у формі продукту або харчового продукту, що отримується з випадку кукурудзи MON89034, продукту або харчового продукту, що включає колоски кукурудзи, очищену від лушпиння кукурудзу, кукурудзяний шовк, кукурудзяний пилок, піддану дробленню кукурудзу, кукурудзяне борошно великого помелу, подрібнену кукурудзу, кукурудзяне борошно, кукурудзяну олію, кукурудзяний крохмаль, рідкий кукурудзяний екстракт, кукурудзяний солод, кукурудзяний цукор, кукурудзяний сироп, маргарин, що отримується з кукурудзяної олії, ненасиченої кукурудзяної олії, насиченої кукурудзяної олії, кукурудзяні пластівці, попкорн, етанол і/або напій, отримані з кукурудзи або продуктів кукурудзи, що включає ДНК, яка є діагностичною відносно випадку кукурудзи MON89034, сухі продовольчі товари з барди (DDGS), що отримуються при ферментації такого випадку кукурудзи, і корму для тварин, включаючи такі DDGS і/або кукурудзу, незалежно від того є вона цілою, підданою дробленню або подрібненню, піддані технологічній обробці харчові продукти, косметичний засіб і наповнювач, в яких виявляється кількість полінуклеотиду, що визначається, який є діагностичним відносно присутності випадку трансгенної кукурудзи MON89034 в біологічному зразку. Альтернативним способом надання кукурудзи як харчового продукту є надання кукурудзи в різних формах зерна для харчування, таких як ціла кукурудза, піддана дробленню кукурудза, піддана подрібненню кукурудза, і різних формах вищевказаного в суміші з сорго, ниркоподібним салом, просом, соняшником, вівсом, пшеницею, рисом, бобами і т.п. Кількості нуклеотидної послідовності, що визначаються в такому продукті або харчовому продукті, такі як та, яка визначена в SEQ ID NO:1 або SEQ ID NO:2, або їх комплементах, діагностують присутність ДНК такого трансгенного випадку MON89034 в зразку, і, отже, присутність клітин трансгенного випадку як джерело ДНК в зразку. Вищевказані і інші аспекти даного винаходу стануть більш явними з наступного докладного опису. Фіг. Організація вставки трансгену, присутньої в геномі випадку трансгенної кукурудзи MON89034. Центральна відкрита або біла смуга являє собою вставлену ДНК. Нижче білої смуги знаходиться схема, що являє собою різні елементи у вставленій ДНК. Кінці вставленої ДНК довільно позначені як 5' (з лівого боку фігури) і 3' (з правого боку фігури). Права крайова і ліва крайова послідовності або сегменти відмічені під кожним кінцем схемі, що ілюструє різні елементи у вставленій ДНК. Відміченими елементами в експресійних касетах в межах вставленої ДНК є, в наступному порядку, починаючи з правого краю: промотор e35S, нетрансльована лідерна послідовність CAB пшениці, інтрон актину рису, кодуюча Cry1А.105 послідовність, 3' послідовність термінації і поліаденілування HSP17 пшениці, промотор FMV, інтрон hsp70, послідовність, що кодує пептид для перенесення в хлоропласт невеликої субодиниці Rubisco, кодуюча Сrу2Аb послідовність, інакше не вказана 3' послідовність термінації і поліаденілування і потім лівий край. Вертикально огороджені смуги з кожного з двох кінців центральної відкритої або білої смуги відповідають довільно позначеним 5' і 3' 4 UA 98770 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 фланкуючим послідовностям геному кукурудзи. Найдовша чорна лінія над огородженими смугами і відкритою або білою смугою являє собою SEQ ID NO:5 (повнорозмірну послідовність, представлену на фігурі, що відображає 5' фланкуючу послідовність, послідовність вставленої ДНК і 3' фланкуючу послідовність). Більш короткі чорні лінії вище і нижче чорної лінії, відміченої як SEQ ID NO:5, являють собою приблизні місцеположення в межах SEQ ID NO:5, в яких можна виявити кожну зі спеціально відмічених послідовностей (тобто SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 і SEQ ID NO:4). SEQ ID NO:1 і SEQ ID NO:2 і будь-яка послідовність, що походить з випадку кукурудзи MON89034, що містить SEQ ID NO:1 і/або SEQ ID NO:2, є діагностичними відносно присутності ДНК випадку кукурудзи MON89034 в біологічному зразку. Наступні визначення і способи надані для кращого визначення даного винаходу і напрямку фахівців із середнім рівнем компетентності в даній галузі техніки при здійсненні на практиці даного винаходу. Якщо не відмічене інше, терміни потрібно розуміти відповідно до загальноприйнятого вживання фахівцями із середнім рівнем компетентності в релевантній галузі техніки. Визначення загальних термінів молекулярної біології можна також знайти у Reiger та ін. (Glossary of Genetics: Classical and Molecular, 5th edition, Springer-Verlag: New York, 1991) і Lewin (Genes V, Oxford University Press: New York, 1994). Як тут використовується, термін "кукурудза" означає Zea mays або маїс і включає всі сорти рослини, які можна вивести з кукурудзи, в тому числі дикі види кукурудзи. Як тут використовується, термін "що включає" означає "той, що включає, але без обмеження". Трансгенний "випадок" отримують трансформацією клітин рослини гетерологічної ДНК, тобто конструкцією нуклеїнової кислоти, яка включає представляючий інтерес трансген, регенерацією популяції рослин, що є результатом вставки трансгену в геном рослини, і відбором конкретної рослини, що характеризується вставкою в конкретне місцеположення геному. Термін "випадок" належить до первинного трансформанту і потомства трансформанту, які містять гетерологічну ДНК. Термін "випадок" також належить до потомства, що отримується з допомогою статевого ауткросингу між трансформантом і іншим сортом, який містить гетерологічну ДНК. Навіть після повторного зворотного схрещування до зворотного батька вставлена ДНК і фланкуюча ДНК з трансформованого батька присутня в потомстві від схрещування в тому ж самому місцеположенні в хромосомі. Термін "випадок" також належить до ДНК з первинного трансформанту, що включає вставлену ДНК і фланкуючу геномну послідовність, що безпосередньо примикає до вставленої ДНК, яка, як слід би чекати, передається потомству, що одержує вставлену ДНК, яка включає представляючий інтерес трансген, внаслідок статевого схрещування батьківської лінії, що містить вставлену ДНК (наприклад, первинного трансформанту і потомства, що є результатом самозапилення) і батьківською лінією, що не містить вставленої ДНК. Даний винахід належить до ДНК випадку MON89034, клітин рослини, тканин, насіння і підданих технологічній обробці продуктів, що отримуються з MON89034. Також потрібно розуміти, що дві різних трансгенні рослини можна також схрестити з отриманням нащадків, які містять два незалежно доданих розщепленням, екзогенних гена. При самозапиленні відповідного потомства можна отримати рослину, гомозиготну за обома доданими, екзогенними генами. Як вегетативне розмноження також передбачаються зворотне схрещування до батьківської рослини і ауткросинг з нетрансгенною рослиною. Описи інших способів схрещування, які зазвичай використовуються для різних ознак і сільськогосподарських культур, можна знайти в одному з декількох посилань, наприклад, Fehr, в Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox J. ed., American Society of Agronomy, Madison WI (1987). "Зонд" являє собою виділену нуклеїнову кислоту, до якої приєднана традиційна мітка, що визначається, або репортерна молекула, наприклад, радіоактивний ізотоп, ліганд, хемілюмінесцентний агент або фермент. Такий зонд комплементарній ланцюгу нуклеїнової кислоти-мішені, у випадку даного винаходу ланцюга геномної ДНК випадку кукурудзи MON89034 або з рослини кукурудзи, або із зразка, який включає ДНК цього випадку. Зонди відповідно до даного винаходу включають не тільки дезоксирибонуклеїнові або рибонуклеїнові кислоти, але також поліаміди і інші зондові речовини, які специфічно зв'язуються з послідовністю ДНК мішенню і можуть використовуватися для виявлення присутності цієї послідовності ДНК мішені. "Праймери" являють собою виділені нуклеїнові кислоти, які зазнають відпалу з комплементарним ланцюгом ДНК мішенню за допомогою гібридизації нуклеїнових кислот з утворенням гібриду між праймером і ланцюгом ДНК - мішенню, потім зазнають подовження вздовж ланцюга ДНК - мішені полімеразою, наприклад, ДНК-полімеразою. Пара праймерів даного винаходу належить до їх застосування для ампліфікації послідовності нуклеїнової 5 UA 98770 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 кислоти мішені, наприклад, за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) або інших традиційних способів ампліфікації нуклеїнової кислоти. Довжина зондів і праймерів складає, як правило, 11 нуклеотидів або більше, переважно, 18 нуклеотидів або більше, більш переважно, 24 нуклеотиди або більше і найбільш переважно, 30 нуклеотидів або більше. Такі зонди і праймери специфічно гібридизуються з послідовністюмішенню в умовах гібридизації високої жорсткості. Переважно, послідовності зондів і праймерів відповідно до: даного винаходу повністю схожі з послідовністю-мішенню, хоча за допомогою традиційних способів можна створити зонди, які відрізняються від послідовності-мішені і зберігають здатність гібридизуватися з послідовностями-мішенями. Способи приготування і використання зондів і праймерів описані, наприклад, в Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 (нижче "за Sambrook et al., 1989"); Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel et al., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, 1992) (з періодичними оновленнями) (нижче "за Ausubel et al., 1992") і Innis et al., PCR Protocols: A guide to Methods and Applications, Academic Press: San Diego, 1990. Пару ПЛР-праймерів можна отримати з відомої послідовності, наприклад, за допомогою комп'ютерних програм, призначених для цієї мети, таких як Primer (версії 0.5, © 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA). Праймери і зонди, засновані на фланкуючих ДНК і послідовностях вставок, розкритих тут, можна використовувати для підтвердження (і, якщо необхідно, для коректування) розкритих послідовностей за допомогою традиційних способів, наприклад, з допомогою повторного клонування і секвенування таких послідовностей. Зонди і праймери даного винаходу у вигляді нуклеїнових кислот гібридизуються в жорстких умовах з послідовністю ДНК мішенню. Для встановлення присутності ДНК трансгенного випадку у зразку можна використовувати будь-який традиційний спосіб гібридизації або ампліфікації нуклеїнових кислот. Молекули нуклеїнових кислот або їх фрагменти здатні специфічно гібридизуватися з іншими молекулами нуклеїнових кислот при певних обставинах. Як тут використовується, кажуть, що дві молекули нуклеїнових кислот здатні специфічно гібридизуватися одна з одною, якщо дві молекули здатні утворювати антипаралельні, дволанцюгові структури нуклеїнових кислот. Кажуть, що молекула нуклеїнової кислоти є "комплементом" іншої молекули нуклеїнової кислоти, якщо вони виявляють повну комплементарність. Як тут: використовується, кажуть, що молекули виявляють "повну комплементарність", якщо кожний нуклеотид однієї молекули комплементарній нуклеотиду іншої молекули. Кажуть, що дві молекули "в мінімальній мірі комплементарні", якщо вони гібридизуються одна з одною з міцністю, достатньою для того, щоб дозволити їм залишатися підданими відпалу одна з одною в принаймні загальноприйнятих умовах "низької жорсткості". Аналогічно, кажуть, що молекули "комплементарні", якщо вони гібридизуються одна з одною з міцністю, достатньою для того, щоб дозволити їм залишатися підданими відпалу одна з одною в загальноприйнятих умовах "високої жорсткості". Загальноприйняті умови жорсткості описуються Sambrook та ін. 1989, і Haymes та ін. в Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985). Отже, відходи від повної комплементарності допустимі, поки такі відходи не виключають повністю здатність молекул утворювати дволанцюгові структури. Для слугування молекули нуклеїнової кислоти як праймера або зонда потрібно тільки, щоб її послідовність була досить комплементарна для того, щоб вона могла утворювати стабільну дволанцюгову структуру в конкретних використовуваних розчиннику і концентраціях солі. Як тут використовується, значною мірою гомологічна послідовність являє собою послідовність нуклеїнової кислоти, яка буде специфічно гібридизуватися з комплементом послідовності нуклеїнової кислоти, з якою її порівнюють, в умовах високої жорсткості. Відповідні умови жорсткості, які сприяють гібридизації ДНК, наприклад, 6,0  натрію хлорид/натрію цитрат (SSC) при 45 °C з подальшим промиванням 2,0 SSC при 50 °C, добре відомі кваліфікованим в даній галузі техніки фахівцям, і їх можна знайти в Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Наприклад, концентрацію солі на стадії промивання можна вибрати від низької жорсткості, що складає приблизно 2,0  SSC при 5 °C, до високої жорсткості, що складає приблизно 0,2  SSC при 50 °C. Крім того, температуру на стадії промивання можна збільшити від умов низької жорсткості при кімнатній температурі, приблизно 22 °C, до умов високої жорсткості при приблизно 65 °C. Як температура, так і концентрація солі можуть варіювати, або може залишатися постійною або температура, або концентрація солі, в той час як інша змінна буде змінюватися. У переважному варіанті здійснення нуклеїнова кислота даного винаходу буде специфічно гібридизуватися з однією або декількома молекулами нуклеїнових кислот, визначеними в SEQ ID NO:1 і 2, або їх комплементами або 6 UA 98770 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 фрагментами тих або інших в помірно жорстких умовах, наприклад, в приблизно 2,0SSC і при приблизно 65 °C. В особливо переважному варіанті здійснення нуклеїнова кислота даного винаходу буде специфічно гібридизуватися з однією або декількома молекулами нуклеїнових кислот, визначеними в SEQ ID NO:1 і SEQ ID NO:2, або їх комплементами або фрагментами тих або інших в умовах високої жорсткості. В одному аспекті даного винаходу переважна маркерна молекула нуклеїнової кислоти даного винаходу має послідовність нуклеїнової кислоти, визначену в SEQ ID NO:1 і SEQ ID NO:2 або їх комплементах або фрагментах тих або інших. В іншому аспекті даного винаходу переважна маркерна молекула нуклеїнової кислоти даного винаходу ідентична на 80 %-100 % або 90 %-100 % послідовності нуклеїнової кислоти, визначеної в SEQ ID NO:1 і SEQ ID NO:2, або її комплементу або фрагментам тієї або іншої. У додатковому аспекті даного винаходу переважна маркерна молекула нуклеїнової кислоти даного винаходу ідентична на 95 %-100 % послідовності, визначеній в SEQ ID NO:1 і SEQ ID NO:2, або її комплементу або фрагментам тієї або іншої. SEQ ID NO:1 і SEQ ID NO:2 можна використовувати як маркери в способах схрещування рослин для ідентифікації потомства від генетичних схрещувань, схожих зі способами, описаними для простого аналізу ДНК-маркера у вигляді повтору послідовності в DNA-markers: Protocols, applications, and overviews: (1997) 172185,. Cregan, et al., eds., Wiley-Liss NY; всі з яких повністю включені сюди за допомогою посилання. Гібридизацію зонда з молекулою ДНК мішенню можна виявити за допомогою будьякого ряду способів, відомих кваліфікованим в даній галузі техніки фахівцям, вони можуть включати, але без обмеження, флуоресцентні мітки, радіоактивні мітки, мітки на основі антитіл і хемілюмінесцентні мітки. Відносно ампліфікації послідовності нуклеїнової кислоти мішені (наприклад, за допомогою ПЛР) з використанням конкретної пари праймерів для ампліфікації "жорсткими умовами" є умови, який роблять можливою гібридизацію пари праймерів тільки з послідовністю нуклеїнової кислоти мішенню, з якою зв'язувався б праймер, що має відповідну послідовність дикого типу (або її комплемент), і переважне утворення унікального продукту ампліфікації, амплікону, в термічній реакції ампліфікації ДНК. Термін "специфічний для (послідовності-мішені)" означає, що зонд або праймер гібридизується в жорстких умовах гібридизації тільки з послідовністю-мішенню в зразку, що включає послідовність-мішень. Як тут використовується, "ампліфікована ДНК" або "амплікон" належить до продукту ампліфікації послідовності нуклеїнової кислоти - мішені, яка є частиною матриці - нуклеїнової кислоти. Наприклад, для визначення того, чи містить рослина кукурудзи, що є результатом статевого схрещування, геномну ДНК трансгенного випадку з рослини кукурудзи даного винаходу, ДНК, екстраговану із зразка тканини рослини кукурудзи, можна піддати способу ампліфікації нуклеїнової кислоти з використанням пари праймерів, яка включає праймер, що походить з фланкуючої послідовності в геномі рослини, що примикає до сайту вставки вставленої гетерологічної ДНК, і другий праймер, що походить з вставленої гетерологічної ДНК, для утворення амплікону, який є діагностичним відносно присутності ДНК випадку. Амплікон має довжину і послідовність, які також діагностують цей випадок. Довжина амплікону може знаходитися в діапазоні від об'єднаної довжини пар праймерів плюс одна пара основ нуклеотидів, переважно, плюс приблизно п'ятдесят пар основ нуклеотидів, більш переважно, плюс приблизно двісті п'ятдесят пар основ нуклеотидів і навіть більш переважно, плюс приблизно чотириста п'ятдесят пар основ нуклеотидів. В альтернативному випадку пара праймерів може походити з фланкуючої послідовності з обох сторін вставленої ДНК для того, щоб утворювати амплікон, який включає нуклеотидну послідовність всієї вставки. Член пари праймерів, що походить з геномної послідовності рослини, може знаходитися на відстані від молекули вставленої ДНК, ця відстань може знаходитися в діапазоні від однієї пари основ нуклеотидів до приблизно двадцяти тисяч пар основ нуклеотидів. Використання терміну "амплікон", зокрема, виключає димери праймерів, які можуть утворитися в термічній реакції ампліфікації ДНК. Ампліфікацію нуклеїнової кислоти можна провести будь-яким з різних способів ампліфікації нуклеїнових кислот, відомих в даній галузі техніки, що включають полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР). Множина способів ампліфікації відома в даній галузі техніки і описана, між іншим, в патентах США № 4683195 і 4683202 і в PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, ed. Innis et al, Academic Press, San Diego, 1990. Розроблені способи ампліфікації за допомогою ПЛР для ампліфікації до 22 т.ч. геномної ДНК і до 42 т.ч. ДНК бактеріофага (Cheng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 5695-5699, 1994). Ці способи, а також інші способи, відомі в галузі ампліфікації ДНК, можна використовувати для здійснення на практиці даного винаходу. Послідовність вставки гетерологічної ДНК або фланкуючої послідовність випадку кукурудзи 7 UA 98770 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 MON89034 із зразками насіння, депонованими у вигляді номерів АТСС, можна підтвердити (і скоректувати, якщо необхідно) за допомогою ампліфікації таких послідовностей вказаного випадку, використовуючи праймери, що походять з послідовностей, наданих тут, з подальшим стандартним секвенуванням ДНК отриманого з допомогою ПЛР амплікону або клонованої ДНК. Амплікон, утворений за допомогою цих способів, можна виявити за допомогою множини методів. Одним з таких методів є аналіз генетичних двійкових знаків (Nikiforov, et al. Nucleic Acid Res. 22: 4167-4175, 1994), при якому конструюють ДНК-олігонуклеотид, який перекриває як прилеглу фланкуючу геномну послідовність ДНК, так і вставлену послідовність ДНК. Олігонуклеотид імобілізують в ямку мікроямкового планшета. Після проведення ПЛР представляючої інтерес області (з використанням одного праймера з вставленої послідовності і іншого праймера з прилеглої фланкуючої геномної послідовності) одноланцюжковий продукт ПЛР може гібридизуватися з імобілізованим і; олігонуклеотидом і служити як матриця для реакції подовження на одну основу з використанням ДНК-полімерази і міченими ddNTP, специфічними для наступної очікуваної основи. Прочитання може бути на основі флуоресценції або ELISA. Сигнал означає присутність вставки/фланкуючої послідовності внаслідок успішної ампліфікації, гібридизації і подовження на одну основу. Іншим методом є метод піросеквенування, описаний Winge (Innov. Pharma. Tech. 00: 18-24, 2000). У цьому методі конструюють олігонуклеотид, який перекриває стик прилеглої геномної ДНК і ДНК вставки. Олігонуклеотид гібридизується з одноланцюжковим продуктом ПЛР представляючої інтерес області (з використанням одного праймера з вставленої послідовності і іншого праймера з фланкуючої геномної послідовності) і зазнає інкубації в присутності ДНКполімерази, АТР, сульфурилази, люциферази, апірази, аденозин-5'-фосфосульфату і люциферину. dNTP додають індивідуально, і включення призводить до світлового сигналу, який вимірюють. Світловий сигнал означає присутність вставки трансгену/фланкуючої послідовності внаслідок успішної ампліфікації, гібридизації і подовження на одну або декілька основ. Поляризація флуоресценції, описана Chen та ін. (Genome Res. 9: 492-498, 1999) являє собою метод, який можна використовувати для виявлення амплікону даного винаходу. Використовуючи цей метод, конструюють олігонуклеотид, який перекриває стик геномної фланкуючої і вставленої ДНК. Олігонуклеотид гібридизується з одноланцюжковим продуктом ПЛР представляючої інтерес області (з використанням одного праймера з вставленої послідовності і іншого праймера з фланкуючої геномної послідовності ДНК) і зазнає інкубації в присутності ДНК-полімерази і флуоресцентно мічених ddNTP. Подовження на одну основу призводить до включення ddNTP. Включення можна визначити у вигляді зміни поляризації, використовуючи флуориметр. Зміна поляризації означає присутність вставки трансгену/фланкуючої послідовності внаслідок успішної ампліфікації, гібридизації і подовження на одну основу. Taqman® (РЕ Applied Biosystems, Foster City, CA) описується як метод виявлення і кількісного визначення присутності послідовності ДНК і повністю витлумачений в інструкціях, що надаються виробником. Коротко, конструюють олігонуклеотидний зонд FRET, який перекриває з'єднання геномної фланкуючої і вставленої ДНК. Зонд FRET і праймери для ПЛР (один праймер з послідовності ДНК вставки, а інший праймер з фланкуючої геномної послідовності) зазнають процесу циклічного повторення в присутності термостабільної полімерази і dNTP. Гібридизація зонда FRET призводить до розщеплення і відділення флуоресцентної складової від гасильної складової зонда FRET. Флуоресцентний сигнал означає присутність фланкуючої послідовності/послідовності вставки трансгену внаслідок успішної ампліфікації і гібридизації. Молекулярні маячки описані для застосування для виявлення послідовності, як описано Tyangi та ін. (Nature Biotech. 14: 303-308, 1996). Коротко, конструюють олігонуклеотидний зонд FRET, який перекриває стик фланкуючої геномної і вставленої ДНК. Унікальна структура зонда FRET призводить до того, що він має вторинну структурою, яка містить флуоресцентну і гасильну складові на близькій відстані. Зонд FRET і праймери для ПЛР (один праймер з послідовності ДНК вставки, а інший праймер з фланкуючої геномної послідовності) зазнають процесу циклічного повторення в присутності термостабільної полімерази і dNTP. Після успішної ампліфікації за допомогою ПЛР гібридизація зонда FRET з послідовністю-мішенню призводить до усунення вторинної структури зонда і просторового розділення флуоресцентної і гасильної складових, що призводить до продукції флуоресцентного сигналу. Флуоресцентний сигнал означає присутність фланкуючої послідовності/послідовності вставки трансгену внаслідок успішної ампліфікації і гібридизації. Інші описані методи, такі як мікроструминна техніка (заявка на патент США 2006068398, патент США 6544734), забезпечують способи і пристрої для розділення і ампліфікації зразків ДНК. Описані оптичні барвники, що використовуються для виявлення і кількісного визначення 8 UA 98770 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 специфічних молекул ДНК (WO/05017181). Описані нанотрубні пристрої (WO/06024023), які включають електронний детектор для виявлення молекул ДНК, або наночастинки, які зв'язують специфічні молекули ДНК і потім можуть бути виявлені. Використовуючи розкриті тут композиції, надаються набори для виявлення ДНК. Набори придатні для ідентифікації ДНК випадку кукурудзи MON89034 в зразку і можуть використовуватися принаймні в способах схрещування рослин кукурудзи, що містять ДНК відповідного випадку. Набори містять праймери і/або зонди у вигляді ДНК, які гомологічні або комплементарні сегментам, що вибираються з послідовностей, визначених в SEQ ID NO: 1-7, або праймери або зонди у вигляді ДНК, які гомологічні або комплементарні ДНК, що міститься в трансгенних генетичних елементах ДНК, визначена в списку послідовностей. Ці послідовності ДНК можуть використовуватися в реакціях ампліфікації ДНК або як зонди в способі гібридизації ДНК для виявлення присутності полінуклеотидів, що є діагностичними відносно присутності ДНК-мішені, в зразку. Утворення попередньо визначеного амплікону в термічній реакції ампліфікації ДНК діагностує присутність ДНК, що відповідає ДНК геному РТА-7455, в зразку. Якщо гібридизація є вибраною, виявлення гібридизації зонда з біологічним зразком діагностує присутність ДНК трансгенного випадку MON89034 в зразку. Як правило, зразок являє собою кукурудзу або кукурудзяні продукти або побічні продукти використання кукурудзи. Даним винаходом надається трансгенна рослина кукурудзи, позначена як випадок кукурудзи MON89034, потомство цієї рослини і клітини цієї рослини, а також насіння, отримане від цієї рослини. Типове насіння для вирощування цієї рослини, для отримання потомства, для отримання клітини або для отримання сільськогосподарської культури з вказаного насіння, яке включає випадок трансгенної кукурудзи, було депоноване 28 березня 2006 р. в Американську колекцію типових культур (АТСС) і мають номер надходження РТА-7455. Рослина і клітини, і продукти, що отримується з цих варіантів здійснення, і т.п. містять ДНК, яка є діагностичною відносно присутності ДНК, що походить з будь-якої клітини, яка походить з випадку трансгенної кукурудзи MON89034, в біологічному зразку. Це відбувається тому, що ці дві нові послідовності містяться в клітинах випадку трансгенної кукурудзи MON89034. Діагностична ДНК включає нуклеотидну послідовність, яку вибирають з групи, що складається з SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 і SEQ ID NO:5. Зв'язок цих послідовностей описується тут більш конкретно і в написі до фіг. і з посиланням на фіг. Рослини кукурудзи, розвинені з насіння, яке є гомозиготними за ДНК, що є діагностичною відносно випадку трансгенної кукурудзи MON89034, також знаходяться в межах обсягу даного винаходу. Рослини кукурудзи, розвинені з насіння, яке є гетерозиготними за ДНК, що є діагностичною відносно випадку трансгенної кукурудзи MON89034, також знаходяться в межах обсягу даного винаходу доти, поки це насіння також містить діагностичні послідовності ДНК. Клітини, насіння і тканина, отримані з таких рослин, що містять діагностичну ДНК, також знаходяться в межах обсягу даного винаходу. Рослини кукурудзи і клітини рослини кукурудзи і т.п, що містять ДНК, що є діагностичною відносно випадку трансгенної кукурудзи MON89034, виявляють стійкість до зараження лускокрилими комахами. Ці клітини і рослини містять ДНК, що кодує інсектицидний білок (інсектицид, токсичний агент) Сrу2Аb, і ДНК, що мають нуклеотидну послідовність SEQ ID NO:1 і SEQ ID NO:2, які утворюють частину геному клітин рослини. Ці рослини і клітини рослин також містять ДНК, що кодує інсектицидний білок (інсектицид, токсичний агент) Cry 1 А. 105. Ці білки можуть згадуватися як перший і другий інсектицидні білки, відповідно, або навпаки. Експресія цих білків походить з регуляторних компонентів/генетичних елементів, вбудованих в експресуючі касети, що забезпечують експресію кожної з послідовностей ДНК, які кодують ці токсини і повністю описані тут і в написі до фіг. і з посиланням на фіг., і послідовність, визначену в SEQ ID NO:5. Для захисту рослин від зараження лускокрилими комахами ефективні рослини кукурудзи і клітини рослини кукурудзи, що включають ці послідовності, незалежно від того, чи є вони гетерозиготними або гомозиготними по алелям, в яких ці кодуючі послідовності присутні. Даним винаходом також надаються амплікони, які можуть утворюватися з описаних тут послідовностей, які є діагностичними відносно присутності в біологічному зразку ДНК, що походять з ДНК випадку трансгенної кукурудзи MON89034. Амплікон, який є діагностичним відносно присутності ДНК випадку трансгенної кукурудзи MON89034 в біологічному зразку, містить принаймні один полінуклеотидний сегмент, що складається з нуклеотидної послідовності, визначеної в SEQ ID NO: 1 або SEQ ID NO:2. Ці амплікони можуть утворюватися з використанням послідовностей праймерів, описаних тут нижче, з будь-якого біологічного зразка, який містить принаймні приблизно 0,5 фемтомоль або приблизно 0,5 пікограм ДНК, що походить з випадку трансгенної кукурудзи MON89034. Джерелами ДНК, що відповідає випадку трансгенної кукурудзи MON89034, такого біологічного зразка може бути кукурудзяне борошно 9 UA 98770 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 великого помелу, кукурудзяна олія, кукурудзяний коржик, кукурудзяне насіння, зародок кукурудзи, кукурудзяний крохмаль і кукурудзяне борошно і т.п., що походить з цього трансгенного випадку. Даним винаходом також надаються виділені полінуклеотидні молекули, що демонструють безперервні нуклеотидні послідовності, такі як послідовності, визначені в SEQ ID NO:5. Ці безперервні нуклеотидні послідовності включають (1) від приблизно 11 до приблизно 12000 нуклеотидів і будь-яку проміжну довжину і, крім того, включають безперервні нуклеотиди, визначені в положеннях нуклеотидів 1-11 або 9-20 в SEQ ID NO:1 і 1-11 або 9-20, вказаних в SEQ ID NO:2; (2) будь-яку безперервну нуклеотидну послідовність, визначену в SEQ ID NO: 3 довжиною від приблизно 11 до приблизно 2000 нуклеотидів або будь-якої проміжної довжини, і, крім того, включають безперервні нуклеотиди, визначені в положеннях нуклеотидів 1-11 або 920, вказаних в SEQ ID NO:1; будь-яку безперервну нуклеотидну послідовність, визначену в SEQ ID NO:4 довжиною від приблизно 11 до приблизно 914 нуклеотидів і будь-якої проміжної довжини, і, крім того, включають безперервні нуклеотиди, визначені в положеннях нуклеотидів 1-11 або 9-20, вказаних в SEQ ID NO:2. Ці виділені полінуклеотидні молекули придатні в способах ампліфікації ДНК для утворення одного або декількох ампліконів з біологічного зразка, що містить кукурудзяну ДНК. Виявлення такого амплікону діагностує присутність ДНК випадку трансгенної кукурудзи MON89034 в зразку. Виділені полінуклеотидні молекули також придатні в різних способах виявлення нуклеотидів для виявлення присутності ДНК, що походить з випадку трансгенної кукурудзи MON89034, в біологічному зразку. Зокрема, як зонди в таких способах виявлення ДНК трансгенного випадку MON89034 в зразку придатні полінуклеотидні зонди, що включають принаймні приблизно 11 безперервних нуклеотидів, визначених в SEQ ID NO:1 або SEQ ID NO:2. Комплементарні послідовності цих виділених полінуклеотидних молекул також придатні для тих же способів виявлення і/або ампліфікації. Даним винаходом також надаються набори, що використовуються для виявлення присутності ДНК, що походить з випадку трансгенної кукурудзи MON89034, в біологічному зразку. У наборі використовується зонд у вигляді, полінуклеотидної молекули, молекула зонда, що містить принаймні від приблизно 11 до приблизно 12000 безперервних нуклеотидів, значною мірою гомологічна або значною мірою комплементарна нуклеотидному сегменту, що включає послідовність, визначену в SEQ ID NO:5, була б придатна для виявлення присутності ДНК MON89034 в зразку. Молекула зонда повинна містити принаймні одну з послідовностей, визначених в SEQ ID NO:1 і SEQ ID NO:2. Послідовності, визначені в SEQ ID NO:1 і SEQ ID NO:2, можуть також згадуватися як послідовності стику, тобто послідовності на одному з двох кінців трансгенної ДНК, вставленої в рослину кукурудзи для отримання випадку трансгенної кукурудзи MON89034. Ці послідовності, що довільно згадуються як 5' і 3' кінці, відповідно, містять частину вставленої послідовності ДНК і частину фланкуючої геномної послідовності кукурудзи. Наприклад, SEQ ID NO:1 відтворює на своїй 5'-половині 3'-кінець геномної послідовності кукурудзи, фланкуючої 5'-кінець вставленої ДНК, 5'-кінець вставленої ДНК, представлений 3'-кінцевою половиною послідовності, визначеною в SEQ ID NO:1. SEQ ID NO:2 відтворює на своїй 5'-половині 3'-кінець вставленої ДНК і на своїй 3'-кінцевій половині 5'-кінець геномної послідовності кукурудзи, фланкуючої 3'-кінець вставленої ДНК. У тому геномі кукурудзи, що зустрічається в природі, в положенні вставленої послідовності, визначеній в SEQ ID NO:5, фланкуюча послідовність на 5'-кінці вставленої ДНК і фланкуюча послідовність на 3'кінці вставленої ДНК сполучені, і молекула першого праймера, яка гібридизується з послідовністю, комплементарною послідовності, визначеній в SEQ ID NO:3 (що відрізняється від 21 нуклеотидів 3'-кінця SEQ ID NO:3) і молекула другого праймера, яка гібридизується з послідовністю, визначеною в SEQ ID NO:4, (що відрізняється від 20 нуклеотидів 5'-кінця SEQ ID NO:4) будуть призводити до утворення амплікону в термічній реакції ампліфікації з матрицею, що є ДНК, відмінною від ДНК MON89034, що діагностує відсутність вставленої ДНК в MON89034, і ті ж праймери будуть призводити до утворення амплікону, який трохи більше ніж 12000 нуклеотидів (в залежності від положення праймерів у фланкуючих послідовностях, визначених в SEQ ID NO:3 і SEQ ID NO:4) при використанні ДНК MON89034 як матриця. Надається набір для виявлення послідовності стику SEQ ID NO:I або SEQ ID NO:2 випадку кукурудзи MON89034 в біологічному зразку. Набір містить полінуклеотидний зонд, який являє собою послідовність, що вибирається з групи, яка складається з SEQ ID NO:1 або SEQ ІD NO:2 або їх комплементів. або повністю комплементарної вказаній послідовності, і також містить пару праймерів для застосування в реакції ампліфікації нуклеїнової кислоти. Пара праймерів може згадуватися як перший праймер, що складається і принаймні приблизно 15 приблизно 50 безперервних нуклеотидів з частини геному кукурудзи SEQ ІD NO:3, і другий праймер, що складається з принаймні приблизно 15 приблизно 50 перервних нуклеотидів, комплементарних 10 UA 98770 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 частині гетерологічної ДНК вставки SEQ ID NO:5. Перший праймер пари полінуклеотидних праймерів специфічно гібридизується зі зворотнокомплементарною послідовністю, що відповідає послідовності, визначеній a SEQ ID NO:3 від приблизно положення нуклеотиду 1 по приблизно положення 2050. а другої праймер вкачаної пари полінуклеотидних праймерів специфічно гібридизується з послідовністю, визначеною в SEQ ID NO:5 від приблизно положення нуклеотиду 2060 по приблизно положення нуклеотид) 12208, і довшають а напрямку один до одного з утворенням амплікону, який включає SEQ ID NO:1. при цьому вказаний амплікон є діагностичним відносно присутності ДНК випадку MON89034 в зразку. Відмінна пара праймерів може згадуватися як перший праймер, що складається з принаймні приблизно 15 приблизно 50 безперервних нуклеотидів, комплементарних частині геному кукурудзи SEQ ID NO:4. і другий праймер, що складається з принаймні приблизно 15 приблизно 50 безперервний нуклеотидів з частини гетерологічної, ДHК вставки SEQ ID NO:5. Другий праймер пари полінуклеотидних праймерів специфічно гібридизується зі зворотнокомплементарною послідовністю, відповідною послідовності, визначеній в SEQ ID NO:5 від приблизно положення нуклеотиду І до приблизно положення 11305, а перший праймер пари полінуклеотидних праймерів специфічно гібридизується з послідовністю, визначеною в SEQ ID NO:4 і від приблизно положення нуклеотиду І до приблизно положення нуклеотиду 914, і подовжуються в напрямку один до одного з утворенням амплікону, який включає SEQ ID NO:2. при ньому вказаний амплікон є діагностичним відносно присутності ДНК випадку MON89034 у вказаному зразку. Ці пари праймерів придатні для утворення ампліконів, які включають або SEQ ID NO:1, або SEQ ID NO:2, згідно з випадком, і, отже, є діагностичними відносно присутності ДНК MON89034 в біологічному зразку. Ці амплікони роблять можливим виявлення присутності послідовності стику, що є діагностичною відносно випадку кукурудзи MON89034, в біологічному зразку. Також надається спосіб утворення і виявлення амплікону, який є діагностичним відносно ДНК випадку трансгенної кукурудзи MON89034, в біологічному зразку, що містить ДНК кукурудзи. Спосіб включає приведення в контакт біологічного зразка з двома або більше праймерами в реакції ампліфікації нуклеїнової кислоти, проведення реакції ампліфікації нуклеїнової кислоти, потім виявлення амплікону. Присутність амплікону діагностує ДНК вказаного випадку в зразку доти, поки амплікон містить принаймні одну з безперервних послідовностей, визначених в SEQ ID NO:1 і SEQ ID NO:2, в приблизно положеннях нуклеотидів 1-11 або 9-20, або комплементарні послідовності, що відповідають цим положенням. Нуклеотидні послідовності, які є діагностичними відносно присутності випадку трансгенної кукурудзи MON89034 в біологічному зразку, можна також виявити, використовуючи інші способи. Наприклад, приведенням в контакт біологічного зразка з підозрою на вміст ДНК MON89034 із зондом, яким гібридизується в жорстких умовах гібридизації з однією або більше нуклеотидними послідовностями, визначеними в SEQ ID NO:1 або SEQ ID NO:2, піддаванням зразка і зонда жорстким умовам гібридизації і потім виявленням гібридизації зонда з нуклеотидною послідовністю. Виявлення гібридизації діагностує присутність ДНК MON89034 в зразку. Даним винаходом також надаються праймери у вигляді полінуклеотидів для застосування в утворенні, в термічній реакції ампліфікації, амплікону, який є діагностичним відносно присутності ДНК випадку кукурудзи MON89034 в біологічному зразку. Зазвичай праймери надаються в парах, при цьому члени пари праймерів згадуються, для зручності, як перший праймер і другий праймер. Перший праймер може перебувати з принаймні приблизно 15 безперервних нуклеотидів з частини геному кукурудзи, визначеної в SEQ ID NO:3, а другий праймер може перебувати з принаймні приблизно 15 безперервних нуклеотидів, комплементарних частині гетерологічної ДНК вставки, визначеної в SEQ ID NO:5. Ці два праймери призводили б до утворення амплікону в термічній реакції ампліфікації з матричною ДНК, отриманою з ДНК випадку кукурудзи MON89034, який містить полінуклеотидну послідовність, визначену в SEQ ID NO:1. В альтернативному випадку перший праймер може бути з принаймні приблизно 15 безперервних нуклеотидів з частини геному кукурудзи, визначеної в SEQ ID NO:4, а другий праймер може бути з принаймні приблизно 15 безперервних нуклеотидів, комплементарних частині гетерологічної ДНК вставки, визначеної в SEQ ID NO:5. Ці два праймери призводили б до утворення амплікону в термічній реакції ампліфікації з матричної ДНК, отриманої з ДНК випадку кукурудзи MON89034, який містить полінуклеотидну послідовність, визначену в SEQ ID NO:2. Альтернативний спосіб виявлення послідовності стику випадку кукурудзи MON89034 в біологічному зразку, що містить ДНК кукурудзи, таку як SEQ ID NO:1 або SEQ ID NO:2, складається з приведення в контакт зразка з полінуклеотидним зондом, який гібридизується в 11 UA 98770 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 жорстких умовах гібридизації з однією з послідовностей стику, піддавання зразка і зонда жорстким умовам гібридизації і виявлення гібридизації зонда з послідовністю стику. Виявлення зв'язування/гібридизації зонда з послідовністю стику є індикатором присутності ДНК MON89034 в біологічному зразку. У межах обсягу даного винаходу знаходиться стабільно трансформована рослина кукурудзи, ДНК з якої призводить до утворення ДНК-амплікону, що включає SEQ ID NO:1 або SEQ ID NO:2, при піддаванні способу, вказаному тут. Послідовності праймерів, що наводяться як приклади, зокрема, пари послідовностей праймерів, вказані тут в прикладах і в SEQ ID NO:6 і SEQ ID NO:7. Альтернативний спосіб виявлення присутності ДНК випадку кукурудзи MON89034 в біологічному зразку може складатися зі стадій приведення в контакт зразка із зондом, який гібридизується в жорстких умовах гібридизації з ДНК MON89034 і не гібридизується в жорстких умовах гібридизації з геномною ДНК рослини кукурудзи, яка не є ДНК MON89034, піддавання зразка і зонда жорстким умовам гібридизації і виявлення гібридизації зонда з ДНК MON89034. Відповідний для цього варіанту здійснення зонд є послідовністю, що вибирається з групи, яка складається з SEQ ID NO:1 і SEQ ID NO:2, або комплементарної такій послідовності. Виявлення гібридизації зонда із зразком діагностує присутність полінуклеотиду випадку кукурудзи MON89034 в зразку. Біологічним зразком може бути будь-який зразок, що містить ДНК MON89034, який включає, але без обмеження, кукурудзяну олію, кукурудзяне борошно великого помелу, кукурудзяне борошно, кукурудзяну клейковину, кукурудзяні коржики, кукурудзяний крохмаль, рідкий кукурудзяний екстракт, тканину кукурудзи, клітини кукурудзи, кукурудзяне зерно, пилок кукурудзи, кореневу тканину кукурудзи, DDGS і навіть етанол, що продукується як побічний продукт зброджування такої трансгенної кукурудзи, доти, поки зразок містить принаймні кількість полінуклеотиду, що визначається, який є діагностичним відносно присутності випадку MON89034 в зразку. Полінуклеотидний зонд може бути будь-яким нуклеотидом, що вибираються з групи, яка складається з дезоксирибонуклеїнової кислоти, рибонуклеїнової кислоти і аналога нуклеотиду, і може бути помічений принаймні одним флуорофором, молекулою, що містить радіоактивний ізотоп, або молекулою типу гаптену, яку можна специфічно виявити за допомогою антитіла або іншою реакцією типу зв'язування. Сорт кукурудзи, що містить ДНК, яка є діагностичною відносно присутності ДНК трансгенного випадку MON89034, можна отримати схрещуванням рослини кукурудзи, що містить ДНК випадку трансгенної кукурудзи MON89034, з рослиною кукурудзи, яка відрізняється від випадку MON89034, для отримання гібридної рослини кукурудзи, що містить ДНК, яка є діагностичною відносно вказаного випадку. У межах обсягу даного винаходу знаходиться така гібридна рослина кукурудзи, що містить ДНК, яка є діагностичною відносно випадку трансгенної кукурудзи MON89034, наприклад, насіння, отримане від гібриду (поки воно містить ДНК, що є діагностичною відносно випадку трансгенної кукурудзи MON89034) і пилок, насінний зачаток, насіння, коріння або листя гібридної рослини кукурудзи MON89034, також поки вони містять діагностичні послідовності ДНК, і потомство, що отримується від таких варіантів здійснення даного винаходу. Даним винаходом надається спосіб захисту рослини кукурудзи від зараження лускокрилими комахами, що включає забезпечення в їжі цільового шкідника - лускокрилої комахи однієї або декількох клітин і трансгенної рослини кукурудзи, при цьому кожна клітина рослини кукурудзи містить в своєму геномі полінуклеотид, що відповідає послідовності, визначеній і в SEQ ID NO:1, і в SBQ ID NO:2, і безперервну нуклеотидну послідовність, визначену в SEQ ID NO:5 між SEQ ID NO:1 і SEQ ID NO:2. Подальше годування цільової лускокрилої комахи, яка харчується такими клітинами трансгенної рослини кукурудзи, пригнічується на рослині кукурудзи, з якої походять вказані клітини рослини кукурудзи. Даним винаходом також надаються композиції, що є токсичними для цільових лускокрилих шкідників рослин кукурудзи. Композиція клітин трансгенної рослини, що забезпечується в їжі цільового шкідника - лускокрилої комахи, в якій кожна клітина трансгенної рослини кукурудзи містить в своєму геномі полінуклеотид, що відповідає послідовності, визначеній і в SEQ ID NO:1, і в SEQ ID NO:2, разом з безперервною нуклеотидної послідовністю, визначеною в SEQ ID NO:5 між SEQ ID NO:1 і SEQ ID NO:2. ефективна для забезпечення захисту від зараження лускокрилими комахами рослини кукурудзи або клітини рослини кукурудзи доти, поки рослина кукурудзи або клітина експресують Сry ІА.105 і/або Сгу2Аb2 з експресійних касет, що містяться в безперервній нуклеотидній послідовності. Такі композиції, у формі насіння трансгенної кукурудзи, були депоновані в Американську колекцію типових культур під номером надходження РТА-7455. Такі стійкі до комах рослини кукурудзи, або їх частини, будуть містити ДНК и геномі клітин такої рослини, які мають принаймні одну нуклеотидну послідовність, що вибирається і групи, яка складається з SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 і SEQ ID NO:5. 12 UA 98770 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 В обсяг даного винаходу також включені потомство і насіння стійкої до комах рослини кукурудзи, у яких і тут діагностичні послідовності, що згадуються. Такі стійкі до комах рослини кукурудзи можна отримані способом, що включає схрещування випадку трансгенної рослини кукурудзи MON89034 з відмінною рослиною кукурудзи і відбір стійкого to комах потомства за допомогою аналізу на принаймні одну нуклеотидну послідовність, що вибирається з групи, яка складається з SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 і SEQ ID NO:5. Випадок стійкої до комах трансгенної кукурудзи MON89034 можна об'єднати з іншими трансгенними сортами кукурудзи, такими як кукурудза, стійка до гербіцидів, таких як гліфосат, глюфосинат і діакамба і т.п., або кукурудза, стійка до комах, що знищують коріння, внаслідок вставки послідовностей, що годують такі білки, як PS149B1 і модифікований Сrу3Вb, або іншими сортами трансгенної кукурудзи, стійкої до зараження лускокрилими комахами внаслідок вставки послідовностей, що кодують інші токсичні білки, такі як VIP3a, Cry1Ab і Cry1Fa, і т.п. Різні комбінації всіх цих різних трансгенних випадків схрещують з рослинами кукурудзи даного винаходу, тобто випадком MON89034, для отримання поліпшених сортів гібридної трансгенної кукурудзи, стійкої до зараження жорсткокрилими і лускокрилими і стійкої до вибіркових гербіцидів. Такі сорти виявляють поліпшені вихід і властивості перенести засуху в порівнянні з нетрансгенними сортами і трансгенними сортами з індивідуальною ознакою. Надається спосіб отримання рослини кукурудзи, стійкої до зараження комахами, який включає інсектицидно ефективну кількість кодуючих токсини послідовностей, визначених в SEQ ID NO:5. Спосіб включає виділення кодуючих токсини послідовностей з випадку трансгенної кукурудзи MON89034 і введення цих кодуючих послідовностей, по окремості або разом, в одну або декілька клітин кукурудзи для отримання трансгенних клітин кукурудзи, що містять цю одну або декілька кодуючих токсини послідовностей. Трансгенні клітини кукурудзи потім вирощують (регенерують) в трансгенні рослини кукурудзу, що містить одну або декілька кодуючих послідовностей, і трансгенні рослини потім виявляють стійкість до зараження комахами. Даним винаходом надається спосіб визначення зиготності ДНК трансгенної рослини кукурудзи, що містить ДНК випадку кукурудзи MON89034, по ДНК, яка є діагностичною відносно присутності такої ДНК MON89034 в біологічному зразку. Спосіб складається з, як першої стадії, приведення в контакт зразка з трьома різними праймерами, що включають SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 і SEQ ID NO:10, які при використанні разом в реакції ампліфікації нуклеїнової кислоти, що включає ДНК випадку кукурудзи MON89034, призводять до утворення першого амплікону, який є діагностичним відносно випадку кукурудзи MON89034, а при використанні в реакції ампліфікації нуклеїнової кислоти, що включає геномну ДНК кукурудзу, відмінну від ДНК MON89034, призводять до утворення другого амплікону, який є діагностичним відносно геномної ДНК кукурудзи, відмінної від ДНК MON89034. Подальші стадії складаються з проведення реакції ампліфікації нуклеїнової кислоти і порівняння ампліконів, утвореної під час термічної реакції ампліфікації. Виявлення присутності обох ампліконів діагностує зиготність зразка. Виявлення тільки першого амплікону означає, що зразок містить тільки ДНК MON89034, тобто є гомозиготним зразком. Виявлення тільки другого амплікону означає, що зразок не містить ДНК MON89034. Виявлення і першого амплікону, і другого амплікону разом в зразку означає, що (1) зразок містить гетерозиготну ДНК, яка стосується чистого зразка, що містить тільки гетерозиготний початковий матеріал, або (2) зразок містить і гомозиготну, і гетерозиготну ДНК початкового зразка, або (3) зразок містить деяку комбінацію гомозиготної, гетерозиготної ДНК і/або зразків, відмінних від ДНК MON89034. Даним винаходом також надаються рослини кукурудзи, які ростуть, що містять ДНК, яка є діагностичною у відношенні трансгенного ДНК-сегменту, вставленого в геном клітин рослин кукурудзи. ДНК в геномі клітин кукурудзи включає будь-яку одну або всі послідовності, що вибираються з групи, яка складається з: (а) нуклеотидної послідовності, визначеної в SEQ ID NO:5; (b) обох нуклеотидних послідовностей, визначених в SEQ ID NO:1 і SEQ ID NO:2; (с) нуклеотидної послідовності, визначеної в SEQ ID NO:3; і (d) нуклеотидної послідовності, визначеної в SEQ ID NO:4. Нижченаведені приклади включені для демонстрації прикладів деяких переважних варіантів здійснення даного винаходу. Кваліфікованим в даній галузі техніки фахівцям повинно бути зрозуміло, що методи, розкриті в нижченаведених прикладах, являють собою підходи, які, як виявлено авторами даного винаходу, добре функціонують при здійсненні на практиці даного винаходу, і тому можуть вважатися прикладами переважних варіантів його здійснення на практиці. Однак кваліфікованим в даній галузі техніки фахівцям, в світлі розкриття даного винаходу, повинно бути зрозуміло, що в конкретні розкриті варіанти здійснення даного винаходу 13 UA 98770 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 можна внести багато змін, і все ще отримати подібний або схожий результат, не виходячи за межі суті і обсягу винаходу. ПРИКЛАДИ Приклад 1 У цьому прикладі ілюструється конструювання і молекулярна властивість випадку трансгенної кукурудзи MON89034. Рослину кукурудзи MON89034 отримували за допомогою процесу опосередкованої Agrobacterium трансформації лінії замозапилювальної кукурудзи плазмідною конструкцією pMON38850 (експресійна касета показана на фіг.). Спосіб трансформації, що використовується, схожий зі способом, описаним в патенті США № 6603061. Плазмідна конструкція pMON38850 містить касети, що експресуються в рослинах, зв'язані з регуляторними генетичними елементами, необхідними для експресії інсектицидного білка Cry1A.105 в клітинах рослини кукурудзи. Клітини кукурудзи регенерували в цілі рослини кукурудзи, що складається з принаймні 23000 різних трансгенних випадків. З популяції випадків відбирали індивідуальні трансгенні випадки (рослини), які демонстрували цілісність касет, що експресуються в рослинах, і стійкість до личинок комах ряду Lepidoptera, підтримуючих пошкодження. Рослина кукурудзи, що містить в своєму геномі зв'язані касети, що експресуються в рослинах, pMON38850, являє собою аспект даного винаходу. Після капітального аналізу цих трансгенних випадків відібрали трансгенний випадок MON89034 на основі молекулярної властивості і відсутності будь-яких небажаних фенотипічних або агрономічних ефектів, викликаних недостачею. Послідовності генетичних елементів трансгену, що містяться в геномі кукурудзу MON89034, як проілюстровано на фіг., складаються з наступних елементів, при цьому кожний з них знаходиться в функціональному зв'язку з кожним іншим елементом. По-перше, на довільно визначеному 5' кінці послідовності (тобто біля лівої центральної частини сегмента, зображеного на фіг.) відмічена частина правої крайової ділянки (RB) з Agrobacterium tumefaciens. За нею іде одна за одною експресійна касета, що складається з енхансерного промоторного елемента CaMV.35S (що згадується тут як P-CaMV35SEn, що знаходиться в положеннях 2350-2651 SEQ ID NO:5); нетрансльована лідерна послідовність зв'язуючого з хлорофілом А/В білка пшениці (що згадується тут як L-Ta.lhcbl, що знаходиться в положеннях 2678-2738 SEQ ID NO:5); послідовність інтрону актину рису (що згадується тут як I-Os.Actl, що знаходиться в положеннях 2755-3234 SEQ ID NO:5); послідовність, що не зустрічається в природі, яка кодує химерний ген Сrу1А.105 (що знаходиться в положеннях 3244-6777 SEQ ID NO:5); і 3-кінцева область з пшениці (що згадується тут як Т-Ta.Hsp17-1:1:1, що знаходиться в положеннях 6809-7018 SEQ ID NO:5). Комбінація згаданих вище елементів, відмінних від крайової послідовності, при знаходженні в рослині кукурудзи функціонує разом з викликом експресії інсектицидного білка Cry 1А.105. Ці елементи потім зв'язують одні за іншими з іншою експресійною касетою, що складається з наступних елементів: промотору Figwort mosaic (що знаходиться в положеннях 7086-7649 SEQ ID NO:5), лідерної послідовності Hsp70 Zea mays (що згадується тут як HSP70 або I-Hsp70, що знаходиться в положеннях 7672-8475 SEQ ID NO:5); і послідовності, що кодує пептид для перенесення в хлоропласт Zea mays (що згадується тут як СТР2 або TS-SSU-CTP, що знаходиться в положеннях 8492-8892 SEQ ID NO:5). Ці функціонально пов'язані сегменти потім зв'язують з нуклеотидною послідовністю, що кодує інсектицидний білок Сrу2Аb (що знаходиться в положеннях 8893-10800 SEQ ID NO:5), яка зв'язана на своєму 3'-кінці з нетрансльованою 3' областю гена нопалінсинтази Agrobacterium tumefaciens (що згадується тут як T-AGR.tu.nos-1:1:13, що знаходиться в положеннях 10827-11377 SEQ ID NO:5). Ці елементи, які фланкують кодуючу Сrу2Аb послідовність, функціонують разом для управління експресії Сrу2Аb при знаходженні в рослині кукурудзи. За експресуючою Сrу2Аb касетою потім іде одна за одною нуклеотидна послідовність, що складається із значної частини лівої крайової області (LB) з Agrobacterium tumefaciens. ДНК-молекули, придатні для застосування як праймери в способах ампліфікації ДНК, можуть походити з послідовностей генетичних елементів вставки трансгену, що міститься у випадку MON89034. Ці молекули праймерів можна використовувати як частину набору праймерів, який також включає молекулу ДНК-праймера, що походить з геному випадку, який фланкує вставку трансгену. Частина ДНК плазміди pMON38850, вставлена в геном кукурудзи, трансгенної рослини кукурудзи, що призводить до випадку MON89034, що складається з лівого і правого крайових сегментів і двох зв'язаних касет, що експресуються в рослинах (першої експресійної касети, що кодує Сrу1А.105, і другої експресійної касети, що кодує Сrу2Аb, причому кожна касета може бути взаємозамінною відносно того, що вона може бути призначена бути першою або другою касетою), між крайовими сегментами, була охарактеризована за допомогою детальних 14 UA 98770 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 молекулярних аналізів. Ці аналізи проводили для ідентифікації випадків, що містять тільки один і цілий вставлений сегмент, що складається з крайових областей і двох бажаних експресійних касет між крайовими областями (кількість сайтів інтеграції в межах геному кукурудзи), кількість копій (кількість копій, що використовується для трансформації ДНК в межах одного локусу) і цілісність вставлених генних касет (тобто відсутність будь-якої перебудови або варіації послідовності в порівнянні з послідовністю, яка, як відомо, присутня в плазміді pMON38850). Були використані молекулярні ДНК-зонди, які включали інтактну кодуючу Су1А.105 область і її відповідні регуляторні елементи, промотори, інтрони і послідовності поліаденілування касет, що експресуються в рослинах, і ДНК-область основи плазміди pMON38850. Дані, отримані від аналізів всіх випадків, продемонстрували, що MON89034 містить єдину вставку касетою, що використовується для трансформації ДНК з однією копією експресуючої Cry1А.105. У геномі MON89034 не виявлено додаткових елементів з трансформуючого вектора pMON38850, зв'язаних або незв'язаних з інтактними генними касетами. Нарешті, були проведені ПЛР і аналізи послідовностей ДНК для визначення 5' і 3' стиків вставки з геном рослини, для підтвердження організації елементів в межах вставки (див., наприклад, фіг.) і визначення повної послідовності ДНК, вставленої в геном рослини кукурудзи, трансгенної кукурудзи, що призводять до випадку MON89034. Повна вставлена послідовність, разом з частиною фланкуючих послідовностей геному кукурудзи з кожного з двох кінців вставленої ДНК, зображена в послідовності, визначеній в SEQ ID NO:5. Геномну ДНК з MON89034 і нетрансгенну ДНК з кукурудзи, відмінної від MON89034, (контрольну ДНК) виділяли з насіння кукурудзу, спочатку, переробкою насіння (до 200 насіння) в тонкоподрібнений порошок у струшувачі для фарби Harbil 5G-HD (Harbil Inc, Cincinnati, Ohio). Коротко, порошкоподібне насіння екстрагували в буфер для екстракції (№ в каталозі EM Science 3700, EM Science, Gibbstown, New Jersey, США), і ДНК осаджували з розчину ізопропанолом (№ в каталозі Sigma 1-0398, Sigma, St. Louis, МО, США). Осаджену ДНК зішкрібали в мікроцентрифугальн) пробірку, що місиш, 70 процентів етанолу. ДНК осаджували в мікроцентрифузі при максимальній швидкості (14000 обертів на хвилину) протягом ~ 5 хвилин, сушили піл вакуумом і повторно розчиняли в буфері ТІ (рН 8.0). ДНК потім зберігали в холодильнику при 4 °C. Кваліфікований в даній галузі фахівець може модифікувати цей спосіб для виділення ДНК з одного насіння кукурудзи. Способи, які наводяться як приклади, що використовуються для ідентифікації випадку MON89034 в зразку, описуються в ПЛР Taqman специфічного для випадку кінцевого положення, для якої приклади умов описуються в таблиці 1 і таблиці 2. ДНК-праймерами, що використовуються в цьому аналізі, є праймери SQ2842 (SEQ ID NO:6), SQ2843 (SEQ ID NO:7), ТМ ТМ мічений 6FAM праймер РВ880 (SEQ ID NО:14) і мічений VIC праймер РВ2931 (SEQ ID NO:15). 6FAM і VIC є продуктами Applied Biosystems (Foster City, СА) у вигляді флуоресцентних барвників, приєднаними до ДНК-праймерів. У випадку зондів TAQMAN  MGB 5'-екзонуклеазна активність ДНК-полімерази Taq розщеплює зонд з 5'-кінця, між флуорофором і гасником. При гібридизації з ланцюгом ДНК мішенню гасник і флуорофор досить розділяються в тривимірному просторі з продукуванням флуоресцентного (довжини хвилі збудження флуорофору) сигналу. SQ2842 (SEQ ID NO:6) і SQ2843 (SEQ ID NO:7) при використанні в цих способах реакцій з РВ880 (SEQ ID NO:14) призводять до утворення ДНК-амплікону, який є діагностичним відносно ДНК випадку MON89034. Контролі для цього аналізу повинні включати позитивний контроль з кукурудзи, що містить. ДНК випадку MON89034, негативний контроль з нетрансгенної кукурудзи або з трансгенної кукурудзи, відмінної від випадку MON89034, і негативного контролю, який не містить матричної ДНК. SQ1564 (SEQ ID NO:17) і SQ1565 (SEQ ID NO:18) при використанні в цих способах реакцій з РВ351 (SEQ ID NO:21) призводять до утворення амплікону, який є діагностичним у відношенні Сrу1А.105 в MON89034. Ці аналізи оптимізують для використання з системою для ПЛР Applied Biosystems GeneAmp PCR System 9700 або робоциклером Stratagene, MJ Engine, Perkin-Elmer 9700, або термоциклером Eppendorf Mastercycler Gradient. Інші способи і пристрої, відомі кваліфікованим в даній галузі техніки фахівцям, які дозволяють утворювати амплікони, які ідентифікують ДНК випадку MON89034, знаходяться в межах знань в даній галузі техніки. Будь-який зонд, який специфічно зв'язується з SEQ ID NO:1 або її ідеально комплементарною послідовністю в біологічному зразку і містить принаймні 11 безперервних нуклеотидів, визначених в SEQ ID NO:1, або як можливий випадок зворотнокомплементарної послідовності в SEQ ID NO:1, поки зв'язування може бути виявлене, діагностують присутність ДНК випадку кукурудзи MON89034 в цьому зразку. Будь-який зонд, який специфічно зв'язується з SEQ ID NO:2 або її ідеально комплементарною послідовністю в біологічному зразку і містить 15 UA 98770 C2 5 10 принаймні 11 безперервних нуклеотидів, визначених в SEQ ID NO:2, або як можливий випадок зворотнокомплементарної послідовності в SEQ ID NO:2, поки, ., зв'язування може бути виявлене, діагностує присутність ДНК випадку кукурудзи MON89034 в цьому зразку. У межах обсягу даного винаходу, як вважається, знаходиться будь-яка пара праймерів, що використовується або призначена для використання для утворення амплікону з біологічного зразка, що включає ДНК кукурудзи, і амплікон включає або SEQ ID NO:1, або SEQ ID NO:2, або як можливий випадок він включає обидві ці послідовності. Будь-який такий амплікон, що включає або SEQ ID NO:1, або SEQ ID NO:2, або обидві ці послідовності, вважається, для розкритих тут цілей даного винаходу, діагностичним відносно присутності ДНК випадку кукурудзи MON89034 в такому біологічному зразку. Надається наступний приклад як довідка для кваліфікованого в даній галузі техніки фахівця. Таблиця 1 ПЛР Taqman специфічного для випадку кукурудзи МОN89034 кінцевого положення Стадія 1 2 3 4 5 Реагeнт Вільна від нуклеаз вода 2 X універсальна головна суміш (Applied Biosystems, каталожний  4304437) Праймери SQ2842 (SEQ ID NO:6) і SQ2843 (SEQ ID NO: 7), ресуспендові у вільній від нуклеаз воді до концентрації 20 мкМ, кожний) Мічений 6АМ™ праймер РВ880 (SEQ 1D NO:14) (ресуспендовий у вільній від нуклеаз волі до концентрації 10 мкМ) Праймер внутрішнього контролю SQ2842 і праймер внутрішнього контролю SQ2843 Екстрагована ДНК (матриця): Аналізовані зразки (індивідуальне листя) Негативний контроль 6 Негативний контроль Позитивний контроль Позитивний контроль 7 15 20 Кількість Додати до кінцевого об'єму 10 мкл Коментарі 5 мкл IX кінцева концентрація 0,5 мкл 1,0 мкМ кінцева концентрація 0,2 мкл 0,2 мкМ кінцева концентрація 0,2 мкл 0,2 мкМ кінцева концентрація 3,0 мкл Розведена у воді 4-80 нг геномної ДНК 4 нг геномної ДНК нетрансгенної кукурудзи без ДНК-матриці (розчин, в якому ресуспедована ДНК) 4 нг геномної ДНК і відомою випадку гетерозиготної кукурудзи MON 89034 4 нг геномної ДНК з відомого випадку гомозиготної кукурудзи MON89034 Обережно змішати, додати 1-2 краплі мінерального масла поверх кожної реакції Ампліфікацію ДНК можна налагодити і провести з використанням будь-якого способу термоциклічного повторення, в тому числі ручного маніпулювання або маніпулювання, що електронно контролюється температурними стадіями і циклами. Для ведення наступних параметрів циклічного повторення використовувалися робоциклер Stratagene, MJ Engine, Perkin-Elmer 9700, або термоциклер Eppendorf Mastercycler Gradient, або систему для ПЛР Applied Biosystems GeneAmp PCR System 9700, або термоциклери MJ Research DNA Engine PTC-225. При проведенні ПЛР в Eppendorf Mastercycler Gradient або MJ Engine термоциклер працював циклами розрахованим чином. При використанні Perkin-Elmer 9700 умови повторення циклів супроводжувалися швидкістю відстеження навантаження, встановленою на максимум. 16 UA 98770 C2 Таблиця 2 Умови термоциклеру для аналізу зиготності Установки: система для ПЛР Applied Кількість Biosystems GeneAmp PCR System циклів 9700 1 50 °C 2 хвилини 1 95 °C 10 хвилин 95 °C 15 секунд 64 °C 10 1 хвилина (-1 °C/цикл) 95 °C 15 секунд 30 54 °C 1 хвилина 1 10 °C витримування 5 10 15 20 25 30 35 Приклад 2 У цьому прикладі ілюструються ідентифікація рослини кукурудзи, що містить ДНК, яка є діагностичною відносно випадку трансгенної кукурудзи MON89034, в своєму геномі, і визначення зиготності такої рослини кукурудзи. Способи, що використовуються для ідентифікації гетерозиготного відносно гомозиготного потомства, що містить ДНК випадку MON89034 в своєму геномі, описуються в аналізі зиготності, для якої умови наводяться як приклади в таблиці З і таблиці 4. ДНК-праймерами, які наводяться як приклади, що використовуються в аналізі зиготності, є праймери SQ2842 (SEQ ID NO:6), SQ2843 (SEQ ID NO:7), SQ6523 (SEQ ID NO:10), SQ6524 (SEQ ID NO:11), мічений 6FAM™ праймер РВ880 (SEQ ID NO:14) і мічений VIC™ праймер РВ2931 (SEQ ID NO:15). Як указано вище, 6FAM і VIC є продуктами Applied Biosystems (Foster City, CA) у вигляді флуоресцентних барвників, приєднаними до ДНК-праймеру. SQ2842 (SEQ ID NO:6), SQ2843 (SEQ ID NO:7), SQ6523 (SEQ ID NO:10), SQ6524 (SEQ ID NO:11) при використанні разом з термічною реакцією ампліфікації, в якій біологічний зразок, що містить матричну ДНК, містить ДНК, що є діагностичною відносно присутності випадку кукурудзи MON89034 в зразку, призводять до утворення ДНК-амплікону, що є діагностичним відносно ДНК кукурудзи, відмінної від ДНК випадку кукурудзи MON89034 (незалежно від того, чи отримана ДНК кукурудзи з нетрансгенного або деякого іншого трансгенного зразка). В альтернативному випадку в реакції будуть утворюватися два різних ДНК-амплікони з біологічного зразка, що містить ДНК, що походить з геному кукурудзи, який є гетерозиготним по алелю, що відповідає вставленій ДНК, присутній у випадку трансгенної кукурудзи MON89034. Ці два різних амплікони будуть відповідати першому амплікону, який походить з локусу геному кукурудзи дикого типу, і другого амплікону, який є діагностичним відносно присутності ДНК випадку кукурудзи MON89034. Зразок ДНК кукурудзи, який призводить до отримання тільки одного амплікону, що відповідає другому амплікону, описаному для гетерозиготного геному, діагностують присутність випадку кукурудзи MON89034 в зразку і є діагностичним для визначення того, що ДНК кукурудзи, використана як матриця, походить з насіння кукурудзи, яке є гомозиготним по алелю, відповідному вставленій ДНК випадку трансгенної кукурудзи MON89034. Контролі для цього аналізу повинні включати позитивний контроль з гомозиготної і гетерозиготної кукурудзи, що містить ДНК випадку MON89034, негативний контроль з нетрансгенної кукурудзи або будь-якого іншого трансгенного сорту кукурудзи, і негативний контроль, який не містить матричної ДНК. Цей аналіз оптимізують для використання з робоциклером Stratagene, MJ Engine, Perkin-Elmer 9700 або термоциклером Eppendorf Mastercycler Gradient. Інші способи і пристрої, відомі кваліфікованим в даній галузі техніки фахівцям, які дозволяють утворювати амплікони, які ідентифікують зиготність потомства від схрещувань, що проводяться з рослинами MON89034, знаходяться в межах знань в даній галузі техніки. 17 UA 98770 C2 Таблиця 3 Рішення реакцій для аналізу зиготності Стадія 1 2 3 4 5 6 Реагент Кількість Додати до кінцевого об'єму 5 мкл Вільна від нуклеаз вода 2 X універсальна головна суміш (Applied Biosystems, каталожний # 4304437) Праймери SEQ ID NO:6 і SEQ ID NO: 7, (ресуспендовані у вільній від нуклеаз воді до концентрації 20 мкМ) ТM Мічений 6FAM праймер РВ880 (SEQ ID NO: 14) (ресуспендований у вільній від нуклеаз воді до концентрації 10 мкМ) TM Мічений VIC праймер РВ2931 (SEQ ID NO: 15) (ресуспендований у вільній від нуклеаз воді до концентрації 10 мкМ) ДНК-полімераза REDTaq (1 единица/мкл) Екстрагована ДНК (матриця): Аналізовані (індивідуальне листя) 2,5 мкл 1 X кінцева концентрація 0,05 мкл 0,25 мкМ кінцева концентрація 0,01 мкл 0,4 мкМ кінцева концентрація 0,01 мкл 0,15 мкМ кінцева концентрація 1,0 мкл (рекомендується замінити піпетки до наступної стадії) 1 одиниця/реакцію зразки 4-80 нг геномної ДНК 4 нг геномної ДНК нетрансгенної кукурудзи без ДНК-матриці (розчин, в - якому ресуспендована ДНК) 4 нг геномної ДНК з відомого випадку гетерозиготної кукурудзи MON89034 4 нг геномної ДНК з відомого випадку гомозиготної кукурудзи MON89034 Негативний контроль 7 Позитивний контроль Позитивний контроль 5 2,0 мкл Негативний контроль 8 Коментарі Розведена у воді Обережно змішати, додати 12 краплі мінерального масла поверх кожної реакції Для ведення наступних параметрів циклічного повторення успішно використовувалися ампліфікації ДНК в робоциклері Stratagene, MJ Engine, Perkin-Elmer 9700, або термоциклері Eppendorf Mastercycler Gradient, або системі для ПЛР Applied Biosystems GeneAmp PCR System 9700, або термоциклері MJ Research DNA Engine PTC-225. При використанні Eppendorf Mastercycler Gradient або MJ Engine цикли повторювали розрахованим чином. При використанні Perkin-Elmer 9700 цикли повторювали зі швидкістю відстеження навантаження, встановленою на максимум. 10 18 UA 98770 C2 Таблиця 4 а Умови термоциклеру для аналізу зиготності Кількість циклів в наступному Температура і тривалість порядку 1 50 °C 2 хвилини 1 95 °C 10 хвилин 95 °C 15 секунд 64 °C 1 10 хвилина (- 1 °C/цикл) 95 °C 15 секунд 54 °C 1 30 хвилина 1 10 °C витримування 5 10 15 а: використовуючи систему для ПЛР Applied Biosystems GeneAmp PCR System 9700 Насіння, що відповідає трансгенному випадку MON89034, було депоноване 28 березня 2006 р. згідно з Будапештською угодою в Американську колекцію типових культур (АТСС), 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110. Номером надходження в АТСС або позначенням патентного депонування є РТА-7455. Депонований матеріал буде зберігатися в депозитарії протягом періоду, що становить 30 років, або 5 років після останнього запиту, або протягом терміну дії патенту, що довше, і буде замінюватися, якщо необхідно, під час цього періоду. Після ілюстрації і опису принципів даного винаходу кваліфікованим в даній галузі техніки фахівцям повинно бути зрозуміло, що компонування і деталі даного винаходу можна модифікувати, не виходячи за межі таких принципів. Автори даного винаходу заявляють права на всі модифікації, які знаходяться в межах суті і обсягу прикладеної формули винаходу. Всі публікації і опубліковані патентні документи, процитовані в цьому описі, включені сюди за допомогою посилання в тій же мірі, як якби було спеціально і індивідуально вказано для кожної індивідуальної публікації або заявки на патент, що вона включена за допомогою посилання. 19 UA 98770 C2 5 Список послідовностей MONSANTO ТЕСNOLOGY LLC Anderson, HEATHER Douglas, Jennifer GROAT, JEANNA JOHNSON, SCOTT KELLY, REBBECCA KORTE, JOHN RICE, JAMES 10 РОСЛИНА КУКУРУДЗИ I НАСІННЯ, ЯКІ ВІДПОВІДАЮТЬ ТРАНСГЕНHOМУ ВИПАДКУ МОN89034, І СПОСОБИ ЇЇ ВИЯВЛЕННЯ І ЗАСТОСУВАННЯ 11899.0260.00РС00 15 PCT/US2007/069662 2007-05-24 20 60/808,834 2006-05-26 22 Патент версії 3.3 25 1 21 ДНК ШТУЧНА 30 5 послідовність стику, що відповідає SEQ ID NO:5 в положеннях 2051-2071 35 40 1 aatgagtatg atggatcagc a 2 20 ДНК ШТУЧНА 21 3' послідовність стику, що відповідає SEQ ID NO:5 в положеннях 11295-11314 2 actcattgca tccccggaaa 20 45 3 2071 ДНК ШТУЧНА 50 20 UA 98770 C2 21 UA 98770 C2 22 UA 98770 C2 23 UA 98770 C2 24 UA 98770 C2 25 UA 98770 C2 26 UA 98770 C2 27 UA 98770 C2 28