Застосування лектину насіння сої для регуляції формування і функціонування бобово-ризобіального симбіозу люцерни та сої за дії посухи

Реферат: Застосування лектину насіння сої для регуляції формування і функціонування бобоворизобіального симбіозу люцерни та сої за дії посухи. UA 102177 U (12) UA 102177 U UA 102177 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель стосується рослинництва, зокрема технології вирощування бобових культур - люцерни та сої. Фізіологічні процеси, що відбуваються у рослинах даної родини за умов інокуляції, і, відповідно, їхня реакція на дію стресів, визначаються особливостями утворення та функціонування симбіозу з бульбочковими бактеріями. Тому при пошуку шляхів підвищення продуктивності цих культур, зокрема за несприятливих умов вирощування, важливо враховувати вплив зовнішніх чинників на здатність бобових у симбіозі з ризобіями засвоювати молекулярний азот, а також значення компонентів бобово-ризобіальних систем у реалізації їх потенціалу. Відомо, що лектини бобових відіграють важливу роль на початкових етапах взаємодії рослин та мікроорганізмів, а також у подальшому впливають на ріст і розвиток рослин й функціонування симбіозу [Биологическая фиксация азота: бобово-ризобиалъный симбіоз / С.Я. Коць, В.В. Моргун, В.Ф. Патыка и др. Т.2. - К.: Логос, 2011. - С. 5-117]. Відомий спосіб використання лектину люпину для підвищення симбіотичних властивостей повільнорослих бульбочкових бактерій Bradyrhizobium, які здатні утворювати функціональні кореневі бульбочки на люпині [патент № UA 55620 А від 15.04.2003 p.], що передбачає попередню обробку бактеріальної суспензії речовиною-регулятором, за яку використовують лектин люпину або сої, а обробку проводять шляхом інкубації бактеріальної суспензії ризобій вказаними лектинами у концентрації 1 мг/мл протягом доби при t 28 °C. Відомий спосіб використання рослинних лектинів для захисту овочевих культур від хвороб [патент № UA 41723 U від 10.06.2009 p.], який характеризується тим, що для захисту овочевих культур від грибкових захворювань (фітофторозу, альтернаріозу, несправжньої борошнистої роси) застосовують розчин лектину пшениці (аглютиніну зародків пшениці) та лектину насіння сої у концентраціях 5 мкг/мл (0,0005 %) або 10 мкг/мл (0,001 %) методом обприскування рослин у період вегетації. Відомостей про використання лектинів для підвищення азотофіксувальної активності та продуктивності бобових рослин за дії абіотичного стресу, зокрема посухи, в патентній базі даних нами не знайдено. Водночас у літературі широко обговорюється значення лектинів у формуванні реакцій рослин на дію несприятливих факторів довкілля [Шакирова Ф.М., Безрукова М.В. Современные представления о предполагаемых функциях лектинов растений // Журнал общей биологии. 2007. - 68, № 2. - С. 109-125; De Hoff P.L., Brill L.M., Hirsch A.M. Plant lectins: the ties that bind in root symbiosis and plant defense // Моl Genet Genomics. - 2009. - 282. - P. 1-15; Бабоша А.В. Индуцибельные лектины и устойчивость растений к патогенным организмам и абиотическим стрессам // Биохимия. - 2008. - вып. 7 (73). - С. 1007-1022], а також можливість їх використання на практиці [Melnykova N.M., Mykhalkiv L.M., Mamenko P.M., Kots S.Ya. The areas of application for plant lectins // Biopolymers and Cell. - 2013. - 29, N5. - P. 357-366]. Показано [Кириченко О.В. Біологічна активність екзогенних рослинних лектинів при утворенні та функціонуванні фітобактеріальних асоціацій // Вісник ХНАУ. Серія Біологія. - 2011. - вип. 2 (23). - С. 46-59], що за дії УФ-опромінення обробка насіння пшениці аглютиніном зародків пшениці забезпечує протекторний ефект на ранньому етапі онтогенезу рослин, виявлено [Лубянова А.Р., Безрукова М.В., Фатхутдинова Р.А., Шакирова Ф.М. Ростстимулирующий и защитный эффекты фитогемагглютинина на растения фасоли // Влияние фитогемагглютинина на солеустойчивость проростков // Вісник ХНАУ. Серія Біологія. - 2009. - вип. 2 (17). - С. 40-46], що передстресова обробка проростків квасолі фітогемаглютиніном попереджає викликане засоленням гальмування мітотичної активності клітин апікальної меристеми кореня, тоді як застосування цього лектину в постстресовий період прискорює репарацію ростових процесів у коренях. Задачею представленої корисної моделі є забезпечення ефективного формування і функціонування симбіотичних систем люцерни - Sinorhizobium meliloti та сої - Bradyrhizobium japonicum за посушливих умов. Це досягається шляхом застосування даної моделі, суть якої полягає у використанні лектину насіння сої (кінцева концентрація 100 мкг/мл) для передпосівної обробки насіння рослин із наступною інокуляцією або ж для інкубування з бактеріальною культурою, що використовується для інокуляції, при цьому тривалість обробки лектином становить 20 год. Наведені нижче приклади призначені для ілюстрації та пояснення запропонованої корисної моделі. Для підтвердженняефективності заявленого способу проводили досліди з вирощування рослин люцерни та сої за інокуляції бульбочковими бактеріями на фоні різного водозабезпечення. Приклад 1. Досліди проводили на базі Інституту фізіології рослин і генетики НАН України з використанням районованого на території України сорту люцерни посівної (Medicago sativa L.) 1 UA 102177 U 5 10 Надежда. Передпосівну інокуляцію насіння здійснювали виробничим штамом S. meliloti 441. Рослини вирощували на відкритому вегетаційному майданчику в піщаній культурі на поживному середовищі Гельригеля з 0,25 норми азоту [Ca(NO3)2] із застосуванням контрольованого поливу. Вологість субстрату підтримували на рівні 60 % повної вологоємкості (ПВ). У фазі прихованої бутонізації створювали модельну посуху (40 % ПВ), застосовуючи контрольований полив рослин, яку підтримували упродовж 30 діб, після чого полив у всіх варіантах відновлювали до оптимального рівня (60 % ПВ). Схема досліду включала контрольні варіанти, де насіння інокулювали ризобіями, не використовуючи лектин [Насіння + S.m.], а також дослідні, у яких лектин використовували для обробки насіння [(Насіння + Л) + S.m.] з наступною його інокуляцією або для обробки ризобій [Насіння + (S.m. + Л)], використаних для інокуляції. У результаті проведених досліджень виявлено (табл. 1.1), що передпосівна обробка насіння люцерни лектином активізує формування симбіотичного апарата, сприяючи утворенню на коренях рослин більшої кількості бульбочок у порівнянні з контролем, при цьому знижувався відсоток гроноподібних бульбочок (фаза стеблування). 15 Таблиця 1.1 Вплив обробки лектином насіння сої на формування бульбочок на коренях люцерни, інокульованої S. meliloti 441 Фаза розвитку рослин Варіант бутонізація цвітіння-початок плодоношення 18/16,7 59,4/17,2 43,6/6,42 32,4/25,9 22,4/24,1 47/35,3 10,4/0 32,8/0,6 64/2,8 стеблування 16,4/0 11,2/1,8 21/23,8 60 % ПВ Насіння + S.m., к-1 (Насіння + Л) + S.m. Насіння + (S.m. + Л) 7/11,3* 11,6/4,3 7/5,6 Насіння + S.m., к-2 (Насіння + Л) + S.m. Насіння + (S.m. + Л) 40 % ПВ Примітка. * загальна кількість бульбочок, шт./відсоток грон від загальної кількості бульбочок. Тут, на фіг. 1. і у табл. 1.2-1.3: Л - лектин, S.m. - Sinorhizobium meliloti 441, к-1 - контроль 1, к-2 - контроль 2 20 25 30 35 У фазі бутонізації встановлено стимулювання процесу модуляції на фоні обох способів обробки лектином у 2-6 разів залежно від рівня вологості. На фоні 60 % ПВ за обробки лектином насіння відсоток грон від загальної кількості бульбочок залишався на рівні контролю, тоді як інкубування ризобій із білком спричинило зниження цього показника майже у 3 рази. За недостатності водозабезпечення у контрольному варіанті, на відміну від обох дослідних, взагалі не виявлено грон. У період цвітіння - початок плодоношення кількість бульбочок на коренях люцерни, інокульованої бактеріальною суспензією з лектином, залишалась вищою, ніж у контрольному варіанті, як за 60, так і за 40 % ПВ. У варіантах із обробкою лектином насіння спостерігали меншу, у порівнянні з відповідними контролями, кількість бульбочок. Слід зазначити, що застосування лектину для обробки бактеріальної суспензії не лише інтенсифікувало процес бульбочкоутворення, але й пом'якшувало (а у фазі бутонізації і повністю знімало) негативний вплив посухи на нього. При дослідженні азотфіксувальної активності (фіг. 1) у бульбочках люцерни як за оптимального, так і недостатнього водозабезпечення на фоні використання лектину виявлено зростання даного показника у фазі бутонізації у 2,9-4,5 разу. А в період цвітіння - початок плодоношення позитивний ефект від застосування лектину спостерігали лише при обробці ним бактеріальної культури у варіантах як за 60 %, так і 40 % - в 1,6 і 2,6 разу відповідно. Слід зазначити, що за оптимального водозабезпечення в контрольному варіанті та за обробки лектином ризобій, пік азотофіксувальної активності виявлено у період цвітіння - початку плодоношення. За недостатнього водозабезпечення в усіх досліджуваних варіантах, а також за 60 % ПВ у варіанті з обробкою лектином насіння, активність симбіозу в цей час знижувалась у порівнянні з попередньою фазою. 2 UA 102177 U 5 10 15 Застосування лектину суттєво впливало також на ростові процеси у люцерни. Зокрема, виявлено збільшення маси коренів рослин, бактеризованих ризобіями з лектином, за нестачі вологи, що опосередковано свідчить про збільшення адаптованості до нестачі вологи. Також відзначено зростання надземної маси рослин на фоні використання лектину, особливо значне на фоні впливу нестачі вологи (табл. 1.2). Так, при використанні лектину для обробки насіння маса рослин збільшилась на 17-34 %у порівнянні з контролем, а при інкубуванні бактеріальної суспензії з лектином приріст становив 61-129 % залежно від фази розвитку рослин. Відзначено, що застосування лектину сприяло збільшенню вмісту хлорофілів а і b, а також каротиноїдів у листках люцерни в більшості дослідних варіантів. Обробка лектином інокуляційної суспензії приводила до підвищення урожаю насіння рослин за недостатності водозабезпечення на 32 % (табл. 1.3). Отже, у результаті проведених досліджень було виявлено, що застосування лектину сої інтенсифікує у симбіотичних системах люцерна-S. meliloti процеси бульбочкоутворення, азотофіксації, росту рослин, спричиняє підвищення вмісту хлорофілів і каротиноїдів у листках. Інокуляція насіння люцерни ризобіями, інкубованими з лектином сої, сприяє підвищенню насіннєвої продуктивності рослин за недостатнього водозабезпечення на 32 %. Таблиця 1.2 Вплив обробки лектином насіння сої на наростання надземної маси (г сухої речовини/рослину) люцерни, інокульованої штамом S. meliloti 441 Фаза розвитку рослин Варіант бутонізація цвітіння-початок плодоношення 0,73±0,06 0,72±0,05 0,62±0,03 0,76±0,04 0,74±0,04 0,84±0,05 0,41±0,03 0,55±0,03 0,66±0,04 стеблування 0,35±0,01 0,41±0,03 0,80±0,06 60 % ПВ Насіння + S.m., к-1 (Насіння + Л) + S.m. Насіння + (S.m.+ Л) 0,16±0,02 0,20±0,01 0,21±0,02 Насіння + S.m., к-2 (Насіння + Л) + S.m. Насіння + (S.m. + Л) 40 % ПВ Таблиця 1.3 Урожай насіння (г/посудину) люцерни при застосуванні лектину насіння сої Варіант Насіння + S.m., к-1 (Насіння + Л) + S.m. Насіння + (S.m. + Л) Насіння + S.m., к-2 (Насіння + Л) + S.m. Насіння + (S.m. + Л) 20 25 30 Урожай насіння 60 % ПВ 2,48±0,19 2,58±0,21 2,79±0,24 40 % ПВ 1,30±0,13 1,44±0,12 1,72±0,14 % від контролю 100 104 113 100 111 132 Таким чином, показано перспективність застосування лектину, зокрема, для обробки бактеріальної суспензії для інокуляції насіння люцерни, з метою підвищення ефективності і продуктивності бобово-ризобіальних систем в умовах недостатнього водозабезпечення. Приклад 2. Дрібноділянкові досліди проводили на базі Інституту фізіології рослин і генетики НАН України з використанням люцерни сорту Надежда та бульбочкових бактерій Sinorhizobium meliloti 441. Схема досліду включала: 1) контрольний варіант, у якому не використовували лектин і не проводили передпосівну інокуляцію насіння ризобіями [Насіння + вода], 2) варіант із обробкою насіння лектином без інокуляції [Насіння + Л], 3) варіант, у якому використовували як інокулянт ризобії, проінкубовані з лектином [Насіння + (S.m. + Л)], 4) варіант, у якому насіння інокулювали ризобіями, при цьому не використовували лектин [Насіння + S.m.]. 3 UA 102177 U 5 10 15 Виявлено, що у фазі стеблування на коренях усіх варіантів починають формуватись бульбочки (табл. 2.1). У контролі (насіння, оброблене водою) бульбочки утворювались на більш, ніж 50 % рослин по 1-2 шт. на корені (це свідчить про наявність у ґрунті місцевих активних рас ризобій, здатних інокулювати люцерну), тоді як при передпосівній інкубації насіння з лектином (без наступної інокуляції S. meliloti 441) бульбочки було виявлено майже на усіх рослинах у кількості 2-5 шт. на корені. У варіантах із бактеризацією спостерігали тенденцію до збільшення кількості бульбочок у порівнянні з варіантами без інокуляції, проте в межах похибки досліду. При цьому не виявлено суттєвої різниці між варіантами з обробкою ризобій лектином і без обробки. Отримані дані аналогічні результатам вегетаційного досліду, де у даній фазі інкубування ризобій із лектином не вплинуло на кількість бульбочок у порівнянні зі звичайною інокуляцією. Наступний відбір (стеблування - прихована бутонізація) показав, що виявлені закономірності зберігаються, але при цьому відмічено тенденцію до наростання кількості бульбочок на коренях рослин, бактеризованих ризобіями, інкубованими із лектином, у порівнянні зі звичайною інокуляцією. При цьому всі проаналізовані рослини контрольного варіанту мали бульбочки і фіксували азот. Таблиця 2.1 Вплив лектину насіння сої на формування і функціонування бульбочок на коренях люцерни Варіант Насіння + вода Насіння + Л. Насіння + (S.m. + Л.) Насіння + S.m. Фаза розвитку рослин стеблування-прихована бутонізація шт. / % АФА** 180/100 0,42±0,07 450/100 0,74±0,09 390/100 0,60±0,07 360/100 0,49±0,05 стеблування шт. / %* 13/57 28/82 35/100 32/100 Примітка: * у чисельнику - кількість бульбочок на 10 рослинах, штуки; у знаменнику - відсоток модульованих рослин, %; ** АФА - азотофіксувальна активність бульбочок, мкмольС2Н4/(рослину • год.)) 20 25 30 35 У результаті дослідження азотофіксувальної активності симбіотичних систем у фазі стеблування виявлено незначну ацетиленвідновлювальну активність лише у окремих рослинах у варіанті із обробкою лектином насіння люцерни. Якщо врахувати, що у ґрунті дослідної ділянки існують активні природні ризобії, то в даному випадку можна провести аналогію із попередніми даними вегетаційного досліду, за результатами якого до фази бутонізації обробка насіння лектином є більш ефективною для підвищення азотфіксації, ніж інкубація ризобій з лектином. У період стеблування - прихованої бутонізації (табл. 2.1) найвищу азотофіксувальну активність проявили симбіотичні системи варіантів, де використовували лектин, особливо за обробки ним насіння. Симбіотичні системи контрольного варіанта (насіння+вода), а також інокульовані S. meliloti 441, відзначались майже однаковою (різниця в межах похибки) азотофіксувальною активністю. Надземна маса рослин люцерни у фазу стеблування була однаковою у всіх варіантах (табл. 2.2), тоді як у період стеблування - прихованої бутонізації виявлено позитивний вплив ризобій, інкубованих із лектином, на даний показник. У період цвітіння - початку плодоношення рослини цього варіанта залишались найвищими за масою, при цьому лише дещо відставали від них інокульовані рослини варіантів, у яких не застосовували лектин. Слід зазначити, що позитивний вплив обробки лектином інокуляційної суспензії проявився і на другий рік вегетації. При цьому надземна маса рослин I-го і II-го укосів у варіантах, де у попередній рік використовували інокулянт, оброблений лектином, була більшою на 21 % у порівнянні з варіантом зі звичайною інокуляцією. Рослини люцерни цього варіанта характеризувались також більш раннім настанням фази цвітіння. 40 4 UA 102177 U Таблиця 2.2 Вплив лектину насіння сої на наростання надземної маси (г сухої речовини/рослину) люцерни Варіант Насіння + вода Насіння + Л Насіння + (S.m. + Л) Насіння + S.m. 5 10 15 20 25 Фаза розвитку рослин стеблування - початок бутонізації 0,17±0,01 0,27±0,03 0,43±0,07 0,31±0,04 стеблування 0,13±0,01 0,14±0,01 0,15±0,01 0,15±0,02 цвітіння - початок плодоношення 10,47±0,26 10,73±0,11 12,90±0,77 11,97±0,53 Таким чином, у польових умовах підтверджено відзначений в умовах вегетаційного експерименту позитивний вплив лектину насіння сої на формування симбіотичної системи люцерна - S. meliloti. При цьому виявлено стимулюючий ефект інокуляції насіння люцерни інкубованими з лектином ризобіями на наростання надземної маси у перший та другий роки вегетації рослин. Приклад 3. Досліди проводили на базі Інституту фізіології рослин і генетики НАН України з використанням сої (Glycine max L. Merr.) сорту Васильківська. Передпосівну інокуляцію насіння здійснювали штамом Bradyrhizobium japonicum 634б. Рослини вирощували на відкритому вегетаційному майданчику в піщаній культурі на поживному середовищі Гельрігеля з 0,25 норми азоту [Ca(NO3)2] із застосуванням контрольованого поливу. Вологість субстрату підтримували на рівні 60 % повної вологоємкості (ПВ). У фазі трьох справжніх листків створювали модельну посуху (30 % ПВ), застосовуючи контрольований полив рослин, яку підтримували упродовж двох тижнів, після чого полив у всіх варіантах відновлювали до оптимального рівня (60 % ПВ). Схема досліду включала контрольні варіанти, у яких не використовували лектин [Насіння + B.j.], варіанти, у яких лектин застосовували для обробки насіння [(Насіння + Л) + B.j.] або ж для інкубування з ризобіальною суспензією [Насіння + (B.j. + Л)]. Відзначено (табл. 3.1), що обробка насіння лектином, а також інокуляція насіння ризобіями, інкубованими з лектином, стимулювали утворення бульбочок на коренях сої за недостатності водозабезпечення і сприяли збільшенню даного показника у порівнянні з контролем на 17-78 і 37-81 % відповідно, залежно від фази розвитку рослин. За оптимального водозабезпечення такий ефект спостерігали лише у випадку використання лектину для модифікації ризобій, при цьому приріст відносно контролю без лектину становив 9 - 19 %. При обробці лектином насіння за оптимального водозабезпечення кількість бульбочок на коренях рослин дещо знижувалася, проте відбувалося наростання їх маси (табл. 3.2). Таблиця 3.1 Вплив лектину на утворення бульбочок (штук/рослину) на коренях сої на фоні інокуляції та різного водозабезпечення Фаза розвитку рослин Варіант три справжніх листки Насіння + B.j., к-1* (Насіння + Л) + B.j. Насіння + (B.j. + Л) 33,40±4,77 30,88±2,70 38,40±1,80 Насіння + B.j., к-2** (Насіння + Л) + B.j. Насіння + (B.j. + Л) 28,25±1,89 42,44±2,62 38,80±6,97 бутонізація 60 % ПВ 33,67±0,88 23,48±3,98 39,33±2,94 30 %ПВ 24,80±3,40 44,16±5,01 45,00±3,15 цвітіння формування бобів 41,80±4,28 30,04±2,85 45,75±3,12 55,96±2,83 32,72±2,11 66,68±4,92 26,75±1,50 46,60±3,50 38,80±4,93 39,20±3,84 45,92±4,06 35,60±2,48 Примітка. Тут, на фіг. 2 і в табл. 3.2-3.3: * к-1 - контроль-1, ** к-2 - контроль-2 5 UA 102177 U 5 Відзначено також (фіг. 2) збільшення азотофіксувальної активності бульбочок за оптимального водозабезпечення упродовж періоду трьох справжніх листків - цвітіння при обох способах використання лектину, а за нестачі вологи - у цей же період на фоні обробки лектином насіння. Аналіз 3-річних результатів досліджень насіннєвої продуктивності сої показав позитивний вплив використання лектину на даний показник як за оптимального, так і недостатнього водозабезпечення. Зокрема було відзначено, що приріст урожаю насіння на фоні використання лектину може сягати 20 %, залежно від року досліджень та способу використання білка. Таблиця 3.2 Наростання маси бульбочок (г сухої речовини/рослину) на коренях сої за дії лектину на фоні інокуляції та різного водозабезпечення Фаза розвитку рослин Варіант три справжніх листки Насіння + B.j., к-1 (Насіння + Л) + B.j. Насіння + (B.j. + Л) 0,021±0,001 0,035±0,002 0,026±0,005 Насіння + B.j., к-2 (Насіння + Л) + B.j. Насіння + (B.j. + Л) 0,018±0,004 0,027±0,005 0,016±0,003 цвітіння формування бобів 0,099±0,012 0,115±0,016 0,112±0,009 0,251±0,036 0,236±0,051 0,238±0,042 0,054±0,010 0,068±0,003 0,041±0,008 0,131±0,020 0,168±0,023 0,139±0,024 бутонізація 60 % ПВ 0,047±0,007 0,068±0,007 0,071±0,010 30 % ПВ 0,032±0,006 0,022±0,004 0,024±0,001 10 Таблиця 3.3 Вплив лектину на урожай насіння сої на фоні інокуляції та різного водозабезпечення І рік Варіант г/рослину Насіння + B.j., к-1 (Насіння + Л) + B.j. Насіння + (B.j. + Л) Насіння + B.j., к-2 (Насіння + Л) + B.j. Насіння + (B.j. + Л) 15 20 4,78±0,23 5,31±0,26 5,47±0,28 4,17±0,21 4,96±0,16 4,21±0,12 II рік ± до ± до відповідного г/рослину відповідного контролю, % контролю, % 60 % ПВ 7,07±0,16 +11 7,43±0,21 +5 +14 7,28±0,25 +3 30 % ПВ 6,79±0,26 +19 7,05±0,23 +4 +1 7,37±0,17 +9 III рік ± до г/рослину відповідного контролю, % 4,80±0,09 4,83±0,24 5,14±0,16 0 +7 4,04±0,16 4,20±0,08 4,85±0,15 +3 +20 Таким чином, запропонована модель застосування пектину сої для передпосівної обробки насіння сої і люцерни з наступною інокуляцією ризобіями, або ж як компонента бактеріальної суспензії для інокуляції насіння цих культур, забезпечує формування симбіотичних систем, функціональна активність яких є ефективною як за оптимального, так і недостатнього водозабезпечення, що гарантує підвищення продуктивності рослин люцерни й сої при вирощуванні за нормального зволоження ґрунту та за посушливих умов. При цьому регуляція фізіологічних процесів відбувається за рахунок дії природної речовини - лектину насіння - що володіє біологічною активністю і відіграє важливу роль при становленні взаємовідносин між рослиною та мікроорганізмами, а у подальшому визначає особливості функціонування рослин у симбіозі з бульбочковими бактеріями. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 25 Застосування лектину насіння сої для регуляції формування і функціонування бобоворизобіального симбіозу люцерни та сої за дії посухи. 6 UA 102177 U Комп’ютерна верстка О. Гергіль Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 7