Спосіб моделювання медикаментозного ураження печінки щурів

Реферат: Спосіб моделювання медикаментозного ураження печінки щурів включає введення піддослідній тварині гепатотоксичного препарату. Проводять внутрішньочеревне введення диклофенаку у дозах 5-10 мг/кг, причому самкам - щоденно протягом 4 діб (кумулятивна доза 40 мг/кг), самцям - дворазово, щодоби у кумулятивній дозі 10 мг/кг та проводять прижиттєве динамічне дослідження за допомогою ультразвукової діагностики органів тварини, контроль лабораторних показників крові та виконують прицільну біопсію під контролем УЗД. UA 98459 U (12) UA 98459 U UA 98459 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до медицини та біології і може бути використана у науководослідній роботі при вивченні ультраструктурних і метаболічних закономірностей перебігу запальних процесів у печінці після застосування ксенобіотиків та ліків, що впливають на функцію печінки та кровоносних судин. Лікарські препарати, які надходять у організм, підлягають метаболічним перетворенням. Останні під впливом ферментів здатні утворювати високореакційні форми, що можуть пошкоджувати нуклеїнові кислоти та білки клітини, що супроводжується явищами гепатотоксичності. Розробка адекватних моделей гепатотоксичності дозволяє модулювати патологічні процеси ураження печінки під впливом хімічних речовин, які здатні змінювати ферментативну активність конститутивних та індукованих ізозимів Р 450. Доцільність відтворення модельних систем на піддослідних тваринах, обумовлена неможливістю відтворити взаємодію молекул клітин, органів, організму та навколишнього середовища навіть за допомогою найпотужніжих комп'ютерних систем з застосуванням адаптованих математичних моделей [Science, Medicine, and Animals", Institute for Laboratory Animal Research, Published by the National Research Council of the National Academies 2004; page 2.]. Відмінності у фармакокінетики та фармакодинаміки лікарських засобів у різних людей часто виявляються причиною виникнення ускладнень з боку печінки, це потребує персоналізованого підходу до вибору лікарського засобу та проведення додаткових досліджень реакцій організму на препарат або його метаболіти. Саме тому необхідно створювати стандартизовані модельні системи, які адекватно відображають медикаментозні ураження печінки. Відомий спосіб моделювання токсичного медикаментозного гепатиту, який здійснюється введенням ізоніазиду у дозі 50 мг/кг та рифампіцину у дозі 86 мг/кг маси тіла щурам - внутрішньошлунково, щоденно, у дозах, що використовуються у клінічній практиці [Бережна Л.Г., Коваленко В.М., Вороніна А.К., Шаяхметова Г.М., Волошина О.С. Гепатопротекторний ефект експериментальної полівітамінної композиції за умов індукції цитохрому Р-450 2Е1 ізоніазидом і рифампіцином // Совр. пробл. токсикологии - 2005. - № 3. - С. 54-58]. Недоліком методу застосування ізоніазиду та рифампіцину є тривалий, протягом 28 діб, внутрішньошлунковий шлях введення препаратів та ураження ферментної системи цитохрому Р-450 2Е1, оскільки 50 % лікарських засобів метаболізуються за допомогою цитохрому Р-450 CYP3A (Нu, N… Нu, М., Duan, R., Liu, С, Guo, H., Zhang, M., Yu, Y., Wang, X., Liu, L., Liu, X. Increased levels of fatty acids contributed to induction of hepatic CYP3A4 activity induced by diabetes-In vitro evidence from HepG2 cell and Fa2N-4 cell lines (Article) // Journal of Pharmacological Sciences Volume 124, Issue 4, 2014, Pages 433-444), що потребує розробки адекватних моделей медикаментозного ураження печінки. Перевага диклофенак-індукованої моделі ураження печінки обумовлена активацією CYP3A і CYP2C цитохром Р450-залежних моно оксидаз, які у людини та щурів задіяні у метаболізмі препарату (Lauer В, Tuschl G, Kling M, Mueller SO. Species-specific toxicity of diclofenac and troglitazone in primary human and rat hepatocytes // Chem Biol Interact. 2009 Apr 15; 179(1): 17-24.). При цьому, біотрансформація диклофенак (DCF) у людини та щурів супроводжується утворенням спільних метаболітів 3'-гідрокси-4'-гідрокси-5-гідрокси-4',5-дигідрокси - DCF. (Bort R, Масé К, Boobis A, Gómez-Lechón MJ, Pfeifer A, Castell J Hepatic metabolism of diclofenac: role of human CYP in the minor oxidative pathways. // Biochemical pharmacology 58:5 1999 Sep 1 pg 787-96 Lauer B, Tuschl G, Kling M, Mueller SO. Species-specific toxicity of diclofenac and troglitazone in primary human and rat hepatocytes // Chem Biol Interact. 2009 Aprl5; 179(l):17-24). Shen S, Hargus SJ, Martin BM, Pohl LR. Cytochrome P4502C11 is a target of diclofenac covalent binding in rats // Chem Res Toxicol. 1997 Apr; 10(4):420-3.). Зважаючи на те, що DCF метаболізується декількома цитохромами, що мають спорідненість та функціональну схожість в межах Р450 підродини можливе використання щурів для оцінки шляхів біотрансформації препарату та ризиків його застосування. Необхідно враховувати той факт, що у щурів єдина невелика доза DCF (1,5 мг/кг), призводить до розвитку кишкової виразки (Seitz S, Boelsterli UA. Diclofenac acyl glucuronide, a major biliary metabolite, is directly involved in small intestinal injury in rats. Gastroenterology. 1998 Dec; 115(6):1476-1482.; Atchison CR1, West AB, Balakumaran A. Hargus SJ, Pohl LR, Daiker DH, Aronson JF. Hoffmann WE, Shipp BK,Treinen-Moslen M. Drug enterocyte adducts: possible causal factor for diclofenac enteropathy in rats. Gastroenterology. 2000 Dec; 119(6):1537-47.) Так, відомий спосіб моделювання медикаментозного гастроентериту з виразково-ерозійним процесом у лабораторних щурів (Терещенко С.В., Мельничук Д.О., Грищенко В.А., Реброва З.Б. Патент України: 83904), який здійснюється пероральним введенням DCF у різних дозах від 2,5 до 4,5 мг/кг, впродовж 14 діб, що дозволяє викликати середню та важку ступінь захворювання. Недоліком способу є значна тривалість терміну моделювання медикаментозного 1 UA 98459 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 гастроентериту з виразково-ерозійним процесом та не представлено ступеня ушкодження печінки. Відомий метод експериментальної моделі гастродуоденіту (патент RU 2195024 С2, 20.12.2002, Кнышова В.В., Иванов Е.М. Способ моделирования гастродуоденита, ассоциированного с гиперлипидемией), полягає в тому, що тварин утримують на дієті, яка включає холестерин, протягом 5-6 тижнів, а потім на фоні холестеринового навантаження впродовж 8-10 діб інтрагастрально вводять нестероїдні протизапальні засоби, які попередньо розчиняють у 10 % розчині медичної жовчі. Недоліком даного способу є значна тривалість терміну моделювання гастродуоденіту і більш складний (інтрагастральний) метод введення нестероїдних протизапальних засобів, не представлено ступеня ушкодження печінки. Така висока гепатотоксичність у щурів пов'язана з метаболітом DCF ацилглюкуронід, що викликає травматичні ураження у тонкому кишечнику щурів (Seitz, S Boelsterli, UA (1998) Diclofenac acyl glucuronide, a major biliary metabolite, is directly involved in small intestinal injury in rats. Gastroenterology. 115: 7476-1482.; Saitta KS, Zhang C, Lee KK, Fujimoto K. Redinbo MR, Boelsterli UA. Bacterial β-glucuronidase inhibition protects mice against enteropathy induced by indomethacin, ketoprofen or diclofenac: mode of action and pharmacokinetics. // Xenobiotica. 2014 Jan; 44(l):28-35.) Відома модель ентеропатій, що створена на мишах (Amanda LoGuidice, Bret D. Wallace, Lauren Bendel, Matthew R. Redinbo, and Urs A. Boelsterli Pharmacologic Targeting of Bacterial βGlucuronidase Alleviates Nonsteroidal Anti-inflammatory Drug-Induced Enteropathy in Mice // JPET Fast Forward. Published on February 10, 2012 as DOI: 10.1124/jpet. 111.191122) шляхом інтраперитонеального введення DCF у дозі 60 мг/кг. Недоліком моделі є не можливість візуалізації патологічного стану тварини та одержання прижиттєвого оцінювання стану печінки за допомогою біопсії. Модель гепатотоксичності індукована DCF, який вводили щурам перорально у дозі 10 мг/мл/кг маси тіла протягом 28 діб (Shyamal K. Das, Chandan Roy The protective role of benincasa hispida on diclofe nac sodium induced hepatotoxicity in albino rat model // International Journal of Pharmaceutical Research & Development 2011; Vol 3(11): January-2012 (171-179), характеризується дослідженнями біохімічних показників функції печінки та оцінки роботи ферментного ряду оксидативної системи тварин (супероксид дисмутази та каталази). Недоліком моделі є значна тривалість терміну моделювання, відсутність комплексного дослідження ультразвукових параметрів, як, наприклад, доплерографія, та відсутність фіксування прижиттєвих гістологічних змін у гепатоцитах під впливом DCF. Найближчим аналогом корисної моделі, що заявляється, є спосіб моделювання гепатотоксичності у щурів [Xiaomin Deng, Robert F. Stachlewitz, Michael J. Liguori, Eric A.G. Blomme, Jeffrey F. Waring, James P. Luvendyk, Jane F. Maddox, Patricia E. Ganey, Robert A. Roth Modest Inflammation Enhances Diclofenac Hepatotoxicity in Rats: Role of Neutrophils and Bacterial Translocation // J Pharmacol Exp Ther December 2006 vol. 319 no. 3 p. 1191-1199), який здійснюється інтраперитонеальним введенням DCF (Sigma-Aldrich) у дозі 20 мг/кг в поєднанні з 6 негепатотоксичною дозою ЛПС [29 × 10 endotoxin units (EU)/kg; catalog number L-2880, lot 072K4095; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO]. Така, схема введення препаратів, дозволяла вже через 6 год., реєструвати пошкодження клітин печінки за гістостологічними даними. Недоліком представленої моделі є необхідність проводити забій тварин, для дослідження ступеня пошкодження клітин печінки та короткий термін спостереження за тваринами, неможливість спостерігати хронічне ураження, а також відсутність опосередкованої оцінки ушкоджень, за наявністю трансаміназ у циркуляції. За прототип способу моделювання медикаментозного гепатиту, що пропонується, є спосіб (Сердюков Я.К., Литвиненко О.М., Грищенко В.А. Патолого-анатомічні та гістологічні зміни в печінці щурів за медикаментозного гепатиту// Совр. пробл. токсикологии - 2008. - № 2. - С. 6365.), який здійснюється пероральним введенням DCF щурам у дозі, що перевищує терапевтичну у 18 разів - 25 мг/кг, щоденно, впродовж 30 діб. Недоліком способу є значна тривалість терміну моделювання медикаментозного гепатиту та перевищення терапевтичної дози DCF. В основу корисної моделі поставлено задачу удосконалити спосіб моделювання на дрібних лабораторних тваринах патологічного стану гепатотоксичності, підвищення об'єктивності реєстрації змін та відтворюваності моделювання за рахунок прижиттєвого динамічного обстеження піддослідних тварин шляхом використання ультразвукової візуалізації високочастотними датчиками, що дозволяє застосовувати та проводити дослідження нових лікарських засобів. Поставлена задача вирішується тим, що питання зменшення кількості втрат дрібних тварин та підвищення якості експерименту за рахунок прижиттєвої оцінки змін тканин тварин є досить актуальним завданням (Кожемякин Ю.М., Хромов О.С., Філоненко М.А., Сайфетдінова Г.А. 2 UA 98459 U 5 10 15 20 25 30 35 Науково-практичні рекомендації з утримання лабораторних тварин та роботи з ними. МОЗУ, Фармкомітет. Київ, 2002. - 156 с.). Крім цього, використання нашої моделі дозволяло контролювати наявність маркеру ушкодження печінки аланінамінотрансферази у циркуляції, шляхом періодичного забору крові та отримання та дослідження біопунктатів печінки тварин під контролем ультразвукової візуалізації. Спосіб виконується таким чином: Піддослідній тварині проводять внутрішньоочеревне введення DCF у дозах 5-10 мг/кг, причому самкам - щоденно протягом 4 діб (кумулятивна доза 40 мг/кг), самцям - дворазово, щодоби у кумулятивній дозі 10 мг/кг та проводять прижиттєве динамічне дослідження за допомогою ультразвукової діагностики органів тварини, контроль лабораторних показників крові та виконують прицільну біопсію під контролем УЗД. Приклад № 1 З експериментальних щурів лінії Вістар (N=160) масою 180-220 г, було сформовано 6 груп тварин - чотири дослідні (по 30 голів у кожній) та дві контрольні. Утримання тварин здійснювали згідно з методичними рекомендаціями "Утримання тварин у віваріях" (Київ-1976), затвердженими МОЗ України. Усі експерименти проводились з дотриманням "Загальних етичних принципів експериментів на тваринах", ухвалених першим національним конгресом з біоетики (м. Київ, 2001) та узгоджених із положенням "Європейської конвенції щодо захисту хребетних тварин, які використовуються для експериментальних та інших наукових цілей". Тваринам дослідних групп вводили (Диклофенак-Дарниця розчин для ін'єкцій 2,5 %, 25 мг/мл), щодоби інтраперитонеально. Першу та другу досліду групу складали самки, яким вводили DCF у дозах відповідно 5 та 10 мг/кг впродовж 4 діб (кумулятивні дози 20 та 40 мг/кг). Третю та четверту дослідні групи складали самці, що отримували DCF у дозах відповідно 5 та 10 мг/кг впродовж 2 діб (кумулятивні дози 10 та 20 мг/кг). До контрольних п'ятої та шостої груп (по 20 голів у кожній) віднесли інтактних самок та самців. Доза препарату для кожної статті була підібрана експериментально. Оскільки DCF в одній і тій самій концентрації проявляв досить різний токсичний ефект, залежно від статі тварин. Так, дворазове введення препарату самцям у кумулятивної дозі 20 мг/кг або чотириразове самкам (40 мг/кг) супроводжувалось загибеллю 10 % тварин на 5-6 добу після останньої ін'єкції DCF. Починаючи з другої доби після останньої ін'єкції препарату тварини дослідних груп становились млявими та кволими. Через три та дев'ять тижнів після останньої ін'єкції препарату за даними УЗД реєстрували дифузні зміни у печінці тварин, розширення ворітної вени, порушення портального кровоплину, спленомегалію, асцит, гідроторакс, нефропатію тощо. Біопунктати печінки отримували за допомогою пункційного втручання під контролем УЗ візуалізації (фіг. 5). Ступінь пошкодження гепатоцитів у динаміки досліду оцінювали за показниками АЛТ в сироватці крові дослідних тварин. Результати виконання способу наведені в таблиці 1. 40 Таблиця 1 Зміна накопичення АЛТ у сироватці крові самиць лабораторних щурів Вістар при DCF індукованої гепатотоксичності Період спостереження, початок експерименту Pre 1 доба 4 доба 10 доба 20 доба 30 доба 40 доба Normal Values Період спостереження, після закінчення застосування DCF ALT (U/L) 43 46 46 46 65 112 129 < 42 0 6 доба 16 доба 26 доба 36 доба 3 Кумулятивна доза DCF started DCF stopped 40 мг/кг UA 98459 U Таблиця 2 Зміна накопичення АЛТ у сироватці крові самців лабораторних щурів Вістар при DCF індукованої гепатотоксичності Період спостереження, початок експерименту Pre 1 доба 2 доба 10 доба 20 доба 30 доба 40 доба Normal Values 5 10 15 20 25 30 35 40 Період спостереження, після закінчення застосування DCF ALT (U/L) 43 46 46 46 65 112 129 < 42 0 8 доба 18 доба 28 доба 38 доба Кумулятивна доза DCF started DCF stopped 20 мг/кг Введення тваринам DCF навіть у терапевтичних дозах (5 мг/кг), на 20 добу супроводжувалось значними порушеннями функцій печінки та кишечнику, підвищенням у 1,5 разу рівня АЛТ у циркуляції. АЛТ-специфічний фермент, що показує наскільки є стабільним стан тканин різних органів під впливом препарату. Підвищений рівень АЛТ під впливом DCF свідчив про пошкодження клітин печінки. Так, значний рівень АЛТ відмічали, починаючи з 20 доби досліду, як наслідок цитолітичного синдрому, оскільки збільшення АЛТ свідчить про некроз, передусім м'язової тканини, клітин печінки і мозку. Підвищений рівень АЛТ корелював з цитоморфологічними змінами тканини печінки виявленими за допомогою гістологічних досліджень. Так, при гістологічному досліджені на третьому тижні експерименту в групі тварин, що отримали DCF у кумулятивної дозі 40 мг/кг, відмічені прояви зернистої/жирової дистрофії гепатоцитів, балкова будова часточок залишалась збереженою. Просвіти центральних вен виглядали розширеними і були заповненими еритроцитами. Портальні тракти інфільтрувалися гістиоцитами, відмічались явища білково гіаліново-крапельної дистрофії, у частини клітин спостерігались явища некрозу. Гепатоцити з округлими вакуолями різних розмірів та гіперхромними ядрами. (Фіг. 1). Подальші дослідження показали: прогресування симптомів ураження печінки та інтоксикації організму. Так, на 12 тижні спостереження, за даними доплерографії, виявлено: печінка збільшена (косий вертикальний розмір КВР) правої та лівої частки 15-17 мм. Структура печінки неоднорідна, помірно дифузно змінена. Селезінка помірно збільшена - 16-19 мм. Ворітна вена ВВ - 1,5-1,6 мм. Тобто, введення DCF самкам у кумулятивній дозі 40 мг/кг, на 12 тижні після останньої ін'єкції препарату супроводжувалось суттєвими порушеннями функції печінки. Так, при гістологічному досліджені відмічені прояви зернистої/жирової дистрофії гепатоцитів, балкова будова часточок залишалась збереженою. Просвіти центральних вен виглядали розширеними і були заповненими еритроцитами, розширення синусоїдних гемокапілярів. Гепатоцити містять округлі вакуолі різних розмірів та гіперхромні ядра. (Фіг. 2). Слід зазначити про наявність гепатотоксичного ефекту DCF. У паренхімі печінки тварини були виявлені ознаки розвитку коагулятивного некрозу, жирової/зернистої дистрофії гепатоцитів. Епітелій жовчних трактів набряклий. Жовчні протоки розширені та інфільтровані лімфоцитами (Фіг. 2). Порушення функцій печінки, для яких характерні: морфологічні зміни у біоптатах (жирова дистрофія та запальні реакції), підвищення активності ферментів печінки у циркуляції, свідчать про розвиток неалкогольного стеатогепатиту (НАСГ). Головною причиною стеатогепатиту вважають накопичення у печінці вільних жирних кислот, які знижують зв'язування інсуліну рецепторами гепатоцитів, що супроводжується стимуляцією глюконеогенезу та зростанням продукції глюкози печінкою. Жирова дистрофія печінки може служити передвісником порушень вуглеводного обміну, коли згодом діагностується порушення толерантності до глюкози і СД 2-го типу. Слід зазначити, що інсулінорезистентність є відтвореним патогенним фактором в НАСГ. Накопичення вільних жирних кислот в печінці сприяє окислювальному стресу. Окислювальний стрес розглядається як дисбаланс між виробництвом високо реакційних сполук кисню та азоту та і антиоксидантного захисту, що корелює з накопиченням жиру в організмі (Lobo V, Patil A, 4 UA 98459 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Phatak A, Chandra N. Free radicals, antioxidants and functional foods: Impact on human health. // Pharmacogn Rev. 2010 Jul; 4(8):118-26; Rosen, P., Nawroth, P.P., King, G., Moller, W., Tritschler, H.J., Packer, L. (2001) The role of oxidative stress in the onset and progression of diabetes and its complications: A summary of a Congress Series sponsored by UNESCO-MCBN, the American Diabetes Association and the German Diabetes Society. Diabetes Metab. Res. Rev. 17:189-212.). Незважаючи на те, що НАСГ частіше за все має доброякісний перебіг, деякі випадки супроводжуються розвитком цирозу печінки, портальною гіпертензією та печінковою недостатністю. Подальші спостереження показали, прогресування НАСГ. Так, на 24 тижні після останньої ін'єкції препарату за даними гістологічних досліджень відмічали симптоми НАСГ з позаклітинним та внутрішньоклітинним накопиченням жиру (фіг. 3а), що поєднувались з морфологічними змінами характерними для хронічного медикаментозного гепатиту, а саме порушенням балкової структури печінки, поліморфізмом гепатоцитів, повнокрів'ям центральних вен, зонами запальної інфільтрації, некротичними змінами гепатоцитів, наявністю жовтого пігменту у їх гепатоцитів (білірубіностаз) (Фіг. 3). За даними гістологічних досліджень отримані результати свідчать, що диклофенак може виступати як модельний препарат, що обумовлює симптоми НАСГз ускладненнями безалкогольної жирової хвороби печінки (Nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD) та інсулінорезистентності. При введені диклофенаку самкам у кумулятивній дозі 40 мг/кг, на 24 тижні після останньої ін'єкції препарату відмічали порушення процесів літогенезу, що супроводжувалось відповідною дистрофією гепатоцитів (Фіг. 4). Актуальність представленої моделі обумовлена соціальними обставинами. Оскільки є повідомлення, що поширеність безалкогольної жирової хвороби печінки (NAFLD) у Сполучених Штатах серед дорослого населення складає 20 % (Nagle CA, Klett EL, Coleman RA. Hepatic triacylglycerol accumulation and insulin resistance. // J Lipid Res. 2009 Apr; 50 Suppl:S74-9). В Російської Федерації поширеність NAFLD складає 27 %, у тому числі 80,3 % випадків припадало на стеатоз печінки, 16,8 % - на неалкогольний стеатогепатит і 2,9 % - на цироз печінки (Драпкина О.М., Ивашкин В.Т. Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии // 2014. - № 4. - С. 32-38). Суть корисної моделі пояснюють креслення. Фіг. 1. Фрагменти печінкової тканини на 3 тижні експерименту. Гематоксилін та еозин, × 1000. Коагулятивний некроз гепатоцитів, ознаки розвитку зернистої/жирової дистрофії гепатоцитів та розширення синусоїдних гемокапілярів і набрякання їх ендотелію. Фіг. 2. Фрагменти печінкової тканини на 12 тижні експерименту. Гематоксилін та еозин, × 1000.): Коагулятивний некроз гепатоцитів, ознаки розвитку зернистої/жирової дистрофії гепатоцитів розширення синусоїдних гемокапілярів. Фіг. 3. Фрагменти печінкової тканини на 24 тижні експерименту. Гематоксилін та еозин, × 200. Макровезикулярний стеатоз, розширення центральної вени, ураження печінки поєднується з збереженням ядер гепатоцитів, лімфогістоцитарная інфільтрація портального тракту і ознаки запалення. Фіг. 4. Фрагменти печінкової тканини на 24 тижні експерименту. Гематоксилін та еозин, × 200. Крупнокрапельний стеатоз ділянки печінки, як наслідок розвитку неалкогольної жирової хвороби печінки. Лімфогістоцитарна інфільтрація портального тракту. Фіг. 5. Ультразвукові скани зміненої печінки щура. А - циротичний вузол печінки. Б прицільна біопсія циротичного вузла. В - візуалізація голки для забору матеріал для оцінки дифузного ураження. Приклади конкретного використання: Приклад 2 Щуру (самець, віком 4 міс.) лінії Вістар масою 200 г двічі, щодоби інтраперитонеально у розрахунку 5 мг/кг ввели DCF у кумулятивній дозі 10 мг/кг. Починаючи з другої доби відмічено зміна поведінки тварини млявість та кволість. При дослідженні на 20 добу спостереження відмічено підвищення АЛТ у циркуляції до 65 U/L, що 1,5 разу перевищує показники, отримані у контрольній групі. За даними цитоморфологічних досліджень зрізів біопсії отриманих на 20 добу, виявлено некротичні та дистрофічні процеси в гепатоцитах, це відбивається в зміні ультраструктури та морфології клітин печінки, різкому зниженні глікогену, набряканню ендотелію синусоїдів, розвитку жирової інфільтрації. Ультразвукові дослідження виявили гепатомегалію, дифузні зміни структури печінки та спленомегалію. Подальші спостереження за твариною показали, що на 24 тижні після останньої ін'єкції препарату, за даними морфологічних досліджень отриманих зразків біопсії печінки, розвиток 5 UA 98459 U 5 10 хронічного медикаментозного гепатиту. У щура кровоносні судини печінки розширені, переповнені кров'ю, відмічено набряканню ендотелію синусоїді, деякі гепатоцити в стані зернистої та жирової дистрофії, порушення балкової структури печінки. Таким чином, запропонований спосіб дає можливість змоделювати медикаментозне ураження печінки, ступінь дистрофічних та запальних змін паренхіми печінки, яке залежить від статі тварин та кумулятивної дози диклофенаку. Оптимальною схемою для розвитку неалкогольного стеатогепатиту (НАСГ) з ускладненнями NAFLD для самок лінії Вістар є чотирьох разове введення DCF у дозі 10 мг/кг (кумулятивна доза 40 мг/кг). Розвиток захворювання спостерігається починаючі з 20 доби досліду. Найбільш виражені симптоми хвороби відмічаються на 24 тижні після останньої ін'єкції препарату. У самців лінії Вістар при дворазовому введені DCF інтраперитонеально у терапевтичній дозі 5 мг/кг на 24 тижні спостереження формуються прояви хронічного медикаментозного ураження печінки, який максимально наближено до відповідної патології у дорослих. 15 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 20 Спосіб моделювання медикаментозного ураження печінки щурів, який включає введення піддослідній тварині гепатотоксичного препарату, який відрізняється тим, що проводять внутрішньочеревне введення диклофенаку у дозах 5-10 мг/кг, причому самкам - щоденно протягом 4 діб (кумулятивна доза 40 мг/кг), самцям - дворазово, щодоби у кумулятивній дозі 10 мг/кг та проводять прижиттєве динамічне дослідження за допомогою ультразвукової діагностики органів тварини, контроль лабораторних показників крові та виконують прицільну біопсію під контролем УЗД. 6 UA 98459 U 7 UA 98459 U 8 UA 98459 U Комп’ютерна верстка І. Мироненко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 9