Спосіб отримання ембріонів свиней in vitro з використанням наноматеріалу

Реферат: Спосіб отримання ембріонів свиней in vitro з використанням наноматеріалу включає в себе вилучення та оцінку ооцит-кумулюсних комплексів із яєчників свиноматок, культивування відібраних ооцитів in vitro до метафази-II, запліднення їх in vitro сперматозоїдами кнурів, культивування отриманих ембріонів. Використовують середовище NCSU-37, що містить наноматеріал ВДК-200 (високодисперсний кремнезем вітчизняного виробництва, м. Калуш, 2 Івано-Франківської обл.) з Sпит=285 м /г, поверхня якого перед експериментом була оброблена упродовж 2 годин при температурі 200 °C. UA 105511 U (12) UA 105511 U UA 105511 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до класу сільського господарства, безпосередньо до репродуктивної сільськогосподарської біотехнології, та може бути використана для одержання ембріонів свиней in vitro, їх пересадки реципієнтам або кріоконсервування у рідкому азоті з метою збереження та раціонального використання генофонду вітчизняних порід свиней. Нині ведуться інтенсивні розробки та удосконалюються ембріологічні та генетичні методи відтворення сільськогосподарських тварин. Але ефективність одержання біологічно повноцінних ембріонів в умовах in vitro, порівняно з одержаними in vivo ембріонами, все ще має не завжди високі та стабільні результати. Тому наразі оптимізації середовищ для культивування репродуктивних клітин приділяється значна увага спеціалістів галузі біотехнології. Сучасні нанотехнології інтенсивно використовують у різних галузях науки та техніки, зокрема біотехнології, сільському господарстві, медицині [6, 7]. Сформовані поза організмом доімплантаційні ембріони є джерелом дешевого біоматеріалу для експериментальних робіт [1]. Крім того, методи отримання in vitro ембріонів ссавців дають змогу вивчати морфологічні, цитогенетичні і молекулярно-генетичні особливості раннього ембріогенезу. Оскільки ембріональний розвиток є результатом взаємозв'язку ембріонів з статевими шляхами самки у ембріонів, які культивуються in vitro, існує "блок" розвитку. У свиней це 4-клітинна стадія, яка пов'язана з початком синтезу РНК. Вирішальним чинником для успішного культивування ембріонів поза організмом є склад середовища, який повинен задовольняти потреби ембріона в поживних речовинах і відповідати особливостям метаболізму клітин in vitro [9]. Аналогом корисної моделі є отримання ембріонів свиней на основі формування зрілої яйцеклітини і попередньої оцінки стану ооцитів [2], яким передбачено виділення яєчників свинок, виділення фолікулів, морфологічна оцінка фолікулів, аспірація фолікулярної рідини, отримання стінок фолікулів, виділення ооцит-кумулюсних комплексів, комплексна морфофункціональна оцінка ооцитів, культивування ооцитів, запліднення яйцеклітин, культивування ембріонів та оцінка мітохондріальної активності. Недоліком аналога є трудомісткість отримання ембріонів свиней in vitro з використанням різних систем дозрівання ооцитів, зниження життєздатності гамет через тривалий час їх вилучення, використання високовартісних тест-систем для оцінки життєздатності ооцитів. Найбільш близьким за технічними характеристиками до заявленого способу є: Спосіб отримання ембріонів свиней in vitro (патент Російської Федерації № 2340177) [3]. Спосіб базується на відокремленні яєчників від тварин після забою, їх транспортування, вилучення ооцит-кумулюсних комплексів із яєчників, культивуванні ооцитів до стадії метафази-II, підготовку сперми кнурів, спільне культивування яйцеклітин і сперматозоїдів та культивування зигот. Отримані зиготи культивують в середовищі NCSU-23, що не містить феноловий червоний, збагачений 0,1 % амінокислот протягом 6-7 днів; перші три доби в середовище NCSU-23 додатково вводять 0,17 мМ Na-пірувата і 2,75 мМ Na-лактату. Недоліки прототипу полягають у обмеженні часових параметрів вилучення (30 хв.) та доставки яєчників (до 1 год.), культивування гамет у різних групах, залежно від оточуючих клітин кумулюсу, запліднення яйцеклітин тільки нативною спермою, що негативно впливає на технологічність проведення досліджень. Також неможливість отримання ембріонів з деконсервованих і дозрілих яйцеклітин свинок, крім того не забезпечують необхідну запліднюючу здатність яйцеклітин та їх наступний ембріональний розвиток. Заявлений нами спосіб отримання ембріонів свиней in vitro із використанням наноматеріалу усуває недоліки прототипу і забезпечує одержання високої кількості зигот. В основу корисної моделі поставлено задачу якісного відбору яєчників за морфологічними ознаками, вилучення ооцит-кумулюсних комплексів свинок із яєчників після їх транспортування, оцінка гамет за морфологічними ознаками, культивування ооцитів до метафази-II мейозу, спільне інкубування яйцеклітин і сперматозоїдів, культивування запліднених яйцеклітин (зигот) з додаванням 0,001 % наноматеріалу ВДК-200, що є простим у виконанні та застосуванні. Цим зумовлена ефективність методу. Поставлена задача вирішена тим, що спосіб отримання ембріонів свиней in vitro із використанням наноматеріалу включає отримання ембріонів як з нативних ооцитів так і з деконсервованих, запліднення прокультивованих і дозрілих яйцеклітин як нативною так і деконсервованою спермою кнурів. В роботі використовують високодисперсний кремнезем (ВДК) із гідроксильованою поверхнею марки А-300 (технічна назва аеросил) із питомою площею 2 поверхні Sпит=285 м /г (м. Калуш Івано-Франківської обл.). Температура попередньої підготовки поверхні наноматеріалу становила 200 °C продовж двох годин на повітрі в підігрівальній шафі, після чого він зберігається в посудині, яка ретельно закрита від вологи повітря. 1 UA 105511 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Спосіб отримання ембріонів свиней in vitro із використанням наноматеріалу включає ознаки, що відрізняють заявлену корисну модель від прототипу: відсутність негативного впливу наноматеріалу на життєздатність гамет, поверхня ВДК організована так, що здатна заміщати свої гідроксильні групи на різні сполуки і біомолекули. В результаті цього нанорозмірні частинки ВДК (4-40 нм) використовуються як матриця для синтезу наноматеріалу. Такий підхід забезпечує пролонговану дію речовин, які іммобілізуються на поверхні носія. При застосуванні як добавки в стандартні середовища для одержання ембріонів свиней in vitro та їх пересадки реципієнтам або кріоконсервування у рідкому азоті з метою збереження та раціонального використання генофонду тварин. Основні етапи технологічного процесу наступні: відбір яєчників за морфологічними ознаками після забою, їх транспортування, виділення ооцит-кумулюсних комплексів із яєчників, оцінку їх за морфологічними ознаками, культивування ооцитів до стадії метафази-II мейозу, капацитацію сперматозоїдів кнура, спільне інкубування яйцеклітин і сперматозоїдів, культивування запліднених яйцеклітин та ембріонів. Яєчники доставлялися в лабораторію не пізніше як через 1,5-2 години після забою тварин із СВАТ "Агрокомбінат "Калита" Броварського району, Київської області, у термосі зі стерильним фізіологічним розчином (0,9 % NaCl) та антибіотиками (100 од/мл пеніциліну і 100 мкг/мл стрептоміцину) за температури +32 - +38 °C. Для отримання ооцит-кумулюсних комплексів використовували яєчники свинок на стадії фолікулярного росту або із пізнім жовтим тілом, в яких спостерігали велику кількість видимих антральних фолікулів. Ооцити отримували надрізаючи лезом видимі антральні фолікули, вимивали середовищем Дюльбекко з 1 од/мл гепарину (Sigma, D5652) і 40 од/мл гентаміцину та три-чотири рази відмивали у середовищі 199 (Sigma, M2520), яке містило 10 % попередньо інактивованої (+56 °C, 30 хв.) сироватки крові корів та оцінювали за морфологічними ознаками. Дозрівання ооцитів поза організмом проводили в 1 мл культурального середовища, в чотирилункових планшетах упродовж 45 год. за температури +38,5 °C та 5 %-ному вмісті СО2 в повітрі, у краплях середовища 199 (Sigma, M5017) з 20 %-ною попередньо інактивованою еструсною сироваткою крові корів та з додаванням 2,0 мМ натрію пірувату (Sigma, P5280), 2,92 мМ кальцію лактату (Sigma, L7900), 40 мкг/мл гентаміцину. Спільне інкубування яйцеклітин і сперматозоїдів 6 (концентрація їх була 1-3 × 10 сперматозоїдів в 1 мл) проводили в термостаті за температури +38,5 °C та 5 %-ному вмісті СО2 в повітрі, у краплях середовища Fert.-TALP. Після 12-18 годин спільного інкубування яйцеклітини і зиготи відмивали від прилиплої сперми і переносили в краплі середовища NCSU-23 для подальшого культивування після запліднення in vitro за температури 38,5 °C та 5 %-ному вмісті СO2 в повітрі з додаванням наноматеріалу. Корисна модель може бути використана у селекційних центрах, господарствах різних форм власності, науково-дослідних установах, ВУЗах для одержання ембріонів in vitro, збереження генофонду, поглиблення знань ембріонального розвитку ссавців і тому відповідає критерію корисної моделі "промислова придатність". Для оцінки ефективності заявленого способу отримання ембріонів свиней in vitro із використанням наноматеріалу було проведено досліди. Дослід 1. Незрілі ооцит-кумулюсні комплекси свиней вилучали із яєчників свинок і культивували в середовищі 199 (Sigma, M5017) з додаванням 20 % еструсної сироватки крові 6 корів і 3-5 × 10 клітин гранульози/мл. Для культивування in vitro відбирали ооцити із щільним та розпушеним кумулюсом. Критерієм морфологічної оцінки дозрівання ооцитів була наявність першого полярного тільця. Видалення розріджувача та відбір рухливих сперматозоїдів кнура 2+ проводили в модифікованому середовищі TALP без іонів Са [10]. Сперматозоїди спільно інкубували in vitro із яйцеклітинами (18 год.) в середовищі TALP-IVF з додаванням суміші РНЕ (20 мкМ пеніциламіну, 10 мкМ гіпотаурину та 1 мкМ епінефрину) і розчину гепарину (10 мкг/мл). Після співкультивування зиготи переносили в середовище NCSU-37 (North Carolina State Universiry-37) [8] в яке додавали 0,001 % ВДК-200. Культивування ембріонів свиней in vitro проводили протягом 5-6 днів. Рівень дозрівання ооцитів in vitro, запліднення та аналіз стану хроматину ядер ембріонів вивчали шляхом оцінки сухоповітряних препаратів, які готували за допомогою модифікованого методу А. Тарковського [4]. Аналіз препаратів проводили під світловим мікроскопом при 1201000 кратному збільшенні. Результати подані в таблиці. 55 2 UA 105511 U Таблиця Ефективність отримання ембріонів свиней in vitro із використанням наноматеріалу ВДК-200 Група Кількість зигот, n Дослідна Контрольна 127 121 Рівень дроблення ембріонів in vitro, n (% ± m) а 51 (40,2±4,4) b 44 (36,4±4,4) ранніх морул, n (% ± m) c 35 (27,6±4,0) d 14 (11,6±2,9) 2 а:b -р < 0,05, c:d -р < 0,01, критерій x [5]. Різні суперскрипти у межах однієї колонки вказують на вірогідну різницю між показниками. 5 Дослід 2. ВДК-200 в 0,001 %-ї концентрації додавали до деконсервованих та запліднених яйцеклітин (зигот) свиней (варіант досліду - А). Варіант досліду (Б) - деконсервовані та запліднені яйцеклітини культивували без додавання 0,001 % ВДК-200. Встановлено, що рівень дроблення in vitro ембріонів свиней із деконсервованих гамет за використання 0,001 %-ї концентрації наноматеріалу у середовищі їх культивування був вищим на 11,1 %, порівняно з контролем. Результати подані в таблиці. Таблиця Вплив 0,001 % концентрації ВДК-200 на ефективність розвитку ембріонів in vitro із деконсервованих яйцеклітин свинок Варіанти досліду Кількість клітин, що підлягали заплідненню in vitro 2 клітин n Кількість ембріонів на стадіях 3-4 клітин 5-8 клітин % n n % % п % 28 18,1 ±3,1 bc 13 8,4 ±2,2 17 11,5 ±2,6 b 7 4,7 ±1,7 а а А 155 57 36,8 ±3,9 46 Б 148 38 25,7 ±3,6 b 27 9-16 клітин 29,7 ±3,7 b 18,2 ±3,2 ab a а:b - Р