Спосіб визначення ступеня гіпертрофії міокарда у хворих з гіпертонічною хворобою 2-го ступеня

Винахід відноситься до галузі медицини, а саме до галузі кардіології та імунології. Відомий "Спосіб виявлення та/або кількісного визначення та/або відділення апоптичних клітин у зразку або частині зразка" (патент на винахід WO9527903 А1, від 19.10.95, Изобретения стран мира (1996). - Выпуск 084, №17. - С.48) передбачає контакт досліджуваного зразка клітин або тканини з реагентом - поліпептидом або білком з класу анексинів, який має спорідненість до фосфатиділсеріну плазматичної мембрани апоптичних клітин. Виявлення та/або кількісна оцінка апоптичних клітин прямим способом здійснюється детекцією мітки, яка зв'язана з анексином. Такими мітками можуть бути радіоактивні маркери, флуоресцентні, ензимні, протеїнові, окремі барвники, імуноглобуліни. Для виявлення наявності або відсутності мітки використовують, наприклад, проточну цитометрію, цитометрію зображення або аналіз зображення. При непрямому способі детекції зразок контактує з неміченим реагентом з високою спорідненістю до фосфатиділсеріну та кількість зв'язаного агента визначають за допомогою специфічних до реагенту антитіл. В цьому випадку може бути використана будь-яка техніка імуноаналіза. Запропоновано визначати якісно та кількісно апоптичні клітини після інкубації проби з субстанціями, що можуть індукувати або гальмувати апоптоз. Спосіб дає можливість проводити діагностику, вивчати е фекти лікування або вивчати вплив реагентів, які посилюють або послаблюють апоптоз. Недоліком використання абсолютних величин апоптозу для діагностики є залежність величини апоптозу від часу, що пройшов від моменту забору клітин до початку дослідження та лабільність цих величин - залежність від функціонального стану організму. Також величини спонтанного, індукованого апоптозу та індукція апоптозу характеризують кожна окрему ланку патогенезу. Задачею заявляємого способу є об'єктивізація методу дослідження для усунення впливу факторів зовнішнього та внутрішнього середовища. Задача досягається тим, що визначають індекс індукції апоптозу, а саме відношення апоптичних індексів спонтанного та індукованого апоптозу. Заявлений спосіб виконують наступним чином. З гепаринізованої крові виділяють мононуклеарні клітини за допомогою центрифугування з прискоренням 400g протягом 25-35 хвилин у градієнті щільності фікол-верографіну (r = 1,077 - 1,078) , знімають кільце мононуклеарів. Отримані клітини піпетують та двічі центрифугують по 8-12 хвилин з прискоренням 200g у розчині нейтрального буфера, наприклад phosphate buffer solution з рН7,2. З відмитих клітин в концентрації 5-6х106 клітин/мл готують подвійні культури, які поміщають у живильне середовище, що містить 10% ембріональної телячої сироватки, у співвідношенні 1:1. До однієї з подвійних культур додають розчин дексаметазону в кінцевій концентрації 10-5-10-7М. Культури клітин інкубують протягом 1224 годин при температурі 37°С. Після інкубації клітини піпетують у розчині нейтрального буфера, наприклад phosphate buffer solution з рН7,2, центрифугують 3-7 хвилин з прискоренням 400g. Підраховують відсоткове співвідношення живих та мертвих клітин за допомогою стандартного тесту з трипановим синім. Відмиті клітини інкубують 25-35 хвилин при температурі 37°С з розчином барвника Hoechst 33342 в концентрації 0,05-0,15мкг/мл у співвідношенні суспензія клітин/розчин барвника - 1:1-2:1, потім центрифугують з додаванням розчину нейтрального буферу, наприклад phosphate buffer solution з рН7,2, протягом 3-7 хвилин з прискоренням 400g. Клітини фіксують фіксуючою сумішшю, поміщають на предметне скельце, покривають покривним скельцем та запаюють. Препарати переглядають при освітленні люмінесцентною лампою при збільшенні 7х90. Визначають апоптичний індекс як відсоткове співвідношення кількості клітин з ознаками апоптозу та 2000 клітин, виявлених у полях зору мікроскопу. Апоптичний індекс визначають як в клітинах, які інкубувались тільки у живильному середовищі - індекс спонтанного апоптозу, так і в клітинах, які інкубувались в живильному середовищі в присутності дексаметазону - індекс індукованого апоптозу. Індекс індукції апоптозу визначався як співвідношення індексів спонтанного та індукованого апоптозу у даного хворого. У хворих з гіпертонічною хворобою 2-го ступеня без супутні х захворювань серця при індексі індукції апоптозу меншому 0,5064 діагностувалась гіпертрофія міокарда, виразність якої зростала при зменшенні величини індексу індукції апоптозу. При індексі індукції апоптозу від 0,5064 до 0,4375 діагностують незначну гіпертрофію міокарда, при індексі індукції апоптозу від 0,4374 до 0,3556 - діагностують помірну гіпертрофію, при індексі індукції апоптозу від 0,2860 до 0,3555 - виражену гіпертрофію. Приклад 1 Хворий Т-лі Г.Т., обстеження 17.04.02, діагноз - гіпертонічна хвороба 1 ступеня, цукровий діабет 2-го типу, дисциркуляторна енцефалопатія. Індекс маси міокарда, визначений методом радіоізотопної вентрикулографії, становив 92,3г/м 2 - гіпертрофія міокарда відсутня. Величина індексу індукції апоптозу - 0,6800. Приклад 2 Хворий К-р B.C., обстеження 16.04.02, діагноз - гіпертонічна хвороба 2-го ступеня. Індекс маси міокарда, визначений методом радіоізотопної вентрикулографії становив 144г/м 2 - незначна гіпертрофія міокарда. Величина індексу індукції апоптозу - 0,4375. Приклад 3 Хворий Р-к А.Б., обстеження 18.04.02, діагноз - гіпертонічна хвороба 2-го ступеня. Індекс маси міокарда, визначений методом радіоізотопної вентрикулографії становив 289г/м 2 - виражена гіпертрофія міокарда. Величина індексу індукції апоптозу - 0,2909. Таким чином, використання заявляємого методу в ЦНДЛ КМАПО ім. П.Л. Шупика дозволило діагностува ти різні ступені гіпертрофії міокарда у хворих з гіпертонічною хворобою 2-го ступеня. Крім того, заявляємий метод дозволив об'єктивізувати оцінку результатів дослідження апоптичного індексу за рахунок культивування клітин та використання для діагностики індексу індукції апоптозу.