Спосіб застосування кісткового матриксу

Реферат: Спосіб застосування кісткового матриксу, отриманого під час резекції головки стегнової кістки при ендопротезуванні шляхом термічної стерилізації з кріопротектором з повідоном, який перед використанням обробляють біотехнологічними продуктами пацієнта, якому він імплантується, після забору центрифугують при обертах від 1 до 6 тисяч, відбирають необхідний прошарок утвореної рідини та проводять подальшу обробку в залежності від виду аутологічного матеріалу та показань пацієнта, як біотехнологічні продукти використовують аспірат кісткового мозку, який центрифугують на низьких обертах, плазму, відібрану після осадження формених елементів кісткового мозку центрифугують на високих обертах до 10 хв., осад формених елементів аспірату розводять 0,9 % NaCl, мононуклеари з утвореної суспензії клітин виділяють шляхом центрифугування до 15 хв. на низьких обертах, отриманий концентрат мононуклеарів з аспірату кісткового мозку, за показаннями обробляють або поєднують матрикс з цим препаратом. UA 115169 U (12) UA 115169 U UA 115169 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі біотехнології та медицини, а саме до способів застосування кісткового матриксу у терапії патологій кісток із залученням біотехнологічних методів. Застосування отриманого кісткового матриксу є безпечним відносно інфекційного зараження, забезпечує неімуногенність по відношенню до пацієнта, якому буде застосований та включає ефективне використання кісткового матриксу завдяки розробленій схемі отримання та його попередній обробці. Техніка формування тканин - галузь, що розвивається, в якій розробляються нові матеріали для імплантації в організм. Одна з важливих областей включає кісткові матеріали для трансплантатів з метою заміщення ділянок кістки, які були втрачені при травмі або захворюванні. Матеріали для трансплантату можуть бути виділені з кістки того ж індивідууму, якому необхідно провести лікування. Однак, це потребує додаткового хірургічного втручання та додаткового відновлення. Кістковий матеріал також може бути взятий в інших осіб або може бути аутопсійним, причому виникають проблеми біосумісності, а також ризик переносу захворювання. Виходячи з вище викладеного, основною проблемою, на вирішення якої була спрямована корисна модель, є створення способу застосування отриманого кісткового матриксу, що є біосумісним по відношенню до пацієнта та безпечним щодо інфекційного зараження. Відомий рівень техніки містить наступні відомості, що стосуються обробки кісткових матриксів для застосування їх при лікуванні кісткових патологій. З рівня техніки відомий спосіб приготування кісткових імплантів, як описано в патенті US 2485791, 25.10.1949, що включає підбір за критеріями за типом крові, дослідження донорів на наявність інфекційних захворювань, взяття матеріалу, поміщення його в контейнер з антибіотичним агентом, утримання матеріалу, тестування матеріалу на фізіологічні показники, що вказують на процеси атрофії та некрозу і таким чином забезпечується зберігання кісткової тканини для трансплантації. Цей спосіб включає використання антибактеріального компонента, що забезпечує часткову стерилізацію, але не включає подальше безпечне застосування щодо біосумісності кісткового імпланта. Відомий метод, який описаний в документі US 5591398, 7.01.1997, де розкритий спосіб виготовлення кісткових трансплантатів із застосуванням пристрою з герметичним контейнером, в який помішують кістковий трансплантат, що потребує стерилізації, разом зі стерильною рідиною, що достатня для покриття кісткового трансплантату. При цьому контейнер спочатку нагрівають при заданій температурі стерилізації на перший певний період часу, а потім підтримують на цій заданій температурі другий проміжок часу, що залежить від розміру кісткового трансплантату. Потім кістковий трансплантат переносять у іншу ємкість та заморожують, а рідину, що залишилася у першому контейнері аналізують на наявність інфекційних агентів. Описаний у документі US 5591398 метод не включає індивідуального підходу при виготовленні трансплантату з урахуванням імунологічних та регенераційних властивостей при його застосуванні. Успішне застосування кісткових імплантів базується на забезпеченні зберігання біологічних та фізичних властивостей, серед яких обов'язковими є наступні: матеріали для трансплантації повинні характеризуватися відсутністю імуногенних реакцій та забезпечувати органотипічну регенерацію кісткової тканини у найкоротші строки. З рівня техніки відомі способи, в яких з метою підвищення якості трансплантату при індивідуальному застосуванні використовують остеоіндуктивне антисептичне покриття для імплантів, що містить збагачену тромбоцитами плазму та аутологічний кістковий мозок (ЕР 1846055 А1, 24.10.2007). Суть цього методу полягає у тому, що готують суміш зі збагаченої тромбоцитами плазми та аутологічного кісткового мозку, що потім використовують як покриття. Відомі й інші методи забезпечення біосумісності імплантів, що базуються на розробках у галузі клітинних біотехнологій із залученням стовбурових клітин (WO 2007103442, 13.09.2007). Однак, такі методи потребують спеціального високовартісного обладнання, розхідних матеріалів та займають багато часу, що не дозволяє такі методи використовувати в мобільному режимі. З рівня техніки є також відомим використання фібринових композицій (ЕР 0592242 А1, 13.04.1994), які застосовують для ізоляції трансплантатів перед пересаджуванням, основним призначенням яких є забезпечення утворення фібринового згустку, отримання фібринових тканин для росту клітин, зупинки кровотечі, тощо. Або застосування фібринових згустків, які містять мультипотентні мезенхімальні стромальні клітини з кісткового мозку або жирової тканини донорів (RU 2380105 С1, 27.01.2010). Такі методи також потребують попередньої підготовки клітинного компонента, іноді містять в своєму складі речовини, що не забезпечують 1 UA 115169 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 повної біосумісності або не є безпечними для застосування у якості імплантів без додаткової обробки. Враховуючи складність виконання та велику собівартість, постає задача розробки більш доступних методів, які забезпечать біосумісність та безпечність кісткових імплантів, а також мобільність їхнього застосування. Вирішення цих проблем було задачею корисної моделі. Нами був розроблений спосіб (його варіанти: заявки № U20160126, U20160127, U20160128, подані в Укрпатент 06.06.2016 та позначені як пріоритет для даної заявки) приготування кісткового матриксу, що включає обробку отриманого кісткового матеріалу під час резекції головки стегнової кістки при ендопротезуванні шляхом термічної стерилізації з кріопротектором, який перед використанням обробляють біотехнологічними продуктами пацієнта, якому він імплантується, після забору центрифугують при обертах від 1 до 6 тисяч, відбирають необхідний прошарок утвореної рідини та проводять подальшу обробку в залежності від виду аутологічного матеріалу та показань до лікування. Ця корисна модель стосується попередньої підготовки матеріалу для застосування при кісткових патологіях і забезпечує стерильність та здатність матеріалу сприймати подальшу обробку. Таким чином частково вирішує поставлену задачу. Представлена корисна модель є удосконаленням попередніх розробок та дозволить авторам повністю вирішити поставлену задачу завдяки створенню способу застосування кісткового матриксу, отриманого під час резекції головки стегнової кістки при ендопротезуванні шляхом термічної стерилізації з кріопротектором, який перед використанням обробляють біотехнологічними продуктами пацієнта, якому він імплантується, після забору центрифугують при обертах від 1 до 6 тисяч, відбирають необхідний прошарок утвореної рідини та проводять подальшу обробку в залежності від виду аутологічного матеріалу та показань до пацієнта. Під час виконання способу беруть венозну кров пацієнта, якому будуть застосовувати матрикс, центрифугують на низьких обертах до 10 хв., отриману плазму центрифугують на низьких обертах до 10 хв., виконують забір верхніх прошарків плазми, нижній прошарок ретельно перемішують з клітинним осадом на дні пробірки, отриману збагачену тромбоцитами плазму застосовують разом з кістковим матриксом, ввівши її за допомогою ін'єкцій. Або під час виконання способу беруть венозну кров пацієнта, якому будуть застосовувати матрикс, у стерильну вакуумну пробірку з діоксидом кремнію, центрифугують на низьких обертах до 10 хв., отриманий фібриновий згусток вкладається на сітчасту поверхню та притискається до отримання мембрани, отриману багату тромбоцитами фібринову мембрану застосовують разом з кістковим матриксом шляхом змішування у стерильній ємкості. Або беруть аспірат кісткового мозку, центрифугують на низьких обертах, плазму, відібрану після осадження формених елементів кісткового мозку центрифугують на високих обертах до 10 хв., осад формених елементів аспірату розводять 0,9 % NaCl, мононуклеари з утвореної суспензії клітин виділяють шляхом центрифугування до 15 хв. на низьких обертах, отриманий концентрат мононуклеарів з аспірату кісткового мозку, за показаннями обробляють або поєднують матрикс з цим препаратом. Іншим варіантом вирішення поставленої задачі є спосіб застосування кісткового матриксу, отриманого під час резекції головки стегнової кістки при ендопротезуванні шляхом термічної стерилізації з кріопротектором, який перед використанням обробляють біотехнологічними продуктами пацієнта, якому він імплантується. Під час виконання способу беруть жирову тканину, промивають у фосфатному буфері, виконують аспірацію буферу, жирову тканину розчиняють у 0,1 % розчині колагенази в шейкері при температурі 37 градусів, зрілі адипоцити та сполучну тканину відділяють від стромальної васкулярної фракції (SVF) шляхом центрифугування при 800 об/хв. протягом 10 хв., для видалення еритроцитів отримані клітини ресуспендують у лізуючому буфері (155 mM NH4Cl, 10 mМ СНСО3, 0,1 mМ EDTA) протягом 5 хв. при кімнатній температурі, клітини промивають у фосфатному буфері та центрифугують при 800 об/хв. протягом 10 хвилин, за показаннями обробляють або поєднують матрикс з цим препаратом. Або під час виконання способу перед застосуванням виготовлений кістковий матрикс подрібнюють та поєднують з біотехнологічними продуктами пацієнта, якому він імплантується, після забору центрифугують при обертах від 1 до 6 тисяч, відбирають необхідний прошарок утвореної рідини та поєднують з подрібненим матриксом. При цьому розмір частин при подрібненні складає до 6 мм, а форма частин при подрібненні підбирається за показаннями та сягає до 56 мм. Технічним результатом використання запропонованого технічного рішення є забезпечення безпечності, анімуногенності та мобільності застосування кісткових матриксів завдяки простоті виконання, можливості використання типового клінічно-лабораторного обладнання та доступних реагентів при виконанні способу. 2 UA 115169 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Терміни, які використані в матеріалах опису Термін "матрикс" стосується засобу кісткового походження, до якого застосовано специфічну обробку, спосіб якої описаний в даному документі. Цей засіб не є в повному розумінні біологічною тканиною з причин того, що не є системою клітин та міжклітинної речовини, а лише матриксом органічного походження. Цей термін також відповідає іншим термінам, застосованим в матеріалах даного документу, таким як біологічний матеріал або кістковий імплант. Біологічний матеріал, який використано для приготування матриксу, не є біопсійним матеріалом з причин того, що не використовується з метою дослідження або діагностики. "Біотехнологічна обробка матеріалу" означає проведення певні процедури, що надають матеріалу певних біологічних властивостей, що не потребує обов'язкового використання біотехнологічних лабораторій. Під "продуктами біотехнологічної обробки" слід розуміти продукти, що отримані в результаті певних процедур із застосуванням спеціалізованого обладнання - відділення прошарків біологічної рідини (крові, кісткового мозку, клітинного субстрату) або інших складових організму за допомогою центрифугування на різних обертах та подальша спеціальна обробка отриманих компонентів в залежності від подальшого застосування. Опис здійснення Взяття матеріалу Для забезпечення безпеки використання отриманих матриксів перед взяттям кісткового матеріалу від донорів проводять відбір пацієнтів, застосовуючи опитувальник, що містить 30 запитань, що стосуються анамнезу життя та анамнезу захворювання. По результатам проводять подальший скринінг донора за допомогою експрес аналізів на ВІЛ, гепатити В та С, сифіліс. Взяття матеріалу виконують під час резекції головки стегнової кістки при ендопротезуванні кульшового суглоба за допомогою відповідного хірургічного інструментарію, наприклад, осциляційна пила, долото, остеотом тощо. Головка стегнової кістки повинна бути не більше 56 мм в діаметрі. Термостерилізація Після взяття матеріалу його транспортують в стерильних умовах в спеціальних транспортних контейнерах, які поміщені в упаковку, виготовлену з медичного пластику. Матеріал може знаходитися в цьому контейнері біля 20 годин. Контейнер має здатність підтримувати температуру від -10 до -40. Подальшу обробку проводять шляхом термостерилізації, застосовуючи контейнер для стерилізації, виготовлений з медичного пластику. Перед початком стерилізації контейнер наповнюється розчином, який повинен покривати головку стегнової кістки. Щоб запобігти негативному впливу при подальшому заморожуванні, а саме формування внутрішньоклітинного льоду та зневоднення, використовують кріопротектори. Як найкращий варіант кріопротектору був вибраний повідон, що є розчинний у воді та інших полярних розчинниках, за рахунок утворення водорозчинних комплексів покращує розчинність та біодоступність лікарських речовин, має адсорбуючі, антисептичні, а також кріопротекторні властивості. Розчин повідону є термостійким при температурах до 200 °C, є безпечним та не викликає побічних ефектів. Експериментальним шляхом було встановлено, що найкращі результати показав комплексний кріопротектор такого складу, на 100 мл/г: повідон 6 натрію хлорид 0,550 калію хлорид 0,042 кальцію хлорид гексагідрат 0,050 магнію хлорид гексагідрат 0,0005 натрію гідрокарбонат 0,023 та 1М натрію гідроксид. Цей розчин має кріопротекторні та антисептичні властивостей, покращує здатність зв'язувати біологічні компоненти, що є важливим для подальшого застосування матриксу для тканинної інженерії. Можливий діапазон термостерилізації від 35 до 140 градусів Цельсія. Час стерилізації залежить від застосованої температури. Підвищення температури скорочує час. Найкраща термостерилізація відбувається при температурі 82,6-83 градусів. Час стерилізації 90 хв. Аналіз на присутність інфекцій 3 UA 115169 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Після закінчення стерилізації проводять аналіз на присутність інфекції шляхом мікробіологічного дослідження розчину, в якому відбувалася стерилізація. Розчин відбирають з контейнера для стерилізації шприцем, поміщають в стерильну лабораторну пробірку та направляють на аналіз в об'ємі 5-10 мл. До отримання результатів мікробіологічного аналізу контейнер з матриксом поміщають у холодильне обладнання для тимчасового карантину з неможливістю клінічного застосування та зберігають при температурі -20 - -80 градусів Цельсія. В разі отримання негативних результатів мікробіологічного дослідження розчину та при відсутності негайного використання проводять кріоконсервацію матриксу при температурі -20 - 80 на строк до 5 років. Подальша обробка матриксу безпосередньо перед використанням матриксу За показаннями готують наступні препарати для обробки матриксу 1. Беруть венозну кров пацієнта, якому будуть застосовувати матрикс, центрифугують на низьких обертах до 10 хв., отриману плазму центрифугують на низьких обертах до 10 хв., виконують забір верхніх прошарків плазми, нижній прошарок ретельно перемішують з клітинним осадом на дні пробірки, отриману збагачену тромбоцитами плазму застосовують разом з кістковим матриксом, ввівши її за допомогою ін'єкцій. 2. Беруть венозну кров пацієнта, якому будуть застосовувати матрикс, у стерильну вакуумну пробірку з діоксидом кремнію, центрифугують на низьких обертах до 10 хв., отриманий фібриновий згусток вкладається на сітчасту поверхню та притискається до отримання мембрани, отриману багату тромбоцитами фібринову мембрану застосовують разом з кістковим матриксом, шляхом змішування у стерильній ємкості. 3. Беруть аспірат кісткового мозку, центрифугують на низьких обертах, плазму, відібрану після осадження формених елементів кісткового мозку центрифугують на високих обертах до 10 хв., осад формених елементів аспірату розводять 0,9 % NaCl, мононуклеари з утвореної суспензії клітин виділяють шляхом центрифугування до 15 хв. на низьких обертах, отриманий концентрат мононуклеарів з аспірату кісткового мозку, за показаннями обробляють або поєднують матрикс з цим препаратом. 4. Беруть жирову тканину, промивають у фосфатному буфері, виконують аспірацію буферу, жирову тканину розчиняють у 0,1 % розчині колагенази в шейкері при температурі 37 градусів, зрілі адипоцити та сполучну тканину відділяють від стромальної васкулярної фракції (SVF) шляхом центрифугування при 800 об/хв. протягом 10 хв., для видалення еритроцитів отримані клітини ресуспендують у лізуючому буфері (155 mM NH4Cl, 10 mМ СНСО3, 0,1 mM EDTA) протягом 5 хв. при кімнатній температурі, клітини промивають у фосфатному буфері та центрифугують при 800 об/хв. протягом 10 хвилин, за показаннями обробляють або поєднують матрикс з цим препаратом. 5. Під час виконання способу перед застосуванням виготовлений кістковий матрикс подрібнюють та поєднують з біотехнологічними продуктами пацієнта, якому він імплантується, після забору центрифугують при обертах від 1 до 6 тисяч, відбирають необхідний прошарок утвореної рідини та поєднують з подрібненим матриксом. При цьому розмір частин при подрібненні складає до 6 мм, а форма частин при подрібненні підбирається за показаннями та сягає до 56 мм. Клінічне застосування демонструється прикладами Приклад 1 Хворий, 51 рік, з діагнозом - правобічний диспластичний коксартроз, стан після ендопротезування кульшового суглоба, нестабільність компонентів ендопротезу. Після клінікорентгенологічного обстеження вирішено провести ревізійне ендопротезування правого кульшового суглоба. Після імплантації чашки западини відмічається кістковий дефект об'ємом 3 30 см . Дефект заміщено кістковим матриксом, насиченим аутологічною збагаченою тромбоцитами плазмою. Приклад 2 Хвора, 46 років, з діагнозом: хронічний гематогенний остеомієліт лівої великогомілкової кістки, стан після кісткової резекції, наявність апарату зовнішньої фіксації на лівій гомілці. Після клініко-рентгенологічного обстеження вирішено виконати стимулювання регенерату за допомогою комбінації кісткової пластики та аутологічної фібринової мембрани. З 70 мл крові пацієнта виготовлено 8 аутологічних фібринових мембран. Кістковий матрикс подрібнено за допомогою осциляційної пилки, а фібринові мембрани за допомогою скальпеля. Кістковий матрикс змішано з мембранами та імплантовано в місце дефекту. Приклад 3 4 UA 115169 U 3 5 10 15 20 25 30 Хворий, 20 років, з фіброзною дисплазією плечової кістки, вогнище розмірами 30 см . Після видалення вогнища прийнято рішення виконати заміщення дефекту за допомогою кісткового матриксу, насиченого концентратом мононуклеарів з аспірату кісткового мозку. Забрано 100 мл кісткового мозку пацієнта з крила клубової кістки та виготовлено концентрат, який ін'єкційним шляхом введено по всій товщі кісткового матриксу. Виконана імплантація кісткового матриксу в місце дефекту. Приклад 4 Хвора, 56 років, з діагнозом: лівобічний диспластичний коксартроз 4 ст., больовий синдром, згинально-привідна контрактура в лівому кульшовому суглобі. Хворій вирішено виконати ендопротезування лівого кульшового суглоба. Під час операції хвора потребувала кісткової пластики. Після імплантації компонентів ендопротезу кістковий дефект заміщено за допомогою кісткового матриксу, який попередньо оброблено концентратом жирової тканини пацієнтки, яку попередньо було взято зі стегна та оброблено наступним способом: жирову тканину, промивають у фосфатному буфері, виконують аспірацію буферу, жирову тканину розчиняють у 0,1 % розчині колагенази в шейкері при температурі 37 градусів, зрілі адипоцити та сполучну тканину відділяють від стромальної васкулярної фракції (SVF) шляхом центрифугування при 800 об/хв. протягом 10 хв., для видалення еритроцитів отримані клітини ресуспендують у лізуючому буфері (155 mM NH4Cl, 10 mМ КНСО3, 0,1 mМ EDTA) протягом 5 хв. при кімнатній температурі, клітини промивають у фосфатному буфері та центрифугують при 800 об/хв. протягом 10 хвилин. Приклад 5 Хвора, 50 років, госпіталізована з діагнозом: правобічний гонартроз 2 ст., варусна деформація правої гомілки. Вирішено виконати корекційну вальгізаційну плюс-остеотомію правої гомілки. Після виконання остеотомії та остеосинтезу за допомогою Г-подібною пластиною з кісткового матриксу виготовлено блок у вигляді клина зі сторонами 2 см, 3 см та 4 см. Матрикс імплантовано в місце кісткового дефекту разом з аутологічною фібриновою мембраною. Представлені приклади підтверджують простоту, невибагливість та швидкість виконання способу в клінічних умовах відповідного профілю. В результаті проведеної роботи було створено спосіб застосування кісткового матриксу, який дозволяє ефективно проводити оперативне лікування пацієнтів з кістковою патологією, враховуючи індивідуальні особливості пацієнтів. Спосіб має переваги над відомими у своїй простоті, доступності при застосуванні, безпеці для хворого. Ефективність способу доведено успішним клінічним застосуванням. 35 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 40 45 Спосіб застосування кісткового матриксу, отриманого під час резекції головки стегнової кістки при ендопротезуванні шляхом термічної стерилізації з кріопротектором з повідоном, який перед використанням обробляють біотехнологічними продуктами пацієнта, якому він імплантується, після забору центрифугують при обертах від 1 до 6 тисяч, відбирають необхідний прошарок утвореної рідини та проводять подальшу обробку в залежності від виду аутологічного матеріалу та показань пацієнта, як біотехнологічні продукти використовують аспірат кісткового мозку, який центрифугують на низьких обертах, плазму, відібрану після осадження формених елементів кісткового мозку центрифугують на високих обертах до 10 хв., осад формених елементів аспірату розводять 0,9 % NaCl,мононуклеари з утвореної суспензії клітин виділяють шляхом центрифугування до 15 хв. на низьких обертах, отриманий концентрат мононуклеарів з аспірату кісткового мозку, за показаннями обробляють або поєднують матрикс з цим препаратом. 50 Комп’ютерна верстка Т. Вахричева Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП "Український інститут інтелектуальної власності", вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5