Спосіб прогнозування радіаційно-індукованих ефектів в імунній системі при опроміненні у професійних лімітах

Спосіб прогнозування радіаційно-індукованих ефектів в імунній системі при опроміненні у професійних лімітах, який включає імунологічний та генетичний аналіз клітин периферичної крові, який відрізняється тим, що встановлюють відносну довжину теломерів з застосуванням флуоресцентної гібридизації та проточної цитометрії та при зниженні показника нижче 15 умовних одиниць прогнозують розвиток радіаційно-індукованих ефектів у імунній системі при дозах опромінення нижче 20м3в. Спосіб відноситься до медико-біологічного напрямку, а саме до радіаційної медицини, радіаційної гігієни та молекулярної біології, і може бути використаний для прогнозування дії іонізуючої радіації на організм людини у діапазоні доз, що не перевищують професійних лімітів та професійного відбору персоналу. Відомий спосіб визначення індивідуальної стійкості до дії радіоактивного випромінювання шляхом визначення лейкоцитарного фенотипу НLА-А,В,С та, при визначенні аллоантигенів А1, В5, В8 та СW4 прогнозування схильності до розвитку гострої променевої хвороби та пов'язаних імунологічних порушень. Спосіб дозволяє визначати радіочутливість та вибірковість імунологічного обстеження [1]. До недоліків способу відносяться неможливість прогнозування у діапазоні малих доз та врахування поточних вікових змін радіочутливості, оскільки антигени гістосумісності І класу залишаються незмінними на протязі життя людини. Відомий спосіб визначення протипоказань до праці з радіоактивними речовинами і джерелами іонізуючих випромінювань (персонал категорії А) за визначенням показників загального аналізу крові, тромбоцитів, рентгенографії органів грудної порожнини, ультразвукового дослідження щитоподібної залози [2]. У якості протипоказань для професійного контакту з іонізуючими випромінюваннями визначають вміст гемоглобіну менше 130г/л у чоловіків і 120г/л у жінок, кількість лейкоцитів менше 4,5 109г/л, тромбоцитів менше 180000, наявність уже діагностованих імунодефіцитних станів, променевої хвороби II-IV ступенів важкості або наявності її стійких наслідків, хронічних захворювань не пухлинного та пухлинного походження. Спосіб дозволяє проведення професійного відбору та недопущення до роботи в особливо шкідливих умовах праці осіб з уже наявними стійкими порушеннями стану здоров'я, але не дає можливості прогнозування таких порушень у працівників, що відповідають критеріям професійного відбору. Відомий також спосіб визначення радіогенного ушкодження у людини та експериментальних тварин, що включає взяття у обстежених зразків периферичної крові, відокремлення фракції мононуклеарних клітин, їх інкубацію на протязі 72 годин з речовинами-індукторами клітинного поділу та встановлення числа хромосомних аберацій, в тому числі радіогенних - числа діцентричних хромосом при обстеженні зразків під мікроскопом [3]. Метод дозволяє визначити дозу опромінення, але (19) UA (11) 48631 (13) U (21) u200910403 (22) 14.10.2009 (24) 25.03.2010 (46) 25.03.2010, Бюл.№ 6, 2010 р. (72) БАЗИКА ДМИТРО АНАТОЛІЙОВИЧ, ІЛЬЄНКО ІРИНА МИКОЛАЇВНА, БЄЛЯЄВА НАДІЯ ВОЛОДИМИРІВНА, БЄЛЯЄВ ОЛЕГ АНАТОЛІЙОВИЧ, ЛЯСКІВСЬКА ОЛЕНА ВІКТОРІВНА, МАЗНІЧЕНКО ОКСАНА ЛЕОНИДІВНА (73) ДЕРЖАВНА УСТАНОВА "НАУКОВИЙ ЦЕНТР РАДІАЦІЙНОЇ МЕДИЦИНИ АКАДЕМІЇ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ" 3 48631 є праце - та часомістким, недостатньо чутливим при дозах у межах професійних лімітів. Підвищена кількість хромосомних аберацій не дозволяє прогнозувати розвитку будь-яких імунологічних ефектів. Відомий спосіб визначення середньої довжини теломерних послідовностей за допомогою полімеразної ланцюгової реакції. Спосіб базується на проведенні денатурації, стадії віджигу та ампліфікації теломерних послідовностей із використанням відповідних праймерів [4]. До недоліків способу відноситься необхідність забезпечення стерильних умов для попередження контамінації дезоксирибонуклеїнової кислоти (ДНК) та неможливість визначення довжини теломерів для окремих клітин. Відомий спосіб визначення захворювань, пов'язаних із старінням, який базується на дослідженні функціонального стану клітин в умовах штучного підвищення їх проліферативної активності шляхом внесення до реакційного середовища біологічно активних субстанцій, які модулюють активність myc- подібного протеїну, з наступним визначенням активності ферменту теломерази, що приймає участь у регуляції довжини теломерів. У якості індукторів використовують L2-myc, N-myc, Lmyc білки. За способом можливо також тестувати фармацевтичні препарати, які містять L2-myc протеїн [5]. Недоліком цього способу є можливість визначення тільки тих захворювань, у розвитку яких приймає участь с-myc протеїн, що робить обмеженим його застосування для визначення ефектів іонізуючого опромінення, а також неможливість застосування до клітин на ранніх стадіях диференціювання, в т.ч. стовбурових. Найбільш близьким до заявленого способу є метод діагностики онкологічних захворювань шляхом визначення "кількості" теломерних послідов 4 ностей методом флуоресцентної гібридизації in situ(FISH) в якості індексу. Даний спосіб обраний за прототип. В основі методу лежить процес гібридизації із зондом міченим флуоресцентним барвником, який специфічно комбінується із теломерними послідовностями. Методика проводиться як із неушкодженими тканинами, так із раковою тканиною. За діагностичний показник приймається відносне співвідношення кількості флуоресцентних сигналів досліджуваної та пухлинної тканин [6]. Даний спосіб, прийнятий за прототип, є аналогічним заявленому лише тим, що використаний подібний технологічний підхід та об'єкт дослідження, а саме кінцеві ділянки хромосом. Як і заявлений спосіб, обраний прототип базується на відносних показниках в якості діагностичних маркерів канцерогенних захворювань, однак не спрямований на вікові та радіаційно-індуковані патології. Основною задачею способу, який заявляється, є вдосконалення діагностики та підвищення надійності прогнозування радіаційно індукованих ефектів у імунній системі в умовах дії іонізуючого опромінення у дозах, що не перевищують професійних лімітів. Поставлена задача запропонованого способу розв'язується шляхом визначення відносної довжини теломерів в ядерних гемопоетичних клітинах із використанням зв'язаних із флуоресцеїном зразків пептидної нуклеїнової кислоти (РИА). Результати оброблялись за допомогою проточної цитометрії із застосуванням джерела лазерного вивипромінювання з довжиною хвилі 488нм. Методика проведення аналізу складалась з декількох етапів, а саме: попередня обробка, денатурація, гібридизація (1-ий день); промивання, фарбування ДНК, аналіз (2-ий день) (табл.1). Таблиця 1 Методика проведення Flow-FISH аналізу 1-ий день Попередня обробка денатурація Гібридизація Промивка дослідних та контрольних клітин в розчині, забуференому фосфатами. Підрахунок клітин в камері Горяєва. 6 6 Для кожного зразка змішати 2*10 дослідних клітин та 2*10 контрольних клітин. Додати розчин, забуферений фосфатами у кількості 6 мл. Розділити суміш на 4 однакові частини по 1.5мл (1*106 клітин) та розмістіть у 1.7мл пробірках для мікроцентрифугування, які необхідно позначити літерами А, Б, В, Г. Центрифугування клітин при 500об./хв. Протягом 5хв. Шляхом всмоктування / аспірації необхідно перенести якомога більше супернатанту. Додати 300мкл гібридизаційного розчину (пляшечка 1) до кожної з 2-х пробірок А та Б (контрольні пробірки) та 300мкл теломерної РКА міченої РІТС в гібридизаційному розчині (пляшечка 2) до кожної з 2-х пробірок В та Г (дослідні пробірки). Закрити кришкою та перемішайте за допомогою вихрової мішалки. Переконатися, що клітинні конгломерати ресуспендувалися як слід. 4 пробірки розмістити у нагрівальному приладі, попередньо прогрітому до темпера2 тури +82°С та залишити на 10хв. За допомогою вихрової мішалки необхідно перемішати та залишити пробірки у темряві при кімнатній температурі на всю ніч. 5 48631 6 Продовження таблиці 1 Промивання Фарбування ДНК Аналіз 2-ий день: Додати 1мл розчину для промивання (вміст пляшечки 3, розведений чистою водою у співвідношенні 1:10) до кожної з 4-х пробірок. Накрити кришкою та перемішайте за допомогою вихрової мішалки. Необхідно розмістити пробірки у нагрівальному приладі, попередньо прогрітому до температури +40°С на 10хв. Перемішати за допомогою вихрової мішалки та пробірок для мікроцентрифугування при 500 об./хв. протягом 5 хв. Обережно злити супернатант у контейнер для відходів. Додати 1мл розчину для промивання (вміст пляшечки 3, розведений чистою водою у співвідношенні 1:10) до кожної пробірки для мікроцентрифугування. Накрити кришкою та перемішати за допомогою вихрової мішалки. Розмістіть пробірки у нагрівальному приладі, попередньо прогрітому до температури +40°С на 10хв. Перемішайте за допомогою вихрової мішалки та пробірок для для мікроцентрифугування при 500об./хв. протягом 5хв. Обережно злити супернатант у відповідний контейнер для відходів Додайте 0.5мл розчину, який фарбує ДНК (пляшечка 4, розведення 1:10) до кожної з 4-х пробірок. Накрийте кришкою та перемішайте за допомогою вихрової мішалки. Перемістити 4 зразки клітинних суспензій (А, Б, В, Г) у 4 пробірки для проточної цитометрії, які позначені літерами А, Б, В та Г. Перемішуйте зразки за допомогою вихрової мішалки безпосередньо перед перенесенням задля того, щоб мінімізувати втрату клітин через їх прилипання до стінок пробірки. 3 Залишити пробірки у темряві при температурі +2-8°С на 2-3год. Аналізувати зразки на проточному цитометрі, використовуючи логарифмічну шкалу FL1-Н для флуоресценції від зразків А, Б та лінійну шкалу FL2-Н для зразків В, Г після зафарблення ДНК пропідію йодидом. В якості контролю, була використана культура лейкемічних клітин К-562, які є гіпотриплоїдними та мають довгі теломерні послідовності. У результаті проведеної методики зразки, які гібридизуються із пробою РNА міченою FІТС показував флуоресцентний сигнал по FL1, який вищий, ніж фоновий / аутофлуоресцентний сигнал, отриманий від зразків таких самих клітин, але гібридизованих за допомогою гібридизаційного розчину без проби. Аналіз проводився у режимі dot plot: FL1-Н/FL2-Н. Робочі гейти були виділені як для дослідних клітин (мононуклеари людини), так і для контрольних (К562) клітини у фазі G0 / 1 Відносна довжина теломерів (RTL) була розрахована за формулою 1: середнезначення 1 у досліднихклітиніз зразком середне FL значення 1 у досліднихклітинбез зразка FL 100 RTL= середнезна ченняFL уконтрольн 1 ихклітиніз зразком середне значення 1 у контрольни клітинбез зразка FL х Проведене нами дослідження ґрунтувалося на визначенні відносної довжини теломерів у мононуклеарах периферичної крові осіб, які виконують роботи в особливо небезпечних умовах праці із зовнішнім опроміненням до 35м3в та небезпекою інкорпорації трансуранових елементів. Група осіб обстежені у ранній період після опромінення та є працівниками об'єкту "Укриття" (ОУ). Загальна кількість осіб, які були обстежені склала 25 осіб. Характеристика групи осіб, які виконують роботи в (1) особливо небезпечних і шкідливих умовах праці (ОНіШУП) наведена у табл.2. Всі пацієнти проходили обстеження за інформованою згодою. За результати поглибленого обстеження стану здоров'я, у тому числі за імунологічними показниками, всі обстежені були допущені до виконання робіт в особливо шкідливих умовах праці по радіаційному фактору згідно з наказом МОЗ України від 21.05.2007р. №246 (2). 7 48631 8 Таблиця 2 Характеристика групи осіб, які виконують роботи в ОНіШУП Характеристика кількість (осіб) n вік (роки) діапазон М±m доза (м3в) діапазон М±m Група осіб, які виконують роботи у радіаційно небезпечних умовах 25 30-58 47,4±1,41 2,20-9,90 6,3±0,37 Контрольну групу склали 10 практично здорових осіб, гематологічні та імунологічні показники яких коливались в межах вікових норм. Віковий діапазон від 39 до 56 років (М±m 49,2±1,73). Всі особи контрольної групи опромінені в межах природного радіаційного фону. Співставлення відносної довжини теломерних послідовностей лімфоцитів з показниками клітинного та гуморального імунітету, а також кількістю радіогенних мутацій у локусі Т-клітинного рецептору після перебування у зоні підвищеного радіаційного фону показало вірогідно вище число відхилень показників від норми у персоналу з низьким показником відносної довжини теломерів. Результати статистичної обробки наведено на рис.1-7. Наводимо конкретні приклади виконання способу. Приклад 1. Пацієнт М., 49 років, лабораторна карта №155213/09, працівник об'єкту "Укриття". Клітинний імунітет: порушення Т-клітинної ланки імунітету - підвищений відсоток СD8+ клітин (Тсупресори) 47,10%, знижений відсоток СD4+ клітин (Т-хелпери) 24,52, як наслідок знижений імунорегуляторний коефіцієнт 0,52. В-ланка - без відхилень. Гуморальний імунітет: IqA-1,78г/л, IqМ0,77г/л, IqG-10,85г/л. ЦИК 4,16% - 7од. опт. щ ., ЦИК 7,2 % - 120од. опт. щ.. Проведений flow-FISН аналіз, для визначення відносної довжини теломерів у мононуклеарах периферичної крові пацієнта. За даними проточної цитометрії були встановлені показники інтенсивності флуоресценції за FL1-детектором (зелений спектр) для контрольних та експериментальних клітин у 2 варіантах: за наявності та відсутності зв'язування з РNА зондом. Відносна довжина теломерів розраховувалась за формулою 1.1, та становила 11%. Приклад 2. Пацієнт Б., 42 років, лабораторна карта №155207/09, працівник об'єкту "Укриття". Клітинний імунітет: показники Т-В-ланки - у межах норми, однак імунорегуляторний коефіцієнт знаходиться на верхній границі норми - 2,02. Гуморальний імунітет: IqA-2,10г/л, IqМ-0,92г/л, IqG-10,85г/л. ЦИК 4,16% - 26од. опт. щ., ЦИК 7,2% -116од. опт. щ.. Проведений flow-FISН аналіз, для визначення відносної довжини теломерів у мононуклеарах периферичної крові пацієнта. Показник RTL становив 11% (формула 1.1.). Приклад 3. Пацієнт А., 47 років, лабораторна карта №156117/09, працівник об'єкту "Укриття". Клітинний імунітет: показники Т-В-ланки - у межах норми. Гуморальний імунітет: IqA-1,22г/л, IqМ-0,60г/л, IqG9,49г/л. ЦИК 4,16% - 24од. опт. щ., ЦИК 7,2% 263од. опт. щ.. Проведений flow-FISH аналіз, для визначення відносної довжини теломерів у мононуклеарах периферичної крові пацієнта. Відносна довжина теломерів розраховувалась за формулою 1.1. та становила 14%. Спосіб може бути використаний в спеціалізованих медичних закладах, що надають допомогу постраждалим внаслідок аварії на Чорнобильській АЕС, в тому числі хворим гострою променевою хворобою, імунодепресіями, енцефалопатіями та іншими органічними розладами. Джерела інформації: 1. Способ определения устойчивости организма к радиоактивному облучению/ Бебешко В.Г., Чумак А.А., Минченко Ж.Н., Базыка Д.А., Талько В.В., Преварский Б.П., Халявка И.Г. // А.с. СССР №311673. 2. Міністерство охорони здоров'я України. Наказ №246 від 21.05.2007р. «Про затвердження Порядку проведення медичних оглядів працівників певних категорій». Зареєстровано Міністерством юстиції за №846/14113 від 23.07.2007р. Офіційний сайт МОЗ України: www.moz.gov.ua 3. Awa A. Chromosomal aberrations. In: Effects of the A-bomb radiation on the human body (Eds. I. Shigematsu et al.). Harwood Academic Publishers. Buncodo Co.: Tokyo. -pp.247 - 274. 4. Method for estimating telomere length / Bendix Laila, Koelvraa Steen // Патент на винахід №WO2009021518 (A1), Індекси МПК: C12Q1/68, C12Q1/68, опубліковано 19.02.2009, esp@cenet. 5. Method of treating aging-related disorders / Andrews William H. // Патент на винахід № US2003077757 (Al), Індекс МПК: С07К16/00, С12Р21/08, СО7К16/00, С12Р21/08, опубліковано 24.04.2003, esp@cenet. 6. Diagnosis of cancer using telomere amount by tissue FISH method as index / Kamimori Makoto, Tacubo Kaiyo // Патент на винахід №JP2006242618 (А), Індекси МПК: G01N33/574, C12N15/09, C12Q1/02, C12Q1/68, G01N21/78, G01N33/53, G01N33/566, G01N33/574, C12N15/09, C12Q1/02, C12Q1/68, G01N24/77, G01N33/53, G01N33/566, опубліковано 14.09,2009, esp@cenet. 9 48631 10 11 48631 12 13 48631 14 15 Комп’ютерна верстка Н. Лиcенко 48631 Підписне 16 Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601