Спосіб виготовлення туберкуліну очищеного (ппд) для птиці

Спосіб виготовлення туберкуліну очищеного для птиці, що включає вирощування протеїногенного штаму M.avium на синтетичному живильному середовищі, інактивацію бактеріальної маси, фільтрацію, відокремлення культурального фільтрату з подальшим осаджуванням білка із фільтрату трихлороцтовою кислотою, виділенням цільового продукту, який відрізняється тим, що культуральний фільтрат попередньо концентрують на мембрані, яка затримує білки розміром 15 кДа, а для осаджування білка використовують трихлороцтову кислоту в кінцевій концентрації 6 об. % та додатково очищують сірчанокислим амонієм при рН 7,07,2, стерилізують одержаний цільовий продукт на установці Sartorius. Корисна модель відноситься до ветеринарної мікробіології та біотехнології, а саме до способу виготовлення діагностичного препарату, який застосовується для алергічної діагностики туберкульозу птиці. Відомі способи одержання туберкуліну, які застосовують для діагностики туберкульозу "Аллерген туберкулезный концентрированный жидкий для накожного применения" (Альттуберкулин - AT) Харьковского предприятия по производству бактериальных препаратов, 1989, "Сухой очищенный туберкулин (ППД) для млекопитающих" (Патент №2035914 от 18. 01. 1993 г), "Туберкулин очищенный (ППД) для млекопитающих" (ГОСТ -1988). Недоліком способів виготовлення цих алергенів є використання органічних розчинників, які погіршують санітарно-гігієнічні умови праці, екологію оточуючого середовища, потребують спеціального обладнання та невеликий вихід готового продукту з одиниці об'єму. "Туберкулин сухой очищенный (ППД) для птицы" (ГОСТ - 1979). Недоліком цього препарату є те, що осадження білка проводять дегідратантами, а вихід готового продукту з 1 л культурального фільтрату 240-280 см 3 , що складає його собівартість однієї дози до 30-40 копійок. Найбільш близьким до заявляемого об'єкту є спосіб одержання очищеного туберкуліну для птиці, який являє собою розчин білкових фракцій, виділених хімічним шляхом із культурального фільтрату М. avium розчином трихлороцтової (ТХО) кислоти та багаторазовим його переосаджуванням цією кислотою (Авт. дис. на соиск. к.в.н. Гринев А.А., с.22). Це рішення може бути прототипом. Недоліком цього способу є велика трудоємкість технологічних процесів, висока собівартість та низький вихід препарату з 1л культурального фільтрату. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб виготовлення туберкуліну очищеного (ППД) для птиці, що включає вирощування протеїногенного штаму M.avium на синтетичному живильному середовищі, інактивацію бактеріальної маси, фільтрацію, відокремлення культурального фільтрату з послідуючим осаджуванням білка із фільтрату трихлороцтовою кислотою, виділенням цільового продукту, шляхом попереднього концентрування культурального фільтрату на мембрані, яка затримує білки розміром 15 кДа, а для осаджування білка використовують ТХОкислоту в кінцевій концентрації 6 об% та додатково очищують сірчанокислим амонієм при рН 7,07,2, стерилізують одержаний цільовий продукт на установці Sartorius, щоб забезпечити ефективність способу виготовлення туберкуліну очищеного ( ППД) для птиці. Спосіб виконується в такій послідовності: вирощують туберкуліногенний штам мікобактерій пташиного виду, стерилізують культуру, фільтрацією відокремлюють бактеріальну масу, попередньо очищують и концентрують культуральний фільтрат до 1:6-1:10 попереднього об'єму, осаджують білок ТХО-кислотою до кінцевого вмісту в фільтраті 4-8 %, переочищають білок сірчанокислим амонієм при рН - 7,0-7,2, діаліз полуфабрикату і після операції стандартизації проводять сте C M 4222 рилізуючу фільтрацію готового продукту (туберкуліну). Спосіб, що пропонується, відповідає критерію "Новизна", так як серед доступних літературних джерел інформації, не було виявлено способу виготовлення туберкуліну для птиці з такою сукупністю ознак. Приклад 1. У ємкість з синтетичним живильним середовищем висівають протеїногенну культуру мікобактерій M.avium і культивують в термостаті при 37,5-38°С протягом 50 діб. Одержану культуру мікобактерій стерилізують автоклавуванням при 102°С протягом 1 години. Потім мікробну завись фільтрують через марлевий фільтр. Одержаний прозорий культуральний фільтрат концентрують на установці УПВ-6 з порожнистими волокнинами 15 кДа при 8°С до 1:6 попереднього об'єму культурального фільтрату. В одержаному концентраті осаджування білка проводять 50% ТХОкислотою до кінцевої концентрації її в фільтраті 4 об. %. Одержаний осад білка через 10 годин центрифугують, після чого осадок розчиняють в дистильованій воді із розрахунку 1 частина білка і 10 частин дистильованої води і 10% розчином аміаку доводять розчин білку до рН - 7,0-7,2. Після цього розчин білка змішують з рівним об'ємом насиченого розчину сірчанокислого амонія і через 8 годин надосадкову рідину видаляють, а осадок розчиняють дистильованою водою в співвідношенні 1:10 і доводять рН до 7,2. Розчин білка обезсолюють у проточній дистильованій воді протягом 6 годин. Потім проводять стандартизацію продукта шляхом внесення до одержаного розчину білка хлористого натрію 0,85±0,05, гліцерину - 10,0+1,0, фенолу - 0,3 +0,1 та стерилізують на установці Sartorius і розливають у флакони по 10см3. Приклад №2. Теж саме, що і в прикладі №1, тільки концентрацію культурального фільтрату проводять до 1:8 попереднього об'єму. Приклад №3. Теж саме, що і в прикладі №1, тільки концентрацію культурального фільтрату проводять до 1:10 попереднього об'єму. Приклад №4. Теж саме, що і в прикладі №1. Осаджування білка проводять 50% ТХО-кислотою до кінцевої концентрації у фільтраті 6%. Приклад №5. Теж саме, що і у прикладі №2, а осаджування білка проводять 50% ТХО-кислотою до кінцевої концентрації у фільтраті 6%. Приклад №6. Теж саме, що і у прикладі №3, а осаджування білка проводять 50% ТХО-кислотою до кінцевої концентрації 6%. Приклад №7,8,9. Теж саме, що і у прикладі 1,2,3, а осаджування білка проводять 50% ТХО кислотою до кінцевої концентрації 8 об.% у культуральному фільтраті. Результати проведених досліджень наведені в таблицях 1,2,3,4. Таблиця 1 Показники Вміст білка мг/см^ Вихід цільового продукту із 1л культурального фільтрату, ТО/см3 Концентрація культурального фільтрату від попереднього об'єму 1:6 1:10 1:8 0,7 0,85 1,0 46000 48500 52000 Таблиця 2 Кінцева концентрація ТХО- кислоти, % 4 6 8 4 Варіант Пропонуємий Прототип Кількість доз препарату 280 520 320 280 Таблиця З Вид стерилізації Стерилізуюча фільтрація через фільтр Зейтца Стерилізуюча фільтрація на установці Sartorius Вихід цільового продукту із 1л культуральної рідини, ТО/см3 До стерилізації Після стерилізації 48000 - 52000 37000 - 40000 48000-52000 47000-51000 Таблиця 4 Показники Вихід білка мг/см13 Кількість доз туберкуліну з 1л культурального фільтрату Вихід цільового продукту з 1 літра культуральної рідини, TO\CM J Спосіб Прототип Пропонуємий 1,0-1 0,75 520 280 47000-51000 37000-40000 4222 Попереднє концентрування культурального фільтрату на ультрафільтраційних мембранах з затримуючою здатністю 15 кДа зменшує об'єм останнього Дослідами встановлено, що оптимальним значенням ступеню концентрації є 10 При більшій кратності спостерігали значні втрати білка, а менша концентрація немає сенсу, так як збільшуються витрати ТХО-кислоти, необхідної для осадження білка Зменшення концентрації культурального фільтрату у 10 раз зменшує КІЛЬКІСТЬ ТХО-кислоти, необхідної для осаджування білка, у 10 раз та в стільки ж разів зменшується КІЛЬКІСТЬ лугу, яка необхідна для нейтралізації надосадкової рідини Це дозволяє зменшити витрати, дефіцитні і дорогі хімреактиви, поліпшити санітарно-гігієнічні умови праці, зменшити забруднення оточуючого середовища При кінцевій концентрації ТХО-кислоти 4% осаджування білка не відбувається в повній мірі, а при 8% концентрації кислоти відбувається частко Комп ютерна верстка А Крулевский ва денатурація білка Встановлено, що оптимальною концентрацією для повного осаджування білка у культуральному фільтраті є 6% концентрація ТХО-кислоти Переосадження (очистка) білка сірчанокислим амонієм при рН - 7,0-7,2 дозволяє виготовити активний туберкулін Стерилізація туберкуліну на установці Sartonus дозволяє збільшити вихід білку і цільового продукту з 1 л культуральної рідини на 1000011000ТО/СМ3 Визначення специфічності виготовленого туберкуліну проведено на 15 морських свинках, сенсибілізованих гомологічним штамом пташиного виду і 15 м св-гетеролопчним штамом бичачого виду Інтенсивність алергічних реакцій у м свинок на виготовлений туберкулін у ГОМОЛОГІЧНІЙ системі була достовірно виражена на туберкулін для птиці а у гетеролопчній системі активність реакцій цього алергену була значно меншою Підписне Тираж 37 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності вул Урицького 45 м Київ МСП 03680 Україна ДП Український інститут промислової власності вул Глазунова 1 м Київ-42 01601