Композиція, що містить антитіла до амілоїду бета 4, які мають глікозиловану варіабельну ділянку

Реферат: Винахід належить до композиції, яка містить молекулу антитіла, здатну специфічно розпізнавати β-A4 пептид/Aβ4, де молекула антитіла представляє собою моноглікозиловану молекулу антитіла або подвійноглікозиловану молекулу антитілу або де вказана композиція містить суміш вказаної моноглікозилованої молекули антитіла та вказаної UA 99097 C2 (12) UA 99097 C2 подвійноглікозилованої молекули антитіла, де принаймні один антигензв'язувальний центр містить глікозилований залишок аспарагіну (Asn) у варіабельній ділянці важкого ланцюга (VH). Також описано спосіб одержання молекули антитіла, яка міститься в заявленій композиції, в тому числі шляхом очищення рекомбінантної молекули антитіла на протеїн A-колонці; на іонообмінній колонці; і на колонці для гель-фільтрації. Винахід розкриває застосування заявленої композиції для приготування лікарського засобу для попередження та/або лікування захворювання, асоційованого з амілоїдогенезом та/або утворенням амілоїдних бляшок; застосування для приготування діагностичного набору для діагностики зазначеного захворювання. UA 99097 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Даний винахід стосується препарату, що містить очищену молекулу антитіла, яка відрізняється тим, що принаймні один антигензв'язувальний центр містить глікозилований залишок аспарагіну (Asn) у варіабельній ділянці важкого ланцюга (VH). Більш конкретно, у винаході запропонована очищена молекула антитіла, яка має здатність специфічно розпізнавати -A4-пептид/A4 і яка глікозилована у варіабельній ділянці важкого ланцюга (V H). Даний винахід стосується суміші антитіл, що мають один або два глікозиловані антигензв'язувальні центри, які містять глікозилований залишок аспарагіну (Asn) у варіабельній ділянці важкого ланцюга (VH), тобто сумішей ізоформ антитіл, які містять глікозилований залишок аспарагіну (Asn) у варіабельній ділянці важкого ланцюга (VH). Винахід також стосується композицій або препаратів антитіл, які містять специфічно глікозиловані ізоформи антитіла. Крім того, запропоновані фармацевтичні й діагностичні застосування таких антитіл. Ізоформи антитіла можна застосовувати, наприклад, при фармацевтичному втручанні в амілоїдогенез або процес утворення амілоїдних бляшок та/або при встановленні його діагнозу. Приблизно 70 % всіх випадків деменції обумовлені хворобою Альцгеймера, яка асоційована з вибірковим ураженням ділянок головного мозку й нервових ланцюгів, що мають вирішальне значення для когнітивної здатності. Хвороба Альцгеймера характеризується наявністю нейрофібрилярних сплетень, насамперед, у пірамідальних нейронах гіпокампу, і численних амілоїдних бляшок, що складаються в основному із щільного ядра амілоїдних відкладень і незлитих оболонок. Позаклітинні невритні бляшки містять велику кількість в основному фібрилярного пептиду, який позначається як "амілоїд β», "A-бета", "Aβ4", «β-A4" або "Aβ» (див. Selkoe, Ann. Rev. Cell Biol. 10, 1004, стор. 373-403, Koo, PNAS т. 96, 1999, стор. 9989-9990, US 4666829 або Glenner, BBRC 12, 1984, стор. 1131). Цей амілоїд β утворюється з "білка-попередника хвороби Альцгеймера/білка-попередника β-амілоїду" (APP). APP - загальна назва зв'язаних з мембраною глікопротеїнів (див. Sisodia, PNAS, т. 89, 1992, стор. 6075), і вони чутливі до ендопротеолітичного розщеплення в Aβ-послідовності протеазою плазматичної мембрани, αсекретазою (див. Sisodia (1992), там же). Крім того, інші види секретазної активності, зокрема, βсекретазна й -секретазна активність, приводять до позаклітинного вивільнення β-амілоїду (Aβ), що містить 39 амінокислот (Aβ39), 40 амінокислот (Aβ40), 42 амінокислоти (Aβ42), або 43 амінокислоти (Aβ43) (див. Sinha, PNAS 96, 1999, стор. 11094-1053; Price, Science 282, 1998, стор. 1078-1083; WO 00/72880 або Hardy, TINS 20, 1997, стор. 154). Слід зазначити, що Aβ існує у вигляді декількох форм, які зустрічаються в природних умовах, форми, які зустрічаються в організмі людини позначають як вказано вище, тобто Aβ39, Aβ40, Aβ41, Aβ42 і Aβ43. Найбільш відома форма Aβ42 має наступну амінокислотну послідовність (починаючи з N-кінця): DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA (SEQ ID NO: 3). В Aβ41, Aβ40, Aβ39 відсутні C-кінцеві амінокислоти A, IA і VIA відповідно. В Aβ43-формі на С-кінці присутній додатковий залишок треоніну в порівнянні із С-кінцем описаної вище послідовності (SEQ ID NO: 3). Встановлено, що час, необхідний для утворення ядра A40-фібрил, істотно перевищує час, необхідний для утворення ядра A42-фібрил (див. Koo, loc. cit. і Harper, Ann. Rev. Biochem. 66, 1997, стор. 385-407). В огляді Wagner, J. Clin. Invest. 104, 1999, стор. 1239-1332 вказано, що A42-форма частіше за інші зв'язана з невритними бляшками, і вона вважається найбільш фібрилогенною in vitro. Існує також думка про те, що Aβ42 служить як "затравка" для залежної від нуклеації полімеризації впорядкованих некристалічних Aβ-пептидів (Jarrett, Cell 93, 1993, стор. 1055-1058). Відомо, що процесинг модифікованого APP та/або утворення позаклітинних бляшок, які містять відкладення, що нагадують білок, відбувається не лише при патології, зв'язаній із хворобою Альцгеймера, але виявлений також у пацієнтів, які страждають від інших неврологічних та/або нейродегенеративних порушень. Ці порушення включають серед інших синдром Дауна, спадковий внутрішньомозковий крововилив, що супроводжується амілоїдозом Дутча-типу, хвороба Паркінсона, ALS (аміотрофічний боковий склероз), хвороба КрейтцфельдаЯкоба, зв'язану з ВІЛ деменцію й рухову невропатію. Зараз відома лише невелика кількість схем медичного втручання, придатних для зв'язаних з амілоїдами захворювань. Наприклад, описано, що інгібітори холінестерази, такі як галантамін, ривастигмін або донепезил, виявляють сприятливу дію на пацієнтів тільки зі слабким або помірним ступенем хвороби Альцгеймера. Однак опубліковані також дані про побічні дії, обумовлені холінергічною активністю цих лікарських засобів. Хоча таке лікування, яке посилює холінергічну дію, виявляє певний сприятливий симптоматичний вплив, для більшості пацієнтів, які піддаються лікуванню, терапевтична відповідь є незадовільною. Оцінки показують, що істотне поліпшення когнітивної здатності відбувається лише в приблизно 5 % пацієнтів, які 1 UA 99097 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 піддавалися лікуванню, і практично відсутні дані про те, що лікування істотно змінює перебіг цього прогресуючого захворювання. Отже, зберігається виражена клінічна необхідність у розробці більш ефективних методів лікування й, насамперед, таких, які дозволяють припиняти або сповільнювати прогресування захворювання. Останнім часом застосовували також антагоністи NMDA- (N-метил-D-аспартат)-рецептора, такі як мемантин. Однак, опубліковані дані про побічні дії, обумовлені його фармакологічною активністю. Крім того, таке лікування із застосуванням вказаних антагоністів NMDA-рецептора може розглядатися тільки як симптоматичний підхід, і не приводить до зміни захворювання. Для лікування зв'язаних з амілоїдами порушень були запропоновані також підходи на основі імуномодуляції. В WO 99/27944 описані кон'югати, які містять фрагменти Aβ-пептиду й молекули-носії, причому молекула-носій повинна підвищувати імунну відповідь. В WO 00/72880 описаний інший підхід, заснований на активній імунізації, у якому для індукції імунної відповіді також використовують Aβ-фрагменти. В WO 99/27944 або WO 01/62801 описані також підходи, засновані на пасивній імунізації з використанням загальних антитіл до Aβ, а специфічні гуманізовані антитіла до Aβ-фрагментів описані в WO 02/46237, WO 02/088306 і WO 02/088307. В WO 00/77178 описані антитіла, що зв'язуються з перехідним станом, який набуває β-амілоїд у процесі гідролізу. В WO 03/070760 описані молекули антитіл, які розпізнають дві відділені одна від одної амінокислотні послідовності Aβ-пептиду. В WO 03/016466 описане гуманізоване антитіло до Aβ, яке модифікують для того, щоб уникнути якого-небудь можливого глікозилування його важкого ланцюга, оскільки глікозилування варіабельної(их) ділянки(ок) було постульовано в Wallick, J. Exp. Med. 168, 1988, стор. 10991109. В основу даного винаходу була покладена задача розробити ефективні засоби й способи медичного впливу на обумовлені амілоїдами порушення, насамперед, засоби й способи, призначені для зменшення амілоїдних бляшок, що заподіюють шкоду, у пацієнтів, які потребують (відповідного) медичного втручання. Першим об'єктом даного винаходу є очищена молекула антитіла, яка відрізняється тим, що принаймні один антигензв'язувальний центр у варіабельній ділянці важкого ланцюга (V H) містить глікозилований залишок аспарагіну (Asn). Очищене антитіло або композиція антитіл, запропоновані у винаході, спрямовані, насамперед, проти Aβ та/або Aβ-фрагмента. Представлену в даному описі очищену молекулу антитіла й насамперед композицію антитіл або препарат антитіл, запропоновані у винаході, можна застосовувати для одержання фармацевтичної або діагностичної композиції, призначеної для лікування, ослаблення або попередження захворювання, асоційованого з амілоїдозом та/або утворенням амілоїдних бляшок. Прикладом такого захворювання є хвороба Альцгеймера. При створенні даного винаходу несподівано було встановлено, що очищені молекули антитіл, у яких принаймні один антигензв'язувальний центр у варіабельній ділянці важкого ланцюга (VH) має N-зв'язане глікозилування, найбільш придатні, наприклад, для зменшення амілоїдних бляшок. Крім того, при створенні даного винаходу було встановлено, що запропоновані в даному винаході глікозиловані антитіла або композиції антитіл найбільш придатні й ефективні з погляду проникнення через гематоенцефалічний бар'єр/гематоенцефалічну границю in vivo, що проілюстровано на основі високоефективного зв'язування бляшок. Ці результати в значній мірі суперечать відомим з існуючого рівня техніки доктринам. В WO 03/016466 описані антитіла, спеціально сконструйовані таким чином, щоб у них був відсутній сайт N-глікозилування у важкому ланцюзі, і висловлена думка про те, що глікозилування в каркасній ділянці варіабельної ділянки впливає на афінність антитіла до зв'язування. З існуючого рівня техніки відомо, що описане антитіло до Aβ з деглікозилованою формою CDR2ділянки варіабельної ділянки важкого ланцюга має істотно більш високу афінність у відношенні синтетичного й очищеного Aβ-пептиду in vitro. Таким чином, даний винахід стосується поліпшеної очищеної молекули антитіла або препарату антитіла, насамперед, препарату молекули антитіла до Aβ4/Aβ-пептиду (амілоїд β), які мають високу ефективність in vivo. Поліпшення запропонованої в даному винаході молекули антитіла/препарату антитіла полягає в створенні очищених молекул антитіла, які Nглікозиловані принаймні в одній з їх варіабельних ділянок важкого ланцюга, наприклад, в CDR2ділянці вказаної варіабельної ділянки важкого ланцюга. Як відзначалося вище, це суперечить прототипам, таким як WO 03/016466, у якому стверджується, що слід уникати такого Nглікозилування в антитілах, наприклад, в антитілах до Aβ. 2 UA 99097 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Прикладами молекули антитіла, запропонованої в даному винаході, є молекули імуноглобуліну, наприклад, молекули IgG. IgG відрізняються тим, що вони містять два важкі й два легкі ланцюги (це проілюстровано, наприклад, на фіг. 14) і тим, що ці молекули містять два антигензв'язувальні центри. Вказані антигензв'язувальні центри містять "варіабельні ділянки", що складаються з ділянок важких ланцюгів (VH) і ділянок легких ланцюгів (VL). Антигензв'язувальні центри утворюються в результаті безпосереднього дотикання VH- і VLділянок. Загальну інформацію, що стосується молекул антитіл або молекул імуноглобуліну, можна знайти також у звичайних довідниках, таких як Abbas, Cellular and Molecular Immunology, вид-во W.B. Sounders Company, 2003. Одним з об'єктів винаходу є, наприклад, молекула імуноглобуліну, запропонована у винаході, що представляє собою антитіло, у якому один антигензв'язувальний центр містить глікозилований залишок аспарагіну (Asn) у відповідній варіабельній ділянці важкого ланцюга (VH). Вказане антитіло позначене нижче в даному описі як "моноглікозиловане АНТИТІЛО", див. також фіг. 14. Іншим об'єктом винаходу є молекула імуноглобуліну, у якій обидва антигензв'язувальні центри містять глікозилований залишок аспарагіну (Asn) у варіабельних ділянках відповідних важких ланцюгів (VH). Вказане антитіло позначене нижче в даному описі як "двічі глікозиловане АНТИТІЛО", див. також фіг. 14. Імуноглобулін, у якому жоден антигензв'язувальний центр не містить глікозилованого залишку аспарагіну (Asn) у варіабельній ділянці важкого ланцюга (V H), позначений нижче в даному описі як "неглікозиловане АНТИТІЛО". Моноглікозиловане АНТИТІЛО, двічі глікозиловане АНТИТІЛО й неглікозиловане АНТИТІЛО можуть мати ідентичні амінокислотні послідовності або різні амінокислотні послідовності. Таким чином, поняття "АНТИТІЛО" включає молекули антитіла, насамперед молекули антитіла, отримані методом рекомбінації, такі як імуноглобуліни. Однак, як вказано нижче, поняття "молекула(и) АНТИТІЛА" включає також відомі ізоформи й модифікації імуноглобулінів, такі як одноланцюгові антитіла або одноланцюгові Fv-фрагменти (scAB/scFv) або біспецифічні конструкції антитіл, де ізоформи й модифікації відрізняються тим, що містять принаймні одну глікозиловану VH-ділянку, як вказано в даному описі. Конкретним прикладом такої ізоформи або модифікації може служити sc (одноланцюгове) антитіло у форматі V H-VL або VL-VH, де VH глікозилована як вказано в даному описі. Можна розглядати також біспецифічні scFvs, наприклад, у форматі VH-VL-VH-VL, VL-VH-VH-VL, VH-VL-VL-VH, які глікозиловані як вказано в даному описі в CDR2-ділянці. У контексті даного опису поняття "АНТИТІЛО", виділене великими літерами, використовується для більшої ясності. Однак у контексті даного опису використовується також поняття "антитіло", написане прописними буквами. Поняття "АНТИТІЛО»/«АНТИТІЛА»/«антитіло" і "антитіла" використовуються взаємозамінно. Вищев даному описі моноглікозиловане АНТИТІЛО й двічі глікозиловане АНТИТІЛО позначені як "ізоформи глікозилованого АНТИТІЛА". Очищена молекула антитіла, яка характеризується тим, що принаймні один антигензв'язувальний центр містить глікозилований залишок аспарагіну (Asn) у варіабельній ділянці важкого ланцюга (V H), являє собою моноглікозиловане АНТИТІЛО, яке вільне від або в дуже малому ступені асоційоване з ізоформою, вибраною із двічі глікозилованого АНТИТІЛА й неглікозилованого АНТИТІЛА, тобто "очищене моноглікозиловане АНТИТІЛО". Двічі глікозиловане АНТИТІЛО в контексті даного винаходу являє собою антитіло, вільне від або в дуже малому ступені асоційоване з ізоформою, вибраною з моноглікозилованого АНТИТІЛА й неглікозилованого АНТИТІЛА, тобто "очищене двічі глікозиловане АНТИТІЛО". Поняття "яке вільне від або в дуже малому ступені асоційоване з" позначає повну відсутність відповідних інших (глікозилованих) ізоформ або присутність іншої (глікозилованої) ізоформи в концентрації, що становить максимум 10 %, наприклад, максимум 5 %, наприклад, максимум 4 %, наприклад, максимум 3 %, наприклад, максимум 2 %, наприклад, максимум 1 %, наприклад, максимум 0,5 %, наприклад, максимум 0,3 %, наприклад, максимум 0,2 %. Додаткового інформація, яка стосується даного предмету, представлена нижче й у доданих прикладах. У контексті даного винаходу поняття "моноглікозиловане(і) антитіло(а)» або "моноглікозиловане(і) АНТИТІЛО(А)» стосується молекул антитіл, які N-глікозиловані в одній (VH)-ділянці індивідуальної молекули антитіла, наприклад, імуноглобуліну, наприклад, IgG, наприклад, IgG1. Наприклад, вказана "моноглікозилована форма" є глікозилованою в одній варіабельній ділянці важкого ланцюга, наприклад, у положенні залишку аспарагіну "Asn 52", як вказано нижче. Така "моноглікозилована IgG1-форма або моноглікозилована ізоформа" може 3 UA 99097 C2 5 10 15 20 25 30 35 бути, як проілюстровано в даному описі, глікозилованою також і у висококонсервативному сайті глікозилування в Fc-фрагменті, наприклад, на залишку аспарагіну Asn 306 у неваріабельному Fc-фрагменті. Поняття «двічі глікозиловане(і) антитіло(а) або «двічі глікозиловане(і) АНТИТІЛО(А)» у контексті даного винаходу глікозиловані як вказано в даному описі в обох варіабельних ділянках (VH)-ділянки важкого ланцюга. У цьому випадку така "двічі глікозилована форма" глікозилована у варіабельній ділянці обох важких ланцюгів, насамперед у положенні залишку аспарагіну Asn 52, як докладно описано нижче й проілюстровано в доданих прикладах. Така "двічі глікозилована IgG1-форма або двічі глікозилована ізоформа" може бути, як проілюстровано в даному описі, глікозилованою також і у висококонсервативному сайті глікозилування в неваріабельному/константному Fc-фрагменті, насамперед у положенні 306 розглянутого імуноглобуліну. На доданій фіг. 14 проілюстровані відповідні молекули антитіл. Антитіла, які не мають такої посттрансляційної модифікації у варіабельній ділянці, наприклад, в обох варіабельних ділянках важкого ланцюга (в обох (V H)-ділянках), у контексті даного винаходу розглядаються як такі, що знаходяться в "неглікозилованій формі", тобто не глікозиловані у варіабельній ділянці важкого ланцюга. Однак така "неглікозилована форма", проте, може бути глікозилована, наприклад, у константній ділянці (C-ділянка) антитіла, і, як правило, у висококонсервативному сайті глікозилування Fc-фрагмента, насамперед на залишку аспарагіну (Asn) 306 у неваріабельному/константному Fc-фрагменті, як вказано в даному описі; див. також SEQ ID NO: 6. Глікозилований залишок аспарагіну (Asn) у варіабельній ділянці важкого ланцюга (V H) може бути присутній також у гіперваріабельній ділянці 2 (CDR2-ділянка). Вказаний глікозилований залишок аспарагіну (Asn) у варіабельній ділянці важкого ланцюга (V H) може бути присутній у положенні 52 варіабельної ділянки, як вказано нижче й проілюстровано в SEQ ID NО. 2 (або в положенні 52 SEQ ID NO: 6, що містить також Fc-фрагмент важкого ланцюга антитіла, як вказано в даному описі). Ізоформи АНТИТІЛА можуть бути також додатково глікозиловані в константній/неваріабельній ділянці молекул антитіла, наприклад, в Fc-фрагменті IgG, наприклад, в Fc-фрагменті IgG1. Таке глікозилування в Fc-фрагменті може мати місце у висококонсервативному сайті глікозилування, що характеризується тим, що він знаходиться в положенні Asn306 важкого ланцюга, наприклад, що має наступну послідовність: Ця послідовність представлена також нижче, де вказані CDR, CH-ділянки, ділянки важкого ланцюга, а також два сайти N-глікозилування (N52 і N306): 4 UA 99097 C2 У вказаній послідовності: 5 10 15 виділена жирним шрифтом буква N: N-зв'язані сайти глікозилування. Fc-ділянка антитіл у вигляді IgG, запропонованих у даному винаході, може являти собою гомодимер, що містить шарнірні ділянки, зв'язані усередині ланцюга дисульфідними містками, глікозиловані CH2-ділянки, що несуть N-зв'язаний олігосахарид на залишку аспарагіну в положенні 306 (Asn-306) CH2, і нековалентно зв'язані CH3-ділянки. Олігосахарид, що обумовлює глікозилування на Asn-306, являє собою олігосахарид комплексного біантенного типу, і він може мати структуру у вигляді гептасахаридного ядра з різними додатковими зовнішніми плечима цукрів. Олігосахарид впливає або визначає структуру й функцію Fc (Jefferis, Immunol Rev. 163, 1998, стор. 50-76). Опубліковано дані про ефекторні функції, властиві конкретним специфічним взаємодіям IgG-Fc/ефектор-ліганд (Jefferis, Immunol Lett. 82(1-2), 2002, стор. 57-65 і Krapp, J Mol Biol. 325(5), 2003, стор. 979-89). Вказане консервативне положення Asn-306 в Fc відповідає "Asn-297" у системі Кебота (Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-е вид., видво Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda MD, 1991). Наведений як приклад важкий ланцюг може кодуватися наступною послідовністю: 20 5 UA 99097 C2 5 10 Вказаний важкий ланцюг може містити також (насамперед, у процесі її одержання методом рекомбінації) додаткові послідовності типу "лідерних послідовностей". Відповідним прикладом кодувальної послідовності є: (SEQ ID NO: 25), відповідна амінокислотна послідовність може являти собою: (після якої знаходиться) 6 UA 99097 C2 5 Вказана вище послідовність містить також "сигнальний пептид", де вказаний сигнальний пептид піддається протеолітичному розщепленню сигнальною пептидазою хазяїна в шляху секреції в процесі одержання молекул антитіл, запропонованих у винаході, у клітинах-хазяїнах, таких як CHO-клітини. В альтернативному варіанті важкий ланцюг може кодуватися нуклеотидною послідовністю, оптимізованою для рекомбінантного одержання, прикладом якої є наступна послідовність: 10 після якої розташована 15 7 UA 99097 C2 5 8 UA 99097 C2 5 10 «Альтернативна" білкова послідовність, представлена вище в SEQ ID NO: 23, містить ту ж саму кодувальну послідовність, що й у першому варіанті, однак вона має невеликі відмінності в структурі геному, такі як додаткові інтрони, і має невеликі відмінності в "лідерній послідовності"/"сигнальній послідовності". Вказана "лідерна послідовність" може містити також, як вказано вище, (додатковий(і) інтрон(і). Фахівець у даній галузі за допомогою загальноприйнятих методів може виявити в представленій вище послідовності відповідну екзонну/інтронну структуру. Наведене як приклад антитіло, запропоноване у винаході, може містити також легкий ланцюг, де легкий ланцюг може містити або мати наступну амінокислотну послідовність 9 UA 99097 C2 яка може кодуватися наступною нуклеотидною послідовністю: 5 10 «Легкий ланцюг" наведеного як приклад антитіла, запропонованого у винаході, також може містити "лідерну послідовність", яка є особливо переважною для процесу одержання. Відповідна послідовність може являти собою наступну послідовність (або вона може входити, наприклад, до складу векторної системи): (після якої розташована) (SEQ ID NO: Вказана послідовність кодує наступну амінокислотну послідовність 15 20 (після якої розташована) В альтернативному варіанті вказаний легкий ланцюг може також кодуватися нуклеотидною послідовністю, оптимізованою для рекомбінантного одержання, прикладом якої є наступна послідовність: 10 UA 99097 C2 після якої розташована 5 11 UA 99097 C2 5 12 UA 99097 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Вказана вище "послідовність" наведеної як приклад легкого ланцюга також має невеликі відмінності в структурі геному. Така "альтернативна послідовність" містить інші та/або додаткові інтрони. Таким чином, всі визначення, вказані для "важкого ланцюга", застосовні й у цьому випадку з відповідними змінами (mutatis mutandis). У контексті даного опису поняття "молекула антитіла" стосується повних молекул імуноглобуліну, наприклад IgM, IgD, IgE, IgA або IgG, таких як IgG1, IgG2, IgG2b, IgG3 або IgG4, а також фрагментів таких молекул імуноглобуліну, таких як Fab-фрагменти, Fab'-фрагменти, F(ab)2-фрагменти, химерні F(ab)2-фрагменти або химерні Fab'-фрагменти, химерні Fabфрагменти або виділені VH-ділянки або CDR-ділянки (вказані VH-ділянки або CDR-ділянки можуть бути, наприклад, інтегровані або вбудовані у відповідну(і) "каркасну(і) ділянка(ки)). Поняття "молекула антитіла" включає також подвійні антитіла й молекули, які містять Fcфрагмент антитіла як носій, приєднаний принаймні до одного антигензв'язувального фрагмента/пептиду, наприклад, пептидні антитіла, описані в WO 00/24782. Відповідно до цього і в контексті даного опису поняття "варіабельна ділянка важкого ланцюга (V H)" стосується не лише варіабельної ділянки повного імуноглобуліну, але також стосується відповідних фрагментів вказаної варіабельної ділянки важкого ланцюга (V H), таких як CDR, або індивідуально, або в комбінації з CDR1, 2 та/або 3, або відповідною "каркасною ділянкою" варіабельної ділянки. Таким чином, молекула антитіла, запропонованого в даному винаході, може являти собою також конструкцію антитіла, що містить антигензв'язувальний центр, декілька CDR або принаймні одну CDR розглянутої варіабельної ділянки глікозилованого важкого ланцюга (VH). Відповідний фрагмент вказаної варіабельної ділянки важкого ланцюга (VH) конструкції антитіла, запропонованого у винаході, глікозилований як вказано в даному описі, наприклад, містить глікозилований залишок аспарагіну (Asn) в антигензв'язувальному центрі. Прикладом такого "виділеного фрагмента" варіабельної ділянки важкого ланцюга (V H) є наведена як приклад CDR2-ділянка, послідовність якого наведена в SEQ ID NO: 12 (або кодується нуклеотидною послідовністю, представленою в SEQ ID NO: 11). Крім того, поняття "молекула антитіла" стосується модифікованих та/або змінених молекул антитіла, таким як химерні, гуманізовані або повністю гуманізовані антитіла. Вказані молекули "повністю гуманізованих антитіл" охарактеризовані й описані також як "повністю людські" антитіла. Всі такі антитіла можна створювати відомими в даній галузі методами. Наприклад, рекомбінантні молекули антитіл можна створювати за допомогою технології презентації фагу з використанням дозрівання in vitro, що передбачає застосування каркасної ділянки повного людського імуноглобуліну  підкласу 1 (IgG1), як описано в Knappik, J Mol Biol. 296(1), 2000, стор. 57-86 і в Rauchenberger, J Biol Chem. 278(40), 2003, стор. 3819438205. Як вказано в доданих прикладах, поняття антитіло стосується, наприклад, молекули IgG, наприклад, IgG1. Поняття також стосується модифікованих або змінених моноклональних або поліклональних антитіл, а також антитіл, створених/синтезованих методом рекомбінації або методом синтезу. Поняття також стосується інтактних антитіл, а також фрагментів/частин антитіла, таких як отримані з легкого й важкого ланцюгів, Fab-, Fab/c-, Fv-, Fab’-, F(ab")2фрагменти. Поняття "молекула антитіла" включає також похідні антитіла, біфункціональні антитіла й конструкції антитіл типу одноланцюгових Fv (scFv) або злиттів антитіл-білок. Поняття включає також каталітичні та/або протеолітичні антитіла, які містять глікозиловану V H-ділянку, наприклад, глікозиловану VH-CDR, як вказано вище. Поняття "молекула антитіла" також стосується молекул антитіла/конструкцій антитіла, отриманих методом рекомбінації, які можуть містити крім однієї специфічності (наприклад, до Aβ/Aβ-пептиду), іншу або додаткову специфічність. Такі конструкції можуть містити (але не обмежуючись ними) "біспецифічні" або "триспецифічні" конструкції. Більш докладне поняття "молекула антитіла", запропонованого у винаході, описано нижче. Як вказане вище, поняття включає також одноланцюгове антитіло, хімерне антитіло, антитіло із трансплантованою CDR-ділянкою, конструкцію бівалентного антитіла, антитіло, злите з білком, отримане шляхом перехресного клонування антитіло або синтетичне антитіло, яке, як вказано в даному описі, глікозиловане принаймні в одному антигензв'язувальному центрі важкого ланцюга, наприклад, глікозиловане принаймні в одній варіабельній ділянці важкого ланцюга, як вказано вище. Коли одержують, наприклад, одноланцюгові антитіла, то вказана в даному описі "варіабельна ділянка важкого ланцюга" не обмежена важким ланцюгом самим по собі, але мається на увазі, що вона також стосується відповідних фрагментів, отриманих з важкого ланцюга повного антитіла, наприклад, повного імуноглобуліну, такого як IgG. Такі фрагменти можуть являти собою відповідні CDR або індивідуально, або в сполученні із фрагментами відповідних каркасних ділянок. Під обсяг винаходу підпадають також генетичні 13 UA 99097 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 варіанти генів імуноглобулінів. Генетичні варіанти, наприклад, важкого ланцюга імуноглобуліну G підкласу 1 (IgG1), можуть нести алотипові маркери G1m(17) або G1m(3) в CH1-домені або алотипові маркери G1m(1) або G1m(non-1) в CH3-домені. Згідно із даним винаходом переважно застосовують IgG1 алотипу Gm(17)(z) і Gm(1)(a). Молекула антитіла, запропонована у винаході, може являти собою також модифіковані або мутантні антитіла типу мутанта IgG з посиленою або ослабленою здатністю до зв'язування з Fc-рецептором або активації комплементу. В одному з варіантів здійснення винаходу антитіло, запропоноване в даному винаході, являє собою повністю гуманізоване антитіло або "повністю людське антитіло". Таким чином, антитіла, запропоновані у винаході, можуть являти собою також отримані перехресним клонуванням антитіла, тобто антитіла, які містять різні ділянки антитіл (наприклад, CDR-ділянки) одного або декількох вказаних батьківських антитіл або антитіл з оптимізованою афінністю, як представлено в даному описі. Ці отримані перехресним клонуванням антитіла можуть являти собою антитіла з декількома різними каркасними ділянками, наприклад, каркасним ділянкою IgG, наприклад, (людською) каркасною ділянкою IgG1, IgG2a або IgG2b. Каркасною ділянкою антитіла може бути, наприклад, каркасна ділянка ссавця, наприклад, людська каркасна ділянка. Домени на легкому й важкому ланцюгах мають однакову загальну структуру, і кожний домен містить чотири каркасні ділянки, послідовності яких є відносно консервативними, зв'язані із трьома гіперваріабельними ділянками, які називають ділянками, які визначають комплементарність (CDR1-3). У контексті даного опису поняття "людська каркасна ділянка" стосується каркасної ділянки, яка практично (приблизно на 85 % або більше, звичайно на 90-95 % або більше) ідентична до каркасної ділянки людського імуноглобуліну, який зустрічається в природних умовах у. Каркасна ділянка антитіла (наприклад, що представляє собою об'єднані каркасні ділянки, що входять у легкий й важкий ланцюги) служить для позиціювання й вибудовування в необхідній послідовності CDR-ділянок. CDR насамперед відповідають за зв'язування з епітопом антигену. Слід зазначити, що в каркасну ділянку імуноглобуліну можна інтродукувати не лише переважні (людські) каркасні ділянки отриманих перехресним клонуванням антитіл, які представлені в даному описі, але також і молекули антитіл, що містять CDR із вказаних у даному описі антитіл. Прикладами каркасних ділянок є каркасні ділянки IgG1, IgG2a або IgG2b. Найбільш переважними є людські каркасні ділянки й каркасні ділянки людського IgG1, такі як важкий ланцюг АНТИТІЛА, представлена, серед іншого, в SEQ ID NO: 6. В одному з варіантів здійснення винаходу ізоформи АНТИТІЛА можуть містити у варіабельній ділянці важкого ланцюга CDR1, що включає наступні амінокислоти: GFTFSSYAMS (SEQ ID NO: 10). Вказана CDR1 може кодуватися наступною нуклеотидною послідовністю: ggatttacctttagcagctatgcgatgagc (SEQ ID NO: 9). Ізоформи АНТИТІЛА можуть містити у варіабельній ділянці важкого ланцюга наступну CDR2: AINASGTRTYYADSVKG (SEQ ID NO: 12) (N: N-зв'язаний сайт глікозилування на Asn-52 повнорозмірного важкого ланцюга). Вказаний CDR2 може кодуватися наступною нуклеотидною послідовністю: gctattaatgcttctggtactcgtacttattatgctgattctgttaagggt (SEQ ID NO: 11). Згідно із даним винаходом N-глікозилування має місце, наприклад, у вказаній CDR2-ділянці на відповідному залишку Asn52 варіабельної ділянки важкого ланцюга, де варіабельна ділянка (VH) кодується молекулою нуклеїнової кислоти, представленої в SEQ ID NO: 1, і має амінокислотну послідовність, представлену в SEQ ID NO: 2. Крім того, ізоформи АНТИТІЛА можуть містити у своїй варіабельній ділянці важкого ланцюга CDR3, що має наступну амінокислотну послідовність: GKGNTHKPYGYVRYFDV (SEQ ID NO: 14). Вказана CDR3 може кодуватися наступною нуклеотидною послідовністю: ggtaagggtaatactcataagccttatggttatgttcgttattttgatgtt (SEQ ID NO: 13). Ізоформи АНТИТІЛА можуть містити легкий (L) ланцюг, у якій можуть бути присутні наступні CDR: CDR1: RASQSVSSSYLA (SEQ ID NO: 16), agagcgagccagagcgtgagcagcagctatctggcg (SEQ ID NO: 15), CDR2: GASSRAT (SEQ ID NO: 18), ggcgcgagcagccgtgcaact (SEQ ID NO: 17), CDR3: LQIYNMPI (SEQ ID NO: 20), cttcagatttataatatgcctatt (SEQ ID NO: 19). 14 UA 99097 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Ізоформи АНТИТІЛА можуть містити додаткові потенційні сайти глікозилування (які, як відомо в даній галузі, містять мотиви Asn-X-Ser/Thr) в амінокислотній послідовності важких ланцюгів антитіла, наприклад, у висококонсервативному сайті глікозилування на Asn 306 у неваріабельній ділянці Fc-фрагмента (відповідає "Asn297" у системі Кебота (Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-і изд., Bethesda, Md., 1991, National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine)), вказані важкі ланцюги мають або містять послідовність, представлену вище, а саме SEQ ID NO: 6 (яка кодується SEQ ID NO: 5). В одному з варіантів здійснення даного винаходу ізоформи АНТИТІЛА характеризуються тим, що принаймні один антигензв'язувальний центр містить глікозилований залишок аспарагіну (Asn) у варіабельній ділянці важкого ланцюга (VH), де вказана VH кодується (a) молекулою нуклеїнової кислоти, що містить нуклеотидну послідовність, представлену в SEQ ID NO: 1: (б) молекулою нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептид, що має амінокислотну послідовність, представлену в SEQ ID NO: 2: виділена жирним шрифтом буква "N" у контексті даного опису позначає залишок Asn у положенні 52 варіабельної ділянки важкого ланцюга); (в) молекулою нуклеїнової кислоти, яка гібридизується з молекулою нуклеїнової кислоти, вказаною в (a) або (б), і яка кодує поліпептид, що має здатність зв'язуватися з β-A4пептидом/Aβ4, що має наступну амінокислотну послідовність DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA (SEQ ID NO: 3) або її фрагмент, що включає принаймні 15 амінокислот; (г) молекулу нуклеїнової кислоти, яка гібридизується з молекулою нуклеїнової кислоти, вказаною в (a) або (б), і яка кодує поліпептид, що має здатність зв'язуватися принаймні із двома ділянками β-A4-пептиду/Aβ4, що має наступну амінокислотну послідовність DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA (SEQ ID NO: 3), або принаймні із двома ділянками фрагмента SEQ ID NO. 3, що містить принаймні 15 амінокислот, причому вказані дві ділянки β-A4-пептиду/Aβ4 або його фрагменти містять амінокислоти, які присутні у положеннях 3-6 і в положеннях 18-26 SEQ ID No. 3; або (д) нуклеотидну послідовність, яка з урахуванням виродженості генетичного коду відповідає нуклеотидній послідовності, вказаній в одному з підпунктів (a) - (г). Фахівцеві в даній галузі повинно бути очевидно, що поняття "молекула нуклеїнової кислоти, яка гібридизується з молекулою нуклеїнової кислоти, вказаною в підпункті (a) або (б), і яка кодує поліпептид, що має здатність зв'язуватися принаймні із двома ділянками β-A4-пептиду/Aβ4" у контексті даного опису стосується кодувального ланцюга дволанцюгової молекули нуклеїнової кислоти, у той час як некодувальний ланцюг гібридизується з молекулою нуклеїнової кислоти, вказаною в (a) і (б). Як вказано вище, молекулу очищеного антитіла, що має згідно із даним винаходом глікозилований залишок Asn, можна, серед іншого, охарактеризувати й описати як молекулу антитіла, у якій варіабельна ділянка, що включає глікозилований Asn, міститься у важкому ланцюзі, вибраному із групи, що включає: (a) поліпептид важкого ланцюга, який кодується молекулою нуклеїнової кислоти, представленою в SEQ ID NOS: 5, 23 або 25; 15 UA 99097 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 (б) поліпептид важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, представлену в SEQ ID NO: 6 або 26; (в) поліпептид важкого ланцюга, який кодується молекулою нуклеїнової кислоти, яка гібридизується з молекулою нуклеїнової кислоти, вказаною в підпункті (a), і яка кодує поліпептид, що має здатність зв'язуватися з β-A4-пептидом/Aβ4, що має наступну амінокислотну послідовність DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA (SEQ ID NO: 3), або її фрагмент, що включає принаймні 15 амінокислот; або (г) поліпептид важкого ланцюга, який кодується молекулою нуклеїнової кислоти, яка гібридизується з молекулою нуклеїнової кислоти, вказаною в підпункті (a), і яка кодує поліпептид, що має здатність зв'язуватися принаймні із двома ділянками β-A4-пептиду/Aβ4, що має наступну амінокислотну послідовність DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA (SEQ ID NO: 3) або принаймні із двома ділянками фрагмента SEQ ID NO. 3, що включає принаймні 15 амінокислот, причому вказані дві ділянки β-A4-пептиду/Aβ4 або його фрагменти включають амінокислоти, які присутні у положеннях 3-6 і в положеннях 18-26. Вказане вище антитіло (наприклад, наведене як приклад антитіло, запропоноване у винаході) може містити також L-ланцюг, що має наступну амінокислотну послідовність: або L-ланцюг, наприклад, який кодується наступною нуклеотидною послідовністю: Як підкреслювалося вище, очищена молекула антитіла, яка має глікозилований відповідно до винаходу залишок Asn у важкому ланцюзі, може містити також легкий ланцюг, вибраний із групи, яка включає: (a) поліпептид легкого ланцюга, який кодується молекулою нуклеїнової кислоти, що представлена в SEQ ID NOS: 7, 21, 24 або 27; (б) поліпептид легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, яка представлена в SEQ ID NO: 8, 22 або 28; (в) поліпептид легкого ланцюга, який кодується молекулою нуклеїнової кислоти, яка гібридизується з молекулою нуклеїнової кислоти, вказаною в підпункті (a), і яка кодує поліпептид, що має здатність зв'язуватися з β-A4-пептидом/Aβ4, що має наступну амінокислотну послідовність DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA (SEQ ID NO: 3) або її фрагмент, що включає принаймні 15 амінокислот; або (г) поліпептид легкого ланцюга, який кодується молекулою нуклеїнової кислоти, яка гібридизується з молекулою нуклеїнової кислоти, вказаною в підпункті (a), і яка кодує поліпептид, що має здатність зв'язуватися принаймні із двома ділянками β-A4-пептиду/Aβ4, що має наступну амінокислотну послідовність DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA (SEQ ID NO: 3) 16 UA 99097 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 або принаймні із двома ділянками фрагмента SEQ ID NO. 3, що містить принаймні 15 амінокислот. Поняття "гібридизація" або "гібридизується" по відношенню до молекул нуклеїнової кислоти/послідовностям ДНК може означати гібридизацію в строгих або в нестрогих умовах. Якщо не вказане інше, переважно умови є нестрогими. Вказані умови гібридизації можна створювати відповідно до загальноприйнятих протоколів, описаних, наприклад, в Sambrook, Russell "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", вид-во Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., 2001; Ausubel, "Current Protocols in Molecular Biology", вид-во Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., 1989, або в "Nucleic acid hybridization, a practical approach", під ред. Higgins і Hames, вид-во IRL Press Oxford, Washington DC, 1985. Регулювання умов також знаходиться в компетенції фахівця в даній галузі, і її можна здійснювати відповідно до протоколів, відомим у даній галузі. Да, виявлення тільки послідовностей, які специфічно гібридизуються, як правило, вимагає строгих умов гібридизації й відмивання, наприклад, з використанням 0,1 × SSC, 0,1 % ДСН при 65 °C. Нестрогі умови гібридизації для виявлення гомологічних або не строго комплементарних послідовностей можуть включати використання 6 × SSC, 1 % ДСН при 65 °C. Добре відомо, що довжина зонда й склад нуклеїнової кислоти, яка підлягає виявленню, являють собою додаткові параметри умов гібридизації. Слід зазначити, що можна здійснювати варіації вищевказаних умов шляхом включення альтернативних блокуючих реагентів (або заміни на них), які застосовують для пригнічення фону в експериментах з гібридизації. Загальноприйнятими блокуючими реагентами є реагент Денхардта, BLOTTO, гепаринів, денатурованої ДНК сперми лосося й патентовані препарати, які надходять у продаж. Включення конкретних блокуючих реагентів може потребувати модифікації вказаних вище умов гібридизації внаслідок проблем, зв'язаних із сумісністю. Гібридизувальні молекули нуклеїнових кислот можуть включати також фрагменти описаних вище молекул. Такі фрагменти можуть являти собою нуклеотидні послідовності, що кодують нефункціональну молекулу антитіла або її нефункціональний фрагмент, або вказану вище CDR, і вони мають довжину, яка складається принаймні 12 нуклеотидів, переважно принаймні 15, більш переважно принаймні 18, більш переважно принаймні 21 нуклеотид, більш переважно принаймні 30 нуклеотидів, ще більш переважно принаймні 40 нуклеотидів, і найбільш переважно принаймні 60 нуклеотидів. Крім того, до молекул нуклеїнових кислот, які гібридизуються принаймні з однією із вказаних вище молекул нуклеїнових кислот, належать також комплементарні фрагменти, похідні й алельні варіанти цих молекул. Крім того, гібридизаційний комплекс являє собою комплекс із двох нуклеотидних послідовностей, утворений за допомогою водневих зв'язків між комплементарними основами G і C і між комплементарними основами A і T; причому ці водневі зв'язки можуть бути додатково стабілізовані за допомогою "стекінг"-взаємодій між основами. Дві комплементарні нуклеотидні послідовності зв'язуються за допомогою водневого зв'язку у вигляді антипаралельної конфігурації. Гібридизаційний комплекс може утворюватися в розчині (наприклад, Cot- або Rot-аналіз) або між однією нуклеотидною послідовністю, що знаходиться в розчині, і іншою нуклеотидною послідовністю, іммобілізованою на твердій основі (наприклад, на мембранах, фільтрах, чіпах, шпильках або предметних стеклах, наприклад, на яких зафіксовані клітини). Поняття "комплементарний" або "комплементарність" стосуються зв'язування полінуклеотидів, що зустрічається в природних умовах, у придатні з погляду вмісту солей і температури умовах шляхом спарювання основ. Наприклад, послідовність "A-G-T" зв'язується з комплементарною послідовністю "T-C-A". Комплементарність між двома одноланцюговими молекулами може бути "частковою", коли зв'язуються тільки деякі з нуклеїнових кислот, або вона може бути повною, коли одноланцюгові молекули є повністю комплементарними. Ступінь комплементарності між ланцюжками нуклеїнових кислот має істотне значення для ефективності й ступеня гібридизації ланцюжків нуклеїнових кислот. Це має особливу важливість для реакцій амліфікації, які залежать від зв'язування двох ланцюжків нуклеїнових кислот. Поняття "послідовності, які гібридизуються" переважно стосується послідовностей, які ідентичні принаймні на 40 %, переважно принаймні на 50 %, більш переважно принаймні на 60 %, ще більш переважно принаймні на 70 %, особливо переважно принаймні на 80 %, більш переважно принаймні на 90 %, ще більш переважно принаймні на 95 %, і найбільш переважно принаймні на 97 % до вказаної вище нуклеотидної послідовності, що кодує молекулу антитіла. Крім того, поняття "послідовності, які гібридизуються" переважно стосується послідовностей, що кодують молекулу антитіла, яка ідентична принаймні на 40 %, переважно принаймні на 50 %, більш переважно принаймні на 60 %, ще більш переважно принаймні на 70 %, особливо переважно принаймні на 80 %, більш переважно принаймні на 90 %, ще більш переважно принаймні на 95 %, і найбільш переважно принаймні на 97 % до амінокислотної послідовності молекули антитіла, вказаної вище. 17 UA 99097 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Згідно із даним винаходом поняття "ідентичний" або "відсоток ідентичності" у контексті двох або більшої кількості нуклеотидних або амінокислотних послідовностей стосується двох або більшої кількості послідовностей або підпослідовностей, які є однаковими або мають певний відсоток однакових амінокислотних залишків або нуклеотидів (наприклад, ідентичні на 60 % або 65 %, переважно ідентичні на 70-95 %, більш переважно ідентичні принаймні на 95 %) при порівнянні й лінеаризації для досягнення максимальної відповідності в вікні порівняння або в призначеній ділянці, що визначають із використанням відомого в даній галузі алгоритму порівняння послідовностей або шляхом лінеаризації вручну й візуального аналізу. Послідовності, ідентичні, наприклад, на 60-95 % або більше, розглядаються як практично ідентичні. Таке визначення застосовне також до комплементу тестованої послідовності. Переважно вказана ідентичність поширюється на ділянку, що має довжину принаймні приблизно від 15 до 25 амінокислот або нуклеотидів, більш переважно на ділянку, що має довжину приблизно від 50 до 100 амінокислот або нуклеотидів. Фахівцям у даній галузі відомо, як визначати відсоток ідентичності між/серед послідовностей з використанням, наприклад, відомих у даній галузі алгоритмів, заснованих на комп'ютерній програмі CLUSTALW (Thompson Nucl. Acids Res. 2, 1994, стор. 4673-4680) або FASTDB (Brutlag Comp. App. Biosci. 6, 1990, стор. 237-245). Хоча при розрахунках з використанням алгоритму FASTDB, як правило, не враховуються внутрішні неспівпадаючі делеції або додавання в послідовностях, тобто пролому, його можна коректувати вручну для того, щоб уникнути завищеної оцінки відсотка ідентичності. Однак при розрахунку ідентичності за допомогою CLUSTALW враховується наявність проломів у послідовності. Фахівці в даній галузі можуть скористатися також алгоритмами BLAST і BLAST 2.0 (Altschul, Nucl. Acids Res. 25, 1997, стор. 3389-3402; Altschul, J. Mol. Evol. 36, 1993, стор. 290300; Altschul, J. Mol. Biol. 215, 1990, стор. 403-410). У програмі BLASTN для нуклеотидних послідовностей використовуються слова, які задають за замовчуванням довжина, (W) 11, очікування (E) 10, M=5, N=4, і проводиться порівняння обох ланцюжків. Для амінокислотних послідовностей у програмі BLASTP використовуються слова, що задають за замовчуванням довжина, (W) 3 і очікування (E) 10. У матриці балів BLOSUM62 (Henikoff Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89, 1989, с. 10915) використовуються вирівнювання (B) 50, очікування (E) 10, M=5, N=4, при цьому виробляється порівняння обох ланцюжків. Крім того, даний винахід також стосується молекул нуклеїнових кислот, послідовність яких вироджена в порівнянні з послідовністю вищевказаної молекули, яка гібридизується. При використанні в контексті даного винаходу поняття "виродженість, обумовлена генетичним кодом" означає, що внаслідок надмірності генетичного коду різні нуклеотидні послідовності кодують ту саму амінокислоту. Для того, щоб визначити, чи відповідає амінокислотний залишок або нуклеотид у розглянутій послідовності антитіла певному положенню в амінокислотній послідовності або нуклеотидній послідовності, представленій, наприклад, в одній з SEQ ID NO: 1, 5, 23 і 25, фахівець у даній галузі може скористатися добре відомими в даній галузі засобами й методами, наприклад, методами порівняльного аналізу первинної структури послідовностей, або вручну, або за допомогою комп'ютерних програм, таких як програми, більш докладно описані нижче у зв'язку з визначенням поняття "гібридизація" і ступеня гомології. Для здійснення локальних порівняльних аналізів первинної структури послідовностей можна застосовувати, наприклад, програму BLAST 2.0, що представляє собою основний пошуковий інструмент для локального порівняльного аналізу первинної структури послідовностей (Basic Local Alignment Search Tool (скорочено BLAST) (Altschul, 1997, там же.; Altschul, 1993, там же; Altschul, 1990, там же). Як вказано вище, BLAST, для визначення подібності послідовностей здійснює порівняння первинних структур як нуклеотидних, так і амінокислотних послідовностей. Завдяки локальній природі алгоритму порівняльного аналізу первинної структури послідовностей програма BLAST особливо придатна для визначення точних співпадінь або ідентифікації подібних послідовностей. Основним модулем вихіднихданих алгоритму BLAST є високобальна сегментна пара (HSP). HSP складається із фрагментів двох послідовностей довільної, але однакової довжини, які мають максимальну локальну відповідність і для яких бал відповідності дорівнює або перевищує граничний або граничний бал, що задається користувачем. Підхід з використанням BLAST полягає в тому, що вона здійснює пошук HSP між розглянутою послідовністю й послідовністю з бази даних з метою оцінки статистичної значимості будь-якого виявленого співпадіння й повідомляє тільки про ті співпадіння, які задовільняють вибраний користувачем поріг значимості. Параметр E задає статистично значиме граничне значення для повідомлюваних співпадінь з послідовностями з бази даних. E інтерпретується як верхня границя частоти зустрічальності HSP (або набору HSP) у контексті 18 UA 99097 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 пошуку в повній базі даних. Відомості про будь-яку послідовність із бази даних, співпадіння з якою задовільняє значенню E, повідомляються у вихідних дані програми. Аналогічні комп'ютерні методи з використанням програми BLAST (Altschul, 1997, loc. cit.; Altschul, 1993, loc. cit.; Altschul, 1990, loc. cit.) застосовують для пошуку ідентичних або споріднених молекул у нуклеотидних базах даних, таких як GenBank або EMBL. Такий аналіз можна здійснювати набагато швидше, ніж численні гібридизації з використанням мембран. Крім того, чутливість комп'ютерного пошуку можна модифікувати для визначення того, чи можна категоризувати будь-яке конкретне співпадіння як точне або подібне. Основою пошуку є бал, який розраховують у вигляді наступного добутку: % ідентичнос послідовно ті стей % максимальн ого BLAST  бала 100 у якому враховується як ступінь подібності між двома послідовностями, так і довжина співпадаючих ділянок послідовностей. Наприклад, якщо бал добутку становить 40, то співпадіння повинне бути точним у межах похибки 1-2 %; а якщо становить 70, то співпадіння повинне бути точним. Подібними молекулами, як правило, вважають ті молекули, для яких бали добутку становлять від 15 до 40, хоча більш низькі бали можуть відповідати спорідненим молекулам. Іншим прикладом програм, що дозволяють здійснювати порівняльний аналіз первинної структури послідовностей, є відомі в даній галузі комп'ютерні програми CLUSTALW (Thompson, Nucl. Acids Res. 2, 1994, стор. 4673-4680) або FASTDB (Brutlag Comp. App. Biosci. 6, 1990, стор. 237-245). Один з варіантів здійснення даного винаходу стосується глікозилованих ізоформ АНТИТІЛА, у яких глікозилування на залишку Asn в VH-ділянці здійснюють за допомогою структури, вибраної із групи, яка включає (a) цукрову структуру біантенного комплексного типу, що не має корового фукозилування (відсутній фукозна ланка в ядрі); (б) цукрові структури біантенного гібридного типу; (в) цукрові структури біантенного олігоманозного типу; і (г) біантенну структуру будь-якого типу із числа структуру, представлених на доданій фіг. 5 або доданій фіг. 27. В одному з варіантів здійснення антитіла/антитіл, запропонованого(их) у даному винаході відповідна цукрова структура не має корового фукозилування. Відповідне N-глікозилування можна переважно здійснювати за допомогою цукрових структур біантенного комплексного типу ( 75 %; як правило, 80-90 %), що не мають корового фукозилування, з високосіалідованими (аж до 80 %) антенами. До мінорних цукрових структур належать структури біантенного гібридного й олігоманозного типу ( (25 %) відповідно, які також представлені на доданих фіг. 5 і 27. Глікозилувальні структури у варіабельній ділянці стійкі до відщеплення N-глікозидазою F від білка (від амінокислот поліпептиду). В одному з варіантів здійснення винаходу домінантні комплексні біантенні цукрові структури додатково характеризуються - наявністю однієї або двох сіалових кислот, приєднаних або до однієї, або до іншої антени, або до обох антен. Сіалова кислота стосується типу N-ацетилнейрамінових кислот і, як правило, зв'язана з допомогою альфа-2,3-зв'язку з кінцевими бета-1,4-зв'язаними залишками галактози; - відсутністю корового фукозилування, тобто відсутністю фукозного залишку, приєднаного за допомогою альфа-1,6-зв'язку до самого вилученого N-ацетилглюкозаміну на скороченому кінці цукрового ланцюга. В одному з варіантів здійснення винаходу гібридні цукрові структури додатково характеризуються - наявністю антени комплексного типу (лактозамінільна ланка (GlcNAc-Gal), приєднана до корової цукрової структури), що представляє собою одне плече біантенної структури. Це плече переважно містить N-ацетилнейрамінову кислоту, приєднану до кінцевої бета-1,4-зв'язаної галактози; - наявністю від однієї до трьох додаткових манозних субодиниць, приєднаних до корової цукрової структури як друга антена; - відсутністю корового фукозилування, тобто відсутністю фукозного залишку, приєднаного за допомогою альфа-1,6-зв'язку до самого вилученого N-ацетилглюкозаміну на скороченому кінці цукрового ланцюга. В одному з варіантів здійснення винаходу цукрові структури олігоманозного типу додатково характеризуються 19 UA 99097 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 - наявністю 4 (Man4 GlcNAc2), 5 (Man5GlcNAc2) або 6 (Man6GlcNAc2) манозних субодиниць у повній цукровій структурі, тобто включаючи 3 розгалужувані манозні субодиниці, які присутні в типовій N-зв'язаній коровій цукровій структурі; - відсутністю корового фукозилування, тобто відсутністю фукозного залишку, приєднаного за допомогою альфа-16-зв'язку до самого віддаленого N-ацетилглюкозаміну на скороченому кінці цукрового ланцюга. Інший варіант здійснення даного винаходу стосується композиції, яка містить молекулу антитіла, що характеризується тим, що один антигензв'язувальний центр містить глікозилований залишок аспарагіну (Asn) у варіабельній ділянці важкого ланцюга (V H), і молекулу антитіла, що характеризується тим, що два антигензв'язувальні центри містять глікозилований залишок аспарагіну (Asn) у варіабельній ділянці важкого ланцюга (V H), тобто композиції, що містить моноглікозиловане АНТИТІЛО й двічі глікозиловане АНТИТІЛО й яка нижче в даному описі позначена як КОМПОЗИЦІЯ АНТИТІЛ. Поняття КОМПОЗИЦІЯ АНТИТІЛ також стосується композицій, які містять принаймні одну глікозиловану V H-ділянку, як вказано вище, або принаймні одну глікозиловану CDR вказаної VH-ділнку, де вказані молекули можуть, серед іншого, являти собою імуноглобуліни або ізоформи й модифікації імуноглобуліну, як вказано вище. Наприклад, вказана композиція може містити також одноланцюгові антитіла (scFvs) або біспецифічні молекули, які включають глікозиловані CDR-ділянки, отримані з VHділянок. Більш докладні визначення КОМПОЗИЦІЇ АНТИТІЛ, запропоновані в даному винаході, наведені нижче. КОМПОЗИЦІЯ АНТИТІЛ зовсім не містить або містить лише в незначному ступені "неглікозиловані в VH-ділянки" молекули АНТИТІЛ, тобто антитіла, які не глікозиловані, як вказано в даному описі, у варіабельній ділянці, насамперед у варіабельній ділянці важкого ланцюга (VH). В контексті даного винаходу й насамперед у контексті запропонованих у даному винаході сумішей антитіл поняття "зовсім не містить або містить лише в незначному ступені неглікозиловані молекули АНТИТІЛ" означає, що КОМПОЗИЦІЯ АНТИТІЛ містить менше 10 %, наприклад, менше 5 %, наприклад, менше 4 %, наприклад, менше 3 %, наприклад, менше 2 %, наприклад, менше 1 %, наприклад, менше 0,5 % або ще менше вказаної(их) у даному описі неглікозилованої(их) ізоформ. Відповідно до цього один з варіантів здійснення даного винаходу стосується препарату АНТИТІЛ, що містить моноглікозиловані та/або двічі глікозиловані антитіла (тобто антитіла, глікозиловані у варіабельній ділянці важкого ланцюга) і не містить молекул антитіл, неглікозилованих у варіабельній ділянці. У цьому випадку поняття "не містить молекул антитіл, неглікозилованих у варіабельній ділянці" стосується препаратів антитіл/сумішей антитіл/пулів антитіл, які містять максимум 10 %, наприклад, максимум 5 %, наприклад, максимум 4 %, наприклад, максимум 3 %, наприклад, максимум 2 %, наприклад, максимум 1 %, наприклад, максимум 0,5 %, наприклад, максимум 0,3 %, наприклад, максимум 0,2 % вказаних у даному описі неглікозилованих ізоформ. Один з варіантів здійснення даного винаходу стосується композиції, яка не містить більше 0,5 % ізоформ антитіл, неглікозилованих у варіабельних ділянках, наприклад, неглікозилованих у варіабельній ділянці важкого ланцюга. Як вказано вище, один з варіантів здійснення даного винаходу стосується суміші моно- і двічі глікозилованих антитіл, наприклад, імуноглобулінів, де суміш не містить молекул антитіл, не глікозилованих у варіабельній ділянці. Антитіла, що не мають таких посттрансляційних модифікацій у варіабельній ділянці, наприклад, в обох варіабельних ділянках важкого ланцюга (в обох (VH)-ділянках), у контексті даного винаходу розглядаються як "неглікозилована форма", тобто форма, неглікозилована у варіабельній ділянці важкого ланцюга. Однак така "неглікозилована форма" може, проте, бути глікозилованою у константній ділянці (в C-ділянці) антитіла, наприклад і як правило, у висококонсервативному сайті глікозилування Fc-фрагмента, насамперед на залишку аспарагіну (Asn) 306 у неваріабельній/константній ділянці Fcфрагмента, як вказано в даному описі. Глікозиловані ізоформи АНТИТІЛА самі по собі або у вигляді комбінації моноглікозилованих і двічі глікозилованих ізоформ являють собою високоефективні й терапевтичні препарати антитіл, які мають переваги, для лікування хвороби Альцгеймера (AD) і інших, зв'язаних з амілоїдами порушень, таких як синдром Дауна, спадковий церебральний крововилив, що супроводжується амілоїдозом Дутча-типу, хвороба Паркінсона, ALS (аміотрофічний боковий склероз), хвороба Крейцфельда-Якоба, зв'язана з ВІЛ деменція й рухова нейропатія. 20 UA 99097 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Глікозиловані ізоформи АНТИТІЛА самі по собі або у вигляді комбінації моноглікозилованих і двічі глікозилованих ізоформ є також унікальними діагностичними засобами. Обидві представлені в даному описі глікозиловані ізоформи мають підвищену й високоефективну здатність до проникнення в головний мозок in vivo. Ефективне проникнення в головний мозок і специфічне зв'язування з β-амілоїдними бляшками можна продемонструвати на мишах лінії PS2APP, на яких моделюють зв'язаний з AD амілоїдоз. Крім того, підвищену специфічність у відношенні справжніх людських β-амілоїдних бляшок можна виявити при імуногістохімічному фарбуванні in vitro у сполученні з істотно зниженою неспецифічною клейкістю. Було встановлено, що мінімальна ефективна концентрація для стійкого фарбування β-амілоїдних бляшок становила 10 нг/мл, як це вказано в доданих прикладах. Як описано в доданих прикладах, розділення і характеризація різним способом глікозилованих антитіл, наприклад, імуноглобулінів, дозволило встановити, що глікозилування варіабельної ділянки важкого ланцюга впливає на зв'язування антигену з Aβ-пептидами, діагностичну цінність, фармакологічний профіль і функціональну активність. Молекули очищеного антитіла можна застосовувати в МС-аналізі, вивченні зв'язування (Biacore) і епітопному картуванні (Pepspot-аналіз) на основі зв'язування з розчинним Aβ, дисоціації агрегованого Aβ і мікроскопічному аналізі зв'язування з β-амілоїдними бляшками in vivo і in vitro. В одному з варіантів здійснення даного винаходу очищене АНТИТІЛО або КОМПОЗИЦІЯ АНТИТІЛ має здатність специфічно розпізнавати β-A4-пептид/Aβ4. Отже, і як це вказано в даному описі, поняття очищене АНТИТІЛО або КОМПОЗИЦІЯ АНТИТІЛ у конкретному варіанті здійснення винаходу стосуються АНТИТІЛА або КОМПОЗИЦІЇ АНТИТІЛ, які мають здатність специфічно розпізнавати дві ділянки (N-кінцеву ділянку і центральну/серединну ділянку) Aβ/Aβ4. Поняття "специфічне розпізнавання" у контексті даного опису означає, що молекула антитіла має здатність специфічно взаємодіяти та/або зв'язуватися принаймні із двома амінокислотами кожної із двох ділянок пептиду -A4, вказаних у даному описі. Це поняття стосується специфічності молекули антитіла, тобто її здатності розрізняти специфічні вказані вище ділянки пептиду -A4 і інші ділянки пептиду -A4, які до них не належать, або іншого, не спорідненого APP білка/пептиду/(не спорідненого) тест-пептиду. Таким чином, специфічність можна визначати експериментально за допомогою методів, відомих у даній галузі, і методів, представлених у даному описі. Такі методи включають, але не обмежуючись ними) Вестернблотинг, аналізи ELISA (твердофазний імуноферментний аналіз), РІА (радіоімуний аналіз), ECL, ІРМА (імунорадіометричний аналіз) і пептидне сканування. Такі методи включають також визначення значень KD, що проілюстровано серед іншого нижче в прикладах. Пептидне сканування (pepspot-аналіз), як правило, застосовують для картування лінійних епітопів у поліпептиді антигену. Первинну послідовність поліпептиду синтезують послідовно на активованій целюлозі з пептидами, що перекривають один одного. Розпізнавання певних пептидів антитілом, яке тестують відносно здатності виявляти або розпізнавати специфічний антиген/епітоп, оцінюють стандартним методом, заснованим на появі кольорового забарвлення (використовують вторинне антитіло, кон'юговане з ферментом або барвником, таким як пероксидаза із хрону, або 4-хлорнафтол або перекис водню), за допомогою хемолюмінісцентної реакції або за допомогою аналогічних методів, відомих у даній галузі. При застосуванні, зокрема, хемолюмінісцентних реакцій або вторинного флуоресцентного антитіла реакцію можна оцінювати кількісно. Якщо антитіло взаємодіє з певним набором пептидів, що перекриваються, то можна виводити мінімальну послідовність амінокислот, необхідну для реакції; див. приклади, наведені як ілюстрація даного винаходу. Цей же аналіз дозволяє виявляти два різні кластери реактивних пептидів, щосвідчить про розпізнавання переривчастого, тобто конформаційного епітопу в антигенному поліпептиді (Geysen, Mol. Immunol. 23, 1986, стор. 709-715). Крім pepspot-аналізу можна здійснювати також стандартний метод ELISA. Як продемонстровано в доданих прикладах, невеликі гексапептиди можна зшивати з білком і сенсибілізувати ними планшет для імунного аналізу й піддавати взаємодії з антитілами, призначеними для тестування. Оцінку можна здійснювати за допомогою стандартного методу, заснованого на появі кольорового фарбування (наприклад, за допомогою вторинного антитіла, кон'югованого з пероксидазою із хрону, і тетраметилбензину з перекисом водню). Реакцію в певних лунках оцінюють по оптичній густини (ОГ), наприклад, при довжині хвилі 450 нм. Типовий фоновий рівень (відповідає негативній реакції) може становити 0,1 ОГ, типовий для позитивної реакції рівень може становити 1 ОГ. Це означає, що розходження (співвідношення) позитивної/негативної реакції може бути більш ніж 10-кратним. Додаткові деталі наведені нижче 21 UA 99097 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 в прикладах. Інші кількісні методи визначення специфічності й здатності "специфічно розпізнавати" вказані дві ділянки пептиду β-A4 представлені нижче в даному описі. Поняття "дві ділянки пептиду β-A4" стосується двох ділянок, які відповідають N-кінцевим амінокислотам 3-6 і центральному/серединному епітопу, що включає амінокислоти, що знаходяться у положеннях 18-24 SEQ ID NО: 3 (β-A4-пептид). Як продемонстровано в доданих прикладах, ізоформа двічі глікозилованого АНТИТІЛА А, запропонована у винаході й проілюстрована в даному описі (див. додані приклади), дозволяє виявляти дві ділянки Aβмолекули, де перша ділянка містить амінокислоти 1-10 з N-кінцевої ділянки, а друга ділянка містить амінокислоти 17-26 із центральної/серединної ділянки Aβ (послідовність якого представлена в SEQ ID NО: 3). Відповідно до цього у випадку сумішей антитіл, запропонованих у винаході, які містять як моно-, так і двічі глікозиловані ізоформи антитіл, запропонованих у винаході, дві ділянки можуть бути трохи ширше, наприклад, можуть включати амінокислоти з 1 по 10 (або по 11, або по 12) або більш короткий фрагмент цієї ділянки, і амінокислоти з 17 по 26 (або амінокислоти з 16 по 27) або більш короткий фрагмент, розташований між амінокислотами з 17 по 26, такий, наприклад, як амінокислоти з 19 по 26 або з 20 по 26). Поняття «β-A4-пептид" у контексті даного винаходу стосується вказаного вище Aβ39, Aβ41, Aβ43, насамперед до Aβ40 і Aβ42. Послідовність Aβ42 представлена також у доданій SEQ ID NO: 3. Слід зазначити, що поняття "дві ділянки β-A4-пептиду" стосуються також "епітопу" та/або "антигенної детермінанти", що містить вказані в даному описі дві ділянки β-A4-пептиду або його фрагменти. Відповідно до даного винаходу вказані дві ділянки β-A4-пептиду розділені (на рівні амінокислотної послідовності) у первинній структурі β-A4-пептиду принаймні однією амінокислотою, наприклад, принаймні двома амінокислотами, наприклад, принаймні трьома амінокислотами, наприклад, принаймні чотирма амінокислотами, наприклад, принаймні п'ятьма амінокислотами, наприклад, принаймні шістьома амінокислотами. Як вказано в даному описі й проілюстровано в доданих прикладах, молекули антитіл/антитіла, запропоновані у винаході, виявляють/взаємодіють та/або зв'язуються із двома ділянками β-A4-пептиду як вказано в даному описі, причому вказані дві ділянки розділені (на рівні первинної структури амінокислотної послідовності) принаймні однією амінокислотою й де послідовність, що розділяє вказані дві ділянки/«епітоп" може включати більше семи амінокислот, більше 8 амінокислот, більше 10 амінокислот або навіть приблизно 14 амінокислот. Поняття "дві ділянки пептиду β-A4" може стосуватися також конформаційного епітопу або до переривчастого епітопу, що складається із вказаних двох ділянок або їхх фрагментів; див. також в Geysen (1986), loc. cit. У контексті даного опису конформаційний епітоп визначається двома або більшою кількістю дискретних амінокислотних послідовностей, розділених у первинній послідовності, які з'являються разом на поверхні, коли відбувається укладання поліпептиду з утворенням нативного білка (Sela, Science 166, 1996, с. 1365 і Laver, Cell 61, 1990, стор. 553556). Молекули антитіл, запропоновані в даному винаході, імовірно, специфічно зв'язуються/взаємодіють із конформаційним(ими) епітопом(ами), який(і) складаються із двох описаних вище ділянок β-A4 або їх фрагментів та/або містять їх, що буде докладніше описано нижче. Вважається, що "молекули антитіл", запропоновані в даному винаході, мають одночасно й незалежно подвійну специфічність по відношенню до (a) амінокислотної ділянки, що містить амінокислоти 1-11 (або її фрагменту(ів)) β-A4, і (б) амінокислотній ділянці, що містить амінокислоти 16-27 (або її фрагменту(ів)) β-A4 (SEQ ID NO. 3). Фрагменти або частини цих ділянок містять принаймні дві, у більшості випадків принаймні три амінокислоти. Молекули антитіла, наприклад, імуноглобуліни, можуть експресуватися, серед іншого, у трьох системах: a) у короткочасно трансфектованих клітинах нирки людського ембріона, що несуть ядерний антиген вірусу Епштейна-Барра (HEK 293 EBNA, фірма Invitrogen), б) у короткочасно трансфектованих клітинах яєчника китайського хом'ячка (CHO) і в) у стабільно трансфектованих лініях CHO-клітин (CHO K1 і CHO K1 SV, фірма Lonza Biologics). Три різні молекули антитіла (неглікозиловані, моно- або двічі глікозиловані) можуть бути розділені за допомогою специфічних стадій очищення, включаючи очищення з використанням протеїну A, катіонообмінну хроматографію, а також гель-фільтрацію на колонках, як це докладно описано нижче. В одному з варіантів здійснення винаходу молекулу антитіла одержують методом рекомбінації, наприклад, у CHO-клітині або в клітині лінії HEK 293, переважно в CHO-клітинах. У конкретному варіанті здійснення винаходу вказані вище схеми глікозилування можна одержувати після експресії в CHO-клітинах. CHO-клітини дуже добре відомі в даній галузі й включають, серед іншого, такі застосовувані в експериментах CHO-клітини, як CHO K1- або CHO K1 SV-клітини. Звичайно застосовуваними HEK 293-клітинами є клітини лінії HEK 293 EBNA. 22 UA 99097 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Рекомбінантну експресію глікозилованого антитіла, запропонованого в винаході, здійснюють, як продемонстровано в прикладах, в еукаріотичній експресійній системі, насамперед в CHO-клітинах. Однак можна застосовувати також інші придатні для експресії клітини, тобто еукаріотичні клітини. До еукаріотичних клітин належать, наприклад, клітини грибів або тварин. Прикладами придатних клітин грибів є клітини дріжджів, наприклад, які належать до роду Saccharomyces, наприклад, які належать до видів Saccharomyces cerevisiae. Прийнятними клітинами тварин є, наприклад, клітини комах, клітини хребетних, наприклад, клітини ссавців, такі, наприклад, як NSO, MDCK, U2-OSHela, NIH3T3, MOLT-4, Jurkat, PC-12, PC-3, IMR, NT2N, Sk-n-sh, CaSki, C33A. Можна застосовувати також лінії клітин людини. Ці клітини-господарі, наприклад, CHO-клітини, можуть забезпечувати пост-трансляційні модифікації молекул антитіл, які пропонуються у винаході, включаючи видалення лідерної пептидної або сигнальної послідовності, укладку і зборку H (важкого) і L (легкого) ланцюга і, що є найбільш важливим, глікозилування молекули в потрібних сайтах, а саме в варіабельній ділянці важкого ланцюга. Такий сигнальний пептид або лідерна послідовність протеолітично розщеплюються сигнальною пептидазою господаря в процесі секреції при рекомбінантному отриманні антитіла, наприклад, в СНО-клітинах. Інші похідні лінії клітин, які відомі в даній галузі, отримують з депозитаріїв клітинних ліній, таких як Американська колекція типових культур (ATCC). Відповідно до даного винаходу також мається на увазі, що як клітини-господарі можуть функціонувати первинні клітини/клітинні культури. Такі клітини отримують, зокрема, з комах (наприклад, комах р.р. Drosophila або Blatta) або ссавців (наприклад, людини, свиней, мишей або щурів). Такі клітинигосподарі можуть містити клітини, отримані та/або виведені з клітинних ліній типу клітинної лінії нейробластоми. Таким чином, молекулу антитіла, запропоновану в винаході, отримують з використанням рекомбінантної експресійної системи. Прикладом такої системи, як вказано вище, є, наприклад, система експресії ссавців з використанням клітин яєчника китайського хом'ячка (CHO). Їх можна застосовувати в сполученні із глутамінсинтетазною (GS) системою (WO 87/04462; WO 89/01036; Bebbington, Biotechnology (N Y), 10, 1992, стор. 169-75). Ця система ґрунтується на застосуванні трансфекції CHO-клітини геном, який кодує фермент GS, і генами потрібного антитіла. Потім відбирають CHO-клітини, здатні рости на середовищах, що не містять глутаміну, і піддають інгібувальному впливу ферменту GS з використанням метіонінсульфоксіміну (MSX). Для виживання клітини повинні ампліфікувати експресію ферменту і супутнього МАт. Іншою можливою експресійною системою є система CHO dhfr-, у якій використовують CHOклітини з с дефіцитом гену дигідрофолатредуктази (dhfr-) і які потребують для росту тимідин та гіпоксантин. Батьківську лінію клітин CHO dhfr- трансфектують антитілом і геном dhfr, що дозволяє здійснити відбір трансформантів CHO-клітин з фенотипом dhfr+. Відбір приводять за відсутності тимідину та гіпоксантину. Експресію гена антитіла можна підвищувати шляхом ампліфікації з використанням метотрексату (MTX). Цей лікарський засіб є безпосереднім інгібітором ферменту dhfr і дозволяє виділяти стійкі колонії, в яких відбувається ампліфікація кількості копій їх гена dhfr й отже гена антитіла, достатня для того, щоб виживати в таких умовах. Іншою можливою експресійною системою є система CHO dhfr-, у якій використовуються CHO-клітини з дефіцитом гена дигідрофолатредуктази (dhfr-) і які для росту потребують тимідин й гіпоксантин. Батьківську лінію клітин CHO dhfr- трансфектують антитілом і геном dhfr, що дозволяє здійснювати відбір трансформантів CHO-клітин з фенотипом dhfr+. Відбір проводять за відсутності тимідину й гіпоксантину. Експресію гена антитіла можна підвищувати шляхом ампліфікації з використанням метотрексату (MTX). Цей лікарський засіб є безпосереднім інгібітором ферменту dhfr і дозволяє виділяти стійкі колонії, у яких відбувається ампліфікація кількості копій їх гена dhfr і отже гена антитіла, достатня для того, щоб виживати в таких умовах. Очищені молекули антитіла, наприклад імуноглобуліни, можна одержувати за допомогою способу, який полягає в тому, що (a) рекомбінантно експресують гетерологічну молекулу нуклеїнової кислоти, яка кодує вказану вище молекулу антитіла, у клітині ссавця, наприклад, в CHO- або HEK 293-клітині; і (б) очищають рекомбінантно експресровану молекулу антитіла за допомогою методу, що полягає в тому, що (б1) проводять очищення на протеїн A-колонці; (б2) проводять очищення на іонообмінній колонці, наприклад, за допомогою катіонообмінної хроматографії; і необов'язково (б3) проводять очищення на колонці для гель-фільтрації. Протокол очищення може включати додаткові стадії, такі як додаткові стадії концентрації, наприклад, діафільтрації (сполучення діалізу й фільтрації), або аналітичні стадії, наприклад, з 23 UA 99097 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 використанням аналітичних колонок. Метод/спосіб може включати також стадії інактивації вірусу та/або стадії видалення вірусу, наприклад, за допомогою фільтрацій/нанофільтрацій. Можливо й припустимо також деякі конкретні стадії повторювати (наприклад, можна здійснювати дві стадії іонообмінної хроматографії) або можна виключати певні стадії (наприклад, гельфільтрацію). Протеїн A являє собою групу специфічних лігандів, які зв'язуються з Fc-фрагментом більшості ізотипів IgG1. Він синтезується деякими штамами Staphylococcus aureus і його можна виділяти з них і зшивати із хроматографічними гранулами. Декілька типів препаратів у формі гелю надходять у продаж. Прикладом придатної для застосування протеїн A-колонки є колонка типу MabSelect (товарний знак). В ідеальному варіанті колонку врівноважують 25 мМ Трис/HCl, 25 мм NaCl, 5 мм ЕДТК, супернатант клітинної культури вносять у колонку, колонку промивають 1M Трис/HCl, pН 7,2 і здійснюють елюцію антитіла при pН 3,2 з використанням 100 мМ оцтової кислоти. Катіонообмінна хроматографія заснована на взаємодіях між позитивно зарядженими групами, які присутні у стаціонарній фазі, і зразком, який знаходиться у рухомій фазі. При ® використанні слабкого катіонообмінника (наприклад, CM Toyopearl 650 ) здійснюють наступні стадії хроматографування: після попереднього зрівноважування за допомогою 100 мМ оцтової кислоти, pН 4, внесення елюату, протеїну A, і промивання 100 мМ оцтовою кислотою, pН 4, елюируют антитіло й фракціонують, здійснюючи стадії з використанням 250 мМ ацетату натрію (pН 7,8-8,5) і 500 мМ ацетату натрію (pН 7,8-8,5). На першій стадії, як правило, елююється суміш фракції двічі глікозилованої ізоформи й фракції моноглікозилованої ізоформи, на другій стадії, як правило, елююється фракція неглікозилованої ізоформи. Із сильного катіонообмінника (наприклад, SP Toyopearl 650) антитіло можна елюювати із використанням сольових стадій: після зрівноважування колонки за допомогою 50 мМ оцтової кислоти, pН 5,0, внесення елюату, протеїну A, pН 4, здійснюють першу стадію елюції з використанням 50 мМ оцтової кислоти й 210 мМ хлориду натрію. Потім здійснюють другу стадію елюції з використанням 50 мМ оцтової кислоти й 350 мМ хлориду натрію. На першій сольовій стадії, як правило, елююється суміш фракції двічі глікозилованої ізоформи й фракції моноглікозилованої ізоформи, на другій сольовій стадії, як правило, елююється неглікозилована ізоформа. Крім того, антитіло можна елюювати зі колонки із сильним катіонообмінником (наприклад, ® SP-Sepharose ) з використанням сольового градієнта: після попереднього зрівноважування, завантаження й промивання колонки при pН 4,5 вносять сольовий градієнт від 50 мМ MES, pН 5,8,до 50 мМ MES/1М хлорид натрію, pН 5,8. У цьому випадку, як правило, двічі глікозилована ізоформа, моноглікозилована ізоформа й неглікозилована ізоформа елююються окремо. Потім фракцію двічі глікозилованої ізоформи й фракцію моноглікозилованої ізоформи можна об'єднувати, одержуючи пул продукту та/або необхідну суміш антитіл. Подальше очищення молекул двічі й моноглікозилованих антитіл, наприклад, імуноглобулінів, можна здійснювати за допомогою гель-фільтрації. Наприклад, можна ® застосовувати Superdex 200 -колонку. Прикладами робочих буферів є гістидин/хлорид натрію, наприклад, 10 мМ гістидин/125 мМ хлорид натрію/pН 6, і забуферений фосфатом фізіологічний розчин (ЗФР). Альтернативною стадією очищення є аніонообмінна хроматографія з використанням протікаючого потоку з наступним концентруванням/діафільтрацією. Прикладом смоли, яку ® можна застосовувати для аніонообмінної стадії, є Q Sepharose . Наприклад, елюат після SPхроматографії можна трикратно розбавляти 37,5 мМ Трис/HCl, pН 7,9, і пропускати через Qсефарозну колонку, попередньо врівноважену 25 мМ Трис/83 мМ ацетатом натрію. Минулий через колонка потік збирають, значення рН доводять до 5,5 і концентрують шляхом ® ультрафільтрації з використанням, наприклад, мембрани типу Hydrosart 30 kD . Потім концентрат можна піддавати діафільтрації в протитечії, наприклад, 10 об'ємів 20 мМ гістидину/HCl, pН 5,5. Описаний вище протокол очищення може включати також як додаткову стадію (в) стадію аналітичної хроматографії, наприклад, з використанням Mono-S HR5/5-колонки. Однак можна застосовувати також інші стадії, такі як діафільтрація, наприклад, для концентрування молекул антитіла. Одним з варіантів здійснення даного винаходу є композиція, препарат антитіл або пул антитіл, що містить описані вище молекули антитіл або молекул, отриманих відповідно до описаного вище методу. У цьому варіанті здійснення винаходу композиція містить моно- або двічі глікозиловані антитіла. В іншому варіанті здійснення винаходу композиція містить моно- і двічі глікозиловані (у варіабельній(их) ділянці(ах) важкого(их) ланцюга(ів)) антитіла й вказану 24 UA 99097 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 композицію одержують із молекул антитіл, неглікозилованих у варіабельній ділянці. У контексті цього варіанта здійснення винаходу поняття "пул антитіл" стосується суміші моно- і двічі глікозилованих (у варіабельній(их) ділянці(ах) важкої(их) ланцюга(ів)) антитіл, які можна виділяти індивідуально й потім об'єднувати в одну суміш. Суміші антитіл або пули антитіл, запропоновані в даному винаході, можуть містити 50 % моноглікозилованих і 50 % двічі глікозилованих антитіл, представлених у даному описі. Однак можна застосовувати також співвідношення від 30/70 до 70/30. Більше того, фахівцеві в даній галузі повинне бути очевидно, що в сумішах антитіл, запропонованих у даному винаході, можна застосовувати також і інші співвідношення. Наприклад, у контексті даного винаходу можна застосовувати співвідношення 10/90 або 90/10, 20/80 або 80/20, а також 40/60 або 60/40. Як проілюстровано в прикладах, найбільш переважне співвідношення двічі глікозилованих і моноглікозилованих антитіл, представлених у даному описі, у сумішах антитіл, запропонованих у винаході, становить від 40/60 до 45/55. Композиції, запропоновані в даному винаході, найбільш придатні як діагностичні або фармацевтичні композиції. Таким чином, винахід стосується діагностичних або фармацевтичних композицій, що включають (a) вказану вище молекулу антитіла, що містить один антигензв'язувальний центр із глікозилованим залишком Asn; (б) вказану вище молекулу антитіла, що містить два антигензв'язувальні центри із глікозилованим залишком Asn; або найбільш переважно (в) комбінацію молекул антитіл, вказаних у підпунктах (a) - (б). Запропонована в даному винаході комбінація, що вказана в підпункті (в), яка включає молекулу(и) антитіла, що містить молекулу(и) антитіла, що мають один антигензв'язувальний центр із глікозилованим залишком Asn, і молекулу(и) антитіла, що мають два антигензв'язувальні центри із глікозилованим залишком Asn, не містить неглікозиловані (у варіабельній ділянці важкого ланцюга) ізоформи. Як вказано вище, поняття "не містить неглікозиловані (у варіабельній ділянці важкого ланцюга) ізоформи" стосується комбінацій/пулів антитіл/препаратів антитіл, які містять менше 5 %, наприклад, менше 4 %, менше 3 %, менше 2 %, менше 1 % або навіть менше 0,5 % видів (ізоформ) антитіл, неглікозилованих у варіабельній ділянці важкого ланцюга. Як продемонстровано в прикладах, вказані комбінації/пули антитіл/препарати антитіл можуть практично не містити (містити менше 0,5 %) неглікозилованих ізоформ. Відсоток та/або кількість розглянутих глікозилованих ізоформ (тобто вказаних у даному описі, наприклад, глікозилованих у варіабельній ділянці важкого ланцюга, див., серед іншого, додану фіг. 14) у розглянутій композиції антитіл можна легко визначати методами, відомими в даній галузі. Такі методи включають (але не обмежуючись ними) масспектрометрію, іонообмінну хроматографію, ДСН-ПААГ-аналіз, HPLL (рідина-рідинна хроматографія), ELISA і т.п. В доданих прикладах показано специфічне і чутливе імунофарбування справжніх альцгеймеровських β-амілоїдних бляшок з використанням антитіл, запропонованих у винаході, яке продемонстровано в експериментах із імуногістохімічного фарбування in vitro кріозрізів тканини головного мозку, взятих із організму пацієнтів, які страждали від AD. Ефективність фарбування β-амілоїдних бляшок в зрізах головного мозку була продемонстрована також при використанні людських антитіл к Aβ, взятих із організму пацієнтів, вакцинованих Aβ (Hock, Nature Medicine, 8, 2002, стор. 1270-1275). Крім того, імунофарбування продемонстровано також на використовуваних як модель трансгенних тваринах, які характеризувались високими рівнями людських β-амілоїдних бляшок (Richards, J. Neuroscience, 23, 2003, стор. 8989-9003). На аналогічних моделях з використанням тварин було продемонстровано, що зв'язування таких бляшок приводить до їх кліренсу і наступного поліпшення зв'язаних із захворюванням симптомів, причому в науковій літературі обговорювалося питання про участь в цьому опосередкованих Fc процесів (Bard, Nature Medicine, 6, 2000, стор. 916-919; Wilcock, Neurobiology Disease, 15, 2003, стор. 11-20; Wilcock, J. Neuroscience, 24, 2004, стор. 6144-6151). Крім того, опубліковані дані про том, що ефективне зв'язування антитіл до Aβ із β-амілоїдними бляшками корелює із більш повільним прогресуванням захворювання (Hock, Nature Medicine, 8, 2002, стор. 1270-1275; Hock, Neuron, 38, 2003, стор. 547-554). Цей аналіз і посмертний аналіз тканини людського головного мозку дозволяє передбачити, що в кліренсі бляшок в організмі людини ймовірно приймає участь фагоцитоз мікрогліальних клітин (Nicoll, Nature Medicine, 9, 2003, стор. 448-452). Таким чином, антитіло, запропоноване в даному винаході, або, насамперед те, яке міститься у фармацевтичних композиціях, представляє собою людський IgG1, який є основним фактором, який відповідає за залежні от FcR процеси в організмі людини. 25 UA 99097 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Ефективне імунне фармбування β-амілоїдних бляшок при використанні антитіл, запропонованих у винаході/суміші, запропонованої у винаході, дозволяє припустити, що лікарський засіб повинен мати ефективність при пасивній імунізації у відношенні очищення от існуючих β-амілоїдних бляшок та запобігання їх утворенню в організмі людини. Крім того, антитіла переважно повинні долати гематоенцефалічний бар'єр для досягнення їх місця призначення. У випадку молекул, що мають більші розміри, таких як людські IgG, цей процес істотно сповільнюється, так що тільки приблизно від 0,1 до 0,2 % антитіла по відношенню до його концентрації в плазмі може досягти спинномозкової рідини (СМР). Механізм кліренсу бляшок усе ще залишається предметом дискусій, він може залежати від периферичних впливів на Aβ-пептид (Dodart, Nature Neuroscience, 5, 2002, стор. 452-457). Так, створене терапевтичне антитіло або відповідні запропоновані у винаході суміші моно- і двічі глікозилованих (у варіабельній ділянці важкого ланцюга) антитіл, запропонованих у винаході, мають також здатність до деполімеризації мультимерів Aβ in vitro без участі залежних від Fc процесів і зв'язуватися з розчинними мономерами й олігомерами Aβ у СМР, оскільки нейтралізація розчинних мономерних Aβ-пептидів або олігомерних Aβ-пептидів (наприклад, агрегація проміжних продуктів) може також впливати на загальну дію, що знижує кількість амілоїдів (Du, Brain, 2003, стор. 126: 1-5). Композиції, запропоновані у винаході, можна вводити у твердій або рідкій формі й серед іншого у формі порошку(ів), таблетки(ок), розчину(ів) або аерозолю(ів). Така композиція може містити одне(у) або декілька антитіл/молекул антитіл, запропонованих у винаході, найбільш переважно суміш моно- і двічі глікозилованих антитіл, запропоновану у винаході. Переважно, щоб фармацевтична композиція необов'язково містила фармацевтично прийнятний носій та/або розріджувач. Вказану фармацевтичну композицію найбільш доцільно застосовувати для лікування неврологічних та/або нейродегенеративних порушень. Такі порушення включають (але не обмежуючись ними) хворобу Альцгеймера, аміотрофічний боковий склероз (ALS), спадковий внутрішньомозковий крововилив, що супроводжується амілоїдозом Дутча-типу, синдром Дауна, зв'язану з ВІЛ деменцію, хворобу Паркінсона й неврологічні захворювання, зв'язані зі старінням. Фармацевтична композиція, запропонована у винаході, серед іншого може розглядатися як сильний інгібітор утворення амілоїдних бляшок або сильний стимулятор деполімеризації амілоїдних бляшок. Таким чином, даний винахід стосується фармацевтичних композицій, що містять сполуки, запропоновані у винаході, які можна застосовувати для лікування амілоїдогенних захворювань/порушень. Поняття "амілоїдогенне захворювання/порушення" включає будь-яке захворювання, асоційоване з утворенням або відкладенням амілоїдних фібрил та/або патологічним протеолізом APP, або яке викликається цими факторами. Приклади амілоїдогенних захворювань включають (але не обмежуючись ними) хворобу Альцгеймера (AD), синдром Дауна, деменцію, асоційовану з утворенням тілець Леві, хвороба Паркінсона, що супроводжується деменцією, помірне когнітивне порушення, церебральну амілоїдну ангіопатію й васкулярну деменцію. Різні амілоїдогенні захворювання визначаються та/або характеризуються природою поліпептиду, що представляє собою компонент амілоїдних відкладень. Наприклад, білок амілоїд-β є характерним для амілоїдних відкладень, що присутні в організмі індивідуумів, що страждають від хвороби Альцгеймера. Приклади прийнятних фармацевтичних носіїв, ексципієнтів та/або розріджувачів добре відомі в даній галузі й включають забуферені фосфатом фізіологічні розчини, воду, емульсії, наприклад, емульсії типу масло/вода, різні типи змочувальних агентів, стерильні розчини й т.д. Композиції, що містять такі носії, можна одержувати за допомогою загальноприйнятих добре відомих методів. Такі фармацевтичні композиції можна вводити пацієнтові в необхідній дозі. Придатні носії можуть являти собою будь-який матеріал, що при об'єднанні зі специфічним у відношенні Aβ зв'язувальним агентом або антитілом зберігає їх високу афінність до зв'язування з Aβ і не має реактивність відносно імунних систем індивідуума, до них належать ексципієнти, поверхнево-активні речовини, агенти, що регулюють тонічність і т.п. (див. Remington's Pharmaceutical Sciences, 16-е вид., під ред. Osol A., 1980). Вказані фармацевтичні композиції слід вводити індивідуумові в необхідній дозі. Введення прийнятних композицій можна здійснювати різними шляхами, наприклад, за допомогою парентерального, підшкірного, внутрішньоочеревинного, місцевого, внутрішньобронхіального, внутрішньолегеневого й інтраназального введення, і, якщо це потрібно для місцевого застосування, то введення в ділянку пошкодження. Парентеральне введення включає внутрішньоочеревинне, внутрішньом'язове, внутрішньошкірне, підшкірне, внутрішньовенне або внутрішньоартеріальне введення. Найбільш переважно таке введення здійснюють шляхом ін'єкції та/або введення, наприклад, в ділянку артерії головного мозку або безпосередньо в тканину головного мозку. 26 UA 99097 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Композиції, запропоновані у винаході, можна вводити також безпосередньо в ділянку-мішень, наприклад, за допомогою біобалістичного введення до зовнішньої або внутрішньої ділянкимішені, такої як головний мозок. Фармацевтичні композиції, що містять представлені в даному описі глікозиловані антитіла, одержують шляхом змішування антитіла, що має певний ступінь чистоти, з необов'язковими фізіологічно прийнятними носіями, ексципієнтами, стабілізаторами, поверхнево-активними речовинами, буферами та/або агентами для регулювання тонічності. Прийнятні носії, ексципієнти та/або стабілізатори повинні бути нетоксичними для реципієнтів у застосовуваних дозах і концентраціях, і вони включають буфери, такі як фосфатний, цитратний буфери й буфери на основі інших органічних кислот; антиоксиданти, включаючи аскорбінову кислоту, глутатіон, цистеїн, метіонін і лимонну кислоту; консерванти (такі як етанол, бензиловий спирт, фенол, м-крезол, п-хлор-м-крезол, метил- або пропілпарабени, бензалконійхлорид або їх комбінації); амінокислоти, такі як аргінін, гліцин, орнітин, лізин, гістидин, глутамінова кислота, аспарагінова кислота, ізолейцин, лейцин, аланін, фенілаланін, тирозин, триптофан, метіонін, серин, пролін і їх комбінації; моносахариди, дисахариди й інші вуглеводи; низькомолекулярні (що містять менше приблизно 10 залишків) поліпептиди, білки, такі як желатин або сироватковий альбумін; хелатуючі агенти, такі як ЕДТК; цукру, такі як трегалоза, сахароза, лактоза, глюкоза, маноза, мальтоза, галактоза, фруктоза, сорбоза, рафіноза, глюкозамін, Nметилгюкозамін (так званий "меглумін"), галактозамін і нейрамінова кислота; і неіоногенні поверхнево-активні речовини, такі як Твін, Brij, плюроніки, Triton-X або поліетиленгліколь (ПЕГ). Фармацевтична композиція може знаходитися в рідкій формі, ліофілізованій формі або рідкій формі, відновленій з ліофілізованої форми, де ліофілізований препарат призначений для відновлення за допомогою стерильного розчину перед введенням. Стандартна процедура відновлення ліофілізованої композиції полягає в додаванні необхідного об'єму чистої води (як правило, еквівалентного до об'єму, який вилучений в процесі ліофілізації), однак для приготування фармацевтичних композицій для парентерального введення можна застосовувати також розчини, що містять антибактеріальні агенти (див. також Chen, Drug Dev Ind Pharm 18, 1992, стор. 1311-1154). Концентрації антитіла у фармацевтичній композиції можуть становити, наприклад, від приблизно 1 мг/мл до приблизно 200 мг/мл, або від приблизно 50 мг/мл до приблизно 200 мг/мл, або від приблизно 150 мг/мл до приблизно 200 мг/мл. Для ясності слід підкреслити, що вказані в даному описі концентрації стосуються концентрації в рідкій формі або в рідкій формі, точно відновленої із твердої форми. Водну композицію антитіла можна готувати в забуферувальному розчині, що служить для регулювання значення pН, наприклад, для підтримки значення pН на рівні від приблизно 4,0 до приблизно 7,0, або від приблизно 5,0 до приблизно 6,0, або в альтернативному варіанті на рівні приблизно 5,5. Приклади буферів, придатних для регулювання значення рН у вказаному діапазоні, включають фосфатний, гістидиновий, цитратний, сукцинатний, ацетатний буфери й буфери на основі інших органічних кислот. Концентрація буфера може становити від приблизно 1 мм до приблизно 100 мм, або від приблизно 5 мм до приблизно 50 мм залежно, наприклад, від конкретного буфера й необхідної тонічності препарату. У препарат антитіла можна включати агент, що служить для регулювання тонічності, з метою регулювання тонічності препарату. Прикладами агентів для регулювання тонічності є хлорид натрію, хлорид калію, гліцерин і будь-який компонент із групи, що включає амінокислоти, цукру, а також їх комбінації. Переважно водний препарат є ізотонічним, хоча можна застосовувати також гіпертонічні або гіпотонічні розчини. Поняття "ізотонічний" стосується розчину, що має таку ж тонічність, що й інший розчин, з яким його порівнюють, такий як фізіологічний сольовий розчин і сироватка крові. Агенти для регулювання тонічності можна застосовувати в концентрації від приблизно 5 мм до приблизно 350 мм, насамперед у концентрації від 105 мм до 305 мм. До препарату антитіла можна додавати також поверхнево-активну речовину для зменшення агрегації включеного в препарат антитіла та/або для мінімізації утворення часток у препараті та/або для зниження адсорбції. Прикладами поверхнево-активних речовин є ефіри поліоксіетиленсорбітану й жирних кислот (Твін), прості алкілові ефіри поліоксіетилену (Brij), прості алкілфенілполіоксіетиленові ефіри (Triton-X), співполімер поліоксіетиленуполіоксипропілену (полоксамер, плюронік) і додецилсульфат натрію (ДСН). Переважними ефірами поліоксіетиленсорбітану й жирних кислот є полісорбат 20 (надходить у продаж під товарним знаком Tween 20™) і полісорбат 80 (надходить у продаж під товарним знаком Tween 80™). Переважними співполімерами поліоксіетилену-поліоксипропілену є продукти, що надходять у продаж під товарними знаками Pluronic® F68 або Poloxamer 188™. Переважними 27 UA 99097 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 простими алкіловими ефірами поліоксіетилену є продукти, що надходять у продаж під товарним знаком Brij™. Концентрації поверхнево-активної речовини можуть варіюватися, наприклад, від приблизно 0,001 до приблизно 1 % (мас./об.). Можна додавати також ліопротектант із метою захисту лабільної діючої речовини (наприклад, білка) від дестабілізуючих умов протягом процесу ліофілізації. Наприклад, відомими ліопротектантами є цукри (включаючи глюкозу й сахарозу); поліоли (включаючи маніт, сорбіт і гліцерин) і амінокислоти (включаючи аланін, гліцин і глутамінову кислоту). Ліопротектанти, як правило, застосовують у концентрації від приблизно 10 мм до приблизно 500 мм. В одному з варіантів здійснення винаходу препарат містить вказані вище агенти (тобто глікозиловане антитіло, поверхнево-активну речовину, буфер, стабілізатор та/або агент для регулювання тонічності) і практично не містить одного або декількох консервантів, таких як етанол, бензиловий спирт, фенол, м-крезол, п-хлор-м-крезол, метил- або пропілпарабени, бензалконійхлорид і їх комбінації. В іншому варіанті здійснення винаходу в препарат можна включати консерванти, наприклад, у концентраціях, що становлять від приблизно 0,001 до приблизно 2 % (мас./об.). В одному з варіантів здійснення винаходу препарат антитіла, запропонований у винаході, являє собою рідкий або ліофілізований препарат, придатний для парентерального введення, що може містити: - представлені в даному описі глікозиловані антитіла або КОМПОЗИЦІЮ АНТИТІЛ у кількості від приблизно 1 до приблизно 200 мг/мл, - принаймні одну поверхнево-активну речовину в кількості від приблизно 0,001 до приблизно 1 %, - буфер у концентрації від приблизно 1 до приблизно 100 мМ, - необов'язково стабілізатор у концентрації від приблизно 10 до приблизно 500 мМ та/або агент для регулювання тонічності в концентрації від приблизно 5 до приблизно 305 мМ, - при значенні pН, що становить від приблизно 4,0 до приблизно 7,0. У переважному варіанті здійснення винаходу препарат для парентерального введення, запропонований у винаході, являє собою рідкий або ліофілізований препарат, що містить: - представлені в даному описі глікозиловані антитіла або КОМПОЗИЦІЮ АНТИТІЛ у кількості від приблизно 1 до приблизно 200 мг/мл, - Твін 20 у концентрації 0,04 % (мас./об.), - L-гістидин у концентрації 20 мМ, - сахарозу в концентрації 250 мМ, - при значенні pН 5,5. У більш переважному варіанті здійснення винаходу препарат для парентерального введення, запропонований у винаході, являє собою також ліофілізований препарат, що містить: - представлені в даному описі глікозиловані антитіла або КОМПОЗИЦІЮ АНТИТІЛ у кількості 15 мг/мл, - Твін 20 у концентрації 0,04 % (мас./об.), - L-гістидин у концентрації 20 мМ, - сахарозу в концентрації 250 мМ, - при значенні pН 5,5; або - представлені в даному описі глікозиловані антитіла або КОМПОЗИЦІЮ АНТИТІЛ у кількості 75 мг/мл, - Твін 20 у концентрації 0,04 % (мас./об.), - L-гістидин у концентрації 20 мМ, - сахарозу в концентрації 250 мМ, - при значенні pН 5,5; або - представлені в даному описі глікозиловані антитіла або КОМПОЗИЦІЮ АНТИТІЛ у кількості 75 мг/мл, - Твін 20 у концентрації 0,02 % (мас./об.), - L-гістидин у концентрації 20 мМ, - сахарозу в концентрації 250 мМ, - при значенні pН 5,5; або - представлені в даному описі глікозиловані антитіла або КОМПОЗИЦІЮ АНТИТІЛ у кількості 75 мг/мл, 28