Спосіб інфікування для оцінки рівня стійкості озимої пшениці до збудника церкоспорельозу

Реферат: Спосіб інфікування для оцінки рівня стійкості рослин пшениці озимої до збудника церкоспорельозу, причому в лабораторних умовах насіння пшениці озимої інкубують у воді для контролю та в суспензії конідій патогенного штаму 543 7/1 Pseudocercosporella herpotrichoides (Fron) Deighton, розкладають у контейнери з кварцовим піском (фракція № 4 0,8-1,6 мм), змоченим живильним середовищем Хогленда-Арнона, і впродовж 1-6 діб визначають рівень стійкості сорту. UA 89960 U (54) СПОСІБ ІНФІКУВАННЯ ДЛЯ ОЦІНКИ РІВНЯ СТІЙКОСТІ ОЗИМОЇ ПШЕНИЦІ ДО ЗБУДНИКА ЦЕРКОСПОРЕЛЬОЗУ UA 89960 U UA 89960 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Запропонована корисна модель належить до сільського господарства, зокрема до створення стійких до захворювань сортів рослин, а саме - до способу інфікування насіння пшениці озимої (Triticum aestivum L.) збудником церкоспорельозу Pseudocercosporella herpotrichoides (Fron) Deighton. Великої шкоди сільськогосподарському виробництву завдають фітопатогенні мікроорганізми: втрати зерна пшениці озимої від хвороб становлять 18-20 %. В умовах насичення сівозмін зерновими культурами, а також вирощування пшениці за інтенсивною технологією значно зросла небезпека ураження посівів грибними захворюваннями, у тому числі і кореневими гнилями. За наявності 1 % уражених кореневою гниллю рослин пшениці, урожай зменшується на 30 кг/га. Це відбувається внаслідок зниження всіх показників врожайності: кількості рослин, продуктивного колосся, зерен у колосі і маси 1000 зерен. За даними Інституту захисту рослин НААН України серед кореневих гнилей домінують церкоспорельозна, офіобольозна, гельмінтоспоріозна, пітіозна та фузаріозна, їх частка становить 12 %. Найнебезпечнішою серед них є церкоспорельоз, або очкова плямистість. У роки епіфітотій від церкоспорельозу втрачається 40-50 % урожаю. Церкоспорельозна гниль найбільшої шкоди завдає в Поліссі, Західному і Центральному Лісостепу, Степу, а також на зрошенні. Збудником церкоспорельозу є гриб Pseudocercosporella herpotrichoides (Fron) Deighton. Сортів, імунних до церкоспорельозу немає. Тому особливо актуальним є створення і впровадження у виробництво стійких сортів. Цей процес потребує знання біохімічної природи захисних реакцій, закономірностей взаємодії рослини-хазяїна та патогену. Одним з інструментів дослідження взаємодії рослина-патоген є модельні системи інфікування. Отже, на сьогодні існує нагальна потреба в ефективних модельних системах інфікування, які б дозволили оцінити стійкість озимої пшениці до збудника церкоспорельозу. Відомий експрес-метод оцінки стійкості пшениці до кореневих гнилей [Лесовой М.П., Кольнобрицкий Н.И., Шупикова О.И. Экспресс-метод оценки устойчивости пшеницы к корневым гнилям - К.: Реклама, 1988. - 4 с.]. У відповідності з даним способом лабораторну оцінку стійкості рослин озимої пшениці до збудника захворювання проводять на проростках пшениці, вирощених у спеціальному пристрої, що являє собою пластину із оргскла з отворами діаметром 0,8-1,0 см. До однієї із сторін пластини прикріплюють синтетичну сітку з отворами 2,03,0 мм. Пластини поміщають у пластмасові кювети або фаянсові ростильні, які заповнені водою або інокулюмом. Насіння пшениці промивають водогінною водою, дезінфікують в 0,5 % розчині перманганату калію впродовж 5 хвилин і поміщають у вологу камеру для пророщування, яке проводять у термостаті за температури 25 °C впродовж 1-2 діб. Насіння, що проросло розкладають в отвори пластини. Воду в кювети наливають так, щоб вона не покривала насіння. Проростки віком 4-6 діб інфікують, поміщаючи їх в суспензію інокулюма, попередньо виливши воду із кювет. Для отримання інфекційного матеріалу збудника культивують в конічних колбах на рідкому живильному середовищі впродовж 2 тижнів. Колонію гриба разом з культуральною рідиною -1 подрібнюють у гомогенізаторі при частоті обертання 2000 хв впродовж 3 хвилин, потім додають воду у об'ємі вдвічі більшому, ніж об'єм суспензії. В інокулюмі проростки витримують 12 доби, потім його зливають і наливають воду. Облік інтенсивності ураження рослин пшениці проводять на 7-10 добу після інфікування за спеціально розробленою імунологічною шкалою. Контролем слугують проростки, поміщені у воду. Основним критерієм, що характеризує ступінь стійкості рослин пшениці є захисні реакції кореневої системи, а саме: характер розвитку кореневих волосків, ступінь галуження зародкових коренів, їх забарвлення, особливості розвитку плям, а також ступінь росту і розвитку першого та другого справжніх листків і всієї рослини в цілому. Додатковим критерієм стійкості сортів пшениці до збудника хвороби слугує відсоток інгібування росту заражених рослин відносно незаражених (контролю). До недоліків даного способу слід віднести наступні: тривала підготовка рослинного матеріалу (5-8 діб), необхідність наявності спеціального пристрою, тривалий проміжок часу від інфікування до обліку інтенсивності ураження (7-10 діб). Найбільш близьким до корисної моделі, що заявляється, є спосіб визначення стійкості озимої пшениці до церкоспорельозу [Лесовой М.П., Парфенюк А.И., Довгаль З.Н. "Способ определения устойчивости озимой пшеницы к церкоспореллёзной гнили" // АС СССР № 1653635, А 01 G 7/00 // А 01 Η 1/04, 07.06.91. Бюл. № 21], який включає в себе пророщування насіння у воді впродовж 3 діб і в 10 % розчині пероксиду водню впродовж 1 доби. Проростки поміщають у спеціальні пристрої та інокулюють гомогенатом міцелію суміші штамів у водній суспензії та крупнозернистому субстраті, в який вводять інокулюм. Рослини інкубують за 18 1 UA 89960 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 22 °C впродовж 10 днів і за температури 1-5 °C впродовж 60 днів. Після чого за імунологічною реакцією оцінюють стійкість рослин пшениці до церкоспорельозу. Цей спосіб вибрано як прототип. Водночас він має ряд недоліків: досить тривале витримування насіння у воді (3 доби) і розчині пероксиду водню (1 доба), що активує процеси набухання насіння, потреба у наявності спеціального пристрою, тривалий проміжок часу від інфікування до оцінки стійкості (10 або 60 діб). В основу корисної моделі поставлено задачу розробити модельну систему інфікування для оцінки рівня стійкості рослин пшениці озимої до збудника церкоспорельозу у лабораторних умовах на ранніх етапах розвитку і максимально наближену до природних умов інфікування. Зазначена задача вирішується шляхом інфікування рослин пшениці озимої суспензією конідій збудника церкоспорельозу в лабораторних умовах. Відмінними від прототипів ознаками даної корисної моделі є: - скорочення терміну перебування насіння у воді, - скорочення часу оцінки сортозразків на стійкість, - використання для інфікування суспензії конідій, - можливість визначати стійкість сортів на ранніх етапах розвитку. Спосіб забезпечує високу ефективність зараження та можливість оцінки великої кількості зразків. Отже об'єктом даної корисної моделі є спосіб інфікування для оцінки рівня стійкості рослин пшениці озимої до збудника церкоспорельозу, яка відрізняється тим, що в лабораторних умовах насіння пшениці озимої інфікують суспензією конідій штаму 543 7/1 Pseudocercosporella herpotrichoides (Fron) Deighton. Вибір для інфікування суспензії конідій, а не нативного штаму Pseudocercosporella herpotrichoides (Fron) Deighton, дозволяє максимально наблизити лабораторні умови інфікування до природних, оскільки джерелом ураження проростків пшениці є конідіальна стадія [1]. В цілому запропонована корисна модель дасть можливість відбирати найстійкіші батьківські пари для селекційного процесу та здійснювати скринінг нових сортів на уражуваність церкоспорельозом на ранніх етапах розвитку, дасть змогу у комплексній дії біотичних та абіотичних факторів агроценозу відокремити вплив інших стресових чинників на досліджувані рослини, а також допоможе уникнути додаткового розповсюдження збудника церкоспорельозу, а отже і погіршення екологічного стану агроценозів України. Спосіб здійснюється таким чином. Насіння пшениці, стерилізують 2 % розчином КМnO4 впродовж 30 хв, ретельно відмивають дистильованою водою, розкладають на стерильний фільтрувальний папір у чашках Петрі, додають таку кількість дистиляту, щоб насіння було покрите наполовину. Чашки з рослинним матеріалом поміщають у термостат за 24±1 °C на 24 год. Після цього зливають залишки води, заливають такою самою кількістю водної суспензії 4 3 конідій P. herpotrichoides (вихідний титр 5-7×10 КУО/см ) і залишають у термостаті ще на 8 год. У контрольному варіанті до насіння додають нову порцію дистильованої води. Пластикові контейнери (9×88 см) на 4/5 висоти наповнюють кварцовим піском (марка ВС-050-2 за ДОСТ 22551-77, фракція № 4 0,8-1,6 мм). Наливають в кожний по 100 мл живильного середовища Хогленда-Арнона. Пінцетом розкладають проросле насіння на вологий пісок (8×8=64 шт в кожний контейнер). На кожну інфіковану насінину піпеткою наносять залишки водної суспензії конідій Р. herpotrichoides з чашок Петрі (двічі по 2 краплі). У контролі насіння зволожують дистилятом. Все насіння притрушують піском (товщина шару 0,5 см). Пророщування насіння в крупнозернистому субстраті забезпечує добре аеровані умови для патогену і значно підвищує ефективність зараження. Контейнери розміщують на окремі піддони. В кожен піддон наливають живильне середовище Хогленда-Арнона - по 25-35 мл для кожного контейнера. Вирощують в умовах 16-годинного фотоперіоду за інтенсивності освітлення 6 тис. лк. У разі необхідності у піддони додають живильне середовище. Стійкість рослин пшениці різних сортів до P. herpotrichoides визначають за такими показниками: динаміка інтегральних показників ростових процесів та вміст малонового діальдегіду (МДА). Динаміку інтегральних показників ростових процесів (довжину, масу сирої та сухої речовини надземної частини; довжину, масу сирої та сухої речовини коренів) визначають за загальноприйнятими методиками. Вміст МДА визначають за реакцією з 2-тіобарбітуровою кислотою та кількісно - на спектрофотометрі СФ-46 при довжині хвилі 533 нм [2]. Потім порівнюють дані одержані для сприйнятливого і відносно стійкого сорту. Корисна модель може бути проілюстрована наступним порівняльним прикладом. Приклад 2 UA 89960 U 5 10 15 20 25 30 35 У дослідженнях використовували рослини пшениці озимої (Triticum aestivum L.) сприйнятливого сорту Миронівська 808 вітчизняної селекції та відносно стійкого сорту Roazon французької селекції. Для зараження використовували високовірулентний штам 543 7/1 Pseudocercosporella herpotrichoides (Fron) Deighton, наданий лабораторією імунітету сільськогосподарських рослин до хвороб Інституту захисту рослин НААН України. Для отримання суспензії конідій гриб вирощували 25 діб на рідкому картопляно-глюкозному живильному середовищі, яке містило 80 мг/л гентаміцин сульфату за стандартних умов. Стійкість рослин пшениці різних сортів до P. herpotrichoides визначали за динамікою інтегральних показників ростових процесів та вмістом МДА. Дослідження свідчать, що за інфікування насіння пшениці озимої суспензією конідій відбуваються значні зміни інтегральних показників ростових процесів і вмісту МДА у інфікованих проростків. При цьому у контрольних проростків досліджуваних сортів максимум вмісту МДА спостерігали у першу добу після проростання насіння, а потім кількість МДА знижувалась (Фіг. 1, Фіг. 2). У інфікованих проростків пшениці сортів Миронівська 808 і Roazon вміст МДА у першу добу становив 61 % і 50 % від контролю відповідно. Максимум вмісту МДА у інфікованих проростків сприйнятливого сорту спостерігався на 3-ю добу і складав 165 % від контролю і в 1,9 разу перебільшував початкове значення тоді, як у інфікованих проростків відносно стійкого сорту пік вмісту МДА відмічався на 2-у добу і становив 92 % від контролю, перевищуючи початкове значення в 1,36 разу. Отримані дані свідчать про ушкодження, викликані дією патогену. Нами виявлено, що рівень МДА у інфікованих проростків відносно стійкого сорту Roazon зменшується на 3-ю добу, а у проростків сприйнятливого сорту Миронівська 808 продовжує зростати, що вказує на відставання у формуванні захисних реакцій у проростків сприйнятливого сорту. Отримані результати свідчать, що запропонований спосіб інфікування та оцінки стійкості пшениці (Triticum aestivum L.) до збудника церкоспорельозу (Pseudocercosporella herpotrichoides (Fron) Deighton) з використанням суспензії конідій збудника церкоспорельозу максимально наближає лабораторні умови інфікування до природних, дає можливість визначати стійкість на ранніх етапах розвитку і скоротити тривалість визначення у 10 разів. Джерела інформації: 1. Левитин Μ.Μ., Тютерев С.Л. Пшеница: гнили корней, корневой шейки и проростков // Защита и карантин растений / Приложение: Грибные болезни зерновых культур. - 2003. - № 11. - C. 5-7. 2. Мерзляк М.Н., Шевырева В.В., Румянцева В.Б., Жиров В.К. Флюорометрическое определение малонового диальдегида в тканях растений // Научные доклады высшей школы / Биологические науки. - 1979. - № 10. - С. 70. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 40 45 Спосіб інфікування для оцінки рівня стійкості рослин пшениці озимої до збудника церкоспорельозу, яка відрізняється тим, що в лабораторних умовах насіння пшениці озимої інкубують у воді для контролю та в суспензії конідій патогенного штаму 543 7/1 Pseudocercosporella herpotrichoides (Fron) Deighton, розкладають у контейнери з кварцовим піском (фракція № 4 0,8-1,6 мм), змоченим живильним середовищем Хогленда-Арнона, і впродовж 1-6 діб визначають рівень стійкості сорту. 3 UA 89960 U Комп’ютерна верстка Г. Паяльніков Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4