Антимікробний засіб у вигляді інтрамамарного розчину для лікування маститів у великої рогатої худоби

Реферат: Антимікробний засіб у вигляді інтрамамарного розчину для лікування маститів у великої рогатої худоби містить активну речовину, стабілізатор і воду. Як активну речовину містить сполуку срібла у вигляді цитрату, який отриманий взаємодією нано- і мікрочастинок срібла, розміром 0,01-10 мкм з лимонною кислотою у водному колоїдному розчині срібла. Додатково містить діючі речовини аргінін та декспантенол. Як стабілізатор виступає полівінілпіролідон. UA 119231 U (12) UA 119231 U UA 119231 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Корисна модель належить до ветеринарії та хіміко-фармацевтичної промисловості, зокрема до розробки, створення та застосування комбінованих лікарських засобів для лікування мастита у сільськогосподарських тварин, зокрема може бути використано при лікуванні субклінічного запалення молочної залози у молочних корів. До теперішнього часу основними засобами для лікування хворих на мастит тварин залишаються препарати на основі антибіотиків. Однак, масове застосування антибіотиків для терапії маститів виявило ряд негативних факторів: поява антибіотикорезистентних штамів мікроорганізмів; розвиток дисбактеріозів та зниження імунного статусу; наявність антибіотиків у молоці після закінчення курсу антибіотикотерапії і як наслідок, поява небажаних реакцій у людей, що вживають таке молоко. Вищенаведені фактори підтверджують актуальність розробки нових антимікробних засобів для профілактики та лікування субклінічного та клінічного маститу у корів. Відомий препарат для лікування маститу у корів, що містить мірамістин у вигляді 0,01 %ного водного розчину [Пат. RU №2180221, A61K 31/00, A61K 31/205, від 10.03.2002]. Недоліком відомого препарату є низька ефективність лікування. Відомий препарат для лікування маститу у корів, що містить 2 % розчин новокаїну, антисептик-стимулятор Дорогова фракція 2, димексид і 40 % розчин глюкози, [Пат. RU №2320325, A61K 31/00, від 2008.03.27]. Недоліком відомого препарату є низька ефективність лікування. Відомий препарат для лікування маститу у корів, що включає антибіотик геліоміцин, ланолін і вазелінове масло при певному співвідношенні компонентів відповідно, мас. %: 2,0-4,0; 20,0-40; до 100,0 [Пат. RU №2058781, A61K 35/74, від 1996.04.27]. Недоліком відомих препаратів є низька ефективність лікування, розвиток дисбактеріозів та зниження імунного статусу; наявність антибіотиків у молоці. Відомий препарат для лікування маститу у корів, що містить колоїдне срібло, димексид, екстракти трав і жирову основу [Пат. RU №2073508, A61K 31/00, від 1997.02.20]. Найближчим аналогом є препарат для лікування корів із субклінічним маститом і спосіб його застосування [RU 2532407, A61K 33/38, від 10.11.2014]. Препарат містить наночастинки срібла, стабілізовані субмікронними частинками діоксиду титану, полі-N-вінілпіролідон-2, і воду. Недоліком цього препарату є те що спосіб отримання композиції недостатньо технологічний та в значній мірі трудомісткий, також у нього недостатня ефективність лікування. В основу корисної моделі поставлено задача створення антимікробного засобу у вигляді інтрамамарного розчину для лікування маститів у великої рогатої худоби з таким якісним і кількісним складом компонентів, який би забезпечив екологічність і ефективність препарату за рахунок використання срібла у найбільш біодоступній та нетоксичній формі. Поставлена задача вирішується тим, що у антимікробний засіб у вигляді інтрамамарного розчину для лікування маститів у великої рогатої худоби, що містить активну речовину, стабілізатор і воду, згідно з корисною моделлю, як активну речовину містить сполуку срібла у вигляді цитрату на основі органічної лимонної кислоти, отриманих взаємодією нано- і мікрочастинок срібла, розміром 0,01-10 мкм з органічною лимонною кислотою у водному колоїдному розчині срібла, додатково містить діючі речовини аргінін та декспантенол, як стабілізатор виступає полівінілпіролідон. Згідно з корисною моделлю, антимікробний засіб містить компоненти в наступних співвідношеннях компонентів мас. %: цитрат срібла у перерахунку на іони срібла 0,005-0,5 аргінін 0,5-10,0 декспантенол 1,0-5,0 полівінілпіролідон 5,0-25,0 вода для ін'єкцій решта. Препарати срібла мають широкий спектр антимікробної активності по відношенню до грампозитивних та грамнегативних, аеробних і анаеробних, спороутворюючих та аспорогенних бактерій у вигляді монокультур і мікробних асоціацій, включаючи антибіотикорезистентні штами Cрібло в іонному вигляді має бактерицидну, противірусну, виражену протигрибкову і антисептичну дії і служить високоефективним знезаражувальним засобом відносно патогенних мікроорганізмів, що викликають гострі інфекції. Науковий інтерес викликають сполуки срібла, а саме цитрат срібла, одержаний за оригінальною технологією українськими вченими, як активний фармацевтичний інгредієнт для розробки антимікробних препаратів. Технологічний процес отримання препарату полягає у наступному. Приготування стерильного розчину на основі цитрату срібла здійснюють в реакторі, 1 UA 119231 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 обладнаному якірною мішалкою. Устаткування, в якому розчин може зазнати впливу світла, має бути зачохлене. У реактор завантажують 50 л розчину цитрату срібла 0,005-0,5 мас. % і додають зі збірника о 20-25 л води для ін'єкцій з температурою (205) С, потім в реактор при перемішуванні завантажують послідовно: - 0,5 – 10,0 мас. % аргініну (в перерахунку на суху речовину), перемішують 10-15 хвилин; 1,0 – 5,0 мас. % декспантенолу (в перерахунку на суху речовину), перемішують 15-20 хвилин; 5,0 – 25,0 мас. % полівінілпіролідону, перемішують 15-20 хвилин. Доводять об'єм розчину водою для ін'єкцій до 100 л. Розчин перемішують протягом 10-15 хвилин. Після закінчення процесу приготування розчину відбирають середню пробу для контролю проміжного продукту згідно з розробленим аналітично - нормативним документу за такими показниками: - рН розчину 6,0-7,0; - кількісний вміст іонів срібла, та декспантенолу; - зовнішній вигляд розчину - прозора рідина світло-жовтого кольору. Під час проведення контролю проводять насичення розчину інертним газом (азотом) протягом 20 хвилин. Після проведення контролю проміжного продукту розчин під тиском інертного газу (азоту або аргону) передають на фільтри для попередньої і фінішної фільтрації розчину з розміром пор від 0,8 до 0,2 мкм. Контролюють рейтинг пор фільтрів, їх цілісність, режим фільтрації (тиск 0,08-0,10 МПа). Розчин після фільтра надходить до збірника фільтрованого розчину. Фільтрований розчин контролюють за показниками: механічні включення (відсутність), прозорість (повинен бути прозорий). При одержанні позитивних результатів фільтрований розчин надходить на наповнення ампул або флаконів і їх герметизацію. Підготовка первинної упаковки проводиться відповідно до документа підприємства, який регламентує підготовку матеріалів первинної упаковки, і складається з наступних операцій: - для ампул скляних місткістю 10 мл: • мийка ампул; • стерилізація ампул; - для флаконів скляних місткістю 10 мл і 50 мл: • підготовка стерильних флаконів; • підготовка стерильних пробок; • підготовка стерильних ковпачків. Контроль матеріалів первинної упаковки здійснюється за показниками стерильність, механічні включення. Наповнення ампул розчином і їх запаювання в струмі інертного газу (азоту) здійснюють в асептичних умовах на машині для наповнення і запаювання ампул. Перед початком роботи проводять наладку і регулювання автомата для наповнення. Перевіряють дозу наповнення об'ємним методом за допомогою каліброваного шприца. Ампули, просуваючись по транспортерній стрічці, надходять на утримувачі ампул в вузол наповнення. Дозуючі насоси наповнюють ампули розчином в дозі 10,5 мл. До і після наповнення розчином ампули насичуються фільтрованим інертним газом (азотом), а потім запаюються. Наповнення та герметизація флаконів розчином здійснюється в асептичних умовах на автоматичній лінії для наповнення і герметизації флаконів. Необхідний обсяг наповнення - 10,5 мл або 51 мл. Після наповнення флакони з розчином переміщаються в зону закупорювання пробками. Флакони, закупорені пробками, закатуються ковпачками алюмінієвими. Приклад 1. Дослідження гострої токсичності цитрату срібла. Дослідження проводили в Інституті біології тварин НААН під керівництвом професора, членкореспондента НААН Федорука Р.С. Експерименти, в яких використовували тварин проводили у відповідності до Міжнародних вимог про гуманне ставлення до тварин та виконанням вимог Директиви 86/609/ЄЕС щодо питання захисту тварин. При дослідженні гострої токсичності препарату інтегральним показником є виживаність/летальність тварин, який дозволяє розраховувати середньо-летальну дозу (LD50) – основну токсикологічну характеристику лікарського засобу Усіх дослідних тварин утримували у стандартних санітарних умовах. Під час експерименту тварини знаходилися у віварії при температурі 19-24 °C, вологості не більше 50 %, природному світловому режимі "день-ніч", у стандартних клітках, на збалансованому харчовому раціоні. Дослідження проведено на 5 групах тварин по 6 щурів у кожній, віком 2,5 місяця з вагою 110120 г. Розчин цитрату срібла (1г/л) вводили внутрішньошлунково за допомогою зонда згідно з методикою, описаної Коцюмбасом І. Я. [Коцюмбас І.Я. Доклінічні дослідження ветеринарних 2 UA 119231 U 5 10 15 20 25 лікарських засобів. – Л.: Тріада плюс, 2006. - 359 с.]. У зв'язку з низькою токсичністю препарату для досягнення летального ефекту введення проводили через кожні 1,5 год. протягом однієї доби. Для вираховування DL50 (DE50) використовуються безпосередні результати експерименту. У кожній групі повинно бути однакове число тварин. Кожна група має складатися із 6 тварин. Достатньо, щоб було досліджено всього 4-5 доз, які включають, з одного боку, дозу, що не викликає загибелі (ефекту) ні в однієї тварини в групі, та, з другого — дозу, яка викликає загибель (ефект) у всіх тварин групи. Визначення DL50 (DЕ50) проводять за формулою: DL50(DЕ50)= DL100(DЕ100)− Σ(zd)/m, де: DL100 (DЕ100) – доза речовини, яка вивчається, і викликає загибель (ефект, який вираховується) у всій групі тварин; d – інтервал між кожними двома суміжними дозами; z – середньоарифметичне з числа тварин, які загинули, або у котрих спостерігалася врахована реакція під впливом двох суміжних доз; m – число тварин у кожній групі. Статистичні висновки при порівнянні рядів експериментальних даних отримували на основі однофакторного дисперсійного аналізу або дисперсійного аналізу для даних з повторними вимірюваннями, критеріїв Ньюмена-Кейлса [Основные методы статистической обработки результатов фармакологических экспериментов /В кн.: Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. – М.:Ремедиум, 2000. – С. 349.]. Симптоми інтоксикації у вигляді матовості шерсті, пригнічення рухливості спостерігалися при введені препарату у кількості 180 мг цитрату срібла /кг маси тіла. За введення препарату з розрахунку 200 мг цитрату срібла /кг маси тіла у тварин починалася діарея. Вираження симптомів інтоксикації зростало із збільшенням дози препарату. Летальність тварин наступала протягом першої доби від початку введення препарату. Патологічний розтин тварин, що загинули не показав відхилень від фізіологічної будови внутрішніх органів. Через 2 доби стан тварин, які вижили не відрізнявся від фізіологічно здорових щурів. Спостереження проводились протягом 14 діб після введення препарату Таблиця 1 Протокол дослідження гострої токсичності цитрату срібла (1 г/л) Група піддослідних тварин 1 2 3 4 5 Доза мг/кг 83 105 247 369 509 Кількість щурів які вижили/кількість щурів які загинули 6/0 4/2 3/3 1/6 0,6 Розрахунок DL50 проводили за методом, що описаний Г. Кербером (табл.2) 30 Таблиця 2 Розрахунок DL50 за методом Г. Кербера Група Доза, мг/кг Вижило загинуло z (середнє з тварин що загинули від суміжних доз) d (інтервал між суміжними введеннями, г) zd І 83 6 0 ІІ 105 5 2 ІІІ 247 3 3 ІV 369 2 5 V 509 0 6 1 2,5 3,5 5,5 22 142 122 140 22 355 427 770 m=6 – кількість тварин у кожній групі DL100=509 мг/кг; Σ(zd)=1574; 3 UA 119231 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 В ході проведеного експерименту було встановлено летальну дозу препарату, яка становить 507,4 мг цитрату срібла /кг маси тіла, а також було визначено токсичну дозу, що зумовлює загибель 50 % цих щурів (DL50), яка становить 245 мг цитрату срібла /кг маси тіла щура. Приклад 2. Дослідження антимікробної активності цитратів срібла. Антимікробну активність активного фармацевтичного інгредієнта - цитрату срібла і вивчали стандартним методом серійних розведень в поживному середовищі - соєво-казеїновому бульйоні на різних тест-штамах мікроорганізмів. Скринінг проводили в лабораторії досліджень хіміко-біологічних чинників (сектор мікробіологічних випробувань) при Українському державному науково-дослідному інституті нанобіотехнологій та ресурсозбереження. Як тест-штами були використані стандартні типові культури мікроорганізмів, рекомендовані ДФУ для визначення антимікробної дії препаратів, отримані з банку культур НДІ мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України: Staphylococcus aureus 6538Р, Pseudomonas aeruginosae АТСС 9027, Escherichia coli ATCC 25922 (F-50), Proteus vulgaris ATCC 4636, Bacillus subtilis ATCC 6633, Candida albicans ATCC 885/6536633. 0 Штами вирощували при температурі 35-37 С 18-20 годин на скошеному соєво-казеїновому агарі (виробник Merck KGaA, Німеччина; термін придатності 15.05.2019) суспендували у 9 фізіологічному розчині, доводили концентрацію клітин до 10 КУО/мл і готували ряд 10-кратних 3 розведень до 10 КУО/мл, які свіжоприготовленими використовували в роботі. Готували суспензії мікроорганізмів і визначали їх оптичну щільність при 550 нм за допомогою денситометра "Densimat" в одиницях McFarland, перераховуючи отримані показники по таблиці для визначення концентрації бактеріальної суспензії в КУО/мл. Кількість мікроорганізмів у суспензії паралельно підтверджували методом прямого посіву на чашки Петрі зі стерильним поживним середовищем соєво-казеїновим агаром, перераховуючи на КУО/мл. Кожну партію готових поживних середовищ перевіряли на стерильність і ростові властивості. У роботі використовувалися розчини, перший - розчин цитрату срібла з вмістом срібла 500 мг/л або 500 мкг/мл та другий, що складається з цитратів срібла і міді в рівних пропорціях (з вмістом: срібла - 250 мг/л або 250 мкг/ мл і міді - 250 мг/л або 250 мкг/мл). У ряд пробірок вносили тріпказо-соєвий бульйон і готували розведення 1/10, 1/25, 1/50, 1/100; всі розчини використовувалися в свіжоприготованому вигляді. Приготовані розведення досліджуваних розчинів (ДР) розливали по 1,0 мл в пробірки; до кожного з розведень додавали по 0,1 мл 3 суспензії тест-штаму 10 КУО/мл (з розрахунку відповідної мікробного навантаження, зазвичай 2 10 клітин/мл). Інкубація посівів - 24-48 годин при 30-35С, з подальшим підтверджуючим висівом на чашки Петрі з поживним агаром. Облік результатів - візуальна оцінка наявності росту тест-штаму в дослідних пробах у співставленні з ростом тест-штаму в позитивному контролі (поживне середовище з тест-штамом без ДР). Негативний контроль (поживне середовище без тест-штаму, контроль стерильності поживного середовища), а також контроль стерильності ДР (поживне середовище без тест-штаму, але з додаванням ДР) скрізь був негативний. Дослідивши протимікробну активність розчину цитрату срібла у різних концентраціях (табл.3), виявлено, що тест-штами відрізняються своєю чутливістю до дії ДР. Найбільш чутливим до розчину цитрату срібла виявився штам Escherichia coli ATCC 25922 (F-50) та Pseudomonas aeruginosae АТСС 9027 при концентрації срібла у розчині 10 мкг/мл (розведення 1/50). Чутливість Staphylococcus aureus 6538Р до ДР срібла проявилась у концентрації срібла 25 мкг/мл (розведення 1/20). 4 UA 119231 U Таблиця 3 Антимікробна активність розчину цитрату срібла Розведення 1/1 500 1/10 1/20 1/50 1/100 Наявність росту тест-штаму Staphylococcus Pseudomonas aureus aeruginosae Термін експозиції в годинах 24 48 24 48 + + + + + + Концентрація срібла, мкг/мл 50 25 10 5 Escherichiа coli 24 + 48 + Примітка: «+» - наявність росту мікроорганізмів, «-» - відсутність росту мікроорганізмів. 5 Для визначення мінімальної інгібуючої концентрації цитрату срібла до Staphylococcus aureus 6538Р, Pseudomonas aeruginosae АТСС 9027 та Escherichia coli ATCC 25922 (F-50), були проведені випробування з використанням додаткових розведень розчину (табл.4). Таблиця 4 Чутливість досліджуваних штамів мікроорганізмів до розчину цитрату срібла Розведення 1/1 1/10 1/20 1/25 1/40 1/50 1/75 1/100 10 15 20 Концентрація срібла, мкг/мл 500 50 25 20 12,5 10 6,7 5 Наявність росту тест-штаму Pseudomonas Escherichiа Staphylococcus aeruginosae coli aureus Термін експозиції в годинах 24 48 24 48 24 48 + + + + + + + + + + + + + + Одержані дані дають підставу стверджувати, що мінімальна інгібуюча концентрація (МІК) цитрату срібла (вміст срібла 500 мкг/мл) по відношенню до тест-штаму Staphylococcus aureus 6538Р складає 20 мкг/мл; по відношенню до Escherichia coli ATCC 25922 – 6,7 мкг/мл, а до Pseudomonas aeruginosae АТСС 9027-10 мкг/мл відповідно. Протестовані розчини володіють високою антимікробною активністю, що за деякими показниками перевищує активність відомих антисептиків (хлоргексидину біглюконат, триклозан). У результаті експерименту встановлено, що цитрат срібла, одержаний за оригінальною ерозійно-вибуховою технологією, має високу антимікробну активність щодо наступних штамів: Staphylococcus aureus 6538Р, Pseudomonas aeruginosae АТСС 9027, Escherichia coli ATCC 25922 (F-50) та значною антимікробною дією по відношенню до тест-штамів: Proteus vulgaris ATCC 4636, Bacillus subtilis ATCC 6633, Candida albicans ATCC 885/6536633, що в деяких випадках перебільшує антимікробну активність хлоргексидину біглюконату, що слугував препаратом порівняння. Таким чином, проведені дослідження дозволили вибрати концентрацію активного фармацевтичного інгредієнта у складі протимаститного ветеринарного препарату. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 25 1. Антимікробний засіб у вигляді інтрамамарного розчину для лікування маститів у великої рогатої худоби, що містить активну речовину, стабілізатор і воду, який відрізняється тим, що як 5 UA 119231 U 5 активну речовину містить сполуку срібла у вигляді цитрату, який отриманий взаємодією нано- і мікрочастинок срібла, розміром 0,01-10 мкм з лимонною кислотою у водному колоїдному розчині срібла, додатково містить діючі речовини аргінін та декспантенол, як стабілізатор виступає полівінілпіролідон. 2. Антимікробний засіб за п. 1, який відрізняється тим, що містить компоненти, в наступних співвідношеннях компонентів, мас. %: цитрат срібла у перерахунку на іони срібла 0,005-0,5 аргінін 0,5-10,0 декспантенол 1,0-5,0 полівінілпіролідон 5,0-25,0 вода для ін'єкцій решта. Комп’ютерна верстка М. Мацело Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 6