Моноклональне антиподвійне інтегринове антитіло, що специфічно зв’язує людські інтегрини альфа v бета 3 та альфа v бета 5, фармацевтична композиція, що його містить, та їх застосування в терапії

1. Моноклона льне ан типодвійне ін те гринове ан ти ті ло людини , що специфічно зв'язує людські інтегрини Альфа V Бета 3 та Альфа V Бета 5 з високою афінністю зв'язування, принаймні 2,1±1,33х10-10 для Альфа V Бета З та принаймні 2,5±1,04х10-11 для Альфа V Бета 5, до очищених інтегринів, яке має варіабельний регіон важкого ланцюга, що містить SEQ ID NO: 7, та варіабельний регіон легкого ланцюга, що містить SEQ ID NO: 8. 2 . Ан ти ті ло за п . 1 , яке від різняє тьс я тим , що з в'я з ує людські і н те грин и Альфа V Бе та 3 та Альфа V Бета 5 з афінністю принаймні 10-9 М, яка виміряна на клітинних лініях. 3 . Ан ти ті ло з а п п . 1 а бо 2 , як е від різняє тьс я ти м , що во н о вироблене за допомогою гібридоми, де гібридому одержують з В-клітини, отриманої з трансгенної тварини (не людини), яка має геном, що місти ть людський тра нсген важко го ла нцюга або тр ансхромо сом у та людськи й трансген ле гкого ланцюга або трансхромосому, злиті до імморталізованої клітини. 4. Ан ти тіло за будь-яким з пп. 1-3, яке від різняє ться тим, що воно суттєво ней траліз ує акти вність одно го з інте грині в людини Альфа V Бета 3 та Альфа V Бета 5 а бо їх фрагмен та . 5. Ан титіло за будь-яким з пп. 1-4, яке відрізняєтьс я тим, що воно повністю інгібує адгезію М21 клітини до вітронектину. 6. Ан ти тіло за будь-яким з пп. 1-5, яке відрізняється тим, що воно місти ть важкий ланцюг ІgG1 або ІgG3. UA (21) 2003021153 (22) 07.08.2001 (24) 10.09.2008 (86) PCT/US01/24784, 07.08.2001 (31) 60/223,363 (32) 07.08.2000 (33) US (31) 60/920,267 (32) 01.08.2001 (33) US (46) 10.09.2008, Бюл.№ 17, 2008 р. (72) ГІЛЕС-КОМАР ДЖІЛЛ, US/US, ХЕВНЕР ДЖОРДЖ, US/US, СНАЙДЕР ЛІНДА, US/US, ТРІКХА МОХІТ, US/US (73) ЦЕНТОКОР, ІНК. (56) WO A1 0031248, 02.06.2000. WO 0044404, 03.08.2000. S. TAM ET AL.: "Abciximab (ReoPro, chimeric 7E3 Fab ) demonstrates equivalent affinity and functional blockade of glycoprotein IIb/IIIa and alpha ( v )beta3 integrins." CIRCULATION , vol. 98, no. 11, 15 September 1998 (1998-09-15), pages 1085-1091, XP000882678. M. TRIKHA ET AL.: "A potential new application for a cardiovascular drug: Role for ReoPro (Abciximab), an inhibitor of gpIIb/IIIa and alphaVbeta3 integrins, as an anti-cancer agent." PROCEEDINGS OF THE AMERIC AN ASSOCIATION FOR CANCER RESEARCH, vol. 41, March 2000 (2000-03), page 577 XP002212901. S. SUZUKI ET AL.: "cDNA and amino acid sequences of the cell adhesion protein receptor recognizing vitronectin reveal a transmembrane domain and homologies with other adhesion protein receptors." PROCEEDINGS OF THE NATION AL AC ADEMY OF SCIENCES OF THE U.S.A., vol. 83, no. 22, November 1986 (1986-11), pages 8614-8618, XP002212902. M. LEH MANN ET AL.: "A monoclonal antibody inhibits adhesion to fibronectin and vitronectin of a colon carcinoma cell line and recognizes the integrins 2 (19) 1 3 83988 4 7. Ан ти тіло за будь-яким з пп. 1-6, яке відрізнялейкоз , гострий лімфобластний лейкоз (ALL), Вється тим, що воно місти ть важкий ланцюг ІgG1 клітинний, Т-клітинний або FAB гострий лімфоблалюдини та легкий ланцюг IgG1 людини. стний лейкоз (ALL), гострий мієлолейкоз (AML), 8. Застосування антитіла за будь-яким з пп. 1-7 в хронічний мієлоцитарний лейкоз (CML), хронічний терапії. лімфолейкоз (CLL), волосатоклітинний лейкоз, 9. Фармаце вти чна композиція яка містить антимієлодиспластичний синдром (MDS), лімфому, тіло людини за будь-яким з пп. 1-7 та фармацевхворобу Ходжкіна, злоякісну лімфому, неходжкінтично прийнятний носій. ську лімфому, лімфому Беркіта, множинну мієло10. Ізольована нуклеїнова кислота, яка кодує анму, саркому Капоші, колоректальну карциному, титіло людини за будь-яким з пп. 1-7. панкреатичну карциному, назофарингеальну кар11. Вектор експресії, який включає ізольовану нукциному, злоякісний гістіоцитоз, паранеопластичлеїнову кислоту за п. 10. ний синдром (гіперкальцемія при злоякісних ново12. Клітина-хазяїн, що містить вектор експресії за п. утвореннях), солідну пухлин у, аденокарциному, 11. саркому, злоякісну меланому, гемангіому, мета13. Клітина-хазяїн за п. 12, яка відрізняється тим, стазуючу пухлину, ракозалежну резорбцію кісток, що являє собою COS-1, COS-7, HEK293, ВНК21, ракозалежний біль у кістках або злоякістні захвоСНО, BSC-1, Hep G2, 653, SP/2, 293, HeLa, мієлорювання, який відрізняє ться тим, що пацієнту, му, лімфому або клітину рослини. який потребує такого лік ування , вводя ть фарма14. Спосіб виробництва антитіла людини за будьцевти чн у композицію за п. 9. яким з пп. 1-7, який включає культивування кліти18. Спосіб за п. 17 , який від різняє ться тим, що ни-хазяїна за пп. 12 або 13 за таких умов, що анпацієнту одно часно вводять е фе к ти вн у кі льтитіло є експресованим. кі сть п рин аймн і о дні єї м і тки або реп ор тера , 15. Застосування анти тіла за будь-яким з пп. 1-7 які можн а визначити, антагоніста TNF, антиревпри виробництві лі кар сько го за со бу для лік уматичного засобу, м'язового релаксанту, наркотиван ня а бо попе ре дження роз ладі в, оп осере дчного засобу, нестероїдно го протизапального ко ва ни х Альфа V Бета 3 та Альфа V Бета 5 ін тезасобу (НС ПЗЗ), ана ль ге тика , а несте тика , сегр инами , ви бран и х з гр упи , що вк лючає да ти вно го пр епара ту, мі сцево го анестетика, лейкоз , го стри й ле йкоз , гострий лімфобластний нервово-м'язового блокатора, ан тимікробного лейкоз (ALL), В-клітинний, Т-клітинний або FAB препарату, ан типсоріатичного препарату, кортигострий лімфобластний лейкоз (ALL), гострий мієкостероїду, анаболі чного стероїду, еритропоетилолейкоз (AML), хронічний мієлоцитарний лейкоз ну, імунізатор у, імуноглобулін у, ім уносупресив(CML), хронічний лімфолейкоз (CLL), волосатокліного препарату, гормон у ро сту, гормонзамісного тинний лейкоз, мієлодиспластичний синдром препарату, радіофармацевтичного препарату, (MDS), лімфому, хворобу Ходжкіна, злоякісну лімантидепресанту, антипсихотичного препарату, фому, не ходжкінську лімфому, лімфому Беркіта, стимулятора, протиастматично го препарату, бемножинну мієлому, саркому Капоші, колоректальта-агоніста, інгаляційного стероїду, адреналіну ну карциному, панкреатичну карциному, назофаабо аналога, цитокіну або цитокінового антагонісрингеальну карциному, злоякісний гістіоцитоз, пата. ранеопластичний синдром (гіперкальцемія при 19. Спосіб за п. 17, який відрізняється тим, що злоякісних новоутвореннях), солідну пухлин у, ефективну кількість принаймні однієї мітки або аденокарциному, саркому, злоякісну меланому, репортера, які можна визначити, антагоніста TNF, гемангіому, метастазуючу пухлин у, ракозалежну антире вма тичн ого за собу, м 'язово го ре лаксанрезорбцію кісток, ракозалежний біль у кістках або ту, нарко ти чно го засобу, нестероїдного протизазлоякістні захворювання. пального засобу (НСПЗЗ), анальгетика, анестети1 6 . Засто суван ня з а п . 1 5 , як е від різняє тьс я ка, седативного препарату, місцевого ти м , що ліка рськ ий з асіб є придатним для паанестетик у, нер вово-м'язового блокатора, антирентерального, підшкірного, внутрішньом'язовомікробного препарату, антипсоріатичного препаго, внутрішньовенного, внутрішньосуглобового, інрату, кортикостероїду, анаболічно го стероїду, трабронхіального, інтраабдомінального, еритропоетину, імунізатор у, імуноглобуліну, імуінтракапсулярного, інтрахрящового, інтракаві тарносупресивного препарату, гормону росту, гормоного , ін тр аце ліально го , ін тр амозочко во го , іннзамісного препарату, радіофармацевтично го трацеребро вен трик улярно го, вве дення в то вспрепарату, антидепресанту, антипсихотичного тий кишкі вник, інтр ацервікально го, препарату, стимулятора, протиастматичного преінтрагастрального , вн утрі шньопечінкового, вн утпарату, бета -агоні ста , ін галяційно го стеро їду, рішньоміокардіального, вн утрішньокістково го, адреналін у або анало га, ци токін у або ци токіновнутрішньотазового, інтраплеврального, інтрапво го ан та гоніста вводя ть п аці єн ту після вверостатового , вн утрі шньолегеневого, інтраректадення фармацевтичної композиції. льного, вн утрі шньониркового, інтраспінального, 20. Спосіб за п. 17 , який від різняє ться тим, що інтрасиновіального, інтраторакального, вн утрішпринаймні одну сполук у або п р о те їн , ви бр а ні ньоматкового, ін травезикального, болюсно го, п р и на йм ні з о дн і єї мі тк и а бо ре по р те р а , я кі вагінального , ректа льного, букального, сублінгм ож на визначити, антагоніста TNF, антиревмативального, інтраназального або трансдермального чного засобу, м'язового релаксанту, наркотичного введення. засобу, нестероїдного протизапального засобу 17. Спосіб лікування розладів, оп осере дко ван и х (НСП ЗЗ), ана ль ге тика , ане сте тика , седа тивноАльфа V Бета 3 та Альфа V Бета 5 і н те гр инами , го пр епара ту, місце во го анестетику, нервовови бра ни х з гр упи, що вк люча є лейкоз , гострий м'язового блокатора, антимікробного препарату, 5 83988 6 антипсо ріа тично го препара ту, кор тикостеро їду, аналога, цитокіну або цитокінового антагоніста анаболі чно го стеро їду, еритропоетину, імунізавводять перед введенням фармацевтичної компотору, імуноглобуліну, імуносупресивного п р е па зиції. р а ту, го р м о н у р о сту, го р м о нз ам і сн о го п ре 21. Продукт виробництва, який включає пакувальп а ра ту, радіофармацевтичного препарату, ний матеріал та контейнер, що містить розчин або антидепресанту, антипсихотичного препарату, ліофілізовану форму антитіла людини за будьстимулятора, протиастматичного препарату, бетаяким з пп. 1-7. агоніста, інгаляційного стероїду, адреналіну або Ця заявка частково грунтується, і має приоритет за, U.S. Pro visional 60/223,363 від 7 серпня 2000 року, що включено тут у ви гляді посилання. Даний винахід відноситься до антитіл, включаючи конкретні частини або варіанти, які специфічні по принаймні одному білку альфа-v-бета3, альфа-v-бета5 подвійного інтегрину (подвійного інтегрину) або його фрагментам, а також по нуклеїновим кислотам, що кодують такі анти-подвійні інтегринові антитіла, додатковим нуклеїновим кислотам, векторам, клітинам господаря та методам виробництва і його використання, включаючи терапевтичні формулювання, призначення та пристрої. Існують суттєві дані про те, що прогресуючий ріст пухлин залежить від ангіогенезу, утворенню нових судин, що забезпечують пухлини поживними речовинами та киснем, виводять продукти розпаду і забезпечують метастазування пухлинних клітин у віддалені зони [Gastl et al., Oncol.54:177-184]. Нещодавні дослідження дали подальше визначення ролі інтегринів в процесі ангіогенезу. Інтегрини є гетеродимерними трансмембранними білками, що відіграють критичну роль в адгезії клітин до екстрацелюлярного матриксу (ЕЦМ), який, у свою чергу, сприяє виживанню, проліферації та міграції клітин через міжклітинне з'єднання. Під час ангіогенезу, кількість інтегринів, що виділяється на поверхні активованих ендотеліальних клітин, регулює критичну адгезивну взаємодію з різноманітними білками ЕЦМ, що забезпечує регуляцію певних біологічних подій, таких як клітинна міграція, проліферація і диференціація. Було показано, що тісно споріднені, але відмінні, інтегрини aVb3 та aVb5 медіюють незалежні шляхи розвитку процесу ангіогенезу. Антитіла проти aVb3 блокують основний фактор росту фібробластів (оФРФ), що індукує ангіогенез, тоді як антитіла до aVb5 пригнічують судинний ендотеліальний фактор росту (СЕФР), що індукує ангіогенез [Eliceri, et al., J. Clin. Invest. 103: 1227-1230 (1999); Friedlander et al., Science 270: 1500-1502(1995)]. Химеричні, поліклональні (напр., антисивороткові) та/або моноклональні антитіла (Мат) і фрагменти (напр., продукти протеолітичного травлення або зливні білки), що отримані не від людей, а від інших ссавців є потенційними терапевтичними препаратами, які досліджувалися у деяких випадках для лікування певних захворюваннях. Однак, такі антитіла або фрагменти можуть спричинити імунну відповідь при перизначені лю дям. Така імунна відповідь може призвести до медійованого імунними комплексами виведення антитіл або фрагментів з кровообігу та унеможливити повторне введення препарату для лікування, таким чином зменшуючи лікувальний ефект для пацієнта і обмежуючи можливість повторного введення антитіл або фрагментів. Наприклад, повторне введення антитіл або фрагментів, що складаються з нелюдських частин, може призвести до сивороткової хвороби та/або анафілаксії. Для того, щоб уникнути цих і інших проблем, було запропоновано декілька підходів зі зменшення імунногеності таких антитіл і їхніх частин, включаючи химеризацію і гуманізацію. Однак, ці та інші підходи все ще можуть призводити до певної їмунногеності антитіл та їх фрагментів, їхньої низької афіності або до проблем з клітинними культурами, посиленню, продукції та/або низького виходу. Отже, такі антитіла або фрагменти можуть бути не досить добрими для виробництва або використання в якості терапевтичних протеїнів. Відповідно, існує потреба в розробці антиподвійних інтегринових антитіл або фрагментів, що долають більшість цих проблем, а також є удосконаленням щодо відомих антитіл та їх фрагментів. Даний винахід описує ізольовані отримані у людей, приматів, гризунів, ссавців химеричні, гуманізовані та/або CDR-трансплантовані антиподвійні інтегринові антитіла, імунноглобуліни, продукти розщеплення та інші їхні специфічні частини і варіанти, а також склад анти-подвійних інтегринових антитіл, кодування або додаткові нуклеїнові кислоти, вектори, клітини господаря, склад, формулювання, пристрої, трансгенні тварини, трансгенні рослини та методи їхнього виробництва і використання, в комбінації з тим, що відомо сучасній науці. В даному винаході також представлено принаймні одне ізольоване анти-подвійне інтегринове антитіло, як буде тут описано. До антитіл, згідно даного винаходу, належать будь-які білки або пептид-вміщуючі молекули, що складаються принаймні з частини імунноглобулінової молекули, такою як, але не обмежуючись, принаймні один допоміжний визначальний регіон (ДВР) важких або легких ланцюгів або їхня ліганд-зв'язуюча частина, важких або легких ланцюгів варіабельного регіону, важких або легких ланцюгів постійного регіону, каркасного регіону, або будь-якої їх частини, що можуть бути включені до складу антитіла в даному 7 83988 8 винаході. Ан титіло винаходу може включати або ктинового зв'язування, інгібіція зв'язування альфапоходити від будь-якого ссавця, включаючи, але v бета-3 з принаймні одним лігандом або рецептоне обмежуючись, людину, мишу, кроля, щура, гриром альфа-v бета-3, інгібіція зв'язування альфа-v зуна, примата або будь-якої їхньої комбінації, і бета-5 з принаймні одним лігандом або рецептотаке подібне. ром альфа-v бета-5, модуляція ангіогенеза, зв'яДаний винахід описує в одному аспекті молезування з подвійним інтегрином або клітинами, що кули ізольованих нуклеїнових кислот, що складавиділяють простий інтегрин. Анти-подвійне інтегють шляхом сполучення або гібридизування поліринове антитіло таким чинос може бути перевіренуклеотіди, котрі кодують специфічні анти-подвійні не на відповідну дію згідно з відомими методиками інтегринові антитіла, які складаються принаймні з такими як, але не тільки, принаймні одна біологічоднієї специфічної їхньої послідовності, домена, на дія щодо подвійного інтегринового білка. частини або варіанта. Даний винахід далі описує Даний винахід далі описує принаймні одне порекомбінантні вектори, що складають вищезгадані двійне інтегринове анти-ідіотипне антитіло до примолекули нуклеїнових кислот анти-подвійних інтенаймні одного подвійного інтегринового антитіла гринових антитіл, клітини господаря, що містять даного винаходу. Ан ти-ідіотипне антитіло включає такі нуклеїнові кислоти та/або рекомбінантні векбудь-які білки або пептид-вміщуючі молекули, що тори, а також методи виробництва та/або викорисскладаються з принаймні частини імунноглобулітання таких нуклеїнових кислот антитіл, векторів нової молекули, такої як, але не тільки, принамні та/або клітин господаря. один допоміжний визначальний регіон (CDR) важПринаймні одне антитіло винаходу зв'язується кого або легкого ланцюга або їхньої лігандз принаймні одним визначеним епітопом специфізв'язуючої частини, важкого ланцюга або легкого чним до принаймні одного подвійного інтегриноволанцюга варіабельного регіону, важкого ланцюга го білка, субодиниці, фрагмента, порції або будьабо легкого ланцюга постійного регіону, каркасноякої їхньої комбінації. Принаймні один епітоп може го регіону або будь-якої їхньої частини, що можуть складатися з принаймні одного регіону, що зв'язує бути включені до антитіла даного винаходу. Антиантитіло, котрий складається з принаймні однієї тіло винаходу може включати або походити від частини вищезгаданого білка, епітоп якого перессавців таких як, але не тільки, людина, миша, важно складається з принаймні 1-5 амінокислот кріль, щури, гризуни, примати та інші. принамні однієї частини подвійного інтегрина, таДаний винахід описує в одному аспекті молекого як, але не обмежуючись, (a) 29-48, 58-63, 69кули ізольованих нуклеїнових кислот, що склада79, 82-85, 88-134, 140-157, 161-183, 186-190, 192ють шляхом сполучення або гібридизування полі198, 202-212, 215-217, 223-237, 240-244, 248-255, нуклеотіди, котрі кодують специфічні анти-подвійні 259-268, 287-301, 313-322, 326-328, 332-344, 348інтегринові антитіла, які складаються принаймні з 351, 354-365, 376-387, 393-401, 407-414, 417-419, однієї специфічної їхньої послідовності, домена, 422-433, 443-451, 458-461, 465-469, 472, (b) 32-41, частини або варіанта. Даний винахід далі описує 46-47, 53-55, 58-69, 72-74, 77-79, 85-88, 91-94, 96рекомбінантні вектори, що складають вищезгадані 105, 110-113, 117-125, 129-142, 145-153, 155-159, молекули нуклеїнових кислот анти-подвійних інте161-163, 166-170, 172-174, 184-197, 200-209, 215гринових антитіл, клітини господаря, що містять 218, 221-225, 184-197, 200-209, 215-218, 221-225, такі нуклеїнові кислоти та/або рекомбінантні век227-250, 259-261, 263-267, 269-270, 275-281; та (с) тори, а також методи виробництва та/або викорис29-35, 43-45, 48-63, 67-69, 72-74, 80-82, 84-87, 95тання таких нуклеїнових кислот антитіл, векторів 105, 108-113, 117-142, 145-163, 166-170, 172-176, та/або клітин господаря. 184-186, 191-201,204-206, 216-219, 224-226, 229Даний винахід також описує принаймні один 251, 260-262, 264-268, 276-282, 286-288, 294-299, метод експресії принаймні одного анти-подвійного 301-318, 323-325, 328-330, 338-342, 345-349, 353інтегринового антитіла або подвійного інтегрино358, SEQ ID N0:9, 16 і 17, відповідно, або такого вого анти-ідіотопного антитіла в клітині господаря, як, але не обмежуючись, принаймні одного функщо складається з культивування клітин господаря, ціонального, екстрацелюлярного, розчинного, гідяк описано тут, за умов коли принаймні одне антирофільного, зовнішнього або цитоплазменного подвійне інтегринове антитіло виділяється у кільдомена вищезгаданого подвійного інтегринового костях, що можна визначити та/або відновити. білка, субодиниці або будь-якої їхньої частини. Даний винахід також описує принаймні одну Принаймні одне антитіло може також складакомбінацію, що складається з (а) нуклеїнових кистися з принаймні однієї певної частини принаймні лот, що кодують ізольоване анти-подвійне інтегриодного допоміжного визначального регіону (CDR) нове антитіло, та/або антитіла, що описується тут; (напр., CDR1, CDR2 або CDR3 важких або легких та (b) належного носія або розчинника. Носій або ланцюгів варіабельного регіону) та/або принаймні розчинник може інколи бути фармацевтично приодного постійного або варіабельного каркасного йнятним згідно з відомими носіями або розчиннирегіону або будь-якої їхньої частини. Принаймні ками. Комбінація може інколи складатися з приодна амінокислотна послідовність антитіла може наймні одного додаткового компонента, білка або також містити принаймні одну певну заміну, вставсуміші. ку або вилучення, як це описано тут або як це віДаний винахід також описує принаймні методомо науці. дику або склад одного анти-подвійного антитіла Даний винахід також описує принаймні одне для введення терапевтично ефективної кількості ізольоване анти-подвійне інтегринове антитіло, як для модуляції або лікування стану, залежного це описано тут, де антитіло має принаймні одну принаймні від одного подвійного інтегрина, у клідію, таку як, але не обмежуючись, інгібіція вітронетинах, тканинах, органах, тваринах або пацієнтах 9 83988 10 та/або до, після або під час відповідного стану, що додавався при 10г/мл у відповідний буфер (+/відомий науці та/або описаний тут. Са++) на 30хв, 37°С. Пластини досліджувалися Даний винахід також описує принаймні один мишиними антитілами IgG Fc, HRP. склад, пристрій та/або метод доставки терапевтиНа рисунках 5А-В показано графік сатурації чно або профілактично ефективної кількості прикривих зв'язування GenO.95 (рис.5А) та ReoPro наймні одного анти-подвійного інтегринового анти(рис.5В) на пластинах, покритих aVb3. тіла, згідно з даним винаходом. Даний винахід далі описує метод або склад НЕ НАДАНО (стор.7) НА МОМЕНТ УКЛАДАНпринаймні одного анти-подвійного антитіла для НЯ діагностики стану в клітині, тканині, органі, тварині або пацієнтів, залежного від принаймні одного Імунофлуоресценція і проаналізовано за доподвійного інтегрина, та/або до, після або під час помогою флоуцитометрії. Гістограма ліворуч відозалежного стану, що відомі науці та/або описуютьбражає базову флуоресценцію за присутності анся тут. титіл мічених ізотопами. Гістограма праворуч Даний винахід також описує принаймні один відображає позитивне зафарбовування. A, D, G, склад, пристрій та/або метод постачання для діагLM609 (Мат до aVb3, 10mг/мл); В, Е, Н, PIF6 (Мат ностики принаймні одного анти-подвійного інтегдо aVb5, 10mг/мл); і С, F, І, GenO95 (10mг/мл). ринового антитіла, згідно з даним винаходом. Рисунок 13. Адгезія HUVECS до пластин, поНа рисунку 1 показано графік подвійного розкритих матриксним протеїном. Аналіз адгезії було ведення анти-aVb3 Мат, які інкубуються на пласвиконано так, як це описано в Методах у Прикладі тинах, покритих aVb3, протягом 1 години при RT. 5. Пластини досліджувалися на флуорометрі на Пластини були потім промиті, оброблені субстра485-538нм. Адгезія клітин до лунок, покритих BSA, том OPD і OD вимірювався на 490нм. слугувала негативним контролем. На рисунку 13 На рисунку 2 показано графік кальцеїн-мічених ступінь клітинної адгезії за присутності різних конклітин М21, які попередньо інкубувалися зі зразкацентрацій антитіл було відображено в якості відсоми антитіл за відсутності або присутності P1F6, тку від клітинної адгезії за відсутності антитіл, яка була прийнята за 100%. Кожна точка даних є сеанти-aVb5 протягом 30 хвилин, а потім були внесені на пластини покриті вібронектином на 45 хвиредньою трьох визначень (+/-SD). лин. Незв'язані клітини М21 були видалені двома Рисунок 14. Адгезія клітин людської меланоми до пластин, покритих матриксним протеїном. Анапромивками по 150mл/лунку HBSS з кальцієм. ліз адгезії було виконано як це описано в Методах. Пластинка досліджувалася на флуорометрі на Адгезія клітин до лунок, покритих BSA, слугувала 485-538нм. негативним контролем. На рисунку 14 ступінь кліНа рисунку 3 показано графік клітинної адгезії, тинної адгезії за присутності різних концентрацій де клітини MDAMB435L2 були збагачені і попереантитіл було відображено в якості відсотку від клідньо інкубовані з різними концентраціями GenO95 тинної адгезії за відсутності антитіл, яка була припротягом 10 хвилин. йнята за 100%. Кожна точка даних є середньою Пухлинні клітини потім було додано до пластрьох визначень (+/- SD). тин Linbro, покритих вібронектином, і інкубовані Рисунок 15. Адгезія клітин людської карциноми при 37°С протягом 1 години. Лунки були промиті товстого кишковика НТ29 до вібронектина. Аналіз тричі і в кожну лунку було додано фарбник МТТ на адгезії було виконано так, як це описано в Метооснові Cell Titer AQ. Адгезія клітин була визначена дах. Адгезія клітин до лунок, покритих BSA, слугуна реєстраторі пластин типу ELISA, де OD490нм вала негативним контролем. Дані на рисунку 15 прямопропорційно клітинній адгезії. Клітинна адгевідображені як відсоток максимального зв'язуванзія в лунках, покритих BSA, слугувала негативним ня (за відсутності антитіл) і є середнім потрійного контролем (дані не представлено). Кожна точка визначення (+/- SD). даних є середньою трьох визначень. Рисунок 16A-D. Мі грація HUVECS у напрямку На рисунках 4A-D представлено графік зв'язувібронектина 2mг/мл. Аналіз було виконано так, як вання антитіл з "V$3, де цей ліганд преінкубувавце описано в Методах, і клітинам дозволялося ся у подвійному розведенні, починаючи при 10г/мл мігрувати протягом 6 год. Фотомікрографії репрез 50mМ ЕДТА в 1% BSA-HBSS (за відсутності Сa++) або з 1% BSA-HBSS (з Са++) протягом 30 зентативних полів (лінза об'єктиву 10х) клітинної міграції на рисунку 16А, відсутність антитіл, (16В), хвилин, 37°С. Суміші додавалися до пластин покритих CNTO 95, С372, с7Е3 або LM609 IgG та Gen095 (5mг/мл), (16С), Gen095 (40mг/мл). Рисунок інкубувалися протягом 1 години, 37°С. LM609 або 16D є графічним відображенням клітинної міграції CNTO 95 додавалися при 20г/мл у відповідний за присутності різноманітних концентрацій буфер (+/- Са++) на 30хв, 37°С. Пластини досліGenO95. Дані нормалізовано до відсотку від контджувалися мишиними антитілами IgG Fc, HRP або ролю (без антитіл), який розглядався як 100%, і людськими антитілами IgG Fc, HRP. кожна точка даних є середньою трьох транслункоНа рисунках 4E-G представлено графік зв'язувих фільтрів (+/- SD). Рисунок 17. Міграція HUVECS у напрямку до вання антитіл з "V$5, де цей ліганд преінкубувався у подвійному розведенні, починаючи при 10г/мл вібронектина 2mг/мл за присутності антитіл до з 50mМ ЕДТА в 1% BSA-HBSS (за відсутності aνb3 і aνb5. Аналіз міграції виконувався так, як це Са++) або з 1% BSA-HBSS (з Са++) протягом 30 описано в Методах, а клітинам дозволялося мігрухвилин, 37°С. Суміші додавалися до пластин повати протягом 6год. LM609 і P1F6 є Мат до aνb3 і критих CNTO 95, С372, с7Е3 або LM609 IgG та aνb5, відповідно. Дані представлені на рисунку 17 інкубувалися протягом 1 години, 37°С. VNR139 11 83988 12 були нормалізовані до відсотків від контролю (без P1F6, LM-P1F6 (L M609+P1F6), людських та мишиантитіл), який розглядався як 100%, і кожний стовних IgG (H-IgG та M-IgG). Графік на рисунку 21(D): пчик є середнім трьох транслункових фільтрів (+/концентрація всіх антитіл та протеїнів становить SD). BSA, мишиний IgG і людський IgG слугували 10mг/мл. Дані нормалізовано до відсотку від контнегативним контролем. LM609-PIF6 відображає ролю (без антитіл), який розглядається як 100%, і комбінацію обох антитіл. Антитіла і BSA викорискожна точка є середнім трьох транслункових фільтовувалися в концентраціях 10mг/мл. трів (+/- SD). Рисунки 18А-Е. Міграція HUVECS у напрямку Даний винахід описує ізольовані, рекомбінантдо 2% FBS. Аналіз міграції дозволялося проводити ні та/або синтетитчні анти-подвійні інтегринові, протягом 4год, а дані отримувалися так, як це опиотримані від людини, приматів, гризунів, ссавців, сано в Метода х. Рисунок 18(А) є графічним відохимеричні, гуманізовані або CDR-шунтовані антибраженням клітинної міграції за присутності тіла та подвійні інтегринові анти-ідіотипні антитіла, LM609, P1F6, комбінації LM609+P1F6, контрольних а також склад та кодування модекул нуклеїнових антитіл мічених ізотопами (людських і мишиних). кислот, що містять принаймні один полінуклеотидАнтитіла і протеши використовувалися в концентний код принаймні одного анти-подвійного інтегринового антитіла або анти-ідіотипного антитіла. рації 10mг/мл. Рисунок 18(В) є графічним відобраДаний винахід також включає, але не обмежуєтьженням клітинної міграції за присутності ReoPro і ся, методи виробництва та використання таких Gen095. Фотомікрографії є репрезентативними нуклеїнових кислот та антитіл і анти-ідіотипних полями (лінза об'єктиву 10 х) клітинної міграції на антитіл, включаючи діагностичні та терапевтивчні рисунку 18(С), відсутність антитіл, рисунку 18(D), склади, методи та пристрої. Gen095 (5mг/мл), і рисунку 18(Е), Gen095 (20mг/мл). Використовувані тут терміни "анти-альфа-vДані було нормалізовано до відсотка від контролю бета-3, альфа-v-бета-5 подвійні інтегринові анти(без антитіл), який розглядався як 100%, і кожна тіла", "анти-подвійні інтегринові антитіла", "частина точка є середньою трьох транслункових фільтрів анти-подвійного інтегринового антитіла" або "фра(+/- SD). гмент анти-подвійного інтегринового антитіла" Рисунки 19А-Е. Міграція клітин A375S.2 у ната/або "варіант анти-подвійного інтегринового анпрямку до 10% FBS. Аналіз міграції дозволялося титіла" то що включають будь-який протеїн- або проводити протягом 4год, а дані отримувалися пептид-вміщуючу молекулу, що складається притак, як це описано в Методах. Антитіла використонаймні з частини імунноглобулінової молекули, вувалися в концентраціях 10mг/мл. Рисунок 19(А) є таких як, але не тільки, принаймні один допоміжграфічним відображенням клітинної міграції за ний визначальний регіон (CDR) важкого або легкоприсутності різноманітних концентрацій Gen095. го ланцюга або їх лагнд-зв'язуючу частину, варіаРисунок 19(В) є графічним відображенням клітинбельний регіон важкого ланцюга або легкого ної міграції за присутності LM609, P1F6, комбінації ланцюга, постійний регіон важкого ланцюга або LM609+P1F6, контрольних антитіл мічених ізотолегкого ланцюга, каркасний регіон або будь-яку їх пом (людських і мишиних). Дані було нормалізовачастину, або принаймні одну частин у подвійного но до відсотку від контролю, який розглядається як інтегринового рецептора або зв'язуючого протеїна, 100%, і кожна точка даних є середньою трьох які можуть бути включені в антитіло даного винатранслункових фільтрів (+/- SD). Фотомікрографії є ходу. Такі антитіла можуть також інколи впливати репрезентативними полями (об'єктив лінзи 10х) на специфічні ліганди, такі які, але не тільки, антиклітинної міграції на рисунку 19(С), відсутність антіла модулюють, зменшують, збільшують, антаготитіл, рисунку 19(D), GenO95 (5mг/мл), і рисунку нізують, агонізують, послаблюють, блокують, при19(Е), GenO95 (20mг/мл). гнічують та/або взаємодіють принаймні з однією Рисунки 20А-Е. Міграція HUVECS у напрямку дією чи зв'язуванням подвійного інтегрина або з до вібронектина за присутності bFGF. Нижня часдією чи зв'язуванням рецептора подвійного інтегтина фільтрів міграційної камери була покрита рина, in vitro, in situ та/або in vivo. В якості одного з 2mг/мл вібронектина, а аналіз виконувався так, як прикладів, відповідне анти-подвійне інтегринове це описано в Методах. Клітинам дозволялося мігантитіло, певна частина або варіант даного винарувати протягом 6год. ходу можуть зв'язувати принаймні один подвійний На рисунках 20А-Е кожна точка даних є середінтегрин або його певну частину, варіант або донім 3 транслункових фільтрів (+/- SD). Рисунок мен. Відповідне анти-подвійне інтегринове антиті20(А), bFGF; рисунок 20(В), Gen095 (5mг/мл); рисуло, певна частина або варіант можуть також доданок 20(С), Gen095 (40mг/мл); рисунок 20 (D), без тково впливати принаймні на одну дію або bFGF. Рисунок 20 (Е), пригнічення клітинної міграфункцію подвійного інтегрина, такі як, але не тільції за присутності різноманітних антитіл показана ки, синтез РНК, ДНК або протеїнів, вивільнення графічно. подвійного інтегрина, передача інформації рецепРисунки 21A-D. Інвазія клітин A375S.2 через тором подвійного інтегрина, розщеплення мемфібриновий гель (5мг/мл). Аналіз інвазії дозволябранного подвійного інтегрина, дія подвійного інтелося виконувати протягом 24год і дані отирмувагрина, проудкція та/або синтез подвійного лися так, як це було описано в Методах. Фотомікінтегрина. Термін "антитіло" вживається щодо анрографії репрезентативних полів (об'єктив лінзи титіл, їх фрагментів травлення, певних частин та 4х) клітинної інвазії на рисунку 21 (А) за відсутності варіантів, включаючи міметики антитіл або склаантитіл, рисунок 21 (В) GenO95 (10 цг/мл), рисунки дові частини антитіл, що нагадують структуру 21(С) і (D) є графічним відображенням клітинної та/або функцію антитіла або його певного фрагмеінвазі за присутності Gen095, 10E5 F(ab')2, LM609, нта чи частини, включаючи одно-ланцюгові антиті 13 83988 14 ла та їх фрагменти. Функціональні фрагменти важно людськими або гуманізованими антитілами, включають антиген-зв'язуючі фрагменти, що зв'ящо мають зв'язуючі характеристики для принаймні зують подвійний інтегрин ссавців. Наприклад, фрадвох різних антигенів. В даному випадку, одна зі гменти антитіл, що спроможні зв'язуватись з позв'язувальних особливостей стосується принаймні двійним інтегрином або його частиною, одного протеїна подвійного інтегрина, а інша включаючи, але не тільки, Fab’ (напр., при папаїбудь-якого іншого антигена. Методи виробництва новому травленні), Fab' (напр., при пепсиновому біспецифічних антитіл відомі науці. Традиційно, травленні та частковій редукції) і F(ab')2 (напр., при рекомбінантна продукція біспецифічних антитіл пепсиновому травленні), facb (напр., при плазмігрунтувалася на ко-експресії двох імунноглобуліновому травленні), pFc' (напр., при пепсиновому нових важколанцюгових-легколанцюгових пар, де або плазміновому травленні), Fd (напр., при пепдва важкі ланцюги мають різні особливості синовому травленні, частковій редукції та реагре[Milstein and Cuello, Nature 305:537 (1983)]. Через гації), Fv або scFv (напр., методики молекулярної випадковий розподіл імунноглобулінових важких і біології) фрагменти, описуються винаходом (див. легких ланцюгів, ці гібирдоми (квадроми) продукунапр., Colligan, Immunology, ви ще). вали потенційну суміш 10 різних молекул антитіл, Такі фрагменти можуть бути вироблені при енсеред яких тільки одна мала правильну біспецифізиматичному розщепленні або за допомогою речну структур у. Очи щення правильної молекули, комбінантних методик, що відомі науці та/або опияке зазвичай проводиться за допомогою хроматосуються тут. Антитіла також можуть бути графічних етапів афіності, є досить складним, і вироблені в різноманітних обмежених формах, з рівень виходу продукту низький. Такі процедури використанням генів антитіл, у котрих один або описані, напр., в WO 93/08829, Патенти США більше зупиняючих кодонів були вставлені до при№№6210668, 6193967, 6106833, 6060285, роднього зупиняючого локуса. Наприклад, комбі6037453, 6010902, 5989530, 5959084, 5959083, нація гена кодуючого частину важкого ланцюга 5932448, 5833985, 5821333, 5807706, 5643759, F(ab')2 може бути розроблена з включенням ДНК 5601819, 5582996, 5496549, 4676980, WO послідовності, що кодує домен СН 1 та/або поворо91/00360, WO 92/00373, ЕР 03089, Traunecker et тний регіон важкого ланцюга. Різноманітні частини al., EMBO J. 10:3655 (1991), Suresh et al., Methods антитіл можуть сполучатися хімічно за допомогою in Enzymology 121:210 (1986), кожний з них тут традиційних методик або можуть готува тися в якоповністю включено у посиланнях. сті прилеглого протеїна з використанням методик Анти-подвійні інтегринові антитіла (також нагенетичної інженерії. зиваються подвійними інтегриновими антитілами) Термін "людське антитіло", що використовувикористані в методиках та складах даного винається тут, відноситься до антитіла, в якому в значходу можуть також додатково характеризуватися ному ступені кожна частина протеїна (напр., CDR, високою афіністю зв'язування з подвійним інтегрикаркасний, CL, CH домени (напр., СH1, СH2, СН3), ном та додатково чи переважно мати низьку токповорот (VL, VH)) є переважно неімунногенними у сичність. Зокрема, антитіло, певний фрагмент або людей, з тільки незначними змінами або варіаціяваріант винаходу, де індивідуальні компоненти, ми послідовності. Так само, антитіла визначені як такі як варіабельний регіон, постійний регіон та такі, що отримані від приматів (мавпи, бабуїни, каркас, індивідуально та/або у поєднанні, додаткошимпанзе тощо), гризунів (миші, щури, кролі, гвіво та переважно мають низьку імунногеність, винейські свинки, хом'ячки тощо) та від інших ссавців користовуються в даному винаході. Антитіла, що означають антитіла, що специфічні для таких виможуть бути використані у винаході додатково дів, підвидів, підродин, родин. Далі, химеричні анхарактеризуються їхньою здатністю виліковувати титіла включають будь-яку комбінацію вищеописапацієнтів на тривалий період з вимірюваним поленого. Такі зміни або варіації додатково і переважно гшенням симптоматики і низькою та/або прийнятзберігають або зменшують імунногенність щодо ною токсичністю. Низька або прийнятна імунногенемодифікованих антитіл у людей або інших видів. ність та/або висока афіність, а також інші Отже, людські антитіла відрізняються від химеривідповідні властивості, можуть робити свій внесок чних або гуманізованих антитіл. Наголошується, у досягнення терапевтичного результату. "Низька що людські антитіла можуть продукуватися твариімунногеність" тут визначається як зростаючі донами або прокаріотичними чи еукаріотичними клістовірні НАНА, НАС А або Н АМА відповіді у менш, тинами, що спроможні експресувати функціональніж 75%, або бажано менше, ніж 50% пацієнтів, що но змінений ген людського імунноглобулін (напр., лікуються, та/або зростаючі низькі титри у ліковаважкий ланцюг та/або легкий ланцюг). Далі, коли них пацієнтів (менше, ніж приблизно 300, бажано людське антитіло є одно-ланцюговим антитілом, менше, ніж приблизно 100, що вимірюється за воно може включати зв'язуючий пептид, що не допомогою імуноферментного аналізу на подвійвиявляється у нативних людських антитілах. Наний антиген) [Elliott et al, Lancet 344:1125-I127 приклад, Fv може включати зв'язуючий пептид, (1994), цілком включено тут у посиланні]. такий як від 2 до приблизно 8 гліцинових або інших Ізольовані нуклеїнові кислоти даного винаходу амінокислотних залишків, який з'єднує варіабельможуть використовуватися для виробництва приний регіон важкого ланцюга і варіабельний регіон наймні одного анти-подвійного інтегринового антилегкого ланцюга. Такий зв'язуючий пептид вважатіла або його певних варіантів, які можуть викориється людського походження. стовуватися для вимірювання або впливу у Біспецифічні, гетероспецифічні, гетерокон'юклітинах, тканинах, органах або тваринах (вклюгантні або однакові антитіла також можуть викоричаючи ссавців і людей) для діагностики, моніторустовуватися, якщо вони є моноклональними, первання, модулювання, лікування, полегшення, для 15 83988 16 допомоги у попередженні виникнення або зменчастина (включаючи синтетичні молекули, такі як шення симптоматики стану, залежного від присинтетичні пептиди). Інші специфічні або загальні наймні одного подвійного інтегрина, обраного з, антитіла ссавців також можуть реагувати. Підготоале не тільки, принаймні одного імунного порувка імунногених антигенів та виробництво монокшення або захворювання, серцево-судинного розлональних антитіл може бути проведена з викориладу або захворювання, інфекційного, злоякісного станням будь-яких належних методик. та/або неврологічного розладу або захворювання, В одному підході гібридома виробляється за або інших відомих чи специфічних станів, залеждопомогою поєднання відповідної лінії безсмертних від подвійного інтегрина. них клітин (напр., лінія мієломних клітин таких як, Такий метод може включати введення ефекале не тільки, Sp2/0, Sp2/0-AG14, NSO, NS1, NS2, тивної кількості складу або фармацевтичного AE-1, L.5, >243, P3 X63Ag8.653, Sp2 SA3, Sp2 MAI, складу, що включає принаймні одне анти-подвійне Sp2 SSI, Sp2 SA5, U937, MLA 144, ACT IV, MOLT4, інтегринове антитіло, в клітину, тканину, орган, DA-1, JURKAT, WEHI, K-562, COS, RAJI, NIH 3T3, тварину або пацієнта для потреб модуляції, лікуHL-60, MLA 144, NAMAIWA, NEURO 2A тощо, або вання, полегшення, профілактики або зменшення гетеромієломи, їхні продукти поєднання, або будьсимптоматики, впливів чи механізмів. Ефективна які клітини або поєднальні клітини, що від них покількість може включати приблизно від 0,001 до ходять, або будь-які відповідні клітинні лінії, що 500мг/кг на шприць (напр., болюс), багаторазове відомі науці. Див., напр., www.atcc.org, або постійне введення чи досягнення сивороткової www.lifetech.com тощо, з клітинами, що продукують антитіла, такі як, але не тільки, ізольовані або концентрації 0,01-5000mг/мл на шприць, багатораклоновані клітини селезінки, клітини периферичної зове або постійне введення, або будь-яке ефектикрові, лімфи, мигдаликів або інші клітини, що місвний діапазон чи значення, як це зроблено і описано з використанням відомих методів, як це тять імунні чи B-клітини, або інші клітини, що експресують важкий або легкий ланцюг постійної або описано тут або відомо з відповідних джерел. варіабельної або каркасної або CDR послідовносВсі публікації або патенти, що цитуються тут, ті, або такі як ендогенні чи гетерогенні нуклеїнові повністю включені тут у посилання наскільки вони кислоти, або такі як рекомбінантні чи ендогенні, відображають стан проблеми на час представлення винаходу та/або надають опис та уможливлювірусні, бактеріальні, водоростеві, прокаріотичні, амфібіальні, комашині, рептилієві, рибні, отримані ють даний винахід. Публікації стосуються будьвід ссавців, гризунів, кінські, овечі, козлині, бараяких наукових або патентних публікацій або будьнячі, приматові, еукаріотичні, геномні ДНК, цДНК, якої іншої доступної інформації у будь-якому мерДНК, мітохондріальні ДНК або РНК, хлоропластдіа-форматі, включаючи всі записані, електронні чи друковані формати. Наступні посилання є цілна ДНК або РНК, hnPHK, мРНК, тРНК, одинарного, подвійного або потрійного скручення, гібридизоваком включеними тут у посиланнях: Ausubel, et al., ні тощо або будь-яка їхня комбінація. Див., напр., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Ausubel, вище, та Colligan, Immunology, вище, розWiley & Sons, Inc., NY, NY (1987-2001); Sambrook, діл 2, повінстю включено тут у посиланнях. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, NY (1989); Harlow and Клітини, що продукують антитіла, можуть також бути отримані з периферичної крові або, баLane, antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring жано, з селезінки чи лімфатичних вузлів, людей Harbor, NY (1989); Colligan, et al., eds., Current або інших відповідних тварин, що були імуннізоваProtocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., ні зацікавленими антигенами. Будь-які інші відпоNY (1994-2001); Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N Y, (1997відні клітини господаря також можуть використовуватися для експресії гетерологічних або 2001). ендогенних нуклеїнових кислот, що кожують антиПринаймні одне анти-подвійне інтегринове антіла, певні їхні фрагменти або частини даного вититіло даного винаходу може бути додатково винаходу. Зливні клітини (гібирдоми) або рекомбінароблене за допомогою клітинної лінії, змішанної клітинної лінії, безмертних клітин або клональної нтні клітини можуть бути ізольованими з використанням певних станів культури або інших популяції безсмертних клітин, як це відомо науці. відповідних відомих методів та клонуватися при Див., напр., Ausubel, et al., ed., Current Protocols in обмеженому розведенні або сортуванні клітин, або Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY іншими відомими методами. Клітини, які продуку(1987-2001); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, ють антитіла с бажаною специфічністю можуть бути відібрані при відповідному аналізі (напр., NY (1989); Harlow and Lane, antibodies, a ELISA). Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989); Можуть використовуватися інші відповідні меColligan, et al., eds., Current Protocols in тоди продукування або ізоляції антитіл необхідної Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (19942001); Colligan et al., Current Protocols in Protein специфічності, включаючи, але не обмежуючись, методами, що відбирають рекомбінантні антитіла з Science, John Wiley & Sons, NY, N Y, (1997-2001), пептидної або протеїнової бібліотеки (напр., але кожне джерело повністю вказується тут у посине обмежуючись, бактеріофаги, рибосоми, оліголаннях. нуклеотиди, РНК, цДНК тощо, подані бібліотеки; Людські антитіла, що є специфічними для людських подвійних інтегринових протеїнів або напр., доступні у Cambridge antibody Technologies, Cambridgeshire, UK; MorphoSys, їхні х фрагментів, можуть реагувати з певними імуMartinsreid/Planegg, DE; Biovation, Aberdeen, нногеними антигенами, такими як ізольований Scotland, UK; Biolnvent, Lund, Sweden; Dyax Corp., та/або подвійний інтегриновий протеїн або його 17 83988 18 Enzon, Affymax/Biosite; Xoma, Berkeley, CA; Ixsys. www.library.thinkquest.org/12429/Immune/Antibody.h Див., напр., ЕР 368,684, PCT/GB91/01134; tml; PCT/GB92/01755; PCT/GB92/002240; www.hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab; PCT/GB92/00883; PCT/GB93/00605; US www.path.cam.ac.uk/~mrc7/mikeimages.html; 08/350260(5/12/94); PCT/GB94/01422; www.antibodyresourse.com/; PCT/GB94/02662; PCT/GB97/01835; (CAT/MRC); mcb.harvard.edu/BioLinks/Immunology.html; WO90/14443; WO90/14424; WO90/14430; www.immunologylink.com/; PCT/US94/1234; WO92/18619; WO96/07754; pathbox.wustl.edu/~hcenter/index.html; (Scripps); EP 614 989 (MorphoSys); WO95/16027 www.biotech.ufl.edu/~hcl/; (Biolnvent); WO88/06630; WO90/3809 (Dyax); US www.pebio.com/pa/340913/340913.html; 4,704,692 (Enzon); PCT/US91/02989 (Affymax); www.nal.usda.gov/awic/pubs/antibody/; WO89/06283; EP 371 998; EP 550 400; (Xoma); EP www.m.ehime-u.ac.jp/~yasuhito/Elisa.html; 229 046; PCT/US91/07149 (Ixsys); або сто хастично www.biodesign.com/table.asp; згенеровані пептиди чи протеїни - US 5723323, www.icnet.uk/axp/facs/davies/links.html; www. 5763192, 5814476, 5817483, 584514, 5976862, WO biotech.ufl.edu/~fccl/protocol.html; www.isac86/05803, ЕР 590 689 (Ixsys, тепер Applied net.org/sites geo.html; aximtl.imt.uniMolecular Evolution (ΑΜΕ), кожний повністю вклюmarburg.de/~rek/AEPStart.html; чений тут в якості посилання) або, що залежать baserv.uci.kun.nl/~jraats/linksl.html; від імуннізації трансгенних тварин (напр., миші www.recab.uni-hd.de/immuno.bme.nwu.edu/; SCID, Nguyen et al., Microbiol. Immunol. 41:901-907 www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/public/INTRO.html; (1997); Sandhu et al., Crit. Rev. Biotechnol. 16:95www.ibt.unam.mx/vir/V mice.html; 118 (1996); Eren et al., Immunol. 93:154-161 (1998), imgt.cnusc.fr: 8104/; кожна повністю включена тут у посиланнях, а таwww.biochem.ucl.ac.uk/~martin/abs/index.html; кож у відповідних патентах і застосуваннях), що antibody.bath.ac.uk/; abспроможні продукувати асортимент людських анgen.cvm.tamu.edu/lab/wwwabgen.html; титіл, як це відомо науці та/або описано тут. Такі www.unizh.ch/~honegger/AHOseminar/Slide01.html: методики включають, але не обмежуються, виявwww.cryst.bbk.ac.uk/~ubcg07s/; лення рибосом [Hanes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. www.nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg.htm: USA, 94:4937-4942 (May 1997); Hanes et al., Proc. www.path.cam.ac.uk/~mrc7/humanisation/TAHH Natl. Acad. Sei. USA, 95:14130-14135 (Nov. 1998)]; P.html; методики однієї клітини, що продукує антитіла (наwww.ibt.unam.mx/vir/structure/stat aim.html; пр., метод антитіл відібраних лімфоцитів ("SLAM") www.biosci.missouri.edu/smithgp/index.html; [патент США №5,627,052, Wen et al., J. Immunol. www.cryst.bioc.cam.ac.uk/~frnolina/Web17:887-892 (1987); Babcook et al., Proc. Natl. Acad. pages/Pept/spottech.html; Sei. USA 93:7843-7848 (1996)]; гелева мікрокрапwww.ierini.de/fr products.htm; линна і потокова цитометрія [Powell et al., www.patents.ibm.conyibm.html.Kabat et al., SeBiotechnol. 8:333-337 (1990); One Cell Systems, quences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Cambridge, MA; Gra y et al., J. Imm. Meth. 182:155Dept. Health (1983), все повністю включено тут у 163 (1995); Kenny et al., Bio/Technol. 13:787-790 посиланнях. (1995)]; вибір В-клітин [Steenbakkers et al., Molec. Такі імпортовані послідовності можуть викориBiol. Reports 19:125-I34 (1994); Jonak et al., стовуватися для зменшення імунногеності або Progress Biotech, Vol. 5, In Vitro Immunization in зменшення, покращення чи модифікування зв'язуHybridoma Technology, Borrebaeck, ed., Elsevier вання, афіності, швидкості зв'язування, швидкості Science Publishers B.V., Amsterdam, Netherlands звільнення, специфічності, часу напівжиття або (1988)]. будь-яких інших відповідних характеристик, що Методи інженирингу та гуманізації нелюдських відомі науці. Загалом частина або всі нелюдські чи та людських антитіл також можуть використовувалюдські CDR послідовності зберігаються, тоді як тися і вони є добре відомими науці. Загалом, гунелюдські послідовності варіабельних та постійних манізовані або модифіковані антитіла мають один регіонів заміняються людськими або іншими аміабо більше амінокислотний залишок, що походить нокислотами. Антитіла також можуть бути додатз джерела, яке є нелюдським, напр., але не обмеково гуманізовані зі збереженням високой афіності жуючись, від мишей, щурів, кролів, приматів або до антигенів та інших сприятливих біологічних інших ссавців. Ці людські амінокислотні залишки властивостей. Для досягнення цієї мети, гуманізочасто називаються як "імпортовані" залишки, які вані антитіла можуть додатково приготовлені за зазвичай отримуються з "імпортованих" варіабедопомогою процесу аналізу батьківської послідовльних, постійних або інших доменів відомої людсьності та різноманітних концептуальних гуманізовакої послідовності. Відомі послідовності Ig людини них продуктів з використанням тривимірних модеописано, напр., лей батьківських та гуманізованих послідовностей. www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/quety.fcgi; Тривимірні імунноглобулінові моделі є широкодоwww.atcc.org/phage/hdb.html, www.sciquest.com/; ступними і добре знайомі тим, хто володіє цією www.abcam.com/; проблемою. Доступні комп'ютерні програми, які www.antibodyresource.com/onlinecomp.html; ілюструють і демонструють можливі тривимірні www.public.iastate.edu/~pedro/research_tools.html; конформаційні структури обраних можливих імуноwww.mgen.uni-heidelberg.de/SD/IT/IT.html; глобулінових послідовностей. Вивчення цих зоwww.whfreeman.com/immunology/CH05/kuby05.htm; бражень дозволяє аналізувати ймовірну роль залишків у функціонуванні можливих 19 83988 20 імуноглобулінових послідовностей, тобто, провований або який може проходити функціональне дити аналіз залишків, що впливають на здатність переналаштування. Ендогенні імунноглобулінові можливих імуноглобулінів зв'язуватися з їхніми локуси у таких мишей можуть бути порушені або антигенами. За такого методу, можуть бути відівидалені для того, щоб прибрати здатність тварин брані FR залишки і скомбіновані з узгодженими та продукувати антитіла, що кодуються ендогенними імпортованими послідовностями, таким чином, генами. щоб досягти бажаних характеристик антитіла, таСкринінг антитіл для специфічного зв'язування ких як підвищена афіність до цільового антигез однаковими протеїнами або фрагментами мона(ів). Загалом, CDR залишки є безпосередньої жуть бути переконливо виконаним з використаннайбільш істотньо залученими до впливу на антиням бібліотек зображень пептидів. Цей метод генне зв'язування. Гуманізація або інжинеринг анвключає перегляд великих колекцій пептидів з титіл даного винаходу може бути виконана з викометою виявлення тих, що мають бажану функцію ристанням будь-якого відомого методу, таких як, або структур у. Скринінг антитіл в бібліотеках зоале не тільки, що описані у Winter (Jones et al, бражень пептидів добре відомий науці. Зображені Nature 321:522 (1986); Riechmann et al., Nature пептидін послідовності можуть бути завдовжки від 332:323 (1988); Verhoyen et al., Science 239:1534 3 до 5000 або більше амінокислот, часто завдовж(1988))? Sims et al., J. Immunol. 151: 2296 (1993); ки 5-100 амінокислот, і досить часто від приблизно Chotnia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 (1987), Carter 8 до 25 амінокислот завдовжки. До того ж було et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 89:4285 (1992); описано методи безпосереднього хімічного синтеPresta et al., J.Immunol. 151:2623 (1993), патент зу для створення бібліотек пептидів, декілька меСША М»: 5723323, 5976862, 5824514, 5817483, тодів рекомбінантної ДНК. Один з них включає 5814476, 5763192, 5723323, 5,766886, 5714352, зображеня пептидної послідовності на поверхні 6204023, 6180370, 5693762, 5530101, 5585089, бактеріофага або клітини. Кожний бактеріофаг або 5225539, 4816567, PCT/; US98/16280, US96/18978, клітина містять нуклеотидну послідовність, що US91/09630, US91/05939, US94/01234, кодує окрему зображену пептидну послідовність. GB89/01334, GB91/01134, GB92/01755; Такі методи описані в патентних публікаціях РСТ WO90/14443, WO90/14424, WO90/14430, ЕР №№91/17271, 91/18980, 91/19818 та 93/08278. Інші 229246, всі включені тут у посиланнях, включаючи системи для генерації бібліотек пептидів мають цитовані там посилання. властивості як хімічного синтезу, так і рекомбінанАнти-подвійне інтегринове антитіло також мотних методик. Див., патентні публікації РСТ №№ же бути згенеровано за допомогою імунізації 92/05258, 92/14843 та 96/19256. Див. також, патентрансгенних тварин (напр., мишей, щурів, хом'ячти США №№ 5,658,754; та 5,643,768. Бібліотеки ків, нелюдських приматів тощо) спроможних пропептидних зображень, вектори та скринінгові надукувати набір людських антитіл, як це описано бори є комерційно доступними від таких постачатут та/або відомо науці. Клітини, що продукують льників, як Invitrogen (Carlsbad, СА) та Cambridge людські анти-подвійні інтегринові атитіла можуть antibody Technologies (Cambridgeshire, UK). Див., бути ізольовані з таких тварин і приведені до стану напр., патента США №№ 4704692, 4939666, безсмерття з використанням відповідних методів, 4946778, 5260203, 5455030, 5518889, 5534621, такі як описані тут методи. 5656730, 5763733, 5767260, 5856456, що належать Трансгенні миші, що можуть виробляти набір Enzon; 5223409, 5403484, 5571698, 5837500, що людських антитіл, які зв'язуються з людськими належать Dyax, 5427908, 5580717, що належать антигенами, можуть продукуватися за допомогою Affymax; 5885793, що належать Cambridge відомих методів [напр, але не обмежуючись, патеantibody Technologies; 5750373, що належать нти США №№ 5,770,428, 5,569,825, 5,545,806, Genentech, 5618920, 5595898, 5576195, 5698435, 5,625,126, 5,625,825, 5,633,425, 5,661,016 та 5693493, 5698417, що належать Xoma, Colligan, 5,789,650 опубліковані Lonberg et al; Jakobovits et вище; Ausubel, вище; або Sambrook, вище, кожен з al. WO 98/50433, Jakobovits et al. WO 98/24893, патентів та публікацій повністю включені тут у поLonberg et al. WO 98/24884, Lonberg et al. WO силаннях. 97/13852, Lonberg et al. WO 94/25585, Kucherlapate Антитіла даного винаходу можуть також бути et al. WO 96/34096, Kucherlapate et al. EP 0463 151 виготовлені з використанням нуклеїнових кислот, Bl, Kucherlapate et al. EP 0710 719 AI, Surani et al. що кодують принаймні одне анти-подвійне антитіПатент США № 5,545,807, Bruggemann et al. EP ло, у трансгенних тварин або ссавців, таких як ко0438 474 Bl, Lonberg et al. EP 0814 259 A2, Lonberg зи, корови, коні, вівці тощо, що продукують такі et al. GB 2 272 440 A, Lonberg et al. Nature 368:856антитіла в їхньому молоці. Такі тварини можуть 859 (1994), Taylor et al, Immunol. 6(4)579-591 бути отримані з використанням відомих методик. (1994), Green et al, Nature Genetics 7:13-21 (1994), Див., напр., але не обмежуючись, патенти США Mendez et al, Nature Genetics 15:146-156 (1997), №№ 5,827,690; 5,849,992; 4,873,316; 5,849,992; Taylor et al, Nucleinic Acids Research 20(23):62875,994,616; 5,565,362; 5,304,489 тощо, кожний з 6295 (1992), Tuaillon et al, Proc Natl Acad Sei USA котрих повність включений тут у посиланнях. 90(8)3720-3724 (1993), Lonberg et al, Int Rev Антитіла даного винаходу можуть бути додатImmunol 13(l):65-93 (1995) та Fishwald et al, Nat ково вироблені з використанням нуклеїнових кисBiotechnol 14(7):845-851 (1996), кожен з яких полот, що кодують принаймні одне анти-подвійне вністю включений тут у посиланнях). Загалом, ці інтегринове антитіло, у трансгенних рослинах та миші мають принаймні один трансген, що містить культурованих клітинах рослин (напр., але не обДНК від принаймні одного людського імунноглобумежуючись, тютюн і кукурудза), що продукують лінового локуса, що функціонально переналаштотакі антитіла, певні частини або варіанти в части 21 83988 22 нах рослин або їхніх культурованих клітинах. В 70-100% прилеглими амінокислотами принаймні якості одного з прикладів, листки трансгенного одного з SEQ ID NOS:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, певних тютюна виробляють рекомбінантні протеїни успішфрагментів, варіантів або їхніх консенсусних поно використовувалися для отримання великих слідовностей або депозитних векторів, що містять кількостей рекомбінантних протеїнів, напр., при принаймні одну з цих послідовностей, молекула використанні індукованих промотерів. Див., напр., нуклеїнової кислоти даного винаходу, що кодує Cramer et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 240:95принаймні одне анти-подвійне інтегринове антиті118 (1999) і цитовані там посилання. Також, трансло, може бути отримана при використанні описагенна кукурудза використовувалася для виробних тут методик або так, як це відомо науці. лення протеїнів ссавців в комерційних кількостях Молекули нуклеїнових кислот даного винаходу продукції, з біологічними діями, що еквівалентні можуть бути у формі РНК, такій як мРНК, hnPHK, тим, що продукуються в інших рекомбінантних тРНК або у будь-якій іншій формі, або у формі системах або очищені з природніх джерел. Див., ДНК, включаючи, але не обмежуючись, цДНК та напр., Hood et al., Ad v. Exp. Med. Biol. 464:127-147 геномну ДНК, що отримані клонуванням або виро(1999) та цитовані там посилання. Антитіла також блені синтетично, або будь-які їхні комбінації. ДНК виготовлялися у великих кількостях з насіння може бути три-ниткова, подвійно-ниткова або одтрансгенних рослин, включаючи фрагменти антино-ниткова або будь-які їхні комбінації. Будь-яка тіл, такі як одноланцюгові антитіла (scFv's), включастина принаймні однієї нитки ДНК або РНК може чаючи насіння тютюна та клубні картоплі. Отже, бути кодуючою ниткою, що також відома як чутлиантитіла даного винаходу можуть також продукува нитка, або може бути некодуючою ниткою, що ватися з використанням трансгенних рослин, згідтакож називається античутливою ниткою. но з відомими методиками. Див. також, напр., Ізольовані нуклеїновокислотні молекули даноFischer et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 30:99-108 го винаходу можуть включати нуклеїновокислотні (Oct., 1999), Ma et al., Trends Biotechnol. 13:522-7 молекули, що складаються з каркасу відкритого (1995); Ma et al., Plant Physiol. 109:341-6 (1995); читання (ORF), додатково з одним або більше інтWhitelam et al., Biochem. Soc. Trans. 22:940-944 роном, напр., але не обмежуючись, принаймні з (1994); і цитовані тут поєднання. Див., також загаоднією певною частиною CDR, в якості CDR1, лом експресію антитіл рослинами, але не тільки. CDR2 та/або CDR3 принаймні одного важкого лаКожне з вищенаведених посилань повністю вклюнцюга (напр., SEQ ID NOS:l-3) або легкого ланцюга чене тут у посиланнях. (напр., SEQ ID NOS:4-6); нуклеїновокислотні молеАнтитіла винаходу можуть зв'язувати людськули, що містять кодуючу послідовність для антикий подвійний інтегрин з широким спектром афіноподвійного інтегринового антитіла або варіабельсті (КD). При бажаному поєднанні принаймні одне ного регіона (напр., SEQ ID NOS:7,8); і нуклеїноволюдське Мат даного винаходу може додатково кислотні молекули, які містять нуклеотидну послізв'язувати людський подвійний інтегрин з високою довність, що істотно відрізняється від тих, що афіністю. Наприклад, людське Мат може зв'язуваописані вище, але які, внаслідок дегенерації генети людський подвійний інтегрин з КD, що дорівнює тичного коду, все ще кодують принаймні одне анабо менше, ніж приблизно 10-7 М, таким як, але не ти-подвійне інтегринове антитіло, як це описано тільки, 0,1-9,9 (або будь-який спектр чи значення тут та/або відомо науці. Звісно, генетичний код є там) x10-7, 10-8, 10-9, 10-10, 10-11, 10-12, 10-13, або з добревідомим науці. Отже, для того, хто має добудь-яким спектром або значенням. статні знання в даній ділянці, буде рутинним отриАфіність антитіла або спорідненість антитіла мати такі дегенеративні нуклеїновокислотні варіадо антигену може бути визначена експериментанти, що кодують специфічні анти-подвійні льно з використанням будь-якого відповідного меінтегринові антитіла даного винаходу. Див., напр., тоду. (Див., наприклад, Berzofsky, et al, "AntibodyAusubel, et al., вище, і такі нуклеїновокислотні ваAntigen Interactions", в Fundamental Immunology, ріанти включені в даний винахід. Один з прикладів Paul, W. E., Ed., Raven Press: New York, NY (1984); ізольованих нуклеїновокислотних молекул даного Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and винаходу включає SEQ ID NOS:10, 11, 12, 13, 14, Company: New York, N Y (1992); та методи описані 15, що відповідають деяким прикладам нуклеїнотут). Вимірювана афіність окремої взаємодії антивокислотного кодування, відповідно, НС CDR1, НС тіло-антиген може змінюватися, якщо вимірювання CDR2, НС CDR3, LC CDR1, LC CDR2, LC СDR3, проводиться в різних умовах (напр., концентрація варіабельний регіон НС та варіабельний регіон солі, pH). Отже, вимірювання афіності та інших LC. антиген-зв'язуючих параметрів (напр., КD, Ка, Kd) В іншому аспекті, винахід описує ізольовані переважно виконується стандартизованим розвенуклеїновокислотні молекули, що кодують антиденнями антитіла та антигена і стандартизованим подвійне інтегринове антитіло, і які мають амінокибуфером, таким як описаний тут буфер. слотну послідовність, що кодується нуклеїновою При використанні наданої тут інформації, такої кислотою, яка міститься в плазмідах, що відкладеяк кодуюча послідовність нуклеотидів з принаймні ні в якості визначених назв клонів 23 83988 Як тут вказується, нуклеїнові кислотні молекули даного винаходу, які містять нуклеїновокислотне кодування анти-подвійного інтегринового антитіла, можуть включати, але не обмежуватись, ті, що самі по собі кодують амінокислотну послідовність фрагменту антитіла; кодуючу послідовність для всього антитіла або його частини; кодуючу послідовність для антитіла, фрагмента або частини, а також додаткові послідовності, такі як кодуюча послідовність принаймні одного сигнального лідера або зливного пептида, з або без вищезгаданих додаткових кодуючих послідовностей, таких як принаймні один інтрон, разом з додатковими, некодуючими послідовностями, включаючи, але не обмежуючись, некодуючі 5' та 3' послідовності, такі як транскрибовані, нерозширофані послідовності, що відіграють роль у транскрипції, обробці мРНК, включаючи сигнали склеювання та поліаденіляції (наприклад - рибосомне зв'язування та стабілізація мРНК); додаткова кодуюча послідовність, що кодує додаткові амінокислоти, такі як ті, що забезпечують додаткові властивості. Отже, послідовність кодуюча антитіло може бути поєднана з маркером послідовності, таким як послідовність кодуюча пептид, що покращує очи щення зливного антитіла, яка містить фрагмент або частину антитіла. Полінуклеотиди, що селективно гібридизовані до полінуклеотида як це описано тут Даний винахід описує ізольовані нуклеїнові кислоти, що гібридизовані за допомогою селективної гібридизації до полінуклеотидів, описаних тут. Отже, полінуклеотиди даного впровадження можуть бути використані для ізоляції, визначення та/або квантифікації нуклеїнових кислот, що містять такі полінуклеотиди. Наприклад, полінуклеотиди даного винаходу можуть бути використані для ідентифікації, ізолювання або посилення часткових чи повномасштабних клонів у депонованій бібліотеці. В деяких впровадженнях, полінуклеотиди є геномними або цДНК послідовностями ізольованими або якимось іншим чином допоміжними щодо цДНК з бібліотеки нуклеїнових кислот людей або ссавців. Бажано, щоб бібліотека цДНК містила принаймні 80% послідовностей повної довжини, краще принаймні 85% або 90% послідовностей повної довжини, і ще краще - 95% послідовностей повної довжини. Бібліотеки цДНК можуть бути нормалізовані для підвищення репрезентативності рідкісних випадків. Низька або помірна строгість умов гібридизації типово, але не ексклюзивно, застосовується з послідовностями, що мають знижену ідентичність послідовності відносно допоміжних послідовностей. Умови помірної або високої строгості можуть додатково застосовуватися для послідовностей більшої ідентичності. Умови низької строгості дозволяють селективно гібридизувати послідовності, що мають приблизно 70% ідентичності послідовності, і можуть застосовуватися для визначення ортологічних або паралогічних послідовностей. Додатково, полінуклеотиди даного винаходу кодуватимуть принаймні частину антитіла, що кодується полінуклеотидами, які описані тут. Поліну 24 клеотиди даного винаходу включають послідовності нуклеїнових кислот, що можуть застосовуватися для селективної гібридизації до полінуклеотидів кодуючих антитіло даного винаходу. Див., напр., Ausubel, вище; Colligan, вище, кожний повністю включений тут у посиланнях. Конструкція нуклеїнових кислот Ізольовані нуклеїнові кислоти даного винаходу можуть бути вироблені з використанням (а) рекомбінантних методів, (b) синтетичних методик, (с) методик очищення або їхньої комбінації, що добре відомі науці. Нуклеїнові кислоти можуть включати послідовності на додаток до полінуклеотида даного винаходу. Наприклад, мульти-клонуючий сайт, що містить один або більше ендонуклеазний обмежувальний сайт, може бути вставлений в нуклеїнову кислоту для допомоги в ізоляції полінуклеотида. Також, транслбовані послідовності можуть бути вставлені для допомоги в ізоляції трансльованого полінуклеотида даного винаходу. Наприклад, гекса-гістидинова маркерна послідовність надає зручний спосіб очищення протеїнів даного винаходу. Н уклеїнова кислота даного винаходу - за винятком кодуючої послідовності - додатково є вектором, адаптером або поєднувачем для клонування та/або експресії полінуклеотида даного винаходу. Додаткові послідовності можуть бути додані до таких послідовностей клонування та/або експресії для оптимізації їхньої функції в клонуванні та/або експресії, для допомоги в ізоляції полінуклеотида або для покращення введення полінуклеотида в клітину. Використання клонованих векторів, експресованих векторів та поєднувачів добре відомо науці. [Див., напр., Ausubel, вище; або Sambrook, вище] Рекомбінантні методики конструювання нуклеїнових кислот Склад ізольованих нуклеїнових кислот даного винаходу, таких як РНК, цДНК, геномна ДНК або будь-які їхні комбінації, можуть бути отримані з біологічних джерел з використанням будь-якої кількості методик клонування відомих тим, хто є фа хівцем в цій галузі. В деяких впровадженнях, олігонуклеотидні зразки, що селективно гібридизуються, за строгих умов, до полінуклеотидів даного винаходу використовуються для ідентифікації бажаної послідовності в цДНК та геномних бібліотеках, що добре відомо тим, хто є фа хівцем в цій галузі [Див., напр., Ausubel, вище; або Sambrook, вище] Методи скринінгу та ізоляції нуклеїнових кислот Бібліотеки цДНК або геномні бібліотеки можуть бути переглянуті з використанням зразків, що грунтуються на послідовності полінуклеотида даного винаходу, таких як описані тут. Зразки можуть використовува тися для гібридизації з послідовностями геномної ДНК або цДНК для ізоляції гомологічних генів в тому ж чи різних організмах. Ті, хто є фа хівцями в даній галузі, усвідомлюють, що в аналізах можуть застосовуватися різноманітні ступені жорсткості гібридизації. Якщо умови гібридизації стають більш жорсткими, то мусить бути бі 25 83988 26 льший ступінь доповнюваності між зразком та цілхімічним синтезом за допомогою відомих методів лю для виникнення дуплексного утворення. Сту[див., напр., Ausubel, et al., вище]. Хімічний синтез пінь жорсткості може контролюватися одним або загалом продукує одно-нитковий олігонуклеотид, декільками факторами температури, іонної сили, який може бути конвертований в дво-ниткову ДНК pH та наявності частково денатуруючого розчинза допомогою гібридизації з допоміжною послідовника, такого як формамід. Наприклад, жорсткість ністю або за допомогою полімеризації з ДНК полігібиридизації зручно змінювати змінюючи полярмеразою з використанням однієї нитки в якості ність розчину реактанта, наприклад, за допомогою шаблону. Ті, хто мають відповідну кваліфікацію в маніпулювання концентрацією формаміда у межах цій галузі, розуміють, що в той час як хімічний синвід 0% до 50%. Ступінь доповнюваності (ідентичтез ДНК може бути обмеженим до послідовностей ність послідовності), що потрібна для визначеного з приблизно 100 або більше основ, довші послідозв'язування, буде варіювати згідно з жорсткістю вності можуть бути отримані за допомогою зв'язугібридизаційних засобів та/або засобів відмивання. вання коротших послідовностей. Методи посилення РНК або ДНК добре відомі Касети рекомбінантної експресії в науці і можуть використовуватися згідно з даним Даний винахід у подальшому описує касети винаходом без неналежного експериментування, рекомбінантної експресії, що містять нуклеїнову грунтуючись на керівництвах, що представлені тут. кислоту даного винаходу. Послідовність нуклеїноВідомі методи посилення ДНК або РНК вклювої кислоти даного винаходу, наприклад цДНК або чають, але не обмежуються, полімеразну ланцюгеномна послідовність, що кодує антитіло даного гову реакцію (PCR) та відповідні процеси посиленвинаходу, може використовуватися для конструюня [див., напр., патент США №№ 4,683,195, вання касети рекомбінантної експресії, що може 4,683,202, 4,800,159, 4,965,188, що належать впроваджуватися безпосередньо в. принаймні Mullis et al; 4,795,699 та 4,921,794, що належать одну бажану клітину господаря. Касета рекомбінаTabor, et al; 5,142,033, що належить Innis; нтної експресії зазвичай містить полінуклеотид 5,122,464, що належить Wilson, et al.; 5,091,310, даного винаходу, що реально зв'язаний з трансщо належить Innis; 5,066,584, що належить крипційними ініціюючими регуляторними послідовGyllensten, et al; 4,889,818, що належить Gelfand, ностями, що спрямовують транскрипцію полінукet al; 4,994,370, що належить Silver, et al; леотида в заплановану клітину господаря. Обидва 4,766,067, що належить Biswas; 4,656,136, що нагетерологічні та негетерологічні (тобто, ендогенні) лежить Ringold] та РНК-медійоване посилення, що промотери можуть застосовуватися для безпосевикористовує анти-чутливу РНК для цільової поредньої експресії нуклеїнових кислот даного винаслідовності, в якості шаблона для синтеза подвійходу. но-ланцюгової ДНК [патент США № 5,130,238, що В деяких впровадженнях, ізольовані нуклеїнові належить Malek, et al, під торговою назвою кислоти, що слугують як промотери, покращувачі NASBA], повний зміст посилань яких включений або інші елементи можуть впроваджуватися у відтут у посиланнях [Див., напр., Ausubel, вище; або повідну позицію (вище, нижче або в інтрон) негеSambrook, вище]. терологічної форми полінуклеотида даного винаНаприклад, технологія полімеразної ланцюгоходу, для того щоб зменшувати або збільшува ти вої реакції (PCR) може використовуватися для експресію полінуклеотида даного винаходу. Напосилення послідовності полінуклеотидів даного приклад, ендогенні промотери можуть бути змінені винаходу та залежних генів безпосередньо з бібin vivo або in vitro за допомогою мутації, видалення ліотек геномної ДНК або цДНК. PCR та інші метота/або заміни. ди посилення in vitro також можуть бути корисниВектори та клітини господаря ми, наприклад, для клонування послідовностей Даний винахід також стосується векторів, що нуклеїнових кислот, що кодують протеїни, які бувключають ізольовані нуклеїновокислотні молекудуть експресовані, для виробництва нуклеїнових ли даного винаходу, клітин господаря, що є модикислот для використання в якості зразків для вифіковані з рекомбінантними векторами методами значення наявності бажаних мРНК у зразках, для генетичної інженерії, та методи продукції принайпослідовності нуклеїнових кислот або для інших мні одного анти-подвійного інтегринового антитіла цілей. Приклади методик, яких достатньо, щоб за допомогою рекомбінантних методик, що відомі скерувати осіб, котрі мають відповідні навички, у науці. Див., напр., Sambrook, et al., вище; Ausubel, методиках посилення in vitro знаходяться у Berger, et al., ви ще, кожні з них внесена тут у посиланнях. вище, Sambrook, вище та Ausubel, вище, а також Полінуклеотиди можуть бути додатково поєдMullis, et al., [патент США № 4,683,202 (1987); та наними з вектором, що містить відібраний маркер Innis, et al., PCR Protocols A Guide to Methods and для проникнення в господаря. Загалом, плазмідApplications, Eds., Academic Press Inc., San Diego, ний вектор вводиться в преципітат, такий як кальCA (1990)]. Комерційно доступні набори для геноцієвий фосфатний преципітат, або в комплекс із много PCR посилення є відомими науці. Див., назарядженим ліпідом. Якщо вектор є вірусом, то він пр., Ad vantage-GC Genomic PCR Kit (Clontech). може бути спакованим in vitro з використанням Додатково, напр., протеїн Т4 гену 32 (Boehringer відповідних ліній пакувальних клітин і потім можуть Mannheim) може використовува тися для покрабути перетворені в клітини господаря. щення виходу продуктів довгої PCR. ДНК вставка має бути реально поєднана з наСинтетичні методи конструювання нуклеїнових лежним промотером. Конструкція експресії в покислот дальшому міститиме обмежувальні сайти для ініІзольовані нуклеїнові кислоти даного винаходу ціації транскрипції, припинення та, в також можуть бути підготолвеними безпосереднім транскрибованому регіоні, рибосом-зв'язуюче міс 27 83988 28 це для трансляції. Кодуюча частина зрілих трансців часто бувають в формі моношарових клітин, криптів експресується за допомогою конструкцій, хоча суспензії або біореактори клітин ссавців тащо бажано має включати кодон, який ініціює кож можуть використовуватися. Наукою розроблетрансляцію, на початку і припиняючий кодон (нано багато належних ліній клітин господаря спропр., UAA, UGA або UAG), який належно розташоможних експресувати інтактні глікозильовані ваний в кінці мРНК, яка має бути трансльована, протеїни, і вони включають клітинні лінії COS-1 при перевазі UAA та UAG для клітинної експресії у (напр., АТСС CRL 1650), COS-7 (напр., АТСС CRLссавців чи еукаріот. 1651), НЕК293, ВНК21 (напр., АТСС CRL-10), СНО Вектори експресії бажано, але не обов'язково, (напр., АТСС CRL 1610) та BSC-1 (напр., АТСС мають включати принаймні один обраний маркер. CRL-26), клітини Cos-7, клітини СНО, клітини hep Такі маркери включають, напр., але не обмежуG2, клітини P3X63Ag8.653, SP2/0-Agl4, 293, клітиються, метотрексат (МТХ), дигідрофолат редуктани HeLa тощо, які доступні від, наприклад, зу [DHFR, патент США №№ 4,399,216; 4,634,665; American Type Culture Collection, Manassas, Va 4,656,134; 4,956,288; 5,149,636; 5,179,017], резис[www.atcc.org]. Бажані клітини господаря включатентність по ампіциліну, неоміцину (G418), мікоють клітини лімфоїдного походження, такі як клітифеноловій кислоті або глютамін синтетазі [GS, ни мієломи і лімфоми. Зокрема бажаними клітинапатент США №№5,122,464; 5,770,359; 5,827,739] ми господаря є клітини P3X63Ag8.653 (АТСС для еукаріотичних клітинних культур та тетрацикAccession Number CRL-1851) та клітини SP2/0лін- або ампіцилін-резистентні гени для культивуAg14 (АТСС Accession Number CRL-1851). В окревання в Е.соlі та інших бактеріях або прокаріотах мих бажаних впровадженнях рекомбінантною клі(вищенаведені патенти повністю включено тут у тинами є клітини P3X63Ag8.653 або SP2/0-Ag14. посиланнях). Відповідні культурні середовища і Вектори експресії для цих клітин можуть вклюумови для вищеописаних клітин господаря відомі чати одну або більше з наступних послідовностей науці. Відповідні вектори є знайомими для кваліфіконтролю експресії, таких як, але не обмежуючись кованих фахівців. Введення векторної конструкції у походженням реплікації; промоутер (напр., пізній клітину господаря може бути здійснено за допомоабо ранній промоутер SV40, промоутер CMV [пагою трансфекції фосфатом кальцію, DEAEтент США №№ 5,168,062; 5,385,839], промоутер декстран-медійованою трансфекцією, катіонною HSV tk, промоутер pgk (фосфогліцерат кіназа), ліпідно-медійованною трансфекцією, електропопромоутер EF-1 альфа [патент США № 5,266,491], рацією, трансдукцією, інфікуванням або іншими принаймні один людський імінноглобуліновий провідомими методами. Такі методи описані в робомоутер; сайти покращувача та/або інформаційної тах, таких як Sambrook, вище, розділи 1-4 та 16-18; обробки, такі як рибосомо-зв'язуючі сайти, поліAusubel, вище, розділи 1, 9, 13, 15, 16. аденилаційні сайти (напр., додатковий сайт SV40 Принаймні одне антитіло даного винаходу мовеликого Τ Ag полі А) та транскрипційні припиняюже бути експресоване у модифікованій формі, тачі послідовності. Див., напр., Ausubel et al., вище; кій як зливний протеїн, і може включати не тільки Sambrook, et al., вище. Інші клітини корисні для сигнали секреції, але також додаткові гетерологічпродукування нуклеїнових кислот або протеїнів ні функціональні регіони. Наприклад, регіон додатданого винаходу відомі та/або доступні, наприкових амінокислот, зокрема заряджені амінокислоклад, від American Type Culture Collection ти, може додаватися до N-закінчення антитіла для Catalogue of Cell Lines and Hybridomas покращення стабільності та персистенції в клітині [www.atcc.org] або інших відомих чи комерційних господаря, під час очищення або під час подальджерел. шого захоплення і зберігання. Також, пептидні моКоли використовуються еукаріотичні клітини лекули можуть додаватися до антитіла даного господаря, то поліаденліаційні або припиняючі винаходу для поліпшення очищення. Такі регіони послідовності зазвичай включені до вектора. Приможуть прибиратися до остаточного приготування кладом припиняючої послідовності є поліаденліаантитіла або принаймні одного його фрагмента. ційна послідовність з гена коров'ячого гормону Такі методи описані у багатьох стандартних лабороста. Послідовності для акуратного зклеювання раторних кервництвах, таких як Sambrook, вище, транскриптів також можуть бути включеними. Прирозділи 17.29-17.42 та 18.1-18.74; Ausubel, вище, кладом зклеєної послідовності є інтрон VP1 з SV40 розділи 16, 17 та 18. [Sprague, et al., J.Virol. 45:773-781 (1983)]. ДодатТі, хто мають належні навички в цій галузі, ково, генні послідовності для контролю реплікації в знають численні системи експресії, що доступні клітинах господаря можуть бути включеними до для експресії нуклеїнової кислоти, яка кодує провектора, як це відомо науці. теїн даного винаходу. Очищення антитіла Альтернативно, нуклеїнові кислоти даного виАнти-подвійне інтегринове антитіло може бути находу можуть експресуватися в клітині господаря відновлене і очищене з культур рекомбінантних за допомогою вмикання (маніпуляційно) і клітині клітин добревідомими методами включаючи, але господаря, що містить ендогенну ДНК, яка кодує не обмежуючись, очищення протеїном А, преципіантитіло даного винаходу. Такі методи добре вітація аммонія сульфатом або етанолом, кислотна домі науці, напр., як це описано в [патенті США екстракція, аніонна або катіонна обміна хроматог№№ 5,580,734, 5,641,670, 5,733,746 та 5,733,761], рафія, фосфоцелюлозна хроматографія, хроматощо повністю включені тут у вигляді посилань. рграфія гідрофобічної взаємодії, афінна хроматорІлюстрацією клітиних культур, що є корисними графія, гідроксилапатитна хроматографія та для продукування антитіл, певних їхніх частин або лектинова хроматографія. Високовиробницька варіантів, є клітини ссавців. Системи клітин ссаврідинна хроматографія ("HPLC") також може вико 29 83988 30 ристовуватися для очищення. Див., напр., Colligan, Принаймні одне антитіло винаходу зв'язує Current Protocols in Immunology, або Current принаймні один певний епітоп специфічний до Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, принаймні одного подвійного інтегринового протеNY, (1997-2001), напр., розділи 1, 4, 6, 8, 9,10, коїна, субодиниці, фрагмента, частини або будь-якої жний з яких включений тут у посиланнях. комбінації. Принаймні один епітоп може містити Антитіла даного винаходу включають природні принаймні один антитіло-зв'язуючий регіон, що очищенні продукти, продукти хімічного синтезу та містить принаймні одну частину вищезгаданого продукти, що вироблені за допомогою рекомбінанпротеїну, епітоп котрого переважно складається з тних методик, з еукаріотичних господарів, вклюпринаймні однієї позаклітинної, розчинної, гідрочаючи, наприклад, кітини дріжжів, вищих рослин, фільної, зовнішньої або цитоплазматичної частини комах та ссавців. Залежно від використаного госвищезгаданого протеїна. Принаймні один певний подаря в процедурах рекомбінантної продукції, епітоп може містити будь-яку комбінацію принаймантитіло даного винаходу може бути глікозильовані однієї амінокислотної послідовності з принаймні не або може бути неглікозильоване, надається 1-3 амінокислот до повної певної частини прилегперевага глікозильованому. Такі методи описані в лих амінокислот SEQ ID NOS:9,16 або 17. багатьох стандартних лабораторних керівництвах, Загалом, людське антитіло або антитілотаких як Sambrook, вище, розділи 17.37-17.42; зв'язуючий фрагмент даного винаходу міститиме Ausubel, вище, розділи 10, 12, 13, 16, 18 та 20, антиген-зв'язуючий регіон, що має принаймні один Colligan, Protein Science, вище, розділи 12-14, всі людський допоміжний визначальний регіон (CDR1, вони повністю включені тут у посиланнях. CDR2 та CDR3) або варіант принаймні одного Анти-подвійні інтегринові антитіла важколанцюгового варіабельного регіона та приІзольовані антитіла даного винаходу складанаймні один людський допоміжний визначальний ються з описаних тут аміноксилотних послідовносрегіон (CDR1, CDR2 та CDR3) або варіант притей антитіла, що кодуються будь-яким відповідним наймні одного легколанцюгового варіабельного полінуклеотидом, або будь-яке ізольоване і пригорегіона. В якості одного з прикладів, антитіло або товлене антитіло. Бажано, щоб людське антитіло антиген-зв'язуюча частина або варіант може місабо антиген-зв'язуючий фрагмент зв'язував людтити принаймні один важколанцюговий CDR3, що ський подвійний інтегрин та, таким чином частково має амінокислотну послідовність SEQ ID NO:3 або суттєво нейтралізував принаймні одну біологіта/або легколанцюговий CDR3, що має амінокисчну дію протеїна. Антитіло або певна його частина лотну послідовність SEQ ID NO:6. В окремому чи варіант, що частково і переважно істотно нейтвпровадженні, антитіло або антиген-зв'язуючий ралізує принаймні одну біологічну дію принаймні фрагмент можуть мати антиген-зв'язуючий регіон, одного подвійного інтегринового протеїна або що містить принаймні частину принаймні одного фрагмента може зв'язувати протеїн або фрагмент важколанцюгового CDR (тобто, CDR1, CDR2 і таким чином пригнічувати дію, що медіюється та/або CDR3), що мають амінокислотну послідовчерез зв'язування подвійного інтегрина з рецептоність, яка відповідає CDR 1, 2 та/або 3 (напр., SEQ ром подвійного інтегрина або через інші подвійні ID NOS:1, 2 та/або 3). В іншому окремому впроваінтегрин-залежні або медійовані механізми. Термін дженні, антитіло або антиген-зв'язуюча частина "нейтралізуюче антитіло", що використовується або варіант можуть мати антиген-зв'язуючий регітут, відноситься до антитіла, яке може пригнічуваон, що містить принаймні частину принаймні одноти подвійну інтегрин-залежну активність на приго легколанцюгового CDR (тобто, CDR1, CDR2 близно 10-120%, бажано на принаймні приблизно та/або CDR3), який має амінокислотну послідов10, 20, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, ність, що відповідає CDR 1, 2 та/або 3 (напр., SEQ 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% або більше заID NOS: 4, 5 та/або 6). У виділеному впровадженні лежно від аналізу. Спроможність анти-подвійних три важкоголанцюгових CDR та три легколанцюгоінтегринових антитіл пригнічувати подвійну інтегвих CDR антитіла або антиген-зв'язуючого фрагрин-залежну активність переважно оцінюється за мента мають амінокислотну послідовність відповідопомогою аналізу принаймні одного відповідного дних CDR принаймні одного з Мат Gen095, інтегринового протеїна або рецпптора, як це опиGen0101, CNTO 95, С372А, як це описано тут. Такі сано тут та/або як це відомо науці. Людське антиантитіла можуть бути вигото влені за допомогою тіло винаходу може бути будь-якого класу (IgG, хімічного з'єднання з різноманітними частинами IgA, IgM, IgE, IgD тощо) або ізотипу і може містити (напр., CDR, каркас) антитіла з використанням каппа або ламбда легкі ланцюги. В одному впротрадиційних методик, за допомогою приготування і вадженні, людське антитіло містить важкий ланцюг експресування (тобто, однієї або більше) нуклеїабо певний фрагмент IgG, наприклад, принаймні новокислотної молекули, що кодує анти тіло з виодин ізотип IgG1, IgG2, IgG3 або IgG4. Антитіла користанням традиційних методик технології рецього типу можуть бути приготовлені за допомокомбінантної ДНК або за допомогою використання гою застосування трансгенних мишей або інших будь-яких інших належних методів. трансгенних нелюдських ссавців, що містять Анти-подвійне інтегринове антитіло може містрансгени принаймні одного людського легкого тити принаймні один важко- або легколанцюговий варіабельний регіон, що має визначену амінокисланцюга (напр., IgG, IgA та IgM (напр., g1, g2, g3, лотну послідовність. Наприклад, у виділенному g4), як це описано тут та/або як це відомо науці. В впровадженні, анти-подвійне інтегринове антитіло іншому впровадженні, анти-людське подвійне інтемістить принаймні один з принаймні одного важкогринове людське антитіло містить важкий ланцюг ланцюгового варіабельного регіону, що додатково IgG1 та легкий ланцюг IgG1. може мати амінокислотну послідовність SEQ ID 31 83988 32 №7 та/або принаймні один легколанцюговий варіабо антиген-зв'язуючі фрагменти та антитіла, які абельний регіон, що може додатково мати аміномістять такі ланцюги або CDR, могли зв'язувати кислотну послідовність SEQ ID №8. Анти тіла, що людський подвійний інтегрин з високою афіністю зв'язують людський подвійний інтегрин та, що міс(напр., КD менше або дорівнює приблизно 10-9М). тять певний важко- або легколанцюговий варіабеАмінокислотна послідовність, що є практично тальний регіон, можуть бути приготовлені з викорискою ж, як і послідовінсть описана тут, містить контанням належних методів, таких як бактеріофагова сервативні амінокислотні заміни, а також амінокипроява [Katsube, Υ., et al, Int J Mol Med, 1(5):863слотні видалення та/або вставки. Консервативною 868 (1998)] або методів, що використовують трансамінокислотною заміною називається заміна пергенниз тварин, які відомі в науці та/або описані тут. шої амінокислоти другою амінокислотою, що має Наприклад, трансгенні миші, що містять функціохімічні та/або фізичні властивості (напр., заряд, нально переналаштований людський імунноглобуструктур у, полярність, гідрофобліновий важколанцюговий трансген та трансген, ність/гідрофільність), які є такими ж, як і у першій який містить ДНК з людського імунноглобулінового амінокислоті. Консервативні заміни включають легколанцюгового локуса, що може проходити заміну однієї амінокислоти іншою в таких групах: функціональне переналаштування, можуть бути лізин (К), аргінин (R) та гістидин (Н); аспартат (D) і імуннізовані людським подвійним інтегрином або глютамат (Е); аспаригін (N), глютамін (Q), серин його фрамгентом для запуска продукції антитіл. (S), треонін (Т), тирозин (Y), К, R, Н, D та Е; аланін При бажанні, клітини продукуючі антитіла можуть (А), валін (V), лейцин (L), ізолейцин (І), пролін (Р), бути ізольовані та можуть бути приготовлені гібрифенілаланин (F), триптофан (W), метіонин (М), доми або інші безсмертні клітини, що продукують цистеїн (С) та гліцин (G); F, W та Y; С, S та Т. антитіла, як це описано тут та/або відомо в науці. Коди амінокислот Альтернативно, антитіло, певна частина або варіАмінокислоти, що складають анти-подвійні інант можуть експресуватися з використанням котегринові антитіла даного винаходу, часто скородуючи х н уклеїнових кислот або їх частин в належчуються у вигляді абревіатури. Амінокислотні поній клітині господаря. значення можуть бути сформовані з позначень Винахід також відноситься до антитіл, антигенамінокислот у вигляді однобуквенного коду, їх тризв'язуючих фрагментів, імунноглобулінових ланбуквеного коду, імені або тринуклеотидного кодоцюгів та CDR, що містять амінокислоти в послідону, так як це часто робиться в наукових роботах вності, яка є практично такою ж, як і амінокислотна [див. Alberts, В., et al., Molecular Biology of The Cell, послідовність, описана тут. Бажано, щоб антитіла Third Ed., Garland Publishing, Inc., New York, 1994]: Анти-подвійне інтегринове антитіло даного винаходу можу включати одну або більше амінокислоту заміну, видалення або додавання, або внаслідок природної мутації або людських маніпуляцій, як це визначено тут. Звісно, кількість амінокислотних замін залежатиме від багатьох факторів, включаючи ті, що описані вище. Взагалі кажучи, кількість амінокислотних замін, вставок або видалень для будь-якого даного інтегринового антитіла буде не більше, ніж 40, 30, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 33 83988 34 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, такою як 1-30 або будь-який діаабо 40%, та бажано принаймні 50%, 60% або 70% пазон чи значення, як вказано тут. та ще бажаніше принаймні 80%, 90% або 95-100% Амінокислоти в анти-подвійному інтегринововід активності природного (несинтетичного), ендому антитілі даного винаходу, що є обов'язковими генного і відомого антитіла. Методи аналізу та для функції, можна ідентифікувати за допомогою заходи визначення ферментної активності та субметодів, що відомі в науці, таких як спрямований стратної специфічності добре відомі тим, хто має мутагенез чи аланін-скануючий мутагенез [напр., відповідну кваліфікацію в даній галузі науки. Ausubel, вище, розділ 8, 15; Cunningham and Wells, В іншому аспекті, винахід стосується людських Science 244:1081-1085 (1989)]. Остання процедура антитіл та антиген-зв'язуючих фрагментів, як це включає тільки аланінову мутацію кожного залишописано тут, які модифікуються за допомогою коку молекули. Результуючі мутантніа молекули повалентного приєднання органічних молекул. Така тім перевіряються на біологічну дію, таку як, але модифікація може продукувати антитіло або антине тільки, принаймні одна нейтралізуюча дія щодо ген-зв'язуючий фрагмент з поліпшенними фармаподвійного інтегрина. Місця, що є критичними для кокінетичними властивостями (напр., збільшений зв'язування антитіла, можуть також бути ідентифісиворотковий час півжиття in vivo). Органічна моковані за допомогою структурного аналізу, такого лекула може бути лінійною або розгалудженою як кристалізація, ядерно-магнітний резонанс або гідрофільною полімерною групою, жирнокислотфотоафінне мічення [Smith, et al., J. Mol. Biol. ною групою або жирнокислотною ефірною групою. 224:899-904 (1992) та de Vos, et al., Science В окремому впровадженні, гідрофільна полімерна 255:306-312 (1992)]. група може мати молекулярну вагу приблизно від Анти-подвійні інтегринові антитіла даного ви800 до приблизно 120000 Дальтон і може бути находу можуть включати, але не обмежуючись, поліалкангліколем (напр., поліетиленгліколь принаймні одну частину, послідовність або комбі(PEG), поліпропіленгліколь (PPG)), карбогідратним націю, обрану з 5 до всіх прилеглих амінокислот полімером, амінокислотним полімером або полівіпринаймні одного SEQ ID №:1, 2, 3, 4, 5, 6. ниловим піролідоном, а жирнокислотні або жирноАнти-подвійне інтегринове антитіло може такислотні ефірні групи можуть містити від приблизкож додатково містити поліпептид з принаймні но 8 до приблизно 40 атомів вуглецю. однієї з 70-100% прилеглих амінокислот принаймні Модифіковані антитіла та антиген-зв'язуючі однієї SEQ ID №:7, 8. фрагменти винаходу можуть містити одну або біВ одному впровадженні, амінокислотна послільше органічних молекул, що є ковалентно зв'язадовність імунноглобулінового ланцюга або його ними, прямо або непрямо, з антитілом. Кожна орчастини (напр., варіабельний регіон, CDR) має ганічна молекула, що зв'язана з антитілом або приблизно 70-100% ідентитчність (напр., 70, 71, антиген-зв'язуючим фрагментом винаходу може 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, незалежно бути гідрофільною полімерною групою, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, жирнокислотною групою або жирнокислотною ефі100 або будь-який діапазон або значення) до амірною групою. Термін, що тут використовується, нокислотної послідовності відповідного ланцюга "жирна кислота" охоплює монокарбоксильні кислопринаймні одного з SEQ ID №№7, 8. Наприклад, ти і дикарбоксильні кислоти. "Гідрофільна полімеамінокислотна послідовність важколанцюгового рна група", в якості терміну, що використовується CDR може порівнюватися з SEQ ID №7. Бажано, тут, відноситься до органічного полімера, що є щоб 70-100% амінокислотна ідентичність (тобто, більш розчинним у воді, ніж в октані. Отже, антиті90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 або будьло модифіковане ковалентним приєднанням поліякий діапазон чи значення) визначалися за дополізина охоплюється винаходом. Гідрофільні полімогою належного комп'ютерного алгоритма, як це мери, що підходять для модифікації антитіл відомо науці. винаходу, можуть бути лінійними або розгалуджеПоказові послідовності важколанцюгових та ними і включати, наприклад, поліалкалінгліколі легколанцюгових варіабельних регіонів забезпе(напр., PEG, монометокси-поліетіленгліколь чені в SEQ ID №№7, 8. Антитіла даного винаходу (mPEG), PPG то що), карбогідрати (напр., декабо його певні варіанти можуть містити будь-яку стран, целюлоза, олігосахариди, полісахариди кількість прилеглих амінокислотних залишків з тощо), полімери гідрофільних амінокислот (напр., антитіла даного винаходу, де кількість вибираєтьполілізин, поліаргінин, поліаспартат тощо), поліся з групи цілих чисел, що складаються з 10-100% акаліноксиди (напр., поліетиленоксид, поліпропікількості прилеглих залишків в анти-подвійному леноксид тощо) та полівініл піролідон. Бажано, інтегриновому антитілі. Додатково, ця послідовщоб гідрофільний полімер, який модифіекує антиність прилеглих амінокислот є завдовжки в притіло винаходу, мав молекулярну масу від приблизнаймні приблизно 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, но 800 до 150000 Дальтон, в якості окремої моле100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, кули. Наприклад може використовуватися 200, 210, 220, 230, 240, 250 або більше амінокисPEG5000 і PEG20000, де нижній індекс є середлот, або будь-який діапазон чи значення. Далі, ньою молекулярною вагою полімера в Дальтонах. кількість таких послідовностей може бути будьГідрофільна полімерна група може бути замінена яким цілим числом обраним з групи чисел від 1 до від 1 до 6 алкильними, жирнокислотними та жир20, таких як принаймні 2, 3, 4 або 5. нокислотно ефірними групами. Гідрофільні поліЯк зрозуміло фахівцям в даній галузі, даний мери, що замінені жирнокислотною або жирнокисвинахід включає принаймні одне біологічно активлотно ефірною групою, можуть бути приготовлені не антитіло даного винаходу. Біологічно активні за допомогою застосування належних методів. антитіла мають певну активність на рівні 20%, 30% Наприклад, полімер, що містить амінну групу може 35 83988 36 бути зпареним з карбоксилатом жирної кислоти моно-Вос-диаміногексана) з жирною кислотою за або жирнокислотного ефіру та активованим карбоприсутності 1-етил-3-(3-диетиламінопропіл) карбоксилатом (напр., активований за допомогою N, Nдиїміда (EDC) для формування амідного зв'язку карбоніл диімідазола) на жирній кислоті або ефірі між жирним аміном та карбоксилатом жирної кисжирної кислоти може бути зпареним з гідроксильлоти. Захисна група Вос може бути видалена з ною групою на полімері. продукут за допомогою обробки трифтороацетоЖирні кислоти та ефіри жирної кислоти, які півою кислотою (TFA), що впливає на первинний лходять для модифікації антитіл винаходу, можуть амін, який може бути зв'язаний з іншим карбоксибути сатуровані або можуть містити одну або білатом, як це описано, або може реагувати з малеїльше одиницю несатурації. Жирні кислоти, що ковим ангідридом, а результутючий продукт цикліпідходять для модифікації антитіл винаходу, вклюзується для продукування активованого чають, наприклад, n-додекаонат (С12, лаурат), nмалеїмідового похідного жирної кислоти. [Див. тетрадекаонат (С14, мирістат), n-октадекаонат (С18, наприклад, Thompson, et al., WO 92/16221, повний стеарат), n-ейкозаноат (С20, арахідат), nвиклад якого вміщено тут у посиланнях]. докозаноат (С22, бегенат), n-триаконтаноат (С30), Модифіковані антитіла винаходу можуть бути виготовлені за допомогою реакції людського антиn-тетраконтаноат (С40), цис-D9-октадеканоат (С18, тіла або антиген-зв'язуючого фрагмента з модифіолеат), всі цис-D5,8,11,14-ейкозатетраеноат (С20, куючим агентом. Наприклад, органічні молекули арахідонат), октанедиоієва кислота, тетрадеканеможуть бути зв'язані з антитілом у несайтоспецидиоїєва кислота, октадеканедиоїєва кислот тощо. фічним спосіб за допомогою застосування амінВідповідні ефіри жирних кислот включають монореактивного модифікуючого агента, наприклад, ефіри дикарбоксильних кислот, що містять лінійну NHS ефіра PEG. Модифіковані людські антитіла або розгалуджену нижню алкілову гр упу. Нижня або антиген-зв'язуючі фрагменти можуть також алкілова група може містити від 1 до приблизно бути виго товлені за допомогою зменшення дису12, бажано від 1 до 6, атомі вуглецю. льфідних зв'язків (напр., міжланцюгові дисульфідні Модифіковані людські антитіла та антигензв'язки) антитіла або антиген-зв'язуючого фрагмезв'язуючі фрагменти можуть бути приготовлені з нта. Редуковане антитіло або антиген-зв'язуючий використанням належних методів, таких як реакція фрагмент може потім реагувати з тіол-реактивним з одним або більше модифікованим агентом. "Момодифікуючим агентом для вироблення модифідифікований агент", в якості використовуваного кованого антитіла винаходу. Модифіковані людські тут терміну, стосується належної органічної групи антитіла та антиген-зв'язуючі фрагменти, що міс(напр., гідрофільний полімер, жирна кислота, ефір тять органічну молекулу, яка може бути зв'язана зі жирної кислоти), що містить активуючу груп у. "Акспецифічними місцями антитіла даного винаходу, тивуюча група" є хімічною молекулою або функціможе бути приготовлене з використанням належональною групою, що може, за певних умов, реаних методів, таких як реверсивний протеоліз [Fisch гувати з другою хімічною групою, таким чином et al, Bioconjugate Chem., 3:147-153 (1992); Werlen формуючи ковалентний зв'язок між модифікуючим et al, Bioconjugate Chem., 5:411-417 (1994); агентом та другою хімічною групою. Наприклад, Kumaran et al, Protein Sci. 6(10):2233-2241 (1997); аміно-реактивні активуючі групи включають електItoh et al, Bioorg. Chem., 24(1):59-68 (1996); рофільні групи, такі як тозилат, мезилат, гало Capellas et al.,Biotechnol. Bioeng., 56(4):456-463 (хлоро, бромо, фторо, йодо), N(1997)] та методи описані в Hermanson, G. Т., гідроксисукцинимідилові ефіри (NHS) тощо. АктиBioconjugate Techniques, Academic Press: San вуючі групи, що можуть реагувати з тіолами, вклюDiego, CA (1996). чають, наприклад, малеїмид, йодоацетил, акрилоСклад анти-ідіотипних антитіл до антилил, піридил дисульфіди, тіол 5-тіол-2подвійних штегринових антитіл нітробензоєвої кислоти (TNB-тіол) тощо. АльдегиНа додаток до моноклональних та химеричних дна функціональна група може бути зв'язана з анти-подвійних антитіл, даний винахід також стоаміно- або гідразид-вміщуючими молекулами, а сується анти-ідіотипічного (анти-Id) антитіла спеазидна група може реагувати з тривалентною фоцифічних до антитіл винаходу. Анти-Id антитіло є сфорною групою для формування фосфорамідатантитілом, яке розпізнає унікальні детермінанти, них або фосфорімидинових зв'язків. Належні мещо загалом пов'язані з антиген-зв'язуючим регуотоди для введення активуючих гр уп в молекулу ном іншого антитіла. Анти-Id можуть бути виробвідомі науці [див. наприклад, Hermanson, G.T., лені за допомогою імуннізації тварин такого ж виду Bioconjugate Techniques, Academic Press: San та генетичного типу (напр., миші), як і ті, що є джеDiego, CA (1996)]. Активуюча група може бути зв'ярелом Id антитіла, антитілом або його CDRзана безпосередньо з органічною групою (напр., вміщуючим регіоном. Імуннізована тварина розпігідрофільний полімер, жирна кислота, ефір жирної знає та відповідає на ідіотипічні детермінанти імукислоти) або через зв'язуючу молекулу, наприклад ннізуючого антитіла і продукує анти-Id антитіло. дивалентну групу C1-C12, де один або більше атоАнти-Id антитіло може також використовуватися в мів вуглецю можуть бути замінені гетероатомом, якості "імуногена" для індукції імунної відповіді у таким як кисень, азот або сірка. Належні зв'язуючі ще однієї тварини, продукуючи так зване антимолекули включають, наприклад, тетраетиленгліанти-Id антитіло. коль, -(СН2)3-, -NH-(CH2)6-NH-, -(CH2)2-NH та –СН2Препарат анти-подвійного штегринового антиO-CH2-CH2-O-CH-NH-. Модифікуючі агенти, що тіла містять зв'язуючу молекулу, можуть бути виготовДаний винахід також описує препарат принайлені, наприклад, за допомогою реакції моно-Восмні одного анти-подвійного інтегринового антитіла, алкілдиаміна (напр., моно-Вос-етиленедиаміна, 37 83988 38 що містить принаймні одне, принаймні два, приних, циклоплегічних, алкілуючих засобів, антименаймні три, принаймні чотири, принаймні п'ять, таболітиків, інгібіторів мітозу, радіоізотопних засопринаймні шість або більше анти-подвійних інтегбів, антидепресантів, антиманічних препаратів, ринових антитіл, як це описано тут та/або відомо в антипсихотиків, анксиолітиків, снодійних, симпагалузях науки, що описують неприродно виниклі томіметиків, стимуляторів, донезепілу, такрину, склади, суміші або форми. Такі препарати містять астматичних препаратів, бета-агоністів, інгаляційнеприродньо виниклі склади, що містять принаймних стероїдів, інгібіторів лейкториєну, метилксанні 1 або 2 повної довжини, С- та/або Nтину, кромоліну, адреналіну або аналогу, дорнази термінально видалені варіанти, домени, фрагменальфа (Пульмозим), цитокіна або цитокінового ти або певні варіанти амінокислотної послідовності антагоніста або антитіла. Деякі приклади таких анти-подвійного інтегринового антитіла, що обрана цитокінів включають, але не обмежуються, будьз групи, яка містить 70-100% прилеглих амінокисякі антитіла до IL-1 - IL-23, IL-6, антипухлинні антилот SEQ ID №№:1, 2, 3, 4, 5 , 6, 7, 8 або певні їхні тіла, хіміотерапевтичні препарати або радіоактивні фрагменти, домени чи антитіла. Бажано, щоб препрепарати. Відповідні дози добре відомі в науці. парат анти-подвійного інтегринового антитіла Див., напр., Wells et al., eds., Pharmacotherapy включав принаймні 1 або 2 повної довжини фрагHandbook, 2nd Edition/ Appleton and Lange, менти, домени або варіанти принаймні однієї CDRStamford, CT (2000); PDR Pharmacopoeia, Tarascon або LDR-вміщуючої частини послідовності антиPocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edition, подвійного інтегринового антитіла з 70-100% SEQ Tarascon Publishing, Loma Linda, CA (2000), посиID №№:1, 2, 3, 4, 5, 6 або їхні певні фрагменти, лання з кожної з цих робіт повністю включені тут у домени чи варіанти. Подальші бажані композиції посиланнях. вмішують 40-99% принаймні одного з 70-100% Такі анти-пухлинні та анти-інфекційні препараSEQ ID №№:1, 2, 3, 4, 5, 6 або певних їхніх фрагти можуть також включати токсинові молекули, що ментів, доменів чи варіантів. Такі відсотки складу є поєднані, пов'язанні, сполучені або призначаються за вагою, об'ємом, концентрацією, молярністю або разом з принаймні одним антитілом даного винамоляльністю такими ж як рідкі або сухі розчини, ходу. Токсин може додатково селективно знищусуміші, суспензії, емульсії або колоїди, як це відовати патологічні клітини або тканини. Патологічна мо науці або описано тут. клітина може бути раковою або іншою клітиною. Препарат анти-подвійного інтегринового антиТакі токсини можуть бути, але не тільки, очищенитіла даного винаходу може містити принаймні одми або рекомбінантними токсинами або фрагменне з будь-якої відповідної та ефективної кількості тами токсинів, що містять принаймні один функціскладу або фармацевтичного препарату, що місональний цитотоксичний домен або токсин, напр., тить принаймні одне анти-подвійне інтегринове обраний принаймні з одного з наступного - рицин, антитіло до клітини, тканини, органу, тварини або дифтерійний токсин, зміїний токсин або бактеріапацієнта при потребі такої модуляції, лікування льний токсин. Термін токсинтакож включає як енабо терапії, що далі додатково містить принаймні дотоксини, так і екзотоксини, що виробляються одне обране з принаймні одного антагоніста TNF будь-якими природньо виниклими, мутантними (напр., але не тільки, антитіло або фрагмент антиабо рекомбінантними бактеріями чи вірусами, які тіла до TNF, розчинний рецептор або його фрагможуть спричинити будь-який патологічний стан у мент до TNF, їхні зливні протеши або малу молелюдей та інших ссавців, включаючи токсиновий кулу антагоніста TNF), антиревматичного шок, що може призвести до смерті. Такі токсини препарату (напр., метотрексат, ауранофін, ауротіможуть включати, але не обмежуючись, ентеротооглюкоза, азатіоприн, етанерсепт, натрієвий тіоксиногенний тепло-лабільний ентеротоксин Е.соlі малат золота, сульфат гідроксихлорохіна, лефлу(LT), тепло-стійкий енетротоксин (ST), цитотоксин номід, сульфасалазин), м'язового релаксанта, Shigella, ентеротоксини Aeromonas, токсин токсичнаркотика, нестероїдного протизапального препаного шокового синдрому - 1 (TSST-1), ентеротократа (НПЗП), анальгетика, анестетика, седативносин стафілококовий типу A (SEA), В (SEB) або С го, місцевого анестетика, нервово-м'язового бло(SEC), стрептококові ентеротоксини тощо. Такі катора, антимікробного препарата (напр., бактерії включають, але не обмежуються, штами аміноглікозид, антигрибковий препарат, антипарародів ентеротоксиногенних Е.соlі (ЕТЕС), ентерозитарний препарат, антивірусний препарат, карбагеморрагічних Е.соlі (напр., штами серотипу пенем, цефалоспорин, фторхінолон, макролід, 0157:Н7), стафілококові штами [напр., пеніцилін, сульфонамід, тетрациклін, інші антимікStaphylococcus aureus, Staphylococcus pyogenes), робні препарати), антипсоріатичного препарата, штами Shigella (напр., Shigella dysenteriae, кортикостероїда, анаболічного стероїда, діабетичShygella flexneri, Shigella boydii ma Shigella sonnei), них препаратів, мінералів, харчових додатків, тиштами Salmonella (напр., Salmonella typhi, реоїдних препаратів, вітамінів, гормонів, що регуSalmonella cholera-suis, Salmonella enteritidis), люють обмін кальція, антидіарейних, штами Clostridium (напр., Clostridium perfringes, протикашльових, антиеметиків, противиразкових Clostridium dificile, Clostridium botulinum), штами препаратів, послаблюючих, антикоагулянтів, еритCamphlobacter (напр., Camphlobacter jejuni, ропоетину (напр., епоетин альфа), філграстима Camphlobacter fetus), штами Helicobacter (напр., (напр., G-CSF, Нейподжен), сарграмостиму (напр., Helicobacter pylori), штами Aeromonas (напр., GM-CSF, Лейкін), імунізації, імуносупресивного Aeromonas sobria, Aeromonas hydrophila, засобу (напр., базиліксимаб, циклоспорин, дакліAeromonas caviae), pleisomonas shigelloides, зумаб), гормону роста, гормоно-замісної терапії, Yersina enterocolitica, штами Vibrios (напр., Vibrios модулятора естрогенових рецепторів, мудріатичcholerae, Vibrios parahemolyticus), штами Klebsiella, 39 83988 40 Pseudomonas aeruginosa та Streptococci. Див., наСклади анти-подвійного інтегринового антитіпр., Stein, ed., INTERNAL MEDICINE, 3rd ed., pp 1ла також можуть включати буфер або pH13, Little, Brown and Co., Boston, (1990); Evans et коригуючий агент; зазвичай, буфером є сіль, що al., eds., Bacterial Infections of Humans: виготовлена з органічної кислоти або луга. РепреEpidemiology and Control, 2d. Ed., pp 239-254, зентативні буфери включають органічні кислотні Plenum Medical Book Co., New York (1991); Mandell солі, такі як солі лимонної кислоти, аскорбінової et al, Principles and Practice of Infectious Diseases, кислоти, глюконієвої кислоти, карбонієвої кислоти, 3d. Ed., Churchill Livingstone, New York (1990); тартарової кислоти, сукцинової кислоти, ацетової Berkow et al, eds., The Merck Manual, 16th edition, кислоти або фталієвої кислоти; Tris, трометаміна Merck and Co., Rahway, N.J., 1992; Wood et al, гідрохлорид або фосфатні буфери. Бажаними буFEMS Microbiology Immunology, 76:121-134 (1991); ферами для використання в даному винаході в Marrack et al, Science, 248:705-711 (1990), список даних складах є солі органічних кислот, такі як посилань котрих повністю відображено тут у посицитрат. ланнях. Додатково, склади анти-подвійного інтегриноКомпоненти, препарати або комбінації антивого антитіла винаходу можуть включати полімерподвійного інтегринового антитіла даного винахоні додатки, такі як полівінілпіролідони, фіколи (поду можуть в подальшому містити принаймні один з лімерний цукор), декстрати (напр., будь-якої відповідної допоміжної речовини, такої циклодекстрини, такі як 2-гідроксипропіл-bяк, але не тільки, розчинник, зв'язувач, стабілізациклодекстрин), поліетилен гліколі, ароматичні тор, буфери, солі, ліпофільні розчинники, консерзасоби, антимікробні засоби, посолоджувачі, антиванти, ад'юванти то що. Надається перевага фароксиданти, антистатичні засоби, сурфактанти (намацевтично прийнятним допоміжним речовинам. пр., полісорбати, такі як "TWEEN 20" та "TWEEN Деякі з прикладів та методів приготування таких 80"), ліпіди (напр., фосфоліпіди, жирні кислоти), стерильних розчинів добре відомі науці, такі як, стероїди (напр., холестерин) та хелатні засоби але не обмежуючись, у [Gennaro, Ed., Remington's (напр., ЕДТА). Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, Mack Ці та інші фармацевтичні додатки, що підхоPublishing Co. (Easton, PA) 1990]. Фармацевтично дять до використання в складах анти-подвійного прийнятні носії можуть бути рутинно обиратися інтегринового антитіла, частинах або варіантах, серед тих, що відповідають способу введення, згідно з винаходом є відомими в науці, напр., як це розчинності та/або стабільності анти-подвійного наводиться у "Remington: The Science & Practice of інтегринового антитіла, фрагмента або варіанта Pharmacy", 19th ed., Williams & Williams, (1995) та у складу, як це добре відомо в науці або описано "Phisician's Desk Reference", 52 nd ed., Medical тут. Economics, Montvale, NJ (1998), що повністю вміФармацевтичні додатки корисні у даному щені туту у посиланнях. Бажаними носіями є карскладі включають, але не обмежуються, протеїни, богідрати (напр., сахариди та альдитоли) та буфепептиди, амінокислоти, ліпіди та карбогідрати (нари (напр., цитрат) або полімерні засоби. пр., цукри, включаючи моносахариди, ді-, три-, Склад тетра та олігосахариди; похідні цукрів такі як алдиЯк зазначалося вище, винахід описує стабільні толи, алдонієві кислоти, естерифіковані цукри тосклади, які переважно містять фосфатний буфер з що; і полісахариди або полімери цукрів), які мофізіологічним розчином або обраною сіллю, а тажуть бути присутніми самостійно чи в комбінації, кож консервуючі розчини та склади, що містять що містить одне або в комбінації 1-99,99% за ваконсервант, а також консервуючі склади багаторагою або об'ємом. Типові протеїни включають сизового використання для фармацевтичного чи вортковий альбумін, такі як людський сиворотковетеринарного використання, що містять принайвий альбумін (HSA), рекомбінантний людський мні одне анти-подвійне інтегринове антитіло або альбумін (rНА), желатин, казеїн тощо. Репрезентадодатково обрані речовини з групи, що складаєтьтивні компоненти амінокислот/антитіла, які також ся з одного фенола, m-крезола, р-крезола, офункціонують в буферних станах, включають алакрезола, хлорокрезола, бензил алкоголя, нітріта нін, гліцин, аргинін, бетаїн, гістидин, глютамову фенілртуті, феноксиетанола, формальдегіда, хлокислоту, аспартову кислоту, цистеїн, лізин, лейробутанола, магнія хлорида (напр., гексагідрат), цин, ізолейцин, валін, метіонин, фенілаланін, асалкілпарабена (метил, етил, пропіл, бутил тощо), партам тощо. Однією з бажаних амінокислот є бензалконія хлорида, бензетоніума хлорида, нагліцин. трія дегідроацетата та тримеросала або їх суміші у Карбогідрати, що підходять до використання в водному розчиннику. Може використовуватися даному винаході включають, наприклад, моносабудь-яка відповідна концентрація або суміш, як це хариди, такі як фруктоза, мальтоза, галактоза, відомо в науці, такі як 0,001-5%, або будь-який глюкоза, D-маноза, сорбоза тощо; дисахариди, діапазон чи значення у вказаних межах, такі які, такі як лактоза, сахароза, трегалоза, целобіоза але не обмежуючись, 0,001, 0,003, 0,005, 0,009, тощо; полісахариди, такі як рафіноза, мелезитоза, 0,01, 0,02, 0,03, 0,05, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, мальтодекстрини, декстрани, крохмалі тощо; та 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, альдитоли, такі як маннітол, ксилітол, мальтитол, 1,9, 2,0 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, лактитол, ксилітол сорбітол (глюцитол), міоінози3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,3, 4,5, тол тощо. Бажаними карбогідратами для викорис4,6, 4,7, 4,8, 4,9, або будь-які діапазони або знатання в даному винаході є манітол, трегалоза та чення у вказаних межах. Деякі приклади включарафіноза. ють, без консервантів, 0,1-2% m-крезол (напр., 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,9, 1,0%), 0,1-3% бензил алкоголь 41 83988 42 (напр., 0,5, 0,9, 1,1, 1,5, 1,9, 2,0, 2,5%), 0,001-0,5% новить від приблизно pH 5 до приблизно pH 9, а тимеросал (напр., 0,005, 0,01), 0,001-2,0% фенол найбільш бажаний діапазон становить від прибли(напр., 0,05, 0,25, 0,28, 0,5, 0,9, 1,0%), 0,0005-1,0% зно pH 6,8 до приблизно 7,8. Бажані буфери вклюалкілпарабен(и) (напр., 0,00075, 0,0009, 0,001, чають фосфатні буфери, найбажаніше натрія фо0,002, 0,005, 0,0075, 0,009, 0,01, 0,02, 0,05, 0,075, сфат, зокрема фосфатний буферний фізіологічний 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,5, 0,75, 0,9, 1,0%) тощо. розчин (PBS). Як вказувалося вище, винахід описує предмеІнші додатки, такі як фармацевтично прийнятні ти виробництва, що містять пакувальні матеріали розчинники по типу Tween 20 (поліоксиетилен (20) та принаймні одну ампулу, що містить розчин присорбітан монолаурат), Tween 40 (поліоксиетилен наймні одного анти-подвійного інтегринового анти(20) сорбітан монопальмітат), Tweeen 80 (поліотіла з відповідним буфером та/або консервантами, ксиетилен поліоксипропілен блоковані кополімери) додатково у водному розчиннику, де вказаний пата PEG (поліетилен гліколь) або неіонні сурфактакувальний матеріал містить позначку, що вказує, нти, такі як полісорбат 20 або 80 або полоксамер що такий розчин може зберігатися протягом пері184 чи 188, поліли Pluronic®, інші блоковані кооду 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9, 12, 18, 20, 24, 30, 36, 40, 48, полімери та хелатори, такі як EDTA та EGTA мо54, 60, 66, 72 і більше годин. Даний винахід окрім жуть додатково додаватися до складів для зментого містить предмети виробництва, що містять шення агрегації. Ці додатки зокрема корисні, якщо пакувальні матеріали, першу ампулу, яка містить для введення засобу використовується помпа або принаймні одне ліофілізоване анти-подвійне інтегпластиковий контейнер. Наявність фармацевтично ринове антитіло та другу ампулу, що містить водприйнятного сурфактанта зменшує схильність ний розчинник відповідного буфера або консервапротеїнів до агрегації. нта, де вказаний пакуальний матеріал містить Препарати даного винаходу можуть бути припозначку, яка інструктує пацієнта розчинити приготовлені за допомогою процесу, який містить наймні одне анти-подвійне інтегринове антитіло у принаймні одне анти-подвійне інтегринове антитіводному розчиннику для утворення розчину, що ло та консервант обраний з групи, яка складається може зберігатися протягом періоду 24 годин або з фенола, m-крезола, р-крезола, о-крезола, хлоробільше. крезола, бензил алкоголя, алкілпарабена (метил, Принаймні одне анти-подвійне інтегринове анетил, пропіл, бутил тощо), бензалконіума хлорида, титіло використовуване згідно з даним винаходом бензетоніума хлорида, натрія дегідроацетата і може вироблятися за допомогою рекомбінантних тимезорала або їхніх сумішей у водному розчинзаходів, включаючи клітини ссавців та трансгенні нику. Змішування принаймні одного антипрепарати, або можуть бути очи щенні з інших біоподвійного інтегринового антитіла та консерванта логічних джерел, як це описано тут або відомо в у водному розчиннику виконується з використаннауці. ням стандартних процедур розчинення та змішуДіапазон принаймні одного анти-подвійного інвання. Для приготування відповідного препарату, тегринового антитіла в продукті даного винаходу наприклад, відміряна кількість принаймні одного включає кількості, що утворюються при розведенанти-подвійного інтегринового антитіла в буферні, якщо в вологій/сухій системі, концентрації від ному розчині комбінується з бажаним консервантом в кількості, що достатня для забезпечення приблизно 1,0mг/мл до приблизно 1000мг/мл, хоча бажаних концентрацій протеїна та консерванта. нижчі чи вищі концентрації також використовуютьВаріації цього процесу можуть визначатися тим, ся і залежать від способу планованого введення, хто є фа хівцем у цій галузі. Наприклад, порядок напр., склади розчинів відрізнятимуться від трансдермальних пластирів, легенвих, трансслизових додавання компонентів, чи додатються додаткові засоби, температура та pH при яких готується або осмотичних чи мікропомпових методів. препарат, всі ці фактори можуть бути оптимізовані Бажано, щоб водні розчинники додатково міспо використовуваним концентрації та засобам тили фармацевтично прийнятні консерванти. Бавведення. жані консерванти включають ті, що обираються з групи, яка складається з фенола, m-крезола, рЗаявлені препарати можуть надаватися пацієнтам у вигляді чистих розчинів або в якості двох крезола, о-крезола, хлорокрезола, бензил алкогоампул, що містять ампулу ліо філізованого приля, алкілпарабена (метил, етил, пропіл, бутил тонаймні одного анти-подвійного інтегринового антищо), бензалконіума хлорида, бензетоніума хлоритіла, яке розчиняється в другій ампулі, що містить да, натрія дегідроацетата і тимезорала або їхніх сумішей. Концентрація консерванта, що викорисводу, консервант та/або додатки, бажано фосфатний буфер та/або фізіологічний розчин і обрану товуєтсья в даному складі є такою, яка достатня сіль, у водному розчиннику. Як одна ампула з роздля антимікробного ефекта. Такі концентрації зачином, так і дві ампули, що потребують розчиненлежать від обраного консерванта та добре визнаня, можуть використовуватися багато разів та мочаються підготовленими фахівцями. Інші додатки, напр., ізотонічні засоби, буфери, жуть бути достатнім для одноразового чи багаторазового циклів лікування пацієнта та, отже, антиоксиданти, покращуючі консерванти, можуть можуть забезпечити зручніший режим лікування, додатково і бажано додаватися у розчинник. Ізоніж натепер доступні. тонічний засіб, такий як гліцерин, часто використоДані заявлені предмети виробництва є корисвуються у відомих концентраціях. Бажано додавати фізіологічно толерований буфер для ними для призначення протягом періоду від негайного до 24-годинного або більше. Відповідно, дані забезпечення поліпшеного контролю pH. Склади заявлені предмети виробництва надають значні можуть покривати широкий спектр pH, такий як від переваги пацієнтові. Препарати винаходу можуть pH 4 до приблизно pH 10, а бажаний діапазон ста 43 83988 44 додатково безпечно зберігатися при температурах www.bectondickenson.com], Disetronic [Burgdorf, Швейцарія, www.disetronic.com; Bioject, Портленд, від приблизно 2 до приблизно 40°С та утримува ти біологічну дію протеїна на тривалі періоди часу, Орегон (www.bioiect.com)]; National Medical Products, Weston Medical [Пітерборо, UK, отже, дозволяють вказувати на пакуальних показwww.weston-medical.com]. Medic-Ject Corp [Міннечиках, що розчин може зберігатися та/або викориаполіс, MN, www.mediject.com]. Визнані пристрої, стовуватися протягом періоду 6, 12, 18, 24, 36, 48, що містять подвійно-ампульну систему включають 72 або 96 годин чи більше. Якщо використано консервуючий розчинник, такі позначки можуть вклютакі ручко-інжекторні системи для розведення ліофілізованого препарату в картриджі для введення чати використання до 1-12 місяців, половини, піврозведеного розчину, як HumatroPen®. тора та/або двох років. Продукти, що заявляються, включають пакуРозчини принаймні одного анти-подвійного інвальний матеріал. Пакувальний матеріал надає, тегринового антитіла в винаході можуть бути приготовані за допомогою процесу, що містить змішуна додаток до інформації, яка вимагається регуляторними органами, умови за яких продукт має вивання принаймні одного антитіла у водному коритовуватися. Пакувальний матеріал даного розчиннику. Змішування здійснюється з викорисвинаходу надає інструкції пацієнту по розведенню танням традиційних процедур розчинення та зміпринаймні одного анти-подвійного інтегринового шування. Для приготування належного розчинника, наприклад, вимірювана кількість принаймні антитіла у водному розчиннику для утворення розчину та використання розчину протягом періодного антитіла у воді або буфері комбінується в оду 2-24 годин та більше для двох ампул, волокількостях, що достатні для забезпечення бажаних га/суха, продукта. Для однієї ампули, розчинений концентрацій протеїна та додатково консерванта продукт, покажчик вказує, що такий розчин може або буфера. Варіації цього процесу можуть визначатися тим, хто є фа хівцем у цій галузі. Напривикористовува тися протягом періоду 2-24 години або більше. Даний продукт, що заявляється, є коклад, порядок додавання компонентів, чи додарисним для використання в якості людського фартються додаткові засоби, температура та pH при мацевтичного продукта. яких готується препарат, всі ці фактори можуть Препарати даного винаходу можуть бути прибути оптимізовані по використовуваним концентрації та засобам введення. готовлені за допомогою процесу, що містить принаймні одне анти-подвійне інтегринове антитіло та Заявлені препарати можуть надаватися пацієобраний буфер, бажано фосфатний буфер, який нтам у вигляді чистих розчинів або в якості двох містить фізіологічний розчин або обрану сіль. Зміампул, що містять ампулу ліо філізованого пришування принаймні одного антитіла та буфера у наймні одного анти-подвійного інтегринового антитіла, яке розчиняється в другій ампулі, що містить водному розчиннику здійснюється з використанням традиційних процедур розчинення та змішуводу, консервант та/або додатки, бажано фосфатвання. Для приготування належного розчинника, ний буфер та/або фізіологічний розчин і обрану наприклад, вимірювана кількість принаймні одного сіль, у водному розчиннику. Як одна ампула з розантитіла у воді або буфері комбінується в кількосчином, так і дві ампули, що потребують розчинення, можуть використовуватися багато разів та мотях, що достатні для забезпечення бажаних концентрацій протеїна та додатково консерванта або жуть бути достатнім для одноразового чи буфера. Варіації цього процесу можуть визначатибагаторазового циклів лікування пацієнта та, отже, ся тим, хто є фа хівцем у цій галузі. Наприклад, можуть забезпечити зручніший режим лікування, порядок додавання компонентів, чи додатються ніж натепер доступні. Заявлені продукти можуть бути надані пацієндодаткові засоби, температура та pH при яких готується препарат, всі ці фактори можуть бути оптам небезпосередньо через забезпечення аптек, тимізовані по використовуваним концентрації та клінік або інших таких інституцій та закладів чисзасобам введення. тими розчинами або подвійними ампулами, що Заявлені стабільні або законсервовані препаскладаються з ампули з ліофілізованого принаймні одного анти-подвійного інтегринового антитіла, яке рати можуть надаватися пацієнтам в якості чистих розчинів або в якості подвійних ампул, що містять розчиняється за допомогою другої ампули, що ампулу ліофілізованого принаймні одного антимістить водний розчин. Чистий розчин у даному подвійного інтегринового антитіла, яке розодиться випадку може бути розміром до одного літра або другою ампулою, що містить консервант або бунавіть більше, що забезпечує великий резервуар з якого можуть одноразово чи багаторазово відбифер та додатки у водному розчиннику. Як одна ампула з розчином, так і дві ампули, що потребуратися менші частини розчину принаймні одного ють розчинення, можуть використовуватися багато антитіла для перенесення у менші ампули та заразів та можуть бути достатнім для одноразового безпечення аптек чи клінік для їхніх покупців чи багаторазового циклів лікування пацієнта та, та/або пацієнтів. Визнані пристрої, що містять ці одноампульні отже, можуть забезпечити зручніший режим лікування, ніж натепер доступні. системи включають такі ручко-інжектерні пристрої Принаймні одне анти-подвійне інтегринове андля введення розчину, як BD Pens, BD Autojector®, титіло як в стабільних, так і у законсервованих Humaject®, NovoPen®, B-D®Pen, AutoPen® та препаратах або розчинах, що описані тут, можуть OptiPen*, GenotropinPen®, Genotronorm Pen®, Humatro Pen®, Reco-Pen®, Roferon Pen®, бути призначені пацієнтові згідно з даними винаходом за допомогою різноманітних методів ввеBiojector*, iject®, J-tip Needle-Free Injector®, дення таких як підшкірні або внутрїшньом'язові Intraject®, Medi-Ject®, напр. такі як розроблені або ін'єкції; транмдермальні, легеневі, трансмукозальстворені Becton Dickensen [Franklin Lakes, NJ, 45 83988 46 ні, імплантовані, осмотичні помпи, картриджи, міктонкого кишковика, відторгнення імплантованого ропомпи або інші засоби, що оцінені кваліфіковатимуса плода, відторгнення паратиреоїдного ними фахівцями, як це добревідомо науці. трансплантанта, відторгнення ксенотрансплантанТерапевтичне застосування та будь-якого органа або тканини, відторгення Даний винахід також надає метод модуляції алотрансплантата, реакції антирецепторної гіперабо лікування принаймні одного захворювання чутливості, хвороба Грейвса, хвороба Рейно, інсузалежного від подвійного інтегрина в клітинах, ліно-резистентний діабет типу В, астма, myastenia тканинах, органах, тваринах або пацієнтах, як це gravis, антитіло-опосередкована цитотоксичність, відомо в науці або описано тут, з використанням реакції гіперчутливості типу III, системний червоодного подвійного інтегринового антитіла даного ний вовчак, синдром POEMS (полінейропатія, орвинаходу. ганомегалія, ендокринопатія, моноклональна гаДаний винахід також надає метод модуляції мопатія та синдром змін шкіри), полінейропатія, або лікування принаймні одного захворювання органомегалія, ендокринопатія, моноклональна залежного від подвійного інтегрина в клітинах, гамопатія, змішане захворювання сполучної ткатканинах, органах, тваринах або пацієнтах вклюнини, ідіопатична хвороба Аддісона, цукровий діачаючи, але не обмежуючись, принаймні одне з бет, хронічний активний гепатит, первинний біліатакого - ожиріння, імунно-залежні захворювання, рний цирроз, вітіліго, васкуліт, синдром серцево-судинні захворювання, інфекційні захвопостінфарктной кардіотомії, гіперчутливість типу рювання або неврологічні захворювання. IV, контактний дерматит, пневмоніт гіперчутливосДаний винахід також надає метод модуляції ті, відторгнення алотрансплантанту, гранульома або лікування принаймні одного захворювання внаслідок внутріклітинних організмів, медикамензалежного від подвійного інтегрина в клітинах, тозна чутливість, метаболічна/ідіопатична, хворотканинах, органах, тваринах або пацієнтах вклюба Вільсона, гемохроматоз, дефіцит альфа-1чаючи, але не обмежуючись, принаймні одне з антитрипсина, діабетична ретинопатія, тиреоїдит такого - ревматоїдний артрит, ювенільний ревмаГашимото, остеопороз, дослідження гіпоталамотоїдний артрит, ювенільний ревматоїдний артрит з гіпофізо-аренальної осі, первиний біліарний цирсистемним початком, псоріатичний артрит, анкілороз, тиреоїдит, енцефаломієліт, кахексія, кістозний зуючий спондиліт, виразка шлунка, серонегативні фіброз, хронічні легеневі захворювання новонароартропатії, остеоартрит, запальні захворювання джених, хронічні обструктивні захворювання лекишковика, виразковий коліт, системний червоний гень (ХОЗЛ), сімейний гепатофагоцитарний лімфововчак, антифосфоліпідний синдром, іридоцикгістиоцитоз, дерматологічні стани, псоріаз, літ/увеїт/неврит зорового нерву, ідіопатичний леалопеція, нефротичний синдром, нефрит, гломегеневий фіброз, системний васкуліт/гранульоматоз рулярний нефрит, гостра ниркова недостатність, Вегенера, саркоїдоз, орхіт/процедури зворотньої гемодіаліз, уремія, токсичність, преекампсія, okt3 вазектомії, алергічні/атопічні захворювання, астма, терапія, анти-ссіЗ терапія, лікування цитокінами, алергічні риніти, екзема, алергічний контактний хіміотерапія, радіаційна терапія (напр., включаюдерматит, алергічний кон'юктивіт, гіперчутливий чи, але не обмежуючись, тоастенія, анемія, кахекпневмоніт, трансплантанти, відторгнення транссія тощо), хронічна інтоксикація саліцилатами топлантованого органу, захворювання по типу шунтщо. Див., напр., Merck Manual, 12th-17th Editions, проти-господаря, синдром системної запальної Merck & Company, Rahway, NJ (1972, 1977, 1982, відповіді, септичний синдром, грам-позитивний 1987, 1992, 1999), Pharmacotherapy Handbook, сепсис, грам-негативний сепсис, культуроWells et al., eds., Second Edition, Appleton and негативний сепсис, грибковий сепсис, нейтропеніLange, Stamford, Conn. (1998, 2000), кожний з яких чна лихоманка, уросепсис, менінгококемія, травповністю включений тут у посиланнях. ма/кровотеча, опіки, опромінення іонізуючою радіДаний винахід також надає метод модуляції ацією, гострий панкреатит, гострий респіраторний або лікування принаймні одного серцеводистрес-синдром у дорослих, ревматоїдний артсудинного захворювання в клітинах, тканинах, оррит, алкоголь-індукований гепатит, хронічні запаганах, тваринах або пацієнтах включаючи, але не льні процеси, саркоїдоз, хвороба Крона, серповиобмежуючись, принаймні одне з такого - синдром дно-клітинна анемія, діабет, нефрох, атопічні кардіального оглушення, інфаркт міокарда, застійзахворювання, реакції гіперчутливості, алергічний на серцева недостатність, інсульт, ішемічний інриніт, сінна лихоманка, переніальний риніт, кон'юсульт, кровотеча, артеріосклероз, атеросклероз, ктивіт, ендометріоз, астма, кропивниця, системна рестеноз, діабетичне атеросклеротичне захворюанафілаксія, дерматит, пернициозна анемія, гемовання, гіпертензія, артеріальна гіпертензія, ренолітичні захворювання, тромбоцитопенія, відторгваскулярна гіпертензія, синкопе, шок, сифіліс сернення трансплантанта або будь-якого органа чи цево-судинної системи, серцева недостатність, тканини, реакції відторгення трансплантованих легеневе серце, первинна легенева гіпертензія, нирок, реакція відторгення трансплантованого аритмії серця, передсердні ектопічні скорочення, серця, реакція відторгення трансплантованої печітріпотіння передсердь, фібриляція передсердь нки, реакція відторгнення трансплантованої під(стійка або пароксизмальна), постперфузійний шлункової залози, реакція відторгнення транспласиндром, запальна відповідь на серцево-легеневе нтованих легенів, реакція відторгнення шунтування, хаотична або мультифокальна петрансплантованого кісткового мозку (ВМТ), відторредсердна тахікардія, звичайна тахікардія з вузьгення шкірного трансплантанта, відторгення хрякими комплексами QRS, певні аритмії, фібриляція щевого трансплантанта, відторгення кісткового шлуночків, аритмії з пучка Гіса, атріовентрикуляртрансплантанта, відторгення трансплантованого на блокада, блокада ніжок пучка Гіса, ішемічні міо 47 83988 48 кардіальні порушення, ішемічна хвороба серця, Даний винахід також надає метод модуляції стабільна стенокардія, інфаркт міокарда, кардіоміабо лікування принаймні одного злоякісного заопатія, дилатаційна застійна кардіоміопатія, рестхворювання в клітинах, тканинах, органах, тваририктивна кардіоміопатія, клапанні захворювання нах або пацієнтах включаючи, але не обмежуюсерця, ендокардит, захворювання перикарда, пухчись, принаймні одне з такого лини серця, аортальні та периферичні аневризми, нейродегенеративні захворювання, множинний розшарування аорти, запалення аорти, оклюзія склероз, мігренозний головний біль, комплекс абдомінальної аорти та її гілок, периферичні суСНІД деменція, демінієлізуючі захворювання, такі динні розлади, оклюзивні артеріальні розлади, як множинний склероз та гострий поперечний мієатеросклеротичне захворювання периферичних літ; екстрапірамідні та мозочкові захворювання, судин, облітеруючий тромбоангіїт, функціональні такі як пошкодження кортикоспінальної системи; розлади периферичних артерій, феномен і захворозлади базальних гангліїв або мозочкові порурювання Рейно, акроціаноз, еритромегалія, венозшення; гіперкінетичні рухові порушення, такі як ні захворювання, венозний тромбоз, варикозні хорея Гантінгтона та сенільна хорея; медикаменвени, артеріо-венозна фістула, лімфодерма, ліпотозно-індуковані рухові порушення, такі як ті, що дема, нестабільна стенокардія, реперфузійне поіндуковані препаратами, котрі блокують допамінові шкодження, пост-насосний синдром, ішемічнорецептори ЦНС; гіпокінетичні рухові розлади, такі реперфузійне пошкодження тощо. Такий метод як хвороба Паркінсона; прогресуючий супраядерможе додатково містити введення ефективної кіний параліч; структурні розлади мозочка; спіномолькості складу або фармацевтичного препарату, зочкові дегенерації, такі як спінальна атаксія, атакщо містить принаймні одне анти-подвійне інтегрисія Фрідрайха, мозочкова кортикальна нове антитіло, в клітину, тканину, орган, тварину дегенерація, множинні системні дегенерації або пацієнта при потребі такої модуляції або ліку[Mencel, Dejerine-Thomas, Shi-Drager та Machadoвання. Joseph]; системні розлади (хвороба Рефсама, Даний винахід також надає метод модуляції абеталіпопротеїнемія, атаксія, телангіектазія та або лікування принаймні одного інфекційного замітохондріальний багатосистемний розлад); деміхворювання в клітинах, тканинах, органах, твариєлінізуючі ядерні розлади, такі як множинний скленах або пацієнтах включаючи, але не обмежуюроз, гострий поперечний мієліт; та розлади моторчись, принаймні одне з такого - гостра або них складових, такі як нейрогенна м'язова атрофія хронічна бактеріальна інфекція, гострі та хронічні (дегенерація клітин переднього рогу, така як аміопаразитарні або інфекційні процеси, включаючи трофічний боковий склероз, спінальна м'язова бактеріальні, вірусні та грибкові інфекції, ВІЛ інфеатрофія немовлят та ювенільна спінальна м'язова кція/ВІЛ нейропатія, менінгіт, гепатит (А, В або С атрофія); хвороба Альцгемера; синдром Дауна у тощо), септичний артрит, перитоніт, пневмонія, середньому віці; дифузне захворювання Леві; сеепіглотит, e. coli 0157:h7, гемолітичний уремічний нільна деменція типу Леві; синдром Вернікесиндром/тромболітична тромбоцитопенічна пурпуКорсакоффа; хронічний алкоголізм; хвороба Кройра, малярія, геморагічна тропічна лихоманка, тцфельда-Якоба; підгострий склерозуючий паненлейшманіаз, лепра, токсичний шоковий синдром, цефаліт, хвороба Hallerrorden-Spatz; і dementia стрептококовий міозит, газова гангрена, мікобакpugilistica тощо. Такий метод може додатково теріальний туберкульоз, внутрішньоклітинна включати введення ефективної кількості складу mycobacteriun avium, пневмонія pneumocystis або фармацевтичного препарату, що містить приcarinii, запальне захворювання тазовиз органів, наймні одне антитіло до TNF або певної його часорхіт/епідидиміт, легіонела, хвороба Лайма, грип тини чи варіанта, в клітину, тканину, орган, тваритипу А, вір ус Епштейна-Барр, гемафагоцитарний ну або пацієнта при потребі такої модуляції або синдром сумісний з життям, енцефаліт/асептичний лікування. Див., напр., Merck Manual, 16th Edition, менінгіт тощо. Merck & Company, Rahway, NJ (1992). Даний винахід також надає метод модуляції Будь-який метод даного винаходу може вклюабо лікування принаймні одного злоякісного зачати введення ефективної кількості складу або хворювання в клітинах, тканинах, органах, тварифармацевтичного препарату, що містить принайнах або пацієнтах включаючи, але не обмежуюмні одне анти-подвійне інтегринове антитіло, в чись, принаймні одне з такого - лейкемія, гостра клітину, тканину, орган, тварину або пацієнта при лейкемія, гостра лімфобластна лейкемія (ALL), Bпотребі такої модуляції або лікування. Такий меклітинна, Т-клітинна або FAB ALL, гостра мієлоїдтод може додатково включати супутнє призначенна лейкемія (AML), хронічна мієлоцитарна лейкеня або комбіновану терапію для лікування таких мія (CML), хронічна лімфоцитарна лейкемія (CLL), імунних захворювань, де призначення вищеназваволосато-клітинна лейкемія, мієлодиспластичний ного принаймні одного анти-подвійного інтегриносиндром (MDS), лімфома, хвороба Годжкіна, злового антитіла, певної його частини чи варіанта, якісна лімфома, не-годжкінська лімфома, лімфома окрім того містить введення до, одночасно та/або Боркіта, множинна мієлома, саркома Капоші, копісля принаймні одного засобу з принаймні одного лоректальна карцинома, панкреатична карцинома, антагоніста TNF (напр., але не обмежуючись, анназофарингеальна карцинома, злоякісний гістиотитіло або фрагмент до TNF, розчинний рецептор цитоз, паранеопластичний синдром/гіперкальцемія або фрагмент до TNF, їхні зливні протеши або злоякісності, безпорожнині пухлини, аденокарцимлаа молекула антагоніста TNF), антиревматичнономи, саркоми, злоякісна меланома, гемангіома, го засобу (напр., метотрексат, ауранофін, ауротіометастатична хвороба, рако-залежна резорпція глюкоза, азатіоприн, етанерсепт, тіомалат натрія кісток, рако-залежний біль у кістках то що. золота, гідроксихлорохіна сульфат, лефлуномід, 49 83988 50 сульфасалазин), м'язового релаксанта, наркотичють діяльності TNFa in vitro, in situ та/або бажано ного препарату, нестероїдного протизапального in vivo. Наприклад, відповідне людське антитіло до препарату (НПЗП), анальгетичного препарату, TNF даного винаходу може зв'язувати TNFa та анестетичного препарату, седативного препарату, включає анти-TNF антитіла, їхні антиген-зв'язуючі місцевого анестетика, нервово-м'язового блокатофрагменти та певні їхні мутанти або домени, що ра, антимікробного засобу (напр., аміноглікозид, специфічно зв'язуються з TNFa. Належне антитіло антигрибковий препарат, антипаразитарний преабо фрагмент до TNF може також зменшити, блопарат, антивірусний препарат, карбапенем, цефакувати, припиняти, перешкоджати та/або пригнічулоспорин, фторхінолон, макролід, пеніцилін, сувати синтез РНК, ДНК або протеїну TNF, вивільльфонамід, тетрациклін, інший антимікробний нення TNF, сигнальну систему рецептора до TNF, препарат), антипсоріатичного засобу, кортикостемембранне розщеплення TNF, діяльність TNF, роїда, анаболічного стероїда, діабетологічного продукцію та/або синтез TNF. препарата, мінерала, харчового додатку, тиреоїдХимеричне антитіло сА2 містить антигенного препарату, вітаміна, кальцій-залежного горзв'язуючий варіабельний регіон високо-афінного мону, антидіарейного засобу, протикашльового нейтралізуючого мишиного антилюдського антитіпрепарату, антиеметика, противиразкового препала IgG1 до TNFa, позначений А2, та постійні регіорату, послаблюючого, антикоагулянта, еритропоени людського IgG1, каппа імунноглобулін. Fc регіон тина (напр., епоетин альфа), філграстима (напр., людського IgG1 покращує аллогенну ефекторну G-CSF, Нейподжен), сарграмостиму (напр., GMфункцію антитіла, підвищує час пів-життя циркуCSF, Лейкін), імунізації, імуносупресивного засобу ляції у сиворотці та зменшує імунногеність антиті(напр., базиліксимаб, циклоспорин, даклізумаб), ла. Спорідненість та епітопна специфічність химегормону роста, гормоно-замісної терапії, модуляричного антитіла сА2 походить з варіабельного тора естрогенових рецепторів, мудріатичних, цикрегіона мишине антитіло А2. В окремому впровалоплегічних, алкілуючих засобів, антиметаболітидженні, бажаним джерелом нуклеїнових кислот, ків, інгібіторів мітозу, радіоізотопних засобів, що кодують варіабельний регіон мишиного антитіантидепресантів, антиманічних препаратів, антила А2, є клітинна лінія гібридоми А2. психотиків, анксиолітиків, снодійних, симпатомімеХимеричне А2 (сА2) нейтралізує цитотоксичтиків, стимуляторів, донезепілу, такрину, астматиний ефект як природного, так і рекомбінантного чних препаратів, бета-агоністів, інгаляційних людського TNFa у дозо-залежний спосіб. З аналізу стероїдів, інгібіторів лейкториєну, метилксантину, зв'язування химеричного антитіла сА2 та рекомбікромоліну, адреналіну або аналогу, дорнази альнантного людського TNFa, константа афіності хифа (Пульмозим), цитокіна або цитокінового антамеричного антитіла сА2 була визначена як гоніста або антитіла. Відповідні дози добре відомі 1,04x1010 М-1. Бажані методи для визначення спев науці. Див., напр., [Wells et al., eds., цифічності та афіності моноклонального антитіла Pharmacotherapy Handbook, 2nd Edition, Appleton за допомогою конкурентного пригнічення можуть and Lange, Stamford, CT (2000); PDR бути знайдені в Harlow, et al, antibodies: A Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory 2000, Deluxe Edition, Tarascon Publishing, Loma Press, Cold Spring Harbor, New York, 1988; Colligan Linda, CA (2000), посилання з кожної з цих робіт et al, eds., Current Protocols in Immunology, Greene повністю включені тут у посиланнях. Publishing Assoc. And Wiley Interscience, New York, Антагоністи TNF, що підходять для препаратів, (1992-2000); Kozbor et al, Immunol. Today, 4:12-19 комбінованого лікування, супутнього призначення, (1983); Ausubel et al, eds. Current Protocols in пристроїв та/або методів даного винаходу (що Molecular Biology, Wiley Interscience, New York містять принаймні одне антитіло даного винаходу, (1987-2000); та Muller, Meth. En zymol, 92:589-601 певну його частину або варіант), включають, але (1983), посилання котрих повінстю включені тут у не обмежуються, анти-TNF антитіла, їхні антигенпосиланнях. зв'язуючі фрагменти и рецепторні молекули, які В окремому впровадженні, мишине моноклоспецифічно зв'язуються з TNF; компоненти, які нальне антитіло А2 виробляється клітинною лініперешкоджають та/або пригнічують синтез TNF, єю, що позначається С134А. Химеричне антитіло вивільнення TNF або його дію на цільові клітини, сА2 виробляється клітинною лінією, що позначатакі як талідомід, тенідап, інгібітори фосфодіестеється с 168А. рази (напр., пентоксифілін та роліпрам), агоністи Додаткові приклади моноклональних анти-TNF аденозинового рецептора А2b та посилювачі адеантитіл, що можуть бути використані в даному винизового рецептора А2b; компоненти, які поперенаході, описані в науці [див., напр., патент США № джають та/або пригнічують сигнальну систему ре5,231,024; Möller, Α. Et al, Cytokine 2(3):162-169 цептора до TNF, такі як інгібітори кінази мітоген (1990); заявка США № 07/943,852 (зареєстровано активованого протеїна (МАР); компоненти, що 11 вересня 1992); Rathjen et al, міжнародна публіблокують та/або пригнічують активінсть TNF, такі кація № WO91/02078 (опубліковано 21 лютого як інгібітори ангіотензин-перетворюючого фермен1991); Rubin et al, патентна публікація ЕРО №0218 ту (АПФ) (напр., каптоприл); та компоненти, що 868 (опубліковано 22 квітня 1987); Yone et al, паблокують та/або пригнічують продукцію та/або тентна публікація ЕРО № 0 288 088 (26 жовтня синтез TNF, такі як інгібітори МАР кінази. 1988); Liang, et al, Biochem. Biophys. Res. Comm. "Анти тіло до фактору некрозу пухлини", "анти757:847-854 (1986); Meager, et al, Hybridoma 6:305тіло до TNF", "антитіло до TNFa" або фрагменти 311 (1987); Fendly et al, Hybridoma 6:359-369 тощо, як тут використовується, зменшують, бло(1987); Bringman, et al, Hybridoma 6:489-507 (1987); кують, пригнічують, припиняють або перешкоджата Hirai, et al, J. Immunol. Meth. 96:51-62 (1987), 51 83988 52 посилання на котрі повністю включені тут у посиet al, Cytokine 6(6):616-623 (1994); Baker et al, Eur. ланнях]. J. Immunol 24:2040-2048 (1994); Beutler et al, паМолекули рецептора до TNF тент США № 5,447,851; та Заявка США № Бажані молекули рецептора до TNF корисні в 08/442,133 (зареєстровано 16 травня 1995), посилання на кожне з яких повінстю включено тут у даному винаході є тими, що зв'язують TNFa з випосиланнях]. Методи виробництва зливних молесокою афіністю [див., напр., Feldmann et al, міжнакул імуннорецептора можуть бути також знайдені у родна публікація № WO 92/07076 (опубліковано 30 квітня 1992); Schall et al, Cell 61:361-310 (1990); та Capon et al, Nature 537:525-531 (1989), посилання на котре повністю включено тут у посиланнях. Loetscher et al, Cell 67:351-359 (1990), посилання Функціональний еквівалент, похідне, фрагмент на котрі повністю включені тут у посиланнях] та або регіон молекули рецептора до TNF відноситьдодатково мають низьку імунногеність. Зокрема, ся до частини молекули рецептора до TNF або 55 кДа (р55 TNF-R) та 75 кДа (р75 TNF-R) рецептори до TNF на поверхні клітин є корисними в дачастини молекулярної послідовності рецептора до TNF, що кодує молекулу рецептора до TNF, що є ному винаході. Обмежені форми цих рецепторів, достатньої величини та послідовності для відтвощо містять екстрацелюлярні домени (ECD) рецепрення молекул рецептора до TNF, які можуть бути торів або їхніх функціональних частин [див., напр., використані в даному винаході (напр., зв'язують Corcoran et al, Eur. J. Biochem. 225:831-840 (1994)] є також корисними в даному винаході. Обмежені TNFa з високою афіністю та при низькій імунногеформи рецепторів до TNF, що містять ECD, були ності). Функціональний еквівалент молекули рецевиявлені у сечі та сиворотці, в якості 30кДа та птора до TNF також включає модифіковані молекули рецептора до TNF, що функціонально схожі 40кДа інгібіторно-зв'язуючих протеїнів до TNFa на молекули рецептора до TNF, які можуть бути [Engelmann, H. et al, J. Biol. Chem. 265:1531-1536 використані в даному винаході (напр., зв'язують (1990)]. Мультимеричні молекули рецептора до TNF та зливні молекули імуннорецептора до TNF TNFa з високою афіністю та при низькій імунногета їхні похідні і частини є додатковими прикладами ності). Напр., функціональний еквівалент молекумолекул рецептора до TNF, які є корисними в мели рецептора до TNF може містити кодон "SILENT" тодах та препаратах даного винаходу. Молекули ("ТИША") або одну чи більше амінокислотних зарецептора до TNF, які можуть бути використані у мін; або заміну одного кодону, що кодує однакові винаході характеризовані по їхній здатності лікуваабо різні гідрофобні амінокислоти для іншого коти пацієнтів протягом подовженого періода часу з дону, який кодує гідрофобні амінокислоти). Див. добрим або прекрасним послабленням симптома[Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, тики і низькою токсичністю. Низька імунногеність Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience, та/або висока афіність, а також інші невизначені New York (1987-2000)]. властивості, можуть робити внесок до досягнутих Цитокіни включають будь-який відомий цитотерапевтичних результатів. кін. Див., напр., CopewithCytokines.com. АнтагонісМультимеричні молекули рецептора до TNF ти цитокінів включають, але не обмежуються, корисні в даному винаході містять весь або функбудь-яке антитіло, фрагмент або міметик, будьціональну частину ECD двох або більше рецептоякий розчинний рецептор, фрагмент або міметик, рів до TNF пов'язані через один або більше полібудь-яку малу молекулу антагоніста або будь-яку пептидний поєднувач або інші непептидні їхню комбінацію. поєднувачі, такі як поліетилен гліколь (PEG). МуТерапевтичне лікування. Будь-який метод дальтимеричні молекули можуть окрім того містити ного винаходу може містити метод лікування розсиганльний пептид секретованого протеїна для ладів опосередкованих подвійним інтегрином, що спрямування експресії мультимеричної молекули. включає введення ефективної кількості складу або Ці мультимеричні молекули та методи їхнього вифармацевтичного препарату, який містить приготовлення були описані у Заявці США № наймні одне анти-подвійне інтегринове антитіло в 08/437,533 (зареєстровано 9 травня 1995), зміст клітину, тканину, орган, тварину або пацієнта, при якої повністю включений тут у посиланнях. потребі такої модуляції або лікування. Такий меЗливні молекули імуннорецептора до TNF, що тод може додатково окрім того включати супутнє є корисними в методах та складах даного винахопризначення або комбіновану терапію для лікуду, містять принаймні одну частину однієї або бівання таких імунних захворювань, де призначення льше імунноглобулінових молекул та всіх або фувищевказаного принаймні одного анти-подвійного нкціональної частини одного або більше інтегринового антитіла, певної його частини чи рецептора до TNF. Ці зливні молекули імуннореваріанта, окрім того включає призначення до, під цепторів можуть бути мономерами або гетеро- чи час та/або після принаймні одного, що обране з гомомультимерами. Зливні молекули імуннорецепринаймні з одного антагоніста TNF (напр., але не пторів можуть також бути моновалентними або обмежуючись, антитілом до TNF або фрагментом, мультивалентними. Прикладом такої зливної морозчинний рецептор до TNF або фрагмент, їхні лекули імуннорецептора до TNF є рецептор до зливні протеїни або малу молекулу антагоніста TNF/зливний протеїн IgG. Зливні молекули імунTNF), антиревматичного засоба (напр., метотрекнорецептора до TNF та методи їхнього виробницсат, ауранофін, ауроглюкоза, азатіоприн, етанертва були описані в науці [Lesslauer et al, Eur. J. септ, натрія тіомалат золота, гідроксихлорохіна Immunol. 27:2883-2886 (1991); Askenazi et al, Proc. сульфат, лефлуномід, сульфасалазин), м'язового Natl. Acad. Sei. USA 55:10535-10539 (1991); Peppel релаксанта, наркотиків, нестероїдних протизапаet al, J. Exp. Med. 774:1483-1489 (1991); Kolls et al, льних препаратів (НПЗП), анальгетиків, анестетиProc. Natl. Acad. Sei. USA 97:215-219 (1994); Butler ків, седативного препарату, місцевого анестетика, 53 83988 54 нервово-м'язового блокатора, антимікробного за7,5, 7,9, 8,0, 8,5, 8,9, 9,0, 9,5, 9,9, 10, 10,5, 10,9, 11, собу (напр., аміноглікозид, антигрибковий препа11,5, 11,9, 20, 12,5, 12,9, 13,0, 13,5, 13,9, 14,0, 14,5, рат, антипаразитарний препарат, антивірусний 4,9, 5,0, 5,5, 5,9, 6,0, 6,5, 6,9, 7,0, 7,5, 7,9, 8,0, 8,5, препарат, карбапенем, цефалоспорин, фторхіно8,9, 9,0, 9,5, 9,9, 10, 10,5, 10,9, 11, 11,5, 11,9, 12, лон, макролід, пеніцилін, сульфонамід, тетрацик12,5, 12,9, 13,0, 13,5, 13,9, 14, 14,5, 15, 15,5, 15,9, лін, інший антимікробний препарат), антипсоріати16, 16,5, 16,9, 17, 17,5, 17,9, 18, 18,5, 18,9, 19, 19,5, чного засобу, кортикостероїда, анаболічного 19,9, 20, 20,5, 20,9, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, стероїда, діабетологічного препарата, мінерала, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 96, харчового додатку, тиреоїдного препарату, вітамі100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, на, кальцій-залежного гормону, антидіарейного 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500 та/або засобу, протикашльового препарату, антиеметика, 5000 цг/мл сивороткової концентрації на однорапротивиразкового препарату, послаблюючого, зове або багаторазове введення, або будь-який антикоагулянта, еритропоетина (напр., епоетин їхній діапазон, значення або фракцію. альфа), філграстима (напр., G-CSF, Нейподжен), Альтернативно, доза, що призначається, може сарграмостиму (напр., GM-CSF, Лейкін), імунізації, змінюватися залежно від відомих факторів, таких імуносупресивного засобу (напр., базиліксимаб, як фармакодинамічні характеристики окремих циклоспорин, даклізумаб), гормону роста, гормопрепаратів та їх спосбі і шлях введення; вік, здоно-замісної терапії, модулятора естрогенових реров'я та вага реципієнт; природа та вираженість цепторів, мудріатичних, циклоплегічних, алкілуюсимптомів, тип супутнього лікування, частота лікучих засобів, антиметаболітиків, інгібіторів мітозу, вання та бажаний ефект. Зазвичай доза активного радіоізотопних засобів, антидепресантів, антимаінгридієнта може бути від приблизно 0,1 до 100 нічних препаратів, антипсихотиків, анксиолітиків, міліграм на кілограм ваги тіла. Як правило 0,1-50, снодійних, симпатоміметиків, стимуляторів, донета бажано 0,1-10 міліграм на кілограм на введення зепілу, такрину, астматичних препаратів, бетаабо у формах з уповільненим вивільненням є ефеагоністів, інгаляційних стероїдів, інгібіторів лейктоктивною для досягнення бажаних результатів. риєну, метилксантину, кромоліну, адреналіну або Як один із прикладів, лікування людей та твааналогу, дорнази альфа (Пульмозим), цитокіна рин може бути забезпечено в якості одноразового або цитокінового антагоніста або антитіла. або періодичного введення принаймні одного анЗазвичай, лікування патологічних станів здійститіла даного винаходу у дозі від 0,1 до 100 мг/кг, нюється за допомогою введення ефективної кільтакій як 0,5, 0,9, 1,0, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, кості або дози препарату принаймні одного анти12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, подвійного інтегринового антитіла, що всього, в 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 або 100 середньому, в діапазоні від принаймні приблизно мг/кг, на добу в принаймні один із днів 1, 2, 3, 4, 5, 0,01 до 500 міліграм принаймні одного анти6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, подвійного інтегринового антитіла на кілограм ваги 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, пацієнта на дозу, та бажано від принаймні прибли35, 36, 37, 38, 39 або 40, або альтернативно чи зно 0,1 до 100 міліграм антитіло/кілограм ваги падодатково у принаймні один із тижнів 1, 2, 3, 4, 5, цієнта на одноразове або багаторазове введення, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, залежно від певної активності, що міститься в да21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, ному препараті. Альтернативно, ефективна сиво35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 або 52, або альтернативно чи додаткороткова концентрація може містити 0,1-5000mг/мл во, у принаймні один із 1,2, З, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, сивороткової концентрації на одноразове чи багаторазове введення. Належні дози відомі практи12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 або 20 років, або будьяка їхня комбінація, з використанням одноразовочуючим медпрацівникам та, звісно, залежатимуть го, інфузійного або повторного введення. від окремого хворобливого стану, певної активносФорми дозування (препарату), що підходять ті препарату, що вводиться, та окремого пацієнта, для внутрішнього введення, загалом містять від якому проводиться лікування. В деяких випадках, для досягення бажаної терапевтичної кількості приблизно 0,1 міліграма до приблизно 500 міліграм активної речовини на одиницю або контейможе бути необхідним повторне введення, тобто, нер. В цих фармацевтичних препаратах активний повторні індивідуальні введення окремо дози, що інгридієнт зазвичай буде присутнім у кількості від моніторується чи вимірюється, де індивідуальні приблизно 0,5-99,999% ваги грунтуючись на загавведення повторюються доки не буде досягнуто бажана добова доза або ефект. льній вазі препарату. Для парентерального введення антитіло може Бажані дози можуть додатково включати 0,1, бути виготовлене в якості розчину, суспензії, ему0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, З, 4, 5, 6, 7, льсії або ліофілізованого порошка у поєднанні, або 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, окремо, з фармацевтично прийнятним парентера23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, льним розчинником. Прикладами таких розчинників є вода, фізіологічний розчин, розчин Рінгера, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 62, 63, 64, 65, розчин декстрози та 1-10% людський сиворотко66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, вий альбумін. Можуть також використовуватися 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, ліпосоми та неводні розчинники, такі як фіксовані 94, 95, 96, 97, 98, 99 та/або 100-500 мг/кг/введення або будь-який їхній діапазон, значення або фракмасла. Розчинник або ліофілізованний порошок може містити додатки, що підтримують ізотонічція, або до досягнення сивороткової концентрації ність (напр., натрія хлорид, маннітол) та хімічну 0,1, 0,5, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,5, 1,9, 2,0, 2,5, 2,9, 3,0, стабільність (напр., буфери та консерванти). Пре3,5, 3,9, 4,0, 4,5, 4,9, 5,0, 5,5, 5,9, 6,0, 6,5, 6,9, 7,0, 55 83988 56 парат стерилізується за допомогою відомих або синовіального, інтраторакального, внутріматковоналежних методик. го, інтравезикального, болюсного, вагінального, Належні фармацевтичні носії описані у більректального, букального, сублінгвального, інтрашості останніх видань Remington's Pharmaceutical назального або трансдермального шляхів. ПрепаSciences, A. Osol, стандартному базовому підручрат принаймні одного анти-подвійного інтегринонику в цій галузі. Альтернативне введення вого антитіла може бути приготовлений для Згідно з даними винаходом можуть використовикористання для парентерального (підшкірного, вуватися багато відомих та розроблених способів внутрім'язового або внутрівенного) чи будь-якого для введення фармацевтично ефективних кількоіншого введення, зокрема у формі рідинних розчистей принаймні одного анти-подвійного інтегринонів або суспензії; для використання при вагінальвого антитіла. В той час як в даному винаході виному або ректальному введенні, зокрема у напівкористано легеневе введення, інші способи твердих формах, таких як, але не обмежуючись, введення можуть використовуватися згідно з даформа порошка, назальних крапель чи аерозолю ним винаходом з належними результатами. або певних препаратів; або трансдермально, таких Подвійні інтегринові антитіла даного винаходу як, але не обмежуючись, гель, мазь, лосйон, суможуть бути доставлені за допомогою носія, в якоспензія або система пластирного введення с хімічсті розчину, емульсії, колоїда або суспензії, або в ними поліпшувачами, такими як диметил сульфокякості сухого порошка, з використанням будь-якого сид, для того щоб модифікувати структур у шкіри, з різноманіття пристроїв та методів, що підходять чи збільшити концентрацію препарата у трансдердля введення за допомогою інгаляції або інших мальному пластирі [Junginger, et al. В "Drug способів, описаних тут або відомих науці. Permeation Enhancement"; Hsieh, D. S., Eds., pp. Парентеральні препарати та введення 59-90 (Marcel Dekker, Inc. New York 1994, повністю Препарати для парентерального введення включений тут у посиланнях], або з оксидуючими можуть містити в якості звичайних додатків воду препаратами, що дають змогу нанесення препараабо фізіологічний розчин, поліалкілен гліколь, тату, який містить протеїни та пептиди, на шкіру (WO кий як поліетилен гліколь, масла рослинного похо98/53847), або нанесення електричних полів для дження, гідрогеновані нафталіни тощо. Водні або створення тимчасового шляху транспортування, маслянні суспензії для ін'єкцій можуть бути приготаких як електропорація, або для підвищення протовлені при використанні відповідних емульгаторів никнення заряджених препаратів через шкіру, таабо зволожувачів та суспендуючи х засобів, згідно ких як іонтофорез, або нанесення ультразвука, з відомими методами. Препарати для ін'єкцій мотакий як сонофорез [Патенти США №№ 4,309,989 жуть бути нетоксичними, такими, що не призначата 4,767,402] (вищенаведені публікації та патенти ються перорально, розчиненими засобами, такими повністю включені тут у посиланнях). як водний розчин або стерильний розчин для ін'єПульмональне/назальне введення кцій або суспензія у розчиннику. В якості придатноДля пульмонального введення, бажано, щоб го для вжитку розчинника дозволено використовупрепарат принаймні одного анти-подвійного інтегвати воду, розчин Рінгера, фізіологічний розчин ринового антитіла, подавався з розміром частинок, тощо; в якості звичайного розчинника, або суспенякий ефективний для досягнення нижніх дихальдуючого розчинника, може бути використане стених шля хів легенів або синусів. Згідно з даними рильне масло, що швидко невипаровується. З цією винаходом, принаймні одне анти-подвійне інтегриметою, може використовуватися будь-який тип нове антитіло може бути доставлене за допомонелетючого масла та жирної кислоти, включаючи гою різноманіття інгаляційних або назальних приприродні або синтетичні або напівсинтетичні жирні строїв, що відомі в науці для введення масла чи жирні кислоти; природні або синеттичні терапевтичних препаратів за допомогою інгаляції. або напівсинтетичні моно- чи ди- чи тригліцериди. Ці пристрої, що спроможні відкладати аерозольні Парентеральне введення відомо в науці і включає, препарати у порожнині синуса або альвеолах паале не обмежується, стандартні засоби ін'єкційноцієнта, включаючи інгалятори, які відмірюють дозу, го введення, газопресові безголокові ін'єкційні небулайзери, сухопорошкові генератори, спреєри пристрої, як це [описано в Патенті США № тощо. Ін ші пристрої, що підходять для проведення 5,851,198, та лазерний перфораторний пристрій, пульмонального або назального введення антитіл, як це описано в Патенті США № 5,839,446], що також відомі в науці. Всі такі пристрої можуть виповністю включені тут у посиланнях. користовувати препарати, які підходять для ввеАльтернативний пристрій дення диспенсованого антитіла в аерозолі. Такі Винахід окрім того відноситься до введення аерозолі можуть складатися як з розчинів (як водпринаймні одного анти-подвійного інтегринового них, так і неводних), таких із твердих частинок. антитіла за допомогою парентерального, підшкірІнгалятори, що відмірюють дозу, по типу дозуючоного, внутрішньом'язового, внутрівенного, внутріго інгалятора Ventolin®, зазвичай використовують суглобового, інтарбронхіального, інтраабдомінапропелентний газ а потребують запуска під час льного, інтракапсулярного, інтрахрящевого, вдиху [Див., напр., WO 94/16970, WO 98/35888]. інтракавітарного, інтрацеліального, інтрамозочкоСухопорошкові інгалятори по типу Turbuhaler™ вого, інтрацеребровентрикулярного, в товстий (Astra), Rotahaler® (Glaxo), Diskus® (Glaxo), інгалякишковик, інтрацервікального, інтрагастрального, тор Spiros™ (Dura), пристрої, що продаються внутріпечінкового, внутріміокардіального, інтраосInhale Therapeutics, та порошковий інгалятор теального, внутрітазового, інтраплеврального, Spinhaler® (Fisons), використовують дихальний інтрапростатового, внутрілегеневого, інтраректазапуск змішанного порошка [US 4668218 Astra, ЕР льного, внутріниркового, інтраспінального, інтра237507 Astra, WO 97/25086 Glaxo, WO 94/08552 57 83988 58 Dura, US 5458135 Inhale, WO 94/06498 Fisons, пощо. Типові карбогідрати, які корисні при приготувністю включені тут у посиланнях]. Небулайзери ванні протеїнового складу антитіла, включають (розпилювачі) по типу AER x™ Aradigm, небулайсахарозу, маннітол, лактозу, трегалозу, глюкозу зер Ultravent® (Mallinckrodt) та небулайзер Acorn тощо. Протеїновий склад антитіла препарату таII® (Marquest Medical Products) (US 5404871 кож може включати сурфактант, який може зменAradigm, WO 97/22376), вищенаведенні посилання шувати або попереджати поверхне-індуковану повністю включені тут у посиланнях, продукують агрегацію протеїнового складу антитіла, що сприаерозолі з розчинів, тоді як дозуючі інгалятори, чинена атомізацією розчину при утворенні аерозосухопорошкові інгалятори тщо генерують аерозолі лю. Можуть застосовуватися різноманітні традиз малих частинок. Ці специфічні приклади комерційні сурфактанти, такі як ефіри та алкоголі ційно доступних пристроїв призначені бути предполіексиетиленових жирних кислот і ефіри поліоставниками специфічних пристроїв, що підходять ксиетилен сорбітолових жирних кислот. Кількості для застосування даного винаходу, та не є обмезагалом перебувають у діапазоні від 0,001 до 14% женням рамок даного винаходу. Бажано, щоб превід ваги препарата. Особливо бажаними сурфакпарат, який містить принаймні одне анти-подвійне тантами для мети даного винаходу є поліоксиетиінтегринове антитіло поставлявся у вигляді сухолен сорбітан моноолеат, полісорбат 80, полісорпорошкового інгалятора або спреєра. Існують дебат 20 тощо. Додаткові компоненти відомі науці кілька бажаних характеристик інгаляційного придля утворення протеїна, такого як подвійні інтегстрою для введення принаймні одного антитіла ринові антитіла, або певні їхні частини чи варіанти, даного винаходу. Наприклад, введення за допомоможуть також включатися в препарат. гою інгаляційного пристрою має переваги в плані Введення препарату подвійного інтегринового надійності, відтворюваності та акуратності. Інгаляантитіла за допомогою небулайзера ційний пристрій може додатково доставляти малі Протеїновий склад антитіла може бути введено за допомогою небулайзера, такого як потоковий сухі частинки, напр. менші, ніж приблизно 10mΜ, небулайзер або ультразвковий небулайзер. Забажано приблизно 1-5mΜ, для хорошого проникзвичай, в потоковому небулайзері, використовунення через дихальні шляхи. ється джерело скомпресованого повітря для ствоВведення подвійного інтегринового антитіла. рення високошвидкісного потоку повітря через Препарати у вигляді спрею отвір. По тому як газ поширюється за сопло, ствоСпрей, що включає препарат протеїна подвійрюється ділянка низького тиску, який витягує розного інтегринового антитіла, може бути виготовлечин протеїнового складу антитіла через капілярну ний за допомогою прогонки під тиком суспензії чи трубку, що під'єднана до резервуара з рідиною. розчину принамйні одного анти-подвійного інтегСтрумінь рідини з капілярної трубки розбивається ринового антитіла через сопло. Розмір та конфігуна нестабільні частинки та краплі, що створює аерація сопла, тиск та швидкість поставки рідини розоль. Можуть застосовуватися цілий діапазон можуть підбиратися для досягнення бажаного виконфігурацій, швидкості потока та типу дефлектоходу та розмірів часток. Електроспрей може бути ра для досягення бажаних характеристик в даному виготовлений, наприклад, за допомогою електричпотоковому небулайзері. В ультразвуковому небуного поля у поєднанні з прогонкою через капіляр лайзері, для створення вібраційної, механічної або сопло. Частинки препарату протеїна принайменергії використовується високочастотна електроні одного анти-подвійного інтегринового антитіла, енергія, що зазвичай потребує використання п'єщо доставляються спреєром, переважно мають зоелектричного трансдюсера. Ця енергія передарозмір менше, ніж приблизно 10mм, бажано у діається на препарат протеїнового складу антитіла пазоні від приблизно 1mΜ до приблизно 5mΜ, і або безпосередньо, або через сполучену рідину, найбажаніше від приблизно 2mΜ до приблизно що створює аерозоль, який включає протеїновий 3mΜ. склад антитіла. Переважно, частинки протеїнового Препарати протеїну принаймні одного антискладу антитіла, які постачаються за допомогою подвійного інтегринового антитіла, що підходить небулайзера, мають бути розміром менше, ніж для використання зі спреєром, зазвичай включа10mΜ, бажано в діапазоні від приблизно 1mΜ до ють протеїновий склад антитіла у водному розчині приблизно 5mΜ, і ще бажаніше від приблизно 2mΜ в концентрації від приблизно 0,1мг до приблизно до приблизно 3mΜ. 100мг протеїнового складу принаймні одного антиПрепарати принаймні одного анти-подвійного подвійного інтегринового антитіла на мл розчину інтегринового антитіла, що підходять для викорисабо мг/г, або будь-який їхній діапазон чи значення, тання з небулайзером, як потоковим, так і ультранапр., але не обмежуючись, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, звуковим, зазвичай включають концентрацію від 0,6, 0,7, 0,8, 0 ,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, приблизно 0,1мг до приблизно 100мг протеїна 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, принаймні одного анти-подвійного інтегринового 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 або антитіла на мл розчину. Препарат може включати 100мг/мл чи мг/г. Препарат може включати такі такі компоненти, як додатки, буфер, ізотонічний компоненти, як додатки, буфер, ізотонічний комкомпонент, консервант, сур фактант та, бажано, понент, консервант, сурфактант та, бажано, цинк. цинк. Препарат також може включати додаток або Препарат також може включати додаток або комкомпонент для стабілізації протеїнового складу понент для стабілізації протеїнового складу антиантитіла, такий як буфер, пом'якшуючий компотіла, такий як буфер, пом'якшуючий компонент, нент, основний протеїн або карбогідрат. Основний основний протеїн або карбогідрат. Основний пропротеїн, що корисний при підготовці протеїнового теїн, що корисний при підготовці протеїнового складу антитіла, включає альбумін, протамін тоскладу антитіла, включає альбумін, протамін то 59 83988 60 що. Типові карбогідрати, які корисні при приготупротеїна, такі як протеїн можуть бути також вклюванні протеїнового складу антитіла, включають чені у препарат. сахарозу, маннітол, лактозу, трегалозу, глюкозу Ті, хто має належну кваліфікацію в даній галутощо. Протеїновий склад антитіла препарату тазі, визнають, що методи даного винаходу можуть кож може включати сурфактант, який може зменбути досягн уті за допомогою пульмонального ввешувати або попереджати поверхне-індуковану дення препаратів принаймні одного антиагрегацію протеїнового складу антитіла, що сприподвійного інтегринового антитіла з використанчинена атомізацією розчину при утворенні аерозоням пристроїв, які тут не описані. лю. Можуть застосовуватися різноманітні традиПероральні препарати та їх введення ційні сурфактанти, такі як ефіри та алкоголі Препарати для перорального призначення баполіексиетиленових жирних кислот і ефіри поліозуються на супутньому використанні ад'ювантів ксиетилен сорбітолових жирних кислот. Кількості (напр., резоциноли та неіонні сурфактанти, такі як загалом перебувають у діапазоні від 0,001 до 14% поліоксиетилен олеїловий ефір та nвід ваги препарата. Особливо бажаними сурфакгексадецилполіетиленовий ефір) для штучного тантами для мети даного винаходу є поліоксиетипідвищення проникності стінок тонкого кишковика, лен сорбітан моноолеат, полісорбат 80, полісора також на супутньому використанні ензиматичних бат 20 тощо. Додаткові компоненти відомі науці інгібіторів (напр., інгібітори панкреатичного трипдля утворення протеїна, такого як подвійні інтегсина, диізопропілфторофосфат (DFF) та тразилол) ринові антитіла, або певні їхні частини чи варіанти, для пригнічення ферментного розщеплення. Актиможуть також включатися в препарат. вні складові препарату у тверій формі для пеораВведення препаратів подвійного інтегринового льного прийому можуть бути змішані з принаймні антитіла за допомогою дозуючих інгаляторів одним додатком, включаючи сахарозу, лактозу, У дозуючому інгаляторі (MDI), пропелент, прицелюлозу, маннітол, трегалозу, рафінозу, мальтинаймні одне анти-подвійне інтегринове антитіло та тол, декстран, крохмалі, агар, аргінати, хітини, будь-які додатки містяться у балончику, в якості хітозани, пектини, трагакантова камідь, арабікова суміші, що включає зріджений скомпресований газ. смола, желатин, колаген, казеїн, альбумін, синеЗапуск дозуючого клапану вивільняє суміш у вигяттичний або напівсинтетичний полімер та гліцелді аерозолю, що бажано має містити частинки в рид. Ці форми також можуть містити інші типи додатків, напр., неактивний розчинюючий компонент, діапазоні розміру від менше, ніж приблизно 10mм, любрікант, такий як магнія стеарат, парабен, конбажано від приблизно 1mм до приблизно 5mм, та сервант, такий як цистеїн, дезінтегратор, зв'язуще бажаніше від приблизно 2mΜ до приблизно вач, потовщувач, буферний компонент, посоло3mΜ. Бажаний розмір частинок аерозолю може джуючий компонент, ароматизуючий компонент бути отриманий при застосуванні препарату протощо. теїнового складу антитіла, що отриманий за допоТаблетки та пігулки можуть окрім того бути вимогою різноманітних методів, відомих тим, хто є готовлені в якості препаратів із спеціальним захифа хівцем в даній галузі, включаючи потрібнення сним покриттям. Рідинні препарати для пероральструменя, висушення спрея, конденсацію в критиного прийому включають емульсію, сироп, еліксир, чній точці тощо. Бажані дозуючі інгалятори вклюсуспензію та розчинні препарати, що дозволяютьчають ті, що вироблені 3М або Glaxo та викорисся для медичного використання. Ці препарати мотовують гідрофторовуглецевий пропелент. жуть містити неактивний розчинюючі компоненти, Препарати принаймні одного анти-подвійного що зазвичай використовуються у вищезгаданій інтегринового антитіла для використання у пригалузі, напр., вода. Ліпосоми також були описані як строях дозуючи х інгаляторів загалом включатисистеми доставки препарата для інсуліна та гепамуть чітко розділений порошок, що містить пририна [Патент США № 4,239,754]. Нещодавно, для наймні одне анти-подвійне інтегринове антитіло, в доставки фармацевтичних засобів були викорисякості суспензії у неводному середовищі, напритані мікросфери штучни х полімерів змішанних аміклад, суспендований у пропеленті за допомогою нокислот (протеноїди) [Патент США № 4,239,673]. сур фактанта. Пропелентом може бути будь-який Окрім того, науці відомі компоненти носіїв для петрадиційний матеріал, що використовується для рорального прийому, що були описані в [Патенті цієї мети, такий як хлорофторвуглець, гідрохлоСША № 5,879,681 та Патенті США № 5,5,871,753]. рофторвуглець, гідрофторовуглець або гідровугМукозальні препарати та їх введення лець, включаючи трихлорофторометан, дихлороДля всмоктування через слизові поверхні, дифторометан, дихлоротетрафтороетанол та препарати та методи введення принаймні одного 1,1,1,2-тетрафтороетан, HFA-134a (гідрофтороаланти-подвійного інтегринового антитіла включають кан-134а), HFA-227 (гідрофтороалкан-227) тощо. емульсію, що містить велику кількість субмікронБажаним пропелентом є гідрофторовуглець. С урних частинок, мукоадгезивні макромолекули, біофактант може бути взятим для стабілізації приактивний пептид та безперервну водну фазу, яка наймні одного анти-подвійного інтегринового антипокращує абсорбцію через слизові поверхні за тіла в якості суспензії в пропеленті, для захисту допомогою досягення мукоадгезії частинок емульактивного компоненту від хімічної деградації тощо. сії [Патент США № 5,514,670]. Слизові поверхні, Належні сурфактанти включають сорбітана триощо підходять для нанесення емульсій даного вилеат, соєвий лецитин, олеєву кислоту то що. В денаходу, можуть включати рогівковий, кон'юктиваяких випадках бажаними є розчинні аерозолі, що льний, буккальний, сублінгвальний, назальний, використовують такі розчинники, як етанол. Додатвагінальний, пульмональний, шлунковий, інтестикові компоненти, які відомі в науці, для утворення нальний та ректальний шляхи введення. Препара