Спосіб виявлення початку порушень енергетичного обміну в ішемізованій м’язовій тканині

Реферат: Винахід належить до галузі медицини, а саме до лабораторної діагностики, та стосується способу виявлення початку порушень енергетичного обміну в ішемізованій м'язовій тканині, який включає визначення у сироватці крові активності креатинфосфокінази (КФК) та в м'язовій тканині експериментальної тварини вмісту аденозинтрифосфату (АТФ) на 3-ю добу після лігування й подальшого перерізу стегнової артерії щурів, а також порівняння одержаних вимірів з контролем, причому у сироватці крові дослідної тварини додатково визначають активність лактатдегідрогенази (ЛДГ), і при зниженні вмісту АТФ у межах 2714,2±25,84 мкмоль/кг, зниженні активності КФК у межах 2194,05±42,38 МО/л і збільшенні активності ЛДГ у межах 714,27±6,98 МО/л констатують початок порушень енергетичного обміну в м'язовій тканині останніх. UA 114453 C2 (12) UA 114453 C2 UA 114453 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до галузі медицини, а саме до лабораторної діагностики, і може бути використаний для поліпшення результатів виявлення початкових проявів порушення енергетичного обміну при ішемії м'язів. Актуальність предмету винаходу пов'язана з суттєвим підвищенням частоти розвитку оклюзійних захворювань судин у людей, особливо нижніх кінцівок, що призводить до необхідності у високій ампутації, зниження якості їх життя й значної загальної смертності. Останнє пов'язано, насамперед, з недостатньо своєчасною діагностикою цієї патології. У той же час, ще мало даних про біохімічні особливості енергетичного обміну в ішемізованій м'язовій тканині. Тому вельми важливими є спроби виявлення нових, патогенетично значущих тестів початку порушень енергетичного обміну, зокрема при ішемії нижніх кінцівок (ІНК). Відомий спосіб виявлення порушень енергетичного обміну в ішемізованій тканині, який передбачає дослідження в ній активності процесів вільнорадикального окислення [Лукьянова Л.Д. Молекулярные механизмы тканевой гипоксии и адаптации организма / Л.Д. Лукьянова // Фізіологічний журнал. - 2003. - Т. 49, № 3. - С. 17-35]. Однак активація вільнорадикальних процесів спостерігається вже під час термінальної стадії енергетичних порушень і тому вказаний спосіб не дозволяє оцінювати саме ранній розвиток змін останніх. Існує також спосіб виявлення порушень енергетичного обміну в ішемізованій тканині, що включає дослідження стану процесу перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) за рівнем у плазмі крові його первинних і вторинних продуктів - дієнових кон'югатів і малонового діальдегіду [Телкова И.Л. Клинические и патофизиологические аспекты влияния хронической гипоксии/ишемии на энергетический метаболизм миокарда / И.Л.Телкова, А.Т.Тепляков // Клиническая медицина. - 2004. - № 3. - С. 4-11]. Але посилення процесів ПОЛ має місце теж уже в термінальній стадії енергетичних порушень. Крім того, цей спосіб має обмежену інформативність у зв'язку з тим, що зміни величин продуктів ПОЛ у відповідь на будь-яку патологію є універсальною біологічною реакцією, яка безумовно не є специфічною для м'язової тканини. Тому був запропонований спосіб виявлення порушень енергетичного обміну в ішемізованій тканині шляхом виявлення в ній концентрації аденозинтрифосфату (АТФ), зміни вмісту якого корелюють з мітохондріальними порушеннями, що виникають при ішемії й передують змінам інших функціонально-метаболічних параметрів, які контролюють життєдіяльність клітин, а також визначення активності креатинфосфокінази (КФК), одного з основних ферментів, які характеризують ішемічне пошкодження скелетної мускулатури [Вгаг В. Urocortin protection of cardiac myocytes from lethal ischemia is mediated by Markinase / B. Brar, A. Jonassen, A. Stephanou // European Heart Journal. - 1999. - № 20. - P. 20-24]. Даний спосіб виявлення початку порушень енергетичного обміну в ішемізованій м'язовій тканині є найбільш близьким до того, що заявляється, за технічною суттю і результатом, який може бути досягнутим, тому його вибрано за прототип. До недоліків способу-прототипу належить те, що він, хоча й передбачає виявлення показників, характерних для початкової стадії біоенергетичної гіпоксії, але не самих інформативних і загальноприйнятих. В основу винаходу поставлено задачу підвищення ефективності відомого способу виявлення порушень енергетичного обміну в ішемізованій тканині, а саме використання показників, що найбільш суттєво й вірогідно змінюються в сироватці крові вже при початкових порушеннях цього обміну, що створює умови для застосування способу й в клініці. Задачу, яку поставлено в основу винаходу, вирішують тим, що у відомому способі виявлення початку порушень енергетичного обміну в ішемізованій м'язовій тканині, який включає визначення у сироватці крові активності креатинфосфокінази (КФК) та в м'язовій тканині експериментальної тварини вмісту аденозинтрифосфату (АТФ) на 3-ю добу після лігування й подальшого перерізу стегнової артерії щурів, а також порівняння одержаних вимірів з контролем, згідно з винаходом, у сироватці крові дослідної тварини додатково визначають активність лактатдегідрогенази (ЛДГ), і при зниженні вмісту АТФ у межах 2714,2±25,84 мкмоль/кг, зниженні активності КФК у межах 2194,05±42,38 МО/л і збільшенні активності ЛДГ у межах 714,27±6,98 МО/л констатують початок порушень енергетичного обміну в м'язовій тканині останніх. Технічний ефект винаходу, а саме підвищення ефективності відомого способу виявлення порушень енергетичного обміну в ішемізованій тканині, а саме використання показників, що найбільш суттєво й вірогідно змінюються в сироватці крові вже при початкових порушеннях цього обміну, що створює умови для застосування способу й в клініці, обумовлений синергізмом заходів та засобів, які заявляються. 1 UA 114453 C2 5 10 15 20 25 30 Наша пропозиція щодо визначення вмісту АТф в м'язовій тканині експериментальної тварини, а також активності КФК і ЛДГ у сироватці крові хворих і щурів з метою виявлення початкових проявів порушень енергетичного обміну в ішемізованих м'язових тканинах базується на вперше встановленій авторами заявленого способу в експериментальних умовах і в подальшому підтвердженій в клініці закономірності, яка полягає в тому, що вже для першої стадії біоенергетичної гіпоксії характерне не тільки зниження вмісту АТФ у самих ішемізованих м'язових тканинах експериментальних тварин, а й суттєве падіння активності КФК, а також підвищення такої ЛДГ у сироватці крові щурів і хворих, що дозволяє використовувати ці показники не тільки в експериментальних дослідженнях, а й в клініці як додаткові об'єктивні біохімічні маркери ранніх порушень досліджуваного обміну. Раніше запропоновані показники як критерії оцінки початкових порушень енергетичного обміну в ішемізованій м'язовій тканині не використовувалися. Заявлений спосіб здійснюють таким чином. Визначають у сироватці крові експериментальної тварини активність креатинфосфокінази (КФК) та в м'язовій тканині - вміст аденозинтрифосфату (АТФ) на 3-ю добу після лігування й подальшого перерізу стегнової артерії щурів, а також порівнюють одержані виміри з контролем. У сироватці крові дослідної тварини додатково визначають активність лактатдегідрогенази (ЛДГ). При зниженні вмісту АТФ у межах 2714,2±25,84 мкмоль/кг, зниженні активності КФК у межах 2194,05±42,38 МО/л і збільшенні активності ЛДГ у межах 714,27±6,98 МО/л констатують початок порушень енергетичного обміну в м'язовій тканині останніх. Ефективність способу підтверджена експериментально. Експериментальне моделювання ІНК проводили на 36 білих безпородних статевозрілих щурах-самцях масою 160-200 г шляхом лігування з подальшим перерізом стегнової артерії під тіопенталовим наркозом. Матеріал для дослідження (сироватка крові й м'язова тканина) забирали через 3, 5, 7, 14, 21 і 28 діб після початку експерименту. Для дослідження брали литковий м'яз оперованої кінцівки. 20 % й 10 % гомогенати готували на охолодженому лізисбуфері (Тритон Х-100, Трис-НСІ, ЕДТА) і сахарозному середовищі виділення (сахароза, ЕДТА). Визначення концентрації АТФ у м'язовій тканині проводили методом тонкошарової хроматографії на сілікагелевих пластинах фірми "Силуфор" (Росія), а активності КФК і ЛДГ у сироватці крові хворих і щурів - загальноприйнятими методами. При цьому забір крові для досліджування у хворих з підозрою на ІНК здійснювався в день їх надходження до стаціонару. Результати порушень енергетичного обміну на підставі даних вмісту АТФ у м'язовій тканині при експериментальній ІНК представлені в таблиці 1. Таблиця 1 Вміст АТФ у м'язовій тканині щурів з ІНК (мкмоль/кг) Показник АТФ Група спостереження Інтактна з ІНК Доба спостереження 3 2714,2±25,84* 5 2864,3±59,79* 7 14 7108,78±24,56 3297,3±46,33* 4109,4±26,52* 21 28 4015,5±18,01* 5479,8±45,9* Примітка: у табл. 1-3 * - показники вірогідні відносно інтактної групи (р