Спосіб визначення граничних меж чутливості біоіндикатора до дії стресорів

Реферат: Спосіб визначення меж чутливості біоіндикатора до дії стресорів включає визначення мінімальних доз меж чутливості біоіндикатора, як першої вірогідної відмінності прояву відповідної реакції біоіндикатора на дію токсиканту у порівнянні з контролем, а верхню межу чутливості як першу концентрацію, що забезпечує відповідь на дію дози стресора у 80-100 % особин популяції біоіндикатора, наприклад, гусениць-мурашів шовковичного шовкопряда Bombyx mоrу L. одного часу виходу з яєць, яких приваблюють на суху плівку з токсикантом за допомогою запаху атрактанту - листя шовковиці, в місцях розташування токсиканту, в оптимальних для виду температурних умовах (+25 °C) з визначенням меж чутливості за допомогою пробіт-аналізу. Тестування проводять при різних температурах повітря, з відхиленням плюс та мінус у бік від оптимальної температури на значення, які суттєво впливають на інтенсивність процесів метаболізму організму комах. Гусениць-мурашів шовковичного шовкопряда тестують при температурах на 5 °C вище (+30 °C) та нижче (+20 °C), порівнюючи з оптимальною (+25 °C), та визначають граничні межі чутливості біоіндикатора у порівнянні з контролем. UA 76389 U (54) СПОСІБ ВИЗНАЧЕННЯ ГРАНИЧНИХ МЕЖ ЧУТЛИВОСТІ БІОІНДИКАТОРА ДО ДІЇ СТРЕСОРІВ UA 76389 U UA 76389 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до досліджень в галузі охорони довкілля, та безпосередньо до способів біоіндикації забруднення довкілля токсикантами і може бути застосована для контролю стану навколишнього середовища з використанням тест-об'єктів (біоіндикаторів). Відомий спосіб визначення чутливості тест-об'єкту до дії інсектицидів за середньою для популяції комах дозою, яка викликає загибель 50 % (СК50) або 90 % (СК90) особин. Але цей спосіб не дає змоги виявити межі чутливості тест-об'єкту до дії стресору, встановлюючи лише дозу, яка викликає певний процент загибелі особин. Цей спосіб розглядається нами як аналог [1]. За прототип взято спосіб визначення граничних меж чутливості біоіндикатора до дії стресорів, який містить набір доз токсиканту, що забезпечує смертність в інтервалах від 10 до близько 99,9 % особин. При цьому нижню межу чутливості біоіндикатора виражають як мінімальну дозу яка викликає вірогідну відмінність у прояву чутливості біоіндикатора до дії стресору у порівнянні з контролем, а верхню за найменшою максимальною концентрацією, що дає відповідь на подразник в зоні близькій до 99,9 %. В дослідах використовують гусениць-мурашів шовковичного шовкопряда одного часу виходу з яєць в день їх відродження. Для досліджень використовують стабільно високу за життєздатністю породу шовковичного шовкопряда Білококонна-2 поліпшена (Б-2 пол.) Проводять 3 серії дослідів. Беруть широкий діапазон концентрацій фосфор-органічного інсектициду фосфаміду (від 0 до 0,1 мг/л) - що забезпечує загибель гусениць від 0 до 100 %. Кожна концентрація випробовується у 5-кратній повторності (по 30 гусениць-мурашів у повторності). Для визначення практичних меж чутливості біоіндикатора гусениць-мурашів використовують метод сухої плівки. Спостереження за загибеллю гусениць-мурашів проводять до початку загибелі гусениць в контролі. Під час проведення тестування освітлення повинно бути природнім, температура повітря в термостаті +25 °C, вологість повітря 90 %. Облік загиблих гусениць проводять щодня. Результати спостережень обробляють статистично (достовірність відмінностей визначають за допомогою t-критерію Стьюдента). Отримані результати (значення проценту загиблих) переводять в пробіти для встановлення лінійної залежності І визначення ефекту (смертності) від певної дози інсектициду. За отриманою кореляційною залежністю визначають межі чутливості біоіндикатора до дози інсектициду [2]. Однак прототип має певні недоліки: 1) визначення граничних меж чутливості біоіндикатора проводиться при постійній оптимальній температурі (+25 °C). І, хоча, це дає змогу чітко визначити граничні межі чутливості біоіндикатора в лабораторії, спосіб не гарантує достовірних результатів в змінених умовах середовища. Використання як тест-об'єктів для визначення дії стресорів комах потребує урахування того, що це пойкілотермні тварини, температура тіла яких залежить від температури навколишнього середовища. Відомо, що в природі постійно відбуваються зміни температур, наприклад добові (день-ніч), сезонні (зміна погодних умов) та ін. Швидкість розвитку та інтенсивність процесів метаболізму комах в зоні між нижнім і верхнім порогами розвитку можуть змінюватись приблизно у 2-3 рази на кожні 10 °C убік зростання [3]. Відповідно змінюється чутливість до дії токсикантів, що приводить до зміни граничних меж чутливості [4]. В основу корисної моделі поставлена задача удосконалення способу визначення граничних меж чутливості біоіндикатора до дії стресору і виправлення недоліків прототипу, та розробка способу визначення граничних меж чутливості біоіндикатора до дії стресору, який би надав об'єктивне уявлення про чутливість біоіндикатора в умовах природних коливань температури в оточуючому середовищі. Поставлена задача вирішується за рахунок того, що спосіб визначення меж чутливості біоіндикатора до дії стресору, який містить спосіб визначення меж чутливості біоіндикатора до дії стресорів, який включає визначення мінімальних доз меж чутливості біоіндикатора, як першої вірогідної відмінності прояву відповідної реакції біоіндикатора на дію токсиканту у порівнянні з контролем, а верхню межу чутливості як першу концентрацію, що забезпечує відповідь на дію дози стресора у 80-100 % особин популяції біоіндикатора, наприклад, гусениць-мурашів шовковичного шовкопряда Воmbух mory L. одного часу виходу з яєць, яких приваблюють на суху плівку з токсикантом за допомогою запаху атрактанту - листя шовковиці, в місцях розташування токсиканту, тестування проводять в оптимальних для виду температурних умовах (+25 °C) з визначенням меж чутливості за допомогою пробіт-аналізу, згідно корисної моделі, тестування проводять при різних температурах повітря, з відхиленням плюс та мінус у бік від оптимальної температури, значення якої суттєво впливають на інтенсивність процесів 1 UA 76389 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 метаболізму організму комах, причому гусениць-мурашів шовковичного шовкопряда тестують при температурах на 5 °C вище (+30 °C) та нижче (+20 °C), порівнюючи з оптимальною (+25 °C), та визначають граничні межі чутливості біоіндикатора у порівнянні з контролем. Рекомендовано проведення біотестування при зміні температури оточуючого середовища в межах 10 °C (±5 °C) від стандартної (оптимальної) температури тестування (наприклад, +25 °C для шовковичного шовкопряда (Воmbух mоrу L.). Як тест-об'єкт використовують гусеницьмурашів шовковичного шовкопряда одного часу виходу з яєць в день їх відродження, на яких діяли токсикантом в межах різних концентрацій. При цьому, для приваблення гусениць на суху плівку з токсикантом використовують екстракт листа шовковиці, який наносять на фільтрувальний папір в місцях розташування токсиканту. Мінімальні та максимальні межі чутливості в усіх варіантах визначають за допомогою пробіт-аналізу. Приклад здійснення способу Для досліджень було вибрано стабільно високу за життєздатністю породу шовковичного шовкопряда Білококонна-2 поліпшена (Б-2 пол.) В дослідах використовували гусениць-мурашів шовковичного шовкопряда одного часу виходу з яєць в день їх відродження. Дослід проводили у 3-х варіантах межі чутливості тест-об'єкту до токсиканту визначали при +25 °C (прототип), +20° та +30 °C. Брали широкий діапазон концентрацій фосфор-органічного інсектициду фосфаміду (від 0 до 0,1 мг/л) - що забезпечило загибель гусениць від 0 до 100 %. Кожна концентрація випробовувалась у 5-кратній повторності (по 30 гусениць-мурашів у повторності). Для визначення практичних меж чутливості біоіндикатора гусениць-мурашів використовували метод сухої плівки. Спостереження за загибеллю гусениць-мурашів проводили до початку загибелі гусениць в контролі. Під час проведення досліду освітлення було природнім, вологість повітря 90 %. Облік загиблих гусениць проводили щодня. Результати спостережень обробляли статистично (достовірність відмінностей визначали за допомогою t-критерію Стьюдента). Отримані результати (значення проценту загиблих) переводили в пробіти для встановлення лінійної залежності і визначення ефекту (смертності) від певної дози інсектициду. За отриманою кореляційною залежністю визначали межі чутливості біоіндикатора до дози інсектициду за різних температур. На фіг. 1 Зображено залежність загибелі гусениць-мурашів шовковичного шовкопряду від концентрації токсиканту (за результатами пробіт-аналізу) при 20 °C. На фіг. 2 Зображено залежність загибелі гусениць-мурашів шовковичного шовкопряду від концентрації токсиканту (за результатами пробіт-аналізу) при 25 °C. На фіг. 3 Зображено залежність загибелі гусениць-мурашів шовковичного шовкопряду від концентрації токсиканту (за результатами пробіт-аналізу) при 30 °C. Результати досліджень Експериментальне вивчення впливу різних температур (в межах екологічного оптимуму) на зміну меж чутливості гусениць-мурашів до дії фосфорорганічного інсектициду - фосфаміду показало (табл.), що спостерігається чітка залежність між ступенем чутливості тест-об'єкта до токсичної дії фосфаміду та температурних умов тестування. Якщо виходити з базової температури +25 °C (оптимум для гусениць-мурашів), то за всіма концентраціями чутливість до токсиканту в умовах підвищеної температури (+30 °C) суттєво зросла, в той час як при температурі +20 °C навпаки спостерігається підвищення стійкості тест-об'єкта до токсиканту у всіх випробуваних дозах (концентраціях). Використовуючи пробіт-аналіз отримали пряму залежності ефекту від дози токсиканту. На основі вирішення кореляційного рівняння находять порогові дози чутливості біоіндикатора до доз токсиканту (фіг. 1, 2, 3). Так, як показано на фiг. 1 при 20 °C мінімальна вірогідна загибель гусениць спостерігається при концентрації токсиканту 0,04 мг/л це нижня межа чутливості. Порівнюючи отримані дані з контролем (фіг. 2) бачимо що відбувається зсув порогу чутливості до токсиканту за рахунок підвищення стійкості особин. В той час як при 30 °C гусениці гинули при концентрації фосфаміду - 0,008 мг/л. Це свідчить про зменшення стійкості тест-об'єкту до дії хімікатів при зростанні температури. Таким чином, в результаті досліджень та математичної обробки отриманих даних встановлено, що при зміні температурних умов середовища межі чутливості біоіндикатора до стресору можуть змінюватись. Для отримання вірогідних даних тестування необхідно проводити при різних температурах повітря, з відхиленням у плюс та мінус бік від оптимальної температури на значення, які суттєво впливають на інтенсивність процесів метаболізму організму комах. 60 2 UA 76389 U Таблиця Чутливість гусениць-мурашів шовковичного шовкопряда до розчину фосфаміду (за % загиблих) Концентрація фосфаміду, мг/л контроль 0,001 0,004 0,008 0,01 0,04 0,08 0,1 5 Температура тестування, °C 20 25 30 20 25 30 20 25 30 20 25 30 20 25 30 20 25 30 20 25 30 20 25 30 Загибель гусениць за днями спостережень, % 1 2 3 4 0 0 0 0 0 0 0 1,0±0,7 0 0 0 2,0±0,5 0 0 0 7,5±0,8 0 0 2,9±1,1 23,0±1,2 0 1,6±0,8 4,1±1,4 41,5±1,4 0 0 4,0±1,2 30±1,3 0 0 5,5±1,4 44,0±1,4 0 3,5±1,0 8,0±1,5 51,3±1,7 0 0 12,1±1,6 67,2±1,8 0 7,3±4,8 30,1±2,7 81,11±1,0 2,1±1,3 10,7±1,8 59,8±2,1 98,2±2,3 0 5,7±2,1 29,2±2,1 76,9±2,7 0 18,5±2,2 51,9±3,0 91,9±2,3 4,7±2,0 27,0±2,3 72,3±1,3 100 5,9±1,7 37,0±2,5 99,0±1 100 8,9±1,8 42,5±1,9 91,22±1,9 100 15,9±2,4 69,3±1,3 100 100 12±13 49,7±2,5 100 21,0±1,7 74,3±3,0/ 100 29,9±1,9 74,1±1,3 100 30,1±2,0 89,9±3,1 100 44,3±2,0 90,0±3,0 100 62,81±2,1 99,0±1,9 100 Джерела інформації: 1. Гар К.А. Методы испытаний токсичности и эффективности инсектицидов: М.: Сельхозиздат, 1963.-217 с. 2. Патент на корисну модель № 60667 "Спосіб визначення граничних меж чутливості біоіндикатора до дії стресорів", Бюл 12, 25.06.2011, (прототип). 3. Чернишов В.Б. Экология насекомых. - М: МГУ, 1996. - С. 46. 4. Трибель C.O. Методика випробувань і застосування інсектицидів. - Київ: Світ, 2001. - С 53, (табл. 4.3). 10 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 15 20 25 Спосіб визначення меж чутливості біоіндикатора до дії стресорів, який включає визначення мінімальних доз меж чутливості біоіндикатора, як першої вірогідної відмінності прояву відповідної реакції біоіндикатора на дію токсиканту у порівнянні з контролем, а верхню межу чутливості як першу концентрацію, що забезпечує відповідь на дію дози стресора у 80-100 % особин популяції біоіндикатора, наприклад, гусениць-мурашів шовковичного шовкопряда Bombyx mоrу L. одного часу виходу з яєць, яких приваблюють на суху плівку з токсикантом за допомогою запаху атрактанту - листя шовковиці, в місцях розташування токсиканту, в оптимальних для виду температурних умовах (+25 °C) з визначенням меж чутливості за допомогою пробіт-аналізу, який відрізняється тим, що тестування проводять при різних температурах повітря, з відхиленням плюс та мінус у бік від оптимальної температури на значення, які суттєво впливають на інтенсивність процесів метаболізму організму комах, причому гусениць-мурашів шовковичного шовкопряда тестують при температурах на 5 °C вище (+30 °C) та нижче (+20 °C), порівнюючи з оптимальною (+25 °C), та визначають граничні межі чутливості біоіндикатора у порівнянні з контролем. 3 UA 76389 U 4 UA 76389 U Комп’ютерна верстка Г. Паяльніков Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5