Спосіб визначення активності очищеного (ппд) туберкуліну для ссавців на тваринах, сенсибілізованих авірулентними культурами m.bovis

Реферат: Спосіб визначення активності очищеного (ППД) туберкуліну для ссавців на тваринах, сенсибілізованих авірулентними культурами M.bovis, включає отримання суспензії, що містить 1-5 мг культури мікобактерій, сенсибілізацію нею морських свинок і великої рогатої худоби та використання сенсибілізованих тварин для визначення активності туберкуліну очищеного (ППД) для ссавців у стандартному розчині. При цьому для сенсибілізації тварин використовують непатогенний, авірулентний (інактивований) біологічний матеріал, що запобігає розповсюдженню вірулентних мікобактерій в довкіллі. UA 108460 U (12) UA 108460 U UA 108460 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до ветеринарної мікробіології, імунології та біотехнології, зокрема до способів виготовлення алергенів для діагностики туберкульозу тварин та птиці, а саме до способів визначення активності ППД-туберкуліну для ссавців, який може бути використаний для проведення випробувань препарату на великій рогатій худобі та лабораторних тваринах. Існує спосіб контролю активності ППД-туберкуліну для ссавців, що передбачає наявність хворих на туберкульоз (заражених збудником туберкульозу бичачого виду) тварин (Технічні умови Державного стандарту СРСР ГОСТ 16739-88). Проте цей спосіб має суттєвий недолік: робота з хворою на туберкульоз худобою може привести до розповсюдження інфекції. Для утримання хворих на туберкульоз тварин потрібні приміщення та умови, які відповідають вимогам епізоотичної та епідемічної безпеки. До того ж в Україні з 1976 року згідно з Інструкцією про заходи профілактики й боротьби з туберкульозом тварин і птиці, затвердженої у 1973 році, ліквідовані туберкульозні ізолятори, тобто перетримку хворої на туберкульоз худоби заборонено. Найбільш близьким за суттю та досягнутими результатами є "Спосіб контролю визначення активності туберкуліну очищеного ППД для ссавців" (Патент України № 36006, пріоритет від 12 жовтня 1999 p., розробники Кассіч Ю.Я., Кассіч В.Ю. з співав.), що передбачає використання для сенсибілізації тварин як патогенного збудника туберкульозу бичачого виду, так і вакцинного штаму M.bovis БЦЖ. Проте живі культури M.bovis є потенційно небезпечними в епідеміологічному та епізоотологічному відношенні, оскільки існує можливість реверсії, тобто відтворення патогенності атенуйованого штаму. В основу корисної моделі поставлена задача розробити специфічний та безпечний для здоров'я тварин і людей спосіб визначення активності туберкуліну очищеного (ППД) для ссавців в дослідах на морських свинках і великій рогатій худобі (ВРХ) з використанням інактивованої автоклавуванням бактеріальної маси M.bovis (Valle). Поставлена задача вирішується шляхом сенсибілізації дослідних тварин непатогенними для них інактивованими та атенуйованими культурами M.bovis і визначення на цих тваринах активності туберкуліну. Визначення активності ППД-туберкуліну для ссавців проводили таким чином. Активність дослідної серії туберкуліну визначали порівнянням з контрольною серією препарату на здоровій великій рогатій худобі та морських свинках, яких попередньо сенсибілізували зависсю, інактивованої автоклавуванням культури M.bovis (Valle), суспендованої в стерильному вазеліновому маслі (дослід 1) та культурою мікобактерій БЦЖ (дослід 2). Контрольним тваринам культури мікобактерій не вводили. Для сенсибілізації великої рогатої худоби готували завись, що містить 5 мг інактивованої автоклавуванням (за температури 100 °C впродовж трьох годин, або при 110 °C протягом однієї 3 години) культури M.bovis (Valle), в об'ємі 5 см стерильного вазелінового масла або ізотонічного 3 розчину (дослід 1) та завись культури БЦЖ, що містить 5 мг бактеріальної маси в об'ємі 5 см ізотонічного розчину або стерильного вазелінового масла (дослід 2). Для сенсибілізації морських свинок готували завись, що містить 1 мг інактивованої 3 автоклавуванням культури M.bovis (Valle), в об'ємі 1 см стерильного вазелінового масла або ізотонічного розчину (дослід 3), та завись культури БЦЖ, що містить 1 мг бактеріальної маси в 1 3 см (дослід 4). Дослід 1. Здоровій великій рогатій худобі віком 8 місяців і старше кількістю 15-18 голів на серію туберкуліну парентерально (підшкірно або внутрішньом'язово) в ділянці підгруддя вводили 5 мг зависі інактивованої автоклавуванням бактеріальної маси M.bovis на стерильному 3 вазеліновому маслі в об'ємі 5 см . Велику рогату худобу використовували через 30 діб після щеплення. Тваринами користувалися багато разів з інтервалом не менше 30 діб між дослідженнями. Тваринам вводили внутрішньошкірно в депільовані ділянки шкіри шиї, відповідно ліворуч та 3 праворуч, по 0,1 см туберкуліну очищеного (ППД) для ссавців випробовуваної та контрольної серій. Реакцію визначали через 72 години й оцінювали за ступенем потовщення складки шкіри в місцях введення туберкуліну (в міліметрах) за допомогою кутиметра. Визначали різницю у інтенсивності реакції на випробовувану й контрольну серії туберкуліну. Випробовувану серію вважали активною, якщо немає різниці в інтенсивності зумовлених туберкулінами реакцій або вона статистично недостовірна. Активність туберкуліну (А) в Міжнародних одиницях (МО) обчислювали за формулою (4): A d1  50000 , d2 (4) 1 UA 108460 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 де d1 - сума середніх діаметрів папул на випробовувану серію, мм; d 2 - сума середніх діаметрів папул на контрольну серію туберкуліну, мм; 3 50000 - кількість МО у 1 см основного розчину контрольної серії туберкуліну. Дослід 2. Здоровій великій рогатій худобі віком 8 місяців і більше кількістю 17-18 голів на серію туберкуліну парентерально (підшкірно або внутрішньом'язово) в ділянці підгруддя вводили 5 мг зависі живої культури вакцини БЦЖ на стерильному фізіологічному розчині в 3 об'ємі 5см . Велику рогату худобу використовували через 30 діб після щеплення. Тваринами користувалися багато разів з інтервалом не менше 30 діб між дослідженнями. Тваринам вводили внутрішньошкірно в депільовані ділянки шкіри шиї, відповідно ліворуч та праворуч, по 3 0,1 см туберкуліну випробовуваної та контрольної серій. Реакцію визначали через 72 години й оцінювали за ступенем потовщення складки шкіри в місцях введення туберкуліну (в міліметрах) за допомогою кутиметра. Визначали різницю у інтенсивності реакції на випробовувану й контрольну серії туберкуліну. Випробовувану серію вважали активною, якщо немає різниці в інтенсивності зумовлених туберкулінами реакцій або вона статистично недостовірна. Активність туберкуліну (А) в Міжнародних одиницях (МО) обчислювали за формулою (4). Приклад визначення активності ППД-туберкуліну для ссавців на великій рогатій худобі. Визначення активності дослідно-виробничої серії № 1 туберкуліну ППД для ссавців, виготовленої Державним підприємством Херсонська біологічна фабрика, у порівнянні з контрольною серією туберкуліну № 3, виготовленою Державним підприємством Сумська біофабрика (контрольна серія), проводили на 18 бичках через 30 діб після щеплення їх інактивованою автоклавуванням культурою M.bovis на стерильному вазеліновому маслі та такій же кількості щеплених культурою БЦЖ тварин. З лівого боку шиї тваринам внутрішньошкірно вводили ППД-туберкулін для ссавців випробовуваної серії, а з правого боку шиї - туберкулін 3 контрольної серії у дозах по 0,1 см в попередньо вистрижені та дезінфіковані місця. За такою ж схемою обидва туберкуліни вводили 18 щепленим культурою БЦЖ тваринам (дослід 2). Облік алергічних реакцій проводили через 72 години після введення туберкулінів. Отримані результати вносили у відомість (таблиця 1). З матеріалів таблиці 1 видно, що серед тварин, щеплених інактивованою культурою M.bovis (Valle), на туберкулін випробовуваної серії у порівнянні з препаратом контрольної серії реагували з більшою інтенсивністю реакцій /+/ 10 голів, з меншою /-/ 5 голів та з однаковою інтенсивністю /=/ 3 голови. Серед щеплених культурою БЦЖ тварин на туберкулін комерційної серії у порівнянні з контрольною реагували з більшою інтенсивністю реакцій /+/ 7 голів, з меншою /-/ 5 голів та з однаковою інтенсивністю /=/ 6 голів худоби. У несенсибілізованих мікобактеріями тварин (контроль) алергічних реакцій на введення туберкуліну не виникало. На підставі проведених експериментів на здоровій ВРХ, щепленій інактивованою культурою M.bovis Valle (дослід 1), та щепленій культурою БЦЖ (дослід 2) визначено, що випробовувана дослідно-виробнича серія № 1 є активною і придатною для алергічного дослідження на туберкульоз. Способи визначення активності туберкуліну на здоровій, щепленій інактивованою культурою M.bovis (Valle) ВРХ та на щепленій вакцинним штамом БЦЖ худобі є однаково ефективними. Обидва способи можуть використовуватись для проведення контролю активності ППДтуберкуліну для ссавців. Таким чином розроблений спосіб контролю активності туберкуліну на ВРХ, щепленій інактивованою бактеріальною масою M.bovis (Valle) є ефективним, активним та специфічним, а до того ж безпечним для здоров'я тварин і людей і запобігає розповсюдженню живих мікобактерій в природі. 2 UA 108460 U Таблиця 1 Результати обліку алергічних реакцій на введення туберкуліну дослідної і контрольної серій у щепленої інактивованою культурою M.bovis (Valle) та вакциною БЦЖ ВРХ Потовщення складки шкіри у мм у тварини Наявність більшої /+/, меншої Дослід 1: Дослід 2: /-/, однакової /=/ реакції на Умовний щеплених інактивованою туберкулін комерційної серії щеплених БЦЖ порядковий культурою M.bovis номер щеплені тварини комерційна контрольна комерційна контрольна інактивованою щеплені БЦЖ серія серія серія серія культурою M.bovis 1 1 5 3 4 2 2 негат. негат. негат. + = 3 3 3 7 5 = + 4 7 4 3 1 + + 5 3 4 10 10 + 6 5 4 14 9 + + 7 1 2 7 5 + 8 9 4 7 1 + + 9 2 1 негат. негат. + = 10 1 1 6 10 = 11 6 4 4 5 + 12 4 2 19 19 + = 13 3 3 10 7 = + 14 5 3 8 10 + 15 1 2 5 3 + 16 7 3 8 8 + = 17 7 4 9 13 + 18 2 3 4 4 = 5 10 15 20 25 Дослід 3. Проведення сенсибілізації морських свинок. Десяти здоровим морським свинкамальбіносам або з білими боками внутрішньом'язово вводили по 1 мг зависі інактивованих автоклавуванням M.bovis (Valle) на стерильному ізотонічному розчині хлористого натрію в об'ємі 3 1 см . Дослід 4. Десяти морським свинкам другої групи вводили по 1 мг зависі культури БЦЖ на 3 стерильному ізотонічному розчині хлористого натрію в об'ємі 1 см . Всіх дослідних морських свинок використовували для визначення активності випробовуваної серії туберкуліну через 30 діб після щеплення. Тварин використовували багато разів з інтервалом не менше 30 діб між дослідженнями. Виготовлення розведень туберкуліну. Готували суміш з п'яти флаконів туберкуліну 3 3 випробовуваної серії. 1 см туберкуліну переносили у пробірку з 9 см стерильного ізотонічного 3 розчину хлористого натрію й перемішували. З цієї пробірки 1 см розчину туберкуліну 3 переносили у другу пробірку з 4 см стерильного ізотонічному розчину і таким чином отримували 3 перше ("1") розведення туберкуліну. З другої пробірки 1 см розчину туберкуліну переносили у 3 пробірку з 9 см стерильного ізотонічного розчину й отримували друге ("2") розведення туберкуліну. Таким же методом готували розведення "3" та "4" контрольної серії туберкуліну, що містять 3 у 1 см 1000 і 100 МО, відповідно. Для виготовлення розведень контрольної серії туберкуліну використовували п'ять флаконів 3 (ампул) алергену з таким розрахунком, щоб у 1 см містилось 50000 МО. Проведення випробування. Перед проведенням випробування (за 3-5 діб) шерсть по боках морських свинок вищипували. Виготовлені розведення алергенів (1, 2, 3, 4) вводили 3 внутрішньошкірно кожній морській свинці в депільовані ділянки шкіри в дозі 0,1 см по два розведення з кожної сторони тіла в умовні місця ін'єкцій: а, б, в, г. Відстань між місцями введення з кожної сторони тіла була не меншою 40 мм. 3 UA 108460 U 5 10 15 20 Кожне розведення туберкуліну вводили окремим шприцом, номер якого відповідає номеру розведення препарату. Шприци з набраним розчином розташовували на кришці стерилізатора за їх порядковими номерами (1, 2, 3, 4). Шкіру фіксували великим і вказівним пальцями, паралельно до її поверхні, голку вводили у шкіру свинки не менше ніж на 3 мм. Потім шкуру 3 відпускали і натиском на поршень повільно вводили 0,1 см розчину. В місці введення утворювалась випуклість величиною з горошину. Для попередження витікання розчину голку після введення розчину затримували на 1-2 секунди у шкірі, а потім виймали. Після ін'єкції розведення першій свинці перший шприц з цим розведенням клали у кінець рядка, за шприцом № 4. Решту шприців після введення розчинів алергенів клали на попередні місця. Ін'єкцію розчину туберкуліну другій свинці робили шприцом № 2, який потім клали праворуч за шприцом № 1. Решту шприців після введення розчинів алергенів клали на попередні місця. Таким чином, умовний номер кожної свинки відповідав номеру розведення, яке вводили цій свинці першим шприцом в умовне місце ін'єкції. Кожну свинку після ін'єкції їй розведення туберкуліну мітили фарбою, що не змивається. Тварин, яким розведення туберкуліну вводили в одному порядку, мітили одною міткою. Порядок маркування і введення туберкуліну морським свинкам наведений у таблиці 2. Обробка результатів. Інтенсивність реакції визначали через 24 години після введення препаратів шляхом обліку діаметра папули, що виникла в місці введення туберкуліну. Для цього обводили чорнилом контур папули. Потім на бік тварини клали лист целофану й перемальовували на нього всі контури з позначенням місць ін'єкцій: а, б, в, г. Таблиця 2 Умовний номер свинки 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 25 30 Місце мітки Мітка не наноситься Голова Спина Крижі Мітка не наноситься Голова Спина Крижі Мітка не наноситься Голова Розведення туберкуліну, що введені в умовні місця ін'єкції ліворуч від голови праворуч від голови а б в г 1 2 3 4 2 3 4 1 3 4 1 2 4 1 2 3 1 2 3 4 2 3 4 1 3 4 1 2 4 1 2 3 1 2 3 4 2 3 4 1 На лист целофану перемальовували контури папул всіх морських свинок групи з позначенням умовного номера кожної тварини. Для визначення активності туберкуліну лист целофану клали на міліметровий папір і вимірювали значення поперечного та подовжнього діаметрів кожної папули. Обчислювали їх середню величину й результати заносили у таблицю 3 (дослід 3) та таблицю 4 (дослід 4). При обробці результатів випробування враховували лише свинок, які реагували на всі розведення туберкуліну. Для визначення активності препарату кількість морських свинок, які реагували на всі розведення туберкуліну, не повинна бути менше десяти. Контролем були несенсибілізовані культурами мікобактерій морські свинки. У контрольних тварин алергічних реакцій на введення розведень туберкуліну не спостерігали. Таблиця 3 (дослід 3) Визначення активності туберкуліну на морських свинках, сенсибілізованих інактивованою культурою M.bovis (Valle) Умовний номер свинки, розведення 1 2 3 Інтенсивність реакції на введення туберкуліну 1 2 3 20,5 8,0 20,0 24,0 7,5 22,5 15,5 9,0 16,0 35 4 розведень 4 10,5 11,5 7,5 UA 108460 U Продовження таблиці 3 (дослід 3) Визначення активності туберкуліну на морських свинках, сенсибілізованих інактивованою культурою M.bovis (Valle) Умовний номер свинки, розведення 4 5 6 7 8 9 Всього: Інтенсивність реакції на введення туберкуліну 1 2 3 17,0 10,0 21,5 20,0 11,5 18,0 18,5 9,0 14,0 21,0 11,0 22,5 25,5 11,0 27,5 20,5 10,0 19,5 182,5 87,0 181,5 розведень 4 13,0 10,0 8,5 10,9 11,0 13,0 95,0 Активність туберкуліну (А) в Міжнародних одиницях (МО) обчислювали за формулою (5): A d1  50000 , d2 (5) 5 де d1 - сума середніх діаметрів папул на випробовувану серію, мм; d 2 - сума середніх діаметрів папул на контрольну серію туберкуліну, мм; 3 50000 - кількість МО у 1 см основного розчину контрольної серії туберкуліну. Таблиця 4 (дослід 4) Визначення активності туберкуліну на морських свинках, сенсибілізованих культурою БЦЖ Умовний номер свинки, розведення 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Всього: Інтенсивність реакції на введення туберкуліну 1 2 3 20,0 7,0 21,0 23,5 7,5 21,0 16,5 7,0 16,0 18,0 8,0 19,0 19,0 14,5 19,0 19,5 9,0 14,0 20,0 9,0 22,5 24,5 16,0 25,5 22,5 10,0 19,5 183,5 88,0 179,5 розведень 4 11,5 10,0 7,5 12,0 11,0 7,5 10,5 12,0 14,0 98,0 10 15 20 25 Приклад визначення активності випробовуваної серії ППД-туберкуліну для використанням морських свинок, сенсибілізованих інактивованою автоклавуванням M.bovis (Valle) (дослід 3). Обчислювали суму середніх діаметрів папул випробовуваної серії туберкуліну середніх діаметрів папул на контрольну серію туберкуліну (d 2): d1=182,5+87,0=269,5 мм; d2=181,5+95,0=276,5 мм. Активність випробовуваної серії туберкуліну: 269,5 A 50000  48734  49000 МО/мг, 276,5 3 де 50000 - кількість МО в 1 см основного розчину контрольної серії туберкуліну. Приклад визначення активності випробовуваної серії ППД-туберкуліну для використанням морських свинок, сенсибілізованих живою культурою БЦЖ (дослід 4). Обчислювали суму середніх діаметрів папул випробовуваної серії туберкуліну середніх діаметрів папул на контрольну серію туберкуліну (d 2): d1=183,5+88,0=271,5 мм; 5 ссавців з культурою (d1) і суму ссавців з (d 1) і суму UA 108460 U 5 10 15 d2=179,5+98,0=277,5 мм. Активність випробовуваної серії туберкуліну: 271,5 A 50000  48916  49000 МО/мг, 277,5 3 де 50000 - кількість МО в 1 см основного розчину контрольної серії туберкуліну. Таким чином, результати визначення активності ППД-туберкуліну на морських свинках, сенсибілізованих живою культурою БЦЖ та інактивованою автоклавуванням культурою M.bovis (Valle), співпадають і становлять 49000 МО/мг, тобто є однаково ефективними. Обидва способи можуть використовуватись для проведення контролю активності ППДтуберкуліну для ссавців. Проте, спосіб сенсибілізації тварин інактивованою автоклавуванням бактеріальною масою M.bovis (Valle) попереджає розповсюдження живих мікобактерій в зовнішньому середовищі і тому є екологічно безпечним. Таким чином, розроблений спосіб визначення активності ППД-туберкуліну для ссавців на великій рогатій худобі та морських свинках, сенсибілізованих інактивованою автоклавуванням суспензією культури M.bovis (Valle) є специфічним та безпечним для здоров'я тварин і людей і запобігає розповсюдженню живих мікобактерій в природі. Спосіб сенсибілізації сільськогосподарських та лабораторних тварин може використовуватись для визначення активності ППД-туберкуліну для ссавців. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 20 25 Спосіб визначення активності очищеного (ППД) туберкуліну для ссавців на тваринах, сенсибілізованих авірулентними культурами M.bovis, який включає отримання суспензії, що містить 1-5 мг культури мікобактерій, сенсибілізацію нею морських свинок і великої рогатої худоби та використання сенсибілізованих тварин для визначення активності туберкуліну очищеного (ППД) для ссавців у стандартному розчині, який відрізняється тим, що для сенсибілізації тварин використовують непатогенний, авірулентний (інактивований) біологічний матеріал, що запобігає розповсюдженню вірулентних мікобактерій в довкіллі. Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 6