Антиміостатинове моноклональне антитіло

1. Антиміостатинове моноклональне антитіло, яке має варіабельну ділянку важкого ланцюга поліпептид з послідовністю ПОСЛІДОВНІСТЬ № C2 2 (19) 1 3 рілих мишей є виснаження м'язів (Ціммерс (Zimmers) та інші, Science, 296:1486-1488, 2002), у той час як, навпаки, миші з блокованим міостатином відрізняються гіпертрофією та гіперплазією скелетних м'язів, наслідком чого є вдвічі або втричі більша м'язова маса порівняно з одноприплідними тваринами дикого типу, та зменшення накопичення жирового компонента тіла (Макферрон (McPherron) та інші, Nature, 387:83-90, 1997). Як повідомлялось, мутація з блокуванням міостатину у людей пов'язується з макроскопічною гіпертрофією м'язів (Шульке (Scheulke) та інші, New Eng. J. Med. 350:2682, 2004). На сучасному етапі існує обмежена кількість доступних способів лікування виснаження м'язів або розладів чи станів, корисним для яких було б збільшення м'язової маси та/або сили м'язів, у тому числі, наприклад, м'язової дистрофії, слабості, атрофії від бездіяльності та кахексії, а також розладів, які пов'язуються з виснаженням м'язів, наприклад, захворювання нирок, недостатності або хвороби серця і захворювання печінки. Завдяки своїй ролі негативного регулятора росту скелетних м'язів, міостатин є бажаною мішенню для терапевтичного або профілактичного втручання у разі таких розладів чи станів або контролювання розвитку таких розладів чи станів. Окрім його безпосередньої ролі у регуляції скелетних м'язів, міостатин може також бути залученим до інших фізіологічних процесів, у тому числі диференціації преадіпоцитів у адіпоцити (Кім (Kіm) та інші, BBRC, 281:902-906, 2001) і, опосередковано, до глюкозного гомеостазу (Макферрон А. (McPherron Α.), Лі С-Дж. (Lee S-J.), JCI 109:595, 2002) та пригнічення утворення кісткової тканини (Хемрік М. (Hamrick Μ.), Моl. Cell Evol. Вiol. 272 388-391, 2003; Хемрік (Hamrick) та інші, Calcif Tissue Int., 71:63, 2002). Таким чином, міостатинспецифічні антагоністи, наприклад, міостатинспецифічні антитіла, можуть також виявитись корисними для лікування, профілактики або контролювання розладів або станів, наприклад, таких, благотворним для яких було б підвищення густини кісткової тканини (наприклад, остеопороз), діабету типу II, порушення обміну речовин, ожиріння та остеоартриту. Міостатин є висококонсервативним у різних видів; амінокислотна послідовність зрілої форми міостатину у людини, миші, пацюка, курки, індика і корови є 100% ідентичною (дивись Фіг.2 і Фіг.3). У великої рогатої худоби спостерігаються природні мутації міостатину, які пов'язують із подвійном'язовим фенотипом (Макферрон (McPherron) та інші, PNAS, 94:12457-12461, 1997). Оскільки міостатин є висококонсервативним як за послідовністю, так і за функцією у різних видів, тому антиміостатинове антитіло являє собою перспективний засіб підвищення м'язової маси або лікування чи профілактики розладів та станів, які були згадані вище, не тільки у людей, але також і у інших ссавців, у тому числі, наприклад, хатніх тварин (наприклад, собак та кішок), спортивних тварин (наприклад, коней), тварин, які задовольняють харчові потреби (наприклад, великої рогатої худоби, свиней, овець) та птахів різних видів (наприклад, курок, індиків, качок та інших мисливських і свійських птахів). 92504 4 Фактор росту і диференціювання клітин-11, який називають також GDF-11 або ВМР-11, є членом надродини білків TGF-β, найбільш гомологічним по відношенню до міостатину. Амінокислотна послідовність зрілих форм людського міостатину і GDF-11 є ідентичною приблизно на 90%, однак GDF-11 експресується у ширшому діапазоні тканин, аніж GDF-8, у тому числі у пульпі зубу, тканині головного мозку, серцевій, нирковій і легеневій тканині, а також у м'язовій і жировій тканині (Накашіма (Nakashima) та інші, Mech. of Development, 80:185, 1999). Миші з блокованим GDF-11 гинуть у межах 24год. після народження із численними відхиленнями від норми. Зокрема, такі миші демонструють зайві пари ребер, у них бракує нирок і у них виявляють пороки розвитку шлунка, селезінки і підшлункової залози (Макферрон (McPherron) та інші, Nature Genetics, 22:260, 1999; Ескела (Esquela) та Лі (Lee), Dev. ВЫ., 257:356, 2003; Хармон (Harmon) та інші, Devpt., 131:6163, 2004). Нещодавно було встановлено, що людський GDF11 регулює часові вікна, у межах яких поліпотентні попередники зберігають компетентність із продукування різних нащадків нервів (Кім Дж. (Kim J.) та інші, Science, 308:1927-1930, 2005). Існує терапевтична потреба у антиміостатиновому антитілі, яке переважно зв'язує міостатин порівняно з іншими білками надродини TGF-β, зокрема, GDF-11. Окрім того, існує потреба у міостатинспецифічних антитілах, які зв'язують міостатин із високою афінністю, зокрема, з більш високою афінністю (тобто з більш сильною афінністю, як показано, наприклад, нижчим значенням KD) порівняно з афінністю, з якою вони зв'язують GDF11, що надає можливість зведення до мінімального рівня дози, яку одержують хворі, наслідком чого, тим самим, може бути рідше введення дози такого антитіла, порівняно з антитілом, яке зв'язує міостатин з меншою афінністю (тобто більшою KD). Високоафінне антитіло є також бажаним тому, що воно може уможливити більшу гнучкість у виборі шляхів введення антитіла хворому, оскільки внутрішньовенний шлях введення лікарського засобу є менш бажаним, аніж, наприклад, підшкірний. Існує також потреба у міостатинспецифічних антитілах із низьким або сприятливим у інших відношеннях значенням ІС50 у аналізах біологічної активності міостатину для одержання терапевтичного антиміостатинового антитіла з мінімальною ефективною терапевтичною дозою. Бажано також надати антитіла, специфічні по відношенню до міостатину, де будь-яка імунна реакція на антитіло, яка виникає у хворого, що одержує згадане антитіло, є зведеною до мінімального рівня. Цей винахід задовольняє ці потреби і забезпечує відповідні переваги. Антитілами за цим винаходом є химерні, гуманізовані або повністю людські антиміостатинові моноклональні антитіла та їхні антигензв'язувальні фрагменти, які антагонізують або нейтралізують щонайменше одну in vitro або in vivo біологічну активність або властивість, якa пов'язується з міостатином або його частиною. За варіантом, якому віддається перевага, антитіла за цим винаходом не зв'язують пептид, який містить амінокислоти 4064 (включно), 43-57 або 45-59 зрілого міостатину, 5 за варіантом, якому віддається перевага, людського міостатину, з рівнями, які значно перевищують вихідні. За одним із варіантів здійснення антитіла за цим винаходом мають ІС50 меншу за або таку, що дорівнює приблизно 40нМ, 30нМ, 25нМ, 20нМ або 10нМ, за варіантом, якому віддається більша перевага, меншу за або таку, що дорівнює приблизно 5нМ, 4нМ, 3нМ, 2нМ або 1нМ у in vitro репортерному аналізі з комбінацією міостатину/SBE (дивись Приклад 5). За варіантом, якому віддається перевага, антитіла за цим винаходом мають ІС50 y in vitro репортерному аналізі з комбінацією міостатину/SBE щонайменше на 20% або 50% нижчу, за варіантом, якому віддається більша перевага, щонайменше приблизно у два рази, три рази або чотири рази нижчу за ІС50 згаданого антитіла у in vitro репортерному аналізі з комбінацією GDF-11/SBE (як описано у Прикладі 5, який наведено у цьому описі). За одним із варіантів здійснення антитіла за цим винаходом відрізняються сильною зв'язувальною спорідненістю (KD) до міостатину, тобто меншою за приблизно 4,2 10-9Μ або 4,0 10-9Μ, за варіантом, якому віддається перевага, меншою за приблизно 4,6 10-10Μ, 4,0 10-10Μ або 2 10-10Μ, та за варіантом, якому віддається більша перевага, меншою за приблизно 8 10-11Μ, 7 10-11Μ, 5 10-12Μ або 1,4 10-12Μ. За альтернативним варіантом антитіла за цим винаходом відрізняються KD до міостатину, що не перевищує приблизно 4,2 10-9Μ або 4,0 10-9Μ, за варіантом, якому віддається перевага, що не перевищує приблизно 4,6 10-10Μ, 4,0 1010 Μ або 2 10-10Μ, та за варіантом, якому віддається більша перевага, що не перевищує приблизно 8 10-11Μ, 7 10-11Μ, 5 10-12Μ або 1,4 10-12Μ. За іншим варіантом здійснення антиміостатинові антитіла за цим винаходом відрізняються переважним зв'язуванням міостатину порівняно з GDF-11 щонайменше на 20%, 30% або 40%. За варіантом, якому віддається перевага, антитіла за цим винаходом, які переважно зв'язують міостатин порівняно з GDF-11, додатково відрізняються KD до міостатину меншою за приблизно 4,2 10-9Μ або 4,0 10-9Μ, за варіантом, якому віддається перевага, меншою за приблизно 4,6 10-10Μ, 4,0 10-10Μ або 2 10-10Μ, та за варіантом, якому віддається більша перевага, меншою за приблизно 5 10-12Μ або 1,4 10-12Μ. За іншим варіантом здійснення антитіла за цим винаходом, які переважно зв'язують міостатин порівняно з GDF-11, додатково відрізняються ІС50 меншою за або такою, що дорівнює приблизно 40нМ, 20нМ або 10нМ, за варіантом, якому віддається більша перевага, меншою за або такою, що дорівнює приблизно 5нМ, 4нМ, 3нМ, 2нМ або 1нМ у in vitro репортерному аналізі з комбінацією міостатину/SBE. За іншим варіантом здійснення антиміостатинове моноклональне антитіло за цим винаходом містить поліпептид варіабельної ділянки легкого ланцюга ("LCVR") з амінокислотною послідовністю, вибраною з групи, до складу якої входять ПОСЛІДОВНОСТІ №74-102, №140, №141 та №142 (Фіг.9). За іншим варіантом здійснення антиміоста 92504 6 тинове моноклональне антитіло за цим винаходом містить поліпептид варіабельної ділянки важкого ланцюга ("HCVR") з амінокислотною послідовністю, вибраною з групи, до складу якої входять ПОСЛІДОВНОСТІ №103-138 (Фіг.10). За іншим варіантом здійснення антиміостатинове моноклональне антитіло за цим винаходом містить (і) LCVR поліпептид, який містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, до складу якої входять ПОСЛІДОВНОСТІ №74-102, №140, №141 та №142, та (И) HCVR поліпептид, який містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, до складу якої входять ПОСЛІДОВНОСТІ №103138. За варіантом здійснення, якому віддається перевага, антитіло за цим винаходом, що містить LCVR поліпептид, який містить амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ, представлену у наведеній нижче Таблиці 1, додатково містить HCVR поліпептид, який містить амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ HCVR поліпептиду, який відповідає конкретній LCVR у наведеній нижче Таблиці 1. Наприклад, антитіло за цим винаходом, яке містить LCVR поліпептид, який містить амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ №88, за варіантом, якому віддається перевага, додатково містить HCVR поліпептид, який містить амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ №103 або №119. Таблиця 1 (Послідовність антитіл за цим винаходом, яким віддається перевага) LCVR (ПОСЛІДОВНОСТІ №) 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 HCVR (ПОСЛІДОВНОСТІ №) 103 104 104 103 або 113 105 103 106 103, 104, 107, 108, 109, 110, 112, 114, 117, 118 104 111 112 113 103, 108, 115 116 103, 119 103, 120, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134 103, 121, 122 121 103, 121 120 120 120, 137 120, 135 120 120, 138 7 92504 Продовження таблиці 1 99 100 101 102 140 141 142 120, 136, 138 120 135 136 137 123 138 За іншим варіантом здійснення моноклональним антитілом за цим винаходом є антитіло, яке може конкурувати за зв'язування з людським міостатином із конкуруючим антитілом, як демонструється доступним аналізом у цій галузі (наприклад, конкурентний ELISA), де згадане конкуруюче антитіло містить два поліпептиди з послідовностями, вибраними з групи, до складу якої входять: (і) ПОСЛІДОВНОСТІ №98 та №138, та (іі) ПОСЛІДОВНОСТІ №74 та №103. За одним із варіантів здійснення антиміостатинове антитіло за цим винаходом має варіабельну ділянку важкого ланцюга і варіабельну ділянку легкого ланцюга, причому варіабельна ділянка важкого ланцюга містить гіперваріабельні ділянки (CDR) з наведеними нижче амінокислотними послідовностями: CDRH1 (ПОСЛІДОВНІСТЬ №42), CDRH2 (ПОСЛІДОВНІСТЬ №71) та CDRH3 (ПОСЛІДОВНІСТЬ №72) (дивись Фіг.7); та/або де варіабельна ділянка легкого ланцюга містить гіперваріабельні ділянки (CDR) з наведеними нижче амінокислотними послідовностями: CDRL1 (ПОСЛІДОВНІСТЬ №12), CDRL2 (ПОСЛІДОВНІСТЬ №154) та CDRL3 (ПОСЛІДОВНІСТЬ №37) (дивись Фіг.6). За варіантом, якому віддається перевага, гіперваріабельні ділянки важкого ланцюга антитіла за цим винаходом об'єднуються разом у одному антитілі, наприклад, у антитілі, яке показано на Фіг.7, і гіперваріабельні ділянки легкого ланцюга антитіла за цим винаходом об'єднуються разом у одному антитілі, наприклад, у антитілі, яке показано на Фіг.6. Антиміостатинове моноклональне антитіло за цим винаходом може додатково містити константну ділянку важкого ланцюга, вибрану з групи, до складу якої входить людський (або по суті людського походження) IgG1, IgG2, IgC3, IgG4, IgA, IgE, IgM та IgD, за варіантом, якому віддається перевага, IgGi або IgG4- Антиміостатинове моноклональне антитіло за цим винаходом може додатково містити людську константну ділянку легкого ланцюга типу каппа або лямбда. У разі, коли антитіло призначене для застосування як терапевтичний або профілактичний засіб для людини, константна ділянка за варіантом, якому віддається перевага, має значною мірою або повністю людське походження. У разі, коли антитіло призначене для застосування як терапевтичний або профілактичний засіб для тварини окрім людини або яйця тварини окрім людини, константна ділянка за варіантом, якому віддається перевага, походить значною мірою від тварини, для якої згадане антитіло призначене як терапевтичний засіб (дивись, наприклад, Кларксон К. (Clarkson С.) та інші, Моl. Іmm., 30:1195-1204, 1993; заявка на патент США 8 №2002/01651350; та номери депонування Genbank X69797, U03778, Х16701, Х07174, АВ016711). Цим винаходом передбачаються антитіла різних форм. Наприклад, антиміостатинове моноклональне антитіло за цим винаходом може містити або являти собою інтактне антитіло (тобто непроцесоване антитіло, яке має інтактний Fcфрагмент), по суті інтактне антитіло або його антигензв'язувальний домен (наприклад, Fab, Fab', F(ab')2) або одноланцюговий Fv-фрагмент. Зрозуміло, що антитіла усіх таких форм позначаються у цьому описі терміном "антитіло". На додаток до цього, антитіло за цим винаходом може мітитись виявною міткою, іммобілізуватись на твердій фазі та/або кон'югуватись із гетерологічною сполукою, наприклад, ферментом або молекулою поліетиленгліколю. Окрім того, антитіла за цимвинаходом вважаються "моноклональними", незважаючи навіть на те, що вони можуть різнитись за характером глікозилування. У цьому описі передбачаються діагностичні, терапевтичні та профілактичні варіанти застосування моноклональних антитіл за цим винаходом. За одним із діагностичних варіантів застосування цей винахід пропонує спосіб визначення присутності та/або кількості білка міостатину, що включає піддання експериментального зразка, підозрюваного на вміст білка міостатину, впливу антиміостатинового антитіла за цим винаходом та визначення специфічного зв'язування антитіла із зразком. Антиміостатинове антитіло за цим винаходом може застосовуватись для визначення рівнів міостатину у експериментальних зразках шляхом порівняння значень експериментального зразка зі стандартною кривою, яку одержали шляхом зв'язування згаданого антитіла зі зразками з відомими кількостями міостатину за допомогою будь-якого способу, доступного у цій галузі, наприклад, ELISA. Цей винахід додатково пропонує набір, до складу якого входить антитіло за цим винаходом, і за варіантом, якому віддається перевага, інструкції із застосування антитіла для виявлення білка міостатину у, наприклад, експериментальному зразку. За іншим варіантом здійснення цей винахід пропонує фармацевтичну композицію, яка містить антиміостатинове моноклональне антитіло за цим винаходом. Фармацевтична композиція за цим винаходом може додатково містити фармацевтично прийнятний носій. У згаданій фармацевтичній композиції антиміостатинове моноклональне антитіло за цим винаходом являє собою активний інгредієнт. За варіантом, якому віддається перевага, фармацевтична композиція містить гомогенну або по суті гомогенну популяцію антиміостатинового моноклонального антитіла за цим винаходом. Композиція для терапевтичного застосування є стерильною і може ліофілізуватись та за варіантом, якому віддається перевага, поставлятись із відповідним розріджувачем. Цей винахід пропонує антиміостатинове моноклональне антитіло за цим винаходом для застосування при виготовленні лікарського засобу для введення ссавцю, за варіантом, якому віддається перевага, людині, для лікування, наприклад, слаб 9 кості, кахексії, вікової саркопенії, виснаження або слабкості м'язів, міопатії, м'язової дистрофії, остеопорозу, ожиріння, COPD (хронічне обструктивне захворювання легень), ниркової недостатності або хвороби, печінкової недостатності або хвороби, серцевої недостатності або хвороби, порушення обміну речовин та діабету типу II у ссавця, за варіантом, якому віддається перевага, у людини, яка цього потребує, шляхом введення згаданому ссавцю терапевтично ефективної або профілактично ефективної кількості антиміостатинового моноклонального антитіла за цим винаходом. Цей винахід пропонує готовий виріб, до складу якого входить пакувальний матеріал і антитіло за цим винаходом, яке знаходиться у згаданому пакувальному матеріалі, де згаданий пакувальний матеріал включає пакувальну вкладку, на якій вказується, що згадане антитіло нейтралізує активність міостатину або знижує рівень міостатину, присутнього у системі. Цей винахід додатково пропонує виділену нуклеїнову кислоту, яка кодує антитіло за цим винаходом; вектор (або вектори), що містить(-ять) згадану нуклеїнову кислоту, за факультативним варіантом функціонально зв'язаний(-і) з контрольними послідовностями, які розпізнаються клітиною-хазяїном, трансформованою згаданим вектором; клітину-хазяїна, яка містить згаданий вектор; спосіб продукування антитіла за цим винаходом, який включає культивування згаданої клітинихазяїна таким чином, що згадана нуклеїнова кислота експресується, і за факультативним варіантом виділення згаданого антитіла із середовища клітини-хазяїна. На Фіг.1 представлена амінокислотна послідовність людського проміостатину з підкресленою сигнальною послідовністю і виділеною жирним шрифтом частиною білка на карбоксильному кінці, яка утворює мономер міостатину зрілої форми. На Фіг.2 представлена амінокислотна послідовність мономерного людського зрілого міостатину. Активний людський міостатин являє собою гомодимер цього поліпептиду, зв'язаний дисульфідними зв'язками. Ця послідовність ідентична послідовності зрілого міостатину у миші, пацюка, курки, індика, собаки, коня і свині. На Фіг.3 представлено впорядковане розміщення амінокислотної послідовності зрілого міостатину ссавців та птахів різних видів. На Фіг.4 представлено впорядковане розміщення амінокислотної послідовності зрілої форми людського міостатину і людського GDF-11. На Фіг.5 представлена амінокислотна послідовність HCVR та LCVR антитіла YN41, зразкового вихідного антитіла для антитіл за цим винаходом. На цій фігурі додатково показана зразкова нуклеотидна послідовність, яка кодує HCVR та LCVR антитіла YN41. На Фіг.6 представлена амінокислотна послідовність гіперваріабельних ділянок LCVR різних антитіл за цим винаходом. На Фіг.7 представлена амінокислотна послідовність гіперваріабельних ділянок HCVR різних антитіл за цим винаходом. 92504 10 На Фіг.8 представлена амінокислотна послідовність константної ділянки легкого ланцюга типу каппа, яка може функціонально зв'язуватись з LCVR антитіла за цим винаходом при одержанні повномірного легкого ланцюга антитіла за цим винаходом, і амінокислотна послідовність домену константної ділянки IgG4, яка може функціонально зв'язуватись з HCVR антитіла за цим винаходом при одержанні повномірного важкого ланцюга антитіла за цим винаходом. На згаданій фігурі додатково показана зразкова нуклеотидна послідовність, яка кодує константну ділянку легкого ланцюга типу каппа, і зразкова нуклеотидна послідовність, яка кодує домен важкого ланцюга IgG4. Фіг.9 представляє впорядковане розміщення амінокислотної послідовності варіабельних ділянок легких ланцюгів різних антитіл за цим винаходом. Гіперваріабельні домени у послідовності першого антитіла підкреслені. Фіг.10 представляє впорядковане розміщення амінокислотної послідовності варіабельних ділянок важких ланцюгів різних антитіл за цим винаходом. Гіперваріабельні домени у послідовності першого антитіла підкреслені. Цей винахід представляє химерні, гуманізовані або повністю людські антиміостатинові моноклональні антитіла або їхні антигензв'язувальні домени, здатні нейтралізувати або антагонізувати щонайменше одну активність міостатину in vitro та/або in vivo, які додатково відрізняються тим, що демонструють ІС50 меншу за приблизно 40нМ, 20нМ або 10нМ, за варіантом, якому віддається більша перевага, меншу за або таку, яка дорівнює приблизно 5нМ, 4нМ, 3нМ, 2нМ або 1нМ у in vitro репортерному аналізі з комбінацією міостатину/SBE , та/або за варіантом, якому віддається перевага, демонструють високу зв'язувальну спорідненість до міостатину. Антитіла за цим винаходом додатково відрізняються тим, що вони переважно зв'язують міостатин порівняно з найближчим гомологом міостатину, GDF-11, щонайменше на 20%. Визначення У разі вживання у цьому описі, термін "зрілий міостатин" (дивись ПОСЛІДОВНІСТЬ №2 для людини, миші, пацюка, курки, індика, собаки, коня та свині) означає мономерну або гомодимерну форму білка, який одержали шляхом протеолітичного розщеплення на Arg 266 пропротеїнової форми міостатину довжиною 375 амінокислот. У разі вживання у цьому описі, термін "міостатин" означає зрілий міостатин. У разі вживання у цьому описі, термін "проміостатин" або "пропротеїнова форма міостатину", у разі вживання відносно людського білка, означає білок, що містить послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ №1, у вигляді мономера або гомодимера. Непроцесоване антитіло у тому вигляді, у якому воно існує за природних умов, являє собою молекулу імуноглобуліну, що складається із чотирьох поліпептидних ланцюгів, двох важких (Н) ланцюгів (приблизно 50-70кДа у непроцесованому вигляді) та двох легких (L) ланцюгів (приблизно 25кДа у непроцесованому вигляді), взаємно зв'язаних дисульфідними зв'язками. Амінокінцева час 11 тина кожного ланцюга містить варіабельну ділянку довжиною приблизно 100-110 амінокислот або більше, яка відповідає, головним чином, за розпізнавання антигену. На карбоксильному кінці кожного ланцюга знаходиться константна ділянка, яка відповідає головним чином за ефекторну функцію. Легкі ланцюги підрозділяються на ланцюги типу каппа або типу лямбда і відрізняються конкретною константною ділянкою, як відомо у цій галузі. Важкі ланцюги підрозділяються на ланцюги типу гамма, мю, альфа, дельта або іпсилон і визначають ізотип антитіла як IgG, IgM, IgA, IgD та IgE відповідно, і декілька з них можуть додатково підрозділятись на субкласи (ізотипи), наприклад, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 та IgA2. Важкий ланцюг кожного типу відрізняється конкретною константною ділянкою, відомою у цій галузі. Субодиничні структури і об'ємні конфігурації антитіл різних класів є добре відомими у цій галузі. Кожен важкий ланцюг містить N-кінцеву варіабельну ділянку важкого ланцюга (у цьому описі "HCVR") і константну ділянку важкого ланцюга. Константна ділянка важкого ланцюга складається з трьох доменів (СН1, СН2 та СН3) у разі IgG, IgD та IgA; і 4 доменів (СН1, СН2, СН3 та СН4) у разі IgM та IgE. Кожен легкий ланцюг містить варіабельну ділянку легкого ланцюга (у цьому описі "LCVR") і константну ділянку легкого ланцюга, CL. HCVR та LCVR можуть додатково підрозділятись на гіперваріабельні ділянки, які називають ділянками, що обумовлюють комплементарність ("CDR"), що чергуються з більш консервативними ділянками, які називаються каркасними ділянками ("FR"). Кожна HCVR та LCVR складається з трьох CDR та чотирьох FR, які розміщуються у напрямку від аміно-кінця до карбоксильного кінця таким чином: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. У цьому описі 3 CDR важкого ланцюга позначають як "CDRH1, CDRH2 і CDRH3", а 3 CDR легкого ланцюга позначають як "CDRL1, CDRL2 і CDRL3". Гіперваріабельні ділянки (CDR) містять більшість залишків, які вступають до специфічних взаємодій з антигеном. Місцезнаходження амінокислот у кожному домені відповідає добре відомим умовним позначенням [наприклад, Кебот (Rabat), "Sequences of Proteins of Immunological Interest," National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991) або номенклатурна схема Чотья (Chothia), описана у Аль-Лазікані (AlLazikani) та інші, J. Моl. Віоl, andrew/bioinf.org/abs]. Функціональна здатність антитіла до зв'язування конкретного антигену значною мірою обумовлюється шістьма гіперваріабельними ділянками. Термін "антитіло" у відношенні до антиміостатинового моноклонального антитіла за цим винаходом (або просто "моноклональне антитіло за цим винаходом"), у значенні, вживаному у цьому описі, означає моноклональне антитіло. Термін "моноклональне антитіло", у значенні, вживаному у цьому описі, означає химерне антитіло, гуманізоване антитіло або непроцесоване антитіло, якщо у цьому описі не вказано інше. За варіантом, якому віддається перевага, моноклональне антитіло за цим винаходом існує у гомогенній або по 92504 12 суті гомогенній популяції. Моноклональні антитіла за цим винаходом можна одержати за допомогою, наприклад, методу гібридом, добре відомого у цій галузі, а також рекомбінантними методами, методами проявлення у фагах, синтетичними методами або комбінаціями таких методів чи іншими методами, добре відомими у цій галузі. "Моноклональне антитіло" означає антитіло, яке одержують з унікальної копії або клону, у тому числі, наприклад, з будь-якого еукаріотного, прокаріотного або фагового клону, а не спосіб, за допомогою якого його продукують. "Моноклональним антитілом" може бути інтактне антитіло (що містить повну або непроцесовану Fc-ділянку), по суті інтактне антитіло або частина чи фрагмент антитіла, що містить антигензв'язувальну ділянку, наприклад, Fab-фрагмент, Fab'-фрагмент або F(аb')2фрагмент химерного, гуманізованого чи людського антитіла. Варіабельні ділянки кожної пари легкий/важкий ланцюг утворюють антигензв'язувальні домени антитіла. Так, інтактне антитіло IgG має два зв'язувальні домени. За виключенням біфункціональних або біспецифічних антитіл, два зв'язувальні домени є однаковими. У значенні, вживаному у цьому описі, термін "антигензв'язувальний домен" або "антигензв'язувальна ділянка" чи "антигензв'язувальний фрагмент" у цьому описі взаємозамінно означає ту частину молекули антитіла у межах варіабельної ділянки, яка містить амінокислотні залишки, які взаємодіють з антигеном і наділяють антитіло його специфічністю та спорідненістю до згаданого антигену. Цей фрагмент антитіла включає каркасні амінокислотні залишки, необхідні для підтримання відповідної конформації антигензв'язувальних залишків. За варіантом, якому віддається перевага, гіперваріабельні ділянки антигензв'язувального домену або у цілому антигензв'язувальний домен антитіл за цим винаходом буде мати мишаче походження або по суті мишаче походження, з певними амінокислотними залишками, які замінюють з метою поліпшення конкретної активності (дивись, наприклад, Фіг.6 та Фіг.7). За варіантом, якому віддається перевага, каркасні ділянки антитіл за цим винаходом мають людське походження або по суті людське походження (людське походження щонайменше на 95%, 97% або 99%; дивись, наприклад, Фіг.9 та Фіг.10). За іншими варіантами здійснення антигензв'язувальний домен або гіперваріабельні ділянки антигензв'язувального домену можуть бути одержаними від інших видів окрім людини, у тому числі (але без обмеження) від кроля, пацюка або хом'ячка. За іншими варіантами здійснення антигензв'язувальний домен може мати повністю людське походження або по суті людське походження з певними зміненими амінокислотними залишками для поліпшення конкретної активності, наприклад, спорідненості або специфічності (дивись, наприклад, амінокислотні положення Фіг.6 та Фіг.7, які виділені жирним шрифтом і підкреслені). Окрім того, термін "моноклональне антитіло", у значенні, вживаному у цьому описі, може означати одноланцюговий Fv-фрагмент, який можна одержати шляхом об'єднання ДНК, що кодує LCVR та 13 HCVR, з лінкерною послідовністю (дивись Плактан (Pluckthun), The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, том 113, Розенбург (Rosenburg) та Мур (Moore) (редактори), Springer-Verlag, New York, cтop.269-315, 1994). Слід розуміти, що, незалежно від того, чи вказуються конкретно фрагменти або домени, термін "антитіло", у значенні, вживаному у цьому описі, включає такі фрагменти або домени, а також одноланцюгові форми. Доти, доки білок зберігає здатність до специфічного або переважного зв'язування своєї гаданої мішені (тобто антигенної детермінанти або антигену), він входить до обсягу терміна "антитіло". Словосполучення "популяція моноклональних антитіл" означає гомогенну або значною мірою гомогенну популяцію антитіл (тобто щонайменше приблизно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, за варіантом, якому віддається більша перевага, щонайменше приблизно 97% чи 98% або за варіантом, якому віддається найбільша перевага, щонайменше 99% антитіл у згаданій популяції могли б конкурувати при проведенні твердофазного імуноферментного аналізу за той самий антиген або антигенну детермінанту). Антитіла можуть бути або можуть не бути глікозилованими і, незважаючи на це, все ще знаходитись у межах цього винаходу. Моноклональні антитіла можуть бути гомогенними, якщо вони мають ідентичну амінокислотну послідовність, хоча вони можуть різнитись за посттрансляційною модифікацією, наприклад, схемою глікозилування. "Варіантне" антиміостатинове антитіло означає у цьому описі молекулу, амінокислотна послідовність якої відрізняється від амінокислотної послідовності "вихідного" антиміостатинового антитіла унаслідок додання, делеції та/або заміни одного або декількох амінокислотних залишків послідовності вихідного антитіла. За варіантом здійснення, якому віддається перевага, варіантне антитіло містить одну або декілька амінокислотних замін на одній або декількох гіперваріабельних ділянках вихідного антитіла. Наприклад, варіантне антитіло може містити щонайменше одну (наприклад, від приблизно однієї до приблизно десяти, а за варіантом, якому віддається перевага, від приблизно двох до приблизно п'яти) заміну на одній або декількох гіперваріабельних ділянках вихідного антитіла. Ідентичність або гомологія відносно послідовності варіантного антитіла визначається у цьому описі як відсоток амінокислотних залишків у послідовності варіантного антитіла, які є ідентичними із залишками вихідного антитіла після впорядкованого розміщення послідовностей і введення розривів, у разі необхідності, для досягнення максимального відсотка ідентичності послідовностей. Жодне з N-кінцевих, С-кінцевих або внутрішніх подовжень, делецій або інсерцій у послідовності антитіла не повинно розглядатись як таке, що впливає на ідентичність або гомологію послідовності. Варіантне антитіло зберігає здатність до зв'язування міостатину і за варіантом, якому віддається перевага, має властивості, які перевищують властивості вихідного антитіла. Наприклад, варіантне антитіло може мати більшу зв'язувальну спорідненість, меншу ІС50 у аналізі з комбінацією 92504 14 SBE/репортерний ген або підвищену здатність до пригнічення біоактивності міостатину. Варіантним антитілом, яке викликає особливий інтерес у цьому описі, є антитіло, яке демонструє щонайменше приблизно п'ятикратне, за варіантом, якому віддається перевага, щонайменше приблизно десятикратне, а за варіантом, якому віддається більша перевага, щонайменше приблизно двадцятикратне, тридцятикратне або п'ятдесятикратне посилення біоактивності, у разі порівняння з вихідним антитілом. "Вихідним" антитілом у цьому описі є антитіло, що кодується амінокислотною послідовністю, яку застосовують для одержання варіантного антитіла. Вихідне антитіло може мати мишачий каркас, але за варіантом, якому віддається перевага, має людську каркасну ділянку. Згадане вихідне антитіло може бути мишачим (дивись, наприклад, наведені у цьому описі Фігури х), химерним, гуманізованим або людським антитілом. Термін "специфічно зв'язується", у значенні, вживаному у цьому описі, означає ситуацію, за якої один член специфічної зв'язувальної пари значною мірою зв'язується лише з молекулами, які є його специфічним зв'язувальним партнером(ами), як визначається методами у цій галузі, наприклад, конкурентним ELISA, BIACORE або KINEXA. Згаданий термін вживається також у тому разі, наприклад, коли антигензв'язувальний домен антитіла за цим винаходом є специфічним для конкретної антигенної детермінанти, яку несе ряд антигенів. У цьому разі специфічне антитіло, яке несе антигензв'язувальний домен, буде здатним до специфічного зв'язування різних антигенів, які несуть згадану антигенну детермінанту. Відповідним чином, моноклональне антитіло за цим винаходом специфічно зв'язує GDF-8 та GDF-11. Термін "переважно зв'язується", у значенні, вживаному у цьому описі, означає ситуацію, за якої антитіло зв'язує специфічний антиген щонайменше приблизно на 20% більше ніж воно зв'язує інший антиген, як визначається методами, доступними у цій галузі, наприклад, конкурентним ELISA або шляхом визначення KD за допомогою аналізу BIACORE або KINEXA. Відповідним чином, моноклональне антитіло за цим винаходом переважно зв'язує GDF-8 порівняно з GDF-11. Подібним же чином, антитіло може переважно зв'язувати одну антигенну детермінанту у межах антигену порівняно з іншою антигенною детермінантою у межах того самого антигену. Термін "антигенна детермінанта" означає частину молекули, яка може розпізнаватись і зв'язуватись антитілом на одному або декількох антигензв'язувальних центрах антитіла. Антигенні детермінанти часто складаються з хімічно активного поверхневого угруповання молекул, наприклад, амінокислот або бічних ланцюгів цукрів, і мають специфічні об'ємні структурні характеристики, а також специфічні зарядові характеристики. Словосполучення "пригнічення антигенної детермінанти" та/або "нейтралізація антигенної детермінанти" має відношення до антигенної детермінанти, наслідком зв'язування якої, у разі знаходження її у контексті інтактної молекули (у 15 цьому разі, міостатину), антитілом, специфічним щодо згаданої антигенної детермінанти, є втрата або зниження біологічної активності молекули або організму, який містить згадану молекулу in vivo або in vitro. Термін "антигенна детермінанта", у значенні, вживаному у цьому описі, додатково означає частину поліпептиду, що має антигенну та/або імуногенну активність у тварини, за варіантом, якому віддається перевага, у ссавця, наприклад, миші або людини. Термін "антигенна детермінанта", у значенні, вживаному у цьому описі, визначається як частина поліпептиду, з якою може специфічно зв'язуватись антитіло, що визначається будь-яким методом, добре відомим у цій галузі, наприклад, традиційними імуноаналізами. Антигенні детермінанти не обов'язково повинні бути імуногенними, однак можуть бути імуногенними. Термін "імуногенна антигенна детермінанта", у значенні, вживаному у цьому описі, визначається як частина поліпептиду, яка викликає гуморальну імунну відповідь у тварини, що визначається будь-яким методом, відомим у цій галузі. (Дивись, наприклад, Гейсен (Geysen) та інші, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:3998-4002 (1983)). Словосполучення "біологічна властивість" або "біоактивність", "активність" або "біологічна активність" по відношенню до антитіла за цим винаходом вживаються у цьому описі взаємозамінно і означають (але без обмеження) афінність і специфічність антигенної детермінанти/антигену, здатність нейтралізувати або антагонізувати активність міостатину in vivo або in vitro. IC50 У репортерному аналізі з комбінацією міостатину/SBE та інших аналізах активності in vitro, in vivo стабільність антитіла та імуногенні властивості антитіла. Іншими біологічними властивостями антитіла, що піддаються встановленню, є наприклад, перехресна реактивність (тобто з нелюдськими гомологами пептиду-мішені або, взагалі, з іншими білками чи тканинами) і здатність до збереження високих рівнів експресії білка у клітинах ссавців. Вищезгадані властивості або характеристики можуть спостерігатись або визначатись чи оцінюватись за допомогою визнаних у цій галузі методів, у тому числі (але без обмеження) ELISA, конкурентного ELISA, аналізу поверхневого плазмонного резонансу, аналізів нейтралізації in vitro та in vivo без обмеження, зв'язування рецептора, продукування та/або секреції цитокіну або фактора росту, розвитку кепів шпоркової жаби Xenopus, трансдукції сигналів та імуногістохімії зі зрізами тканин із різних джерел, у тому числі від людини, примата або будь-якого іншого джерела за потребою. Термін "активність міостатину", у значенні, вживаному у цьому описі, означає одну або декілька фізіологічних росторегулювальних або морфогенетичних активностей, пов'язаних з активним білком міостатином. Наприклад, активний міостатин є негативним регулятором маси скелетних м'язів. Активний міостатин може також модулювати продукування м'язоспецифічних ферментів (наприклад, креатинкінази), стимулювати проліферацію міобластів та модулювати диференціацію преадіпоцитів у адіпоцити. 92504 16 Термін "пригнічувати" або "нейтралізувати", у значенні, вживаному у цьому описі відносно активності антитіла за цим винаходом, означає здатність значною мірою антагонізувати, пригнічувати, запобігати, стримувати, уповільнювати, переривати, ліквідувати, припиняти, зменшувати або обертати, наприклад, розвиток або тяжкість того, що пригнічується, у тому числі (але без обмеження) біологічної активності або властивості, захворювання або стану. Ступінь пригнічення або нейтралізації за варіантом, якому віддається перевага, становить щонайменше приблизно 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% або більше. Термін "виділена(-ий)", у разі вживання по відношенню до нуклеїнової кислоти або білка (наприклад, антитіла), означає нуклеїновокислотну послідовність або білок, яку(який) ідентифікують і відокремлюють від щонайменше однієї домішки, з якою вона(він) є, зазвичай, зв'язана(зв'язаний) у її(його) природному джерелі. За варіантом, якому віддається перевага, "виділеним антитілом" є антитіло, яке є по суті вільним від інших антитіл, що мають інші антигенні специфічності (наприклад, фармацевтичні композиції за цим винаходом містять виділене антитіло, яке специфічно зв'язує міостатин і є по суті вільним від антитіл, які специфічно зв'язують інші антигени окрім міостатину). Терміни "позначення за Кеботом" та "номенклатура за Кеботом" вживаються у цьому описі взаємозамінно. Ці терміни, визнані у цій галузі, означають систему позначення амінокислотних залишків, які є більш змінними (тобто гіперваріабельними), аніж інші амінокислотні залишки у варіабельних ділянках важких і легких ланцюгів антитіла (Кебот (Kabat) та інші, Ann. NYAcad. ScL, 190:382-393 (1971); Кебот (Kabat) та інші, Sequences of Proteins of Immunological Interest, п'яте видання, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication №91-3242 (1991)). Полінуклеотид є "функціонально зв'язаним" у разі його знаходження у функціональному взаємозв'язку з іншим полінуклеотидом. Наприклад, промотор або енхансер є функціонально зв'язаним із кодувальною послідовністю, якщо він впливає на транскрипцію послідовності. Пептид є "функціонально зв'язаним" з іншим пептидом, коли функціонально зв'язаними є полінуклеотиди, які їх кодують, за варіантом, якому віддається перевага, вони знаходяться у тій самій відкритій рамці зчитування. Терміни "індивід", "суб'єкт" і "хворий", які вживаються у цьому описі взаємозамінно, означають тварину, за варіантом, якому віддається перевага, ссавців (у тому числі непримата і примата) або птахів, у тому числі (але без обмеження) мишей, мавп, людей, сільськогосподарських тваринссавців (наприклад, велику рогату худобу, свиней, овець), спортивних тварин-ссавців (наприклад, коней) і хатніх тварин-ссавців (наприклад, собак і кішок); за варіантом, якому віддається перевага, цей термін означає людей. Згаданий термін означає також різні види птахів, у тому числі (але без обмеження) курок та індиків. За певним варіантом здійснення суб'єкт, за варіантом, якому віддається 17 перевага, людина, додатково характеризується захворюванням або розладом чи станом, для якого благотворним був би знижений рівень або зменшена біологічна активність міостатину. За іншим варіантом здійснення суб'єкт, за варіантом, якому віддається перевага, ссавець, за варіантом, якому віддається перевага, людина, додатково характеризується тим, що знаходиться під загрозою розвитку розладу, захворювання або стану, для якого благотворним був би знижений рівень міостатину або зменшена біологічна активність міостатину. Термін "вектор" означає нуклеїновокислотну молекулу, здатну до транспортування іншої нуклеїнової кислоти, з якою вона зв'язана, у тому числі (але без обмеження) плазміди і вектори на основі вірусного геному. Певні вектори здатні до автономної реплікації у клітині-хазяїні, до якої їх вводять, у той час як інші вектори можуть інтегруватись до геному клітини-хазяїна після введення до неї і, завдяки цьому, їх реплікація відбувається разом із геномом згаданої клітини. Більш того, певні вектори здатні до спрямування експресії генів, з якими вони функціонально зв'язані. Такі вектори у цьому описі називаються "рекомбінантними експресійними векторами" (або просто "експресійними векторами"), і зразкові вектори добре відомі у цій галузі. Словосполучення "клітина", "клітина-хазяїн", "клітинна лінія" та "культура клітин" вживаються у цьому описі взаємозамінно і означають окрему клітину або культуру клітин, яка є реципієнтом будь-якого виділеного полінуклеотиду за цим винаходом або будь-якого рекомбінантного(-их) вектора(-ів), що містить(-ять) послідовність, яка кодує HCVR, LCVR або моноклональне антитіло за цим винаходом. Клітини-хазяї являють собою нащадків однієї клітини-хазяїна, і нащадки не обов'язково можуть бути повністю ідентичними (за морфологією або за загальним комплементом ДНК) вихідній клітині-хазяїну унаслідок природної, випадкової або навмисної мутації та/або зміни. Клітина-хазяїн включає клітини трансформовані, трансдуковані або інфіковані in vivo або in vitro одним або декількома рекомбінантними векторами або полінуклеотидом, що експресує моноклональне антитіло за цим винаходом або його легкий чи важкий ланцюг. Клітина-хазяїн, що містить рекомбінантний вектор за цим винаходом (стабільно або нестабільно включений до хромосоми хазяїна), може також називатись "рекомбінантною клітиною-хазяїном". Переважними клітинами-хазяями для застосування за цим винаходом є клітини СНО (культура клітин яєчника китайського хом'ячка) (наприклад, АТСС (американська колекція типових культур) CRL-9096), клітини NS0, клітини SP2/0 та клітини COS (культура клітин яєчника мавпи) (наприклад, АТСС CRL-1650, CRL-1651), HeLa (АТСС CCL-2). Додатковими клітинами-хазяями для застосування за цим винаходом є рослинні клітини, дріжджові клітини, клітини інших ссавців і прокаріотні клітини. Визначення характеристик антитіла Цей винахід має відношення до виділених моноклональних антитіл, які специфічно зв'язують міостатин із високою афінністю. Антитіла за цим винаходом за варіантом, якому віддається перевага, є химерними, гуманізованими або людськими 92504 18 антитілами або їхніми антигензв'язувальними доменами. На додаток до цього, антитіла за цим винаходом нейтралізують або антагонізують біологічну активність міостатину in vivo або in vitro. Специфічне зв'язування антиміостатинових моноклональних антитіл за цим винаходом із міостатином дозволяє застосовувати антитіла за цим винаходом як терапевтичні засоби або профілактичні засоби для пов'язаних із міостатином станів, захворювань або розладів, тобто станів, захворювань або розладів, корисним для яких було б зниження рівнів міостатину або антагонізування чи пригнічення біологічної активності міостатину. За варіантом здійснення, якому віддається перевага, цей винахід пропонує антиміостатинове моноклональне антитіло, яке зв'язує міостатин або його частину із зв'язувальною спорідненістю (Kq) до міостатину меншою за приблизно 4,2 10-9Μ або 4,0 10-9Μ, за варіантом, якому віддається перевага, меншою за приблизно 4,6 10-10Μ, 4,0 10-10Μ або 2 10-10Μ, та за варіантом, якому віддається більша перевага, меншою за приблизно 8 10-11Μ, 7 10-11Μ, 5 10-12Μ або 1,4 10-12Μ. За альтернативним варіантом антитіла за цим винаходом відрізняються Ко до міостатину, яке не перевищує приблизно 4,2 10-9Μ або 4,0 10-9Μ, за варіантом, якому віддається перевага, яке не перевищує приблизно 4,6 10-10Μ, 4,0 10-10Μ або 2 10-10Μ, та за варіантом, якому віддається більша перевага, що не перевищує приблизно 8 10-11Μ, 7 10-11Μ, 5 1012 Μ або 1,4 10-12Μ. Спорідненість антитіл може визначатись, як описано у прикладах, наведених нижче. За варіантом, якому віддається перевага, такі антитіла за цим винаходом, які відрізняються сильною зв'язувальною спорідненістю, як описано у цьому описі, також мають ІС50 меншу за приблизно 40нМ, 30нМ, 25нМ, 20нМ або 10нМ, за варіантом, якому віддається більша перевага, меншу за або таку, що дорівнює приблизно 5нМ, 4нМ, 3нМ, 2нМ або 1нМ у in vitro репортерному аналізі з комбінацією міостатину/SBE . За варіантом, якому віддається ще більша перевага, антитіла, які відрізняються сильною зв'язувальною спорідненістю, як описано у цьому описі, мають ІС50 у in vitro репортерному аналізі з комбінацією міостатину/SBE щонайменше на 20% нижчу, за варіантом, якому віддається більша перевага, щонайменше приблизно у два рази, три рази або чотири рази нижчу за ІС50 згаданого антитіла у in vitro репортерному аналізі з комбінацією GDF-11/SBE (як описано у Прикладі 5, який наведено у цьому описі). За варіантом, якому віддається перевага, такі антитіла за цим винаходом, які відрізняються сильною зв'язувальною спорідненістю, як описано у цьому описі, додатково відрізняють тим, що вони переважно реагують із GDF-8 порівняно з GDF-11 щонайменше на 20%, що визначається за допомогою методу, доступного у цій галузі, наприклад, конкурентного ELISA, або за допомогою аналізу BIACORE або KINEXA для демонстрування щонайменше на 20% більшої спорідненості (тобто меншої ΚD) згаданого антитіла до GDF-8 порівняно з GDF-11. За варіантом, якому віддається перевага, такі антитіла за цим 19 винаходом, що відрізняються сильною зв'язувальною спорідненістю, як описано у цьому описі, додатково відрізняються тим, що вони не зв'язують пептид, який містить амінокислоти 40-64 (включно), 43-57 або 45-59 зрілого міостатину, за варіантом, якому віддається перевага, людського міостатину. За іншим варіантом здійснення, якому віддається перевага, цей винахід пропонує антиміостатинове моноклональне антитіло, яке має ІС50 меншу за або таку, що дорівнює приблизно 40нМ, 30нМ, 25нМ, 20нМ або 10нМ, за варіантом, якому віддається більша перевага, меншу за або таку, що дорівнює приблизно 5нМ, 4нМ, 3нМ, 2нМ або 1нМ у in vitro репортерному аналізі з комбінацією міостатину/SBE . За варіантом, якому віддається ще більша перевага, ІС50 антиміостатинового моноклонального антитіла у in vitro репортерному аналізі з комбінацією міостатину/SBE є щонайменше приблизно у два рази, три рази або чотири рази нижчою за ІС50 згаданого антитіла у in vitro репортерному аналізі з комбінацією GDF-11/SBE (як описано у Прикладі 5, який наведено у цьому описі). Антитіла за цим винаходом з ІС50, як описано вище, можуть додатково відрізнятись KD до міостатину меншою за приблизно 4,2 10-9Μ або 4,0 10-9М, за варіантом, якому віддається перевага, меншою за приблизно 4,6 10-10Μ, 4,0 10-10Μ або 2 10-10Μ, та за варіантом, якому віддається більша перевага, меншою за приблизно 8 10-11Μ, 7 10-11Μ, 5 10-12Μ або 1,4 10-12Μ; за альтернативним варіантом KD до міостатину, що не перевищує приблизно 4,2 10-9Μ або 4,0 10-9Μ, за варіантом, якому віддається перевага, що не перевищує приблизно 4,6 10-10Μ, 4,0 10-10Μ або 2 10-10Μ, та за варіантом, якому віддається більша перевага, що не перевищує приблизно 8 10-11М, 7 10-11М, 5 10-12Μ або 1,4 10-12Μ, де KD до міостатину є щонайменше приблизно на 20% нижчою за відповідну характеристику по відношенню до GDF-11. Антитіла за цим винаходом з ІС50, як описано вище, можуть додатково відрізнятись переважним зв'язуванням міостатину щонайменше на приблизно 20% більшим, за варіантом, якому віддається перевага, щонайменше приблизно у два рази, три рази або чотири рази більшим, у разі порівняння з їхньою здатністю до зв'язування GDF-11, яка визначається за допомогою доступного у цій галузі методу, наприклад, ELISA або конкурентного ELISA чи визначення KD за допомогою аналізу BIACORE або KINEXA. Антитіла за цим винаходом з ІС50, як описано вище, можуть додатково відрізнятись тим, що вони не зв'язують пептид, який містить амінокислоти 40-64 (включно), 43-57 або 45-59 зрілого міостатину, за варіантом, якому віддається перевага, людського міостатину, з рівнями, які значно перевищують вихідні (наприклад, при проведенні ELISA). За варіантом, якому віддається перевага, обидва поліпептиди, міостатин і GDF-11, у разі перевірки на переважне зв'язування антитілом за цим винаходом являють собою гомодимерні форми зрілого білка, за варіантом, якому віддається перевага, ссавцевого або пташиного походження, за 92504 20 варіантом, якому віддається ще більша перевага, людського походження. Однак поліпептиди міостатин і GDF-11 у разі перевірки на переважне зв'язування антитілом за цим винаходом можуть являти собою мономерну форму зрілого білка або пропротеїнову форму. Моноклональні антитіла можна одержати за допомогою методу гібридом, широко відомого у цій галузі (дивись, наприклад, Колер (Kohler) та інші, Nature, 256:495, 1975) або їх можна одержати методами рекомбінантних ДНК (наприклад, за патентом США №4,816,567). Взагалі, гібридому можна одержати шляхом злиття відповідної лінії імморталізованих клітин (наприклад, лінії клітин мієломи, наприклад, SP2/0) з клітинами імунізованих тварин, які продукують антитіла. Клітини, які продукують антитіла, за варіантом, якому віддається перевага, клітини селезінки або лімфовузлів, одержують від тварин, імунізованих антигеном, який становить інтерес. Гібридні клітини (гібридоми) можна виділити шляхом селективного культивування і клонувати методом серійних розведень. Культуральне середовище, у якому вирощують клітини гібридом, аналізують на продукування моноклональних антитіл, спрямованих проти згаданого антигену. За варіантом, якому віддається перевага, зв'язувальну специфічність моноклональних антитіл, які продукуються клітинами гібридом, визначають імунопреципітацією або аналізом зв'язування in vitro, наприклад, радіоімуноаналізом (RIA) або ELISA. Клітини, які продукують антитіла з бажаними зв'язувальними властивостями, можуть відбиратись за допомогою відповідного відбіркового аналізу. Методи такого виділення і відбирання є добре відомими у цій галузі. Можуть застосовуватись інші придатні методи одержання або виділення антитіл за цим винаходом, у тому числі, наприклад, методи, за допомогою яких відбирають рекомбінантне антитіло (наприклад, одноланцюгове Fv або Fab) з бібліотеки, або які базуються на імунізації трансгенних тварин (наприклад, мишей), здатних до продукування репертуару людських антитіл (дивись, наприклад, Джакобовіц (Jakobovits) та інші, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551-2555, 1993; Джакобовіц (Jakobovits) та інші, Nature, 362:255-258, 1993; Лонберг (Lonberg) та інші., патент США №5,545,806; Сурані (Surani) та інші, патент США №5,545,807). Цим винаходом і терміном "антитіло" передбачаються також одноланцюгові антитіла та химерні, гуманізовані або приматизовані (CDRтрансплантовані) антитіла, а також химерні або CDR-трансплантовані одноланцюгові антитіла тощо, що містять частини, одержані від різних видів. Різні частини, цих антитіл можуть об'єднуватись хімічним шляхом за допомогою традиційних методів, синтетичним шляхом або одержуватись у вигляді безперервного білка за допомогою генноінженерних методів. Наприклад, для продукування безперервного білка можуть експресуватись нуклеїнові кислоти, що кодують химерний або гуманізований ланцюг. Дивись, наприклад, патент США №4,816,567; Європатент №0,125,023 В1; Патент США №4,816,397; Європатент №0,120,694 В1; WO 21 86/01533; Європатент №0,194,276 В1; Патент США №5,225,539; Європатент №0,239,400 В1 та патенти США №5,585,089 та №5,698,762. Дивись також Ньюмен P. (Newman R.) та інші, BioTechnology, 10:1455-1460, 1993, відносно приматизованого антитіла та Леднер (Ladner) та інші, патент СИТА №4,946,778 та Берд Р.Е. (Bird R.E.) та інші, Science, 242:423-426, 1988, відносно одноланцюгових антитіл. На додаток до цього, продукуватись можуть також функціональні частини антитіл, у тому числі антигензв'язувальні частини химерних, гуманізованих,, людських або одноланцюгових антитіл. Функціональні частини згаданих антитіл зберігають щонайменше одну антигензв'язувальну функцію та/або біологічну функцію чи біологічну активність непроцесованого антитіла, похідними якого вони є. Функціональні частини, яким віддається перевага, зберігають антигензв'язувальну функцію відповідного непроцесованого антитіла (наприклад, здатність до зв'язування зрілої форми міостатину ссавців). Функціональні частини, яким віддається особлива перевага, зберігають здатність до пригнічення однієї або декількох функцій або біоактивностей, характерних для зрілого міостатину ссавців, наприклад, зв'язувальної активності, сигнальної активності та/або стимулювання клітинної відповіді. Наприклад, за одним із варіантів здійснення функціональна частина або фрагмент може пригнічувати взаємодію зрілого міостатину з одним або декількома з його лігандів та/або може пригнічувати одну або декілька функцій, опосередкованих рецептором. Частини або фрагменти антитіл, здатні до зв'язування зрілого міостатину, включають (але без обмеження) Fv, Fab, Fab' та F(аb')2-фрагменти і охоплюються цим винаходом. Такі фрагменти можуть продукуватись шляхом ферментативного розщеплення або методами рекомбінантних ДНК. Наприклад, шляхом розщеплення папаїном або пепсином можна одержати Fab- або F(аb')2фрагменти відповідно. Найменшим антигензв'язувальним фрагментом є Fv, який містить HCVR та LCVR домени. Fab-фрагмент містить HCVR-CH1 та LCVR-CL домени, ковалентно зв'язані дисульфідним зв'язком між константними ділянками. Для подолання схильності нековалентно зв'язаних HCVR та LCVR доменів у Fv до дисоціації у разі коекспресії у клітині-хазяїні може бути сконструйований так званий одноланцюговий (sc) Fvфрагмент (scFv), у якого гнучкий поліпептид відповідної довжини зв'язує С-кінець HCVR з N-кінцем LCVR або С-кінець LCVR з N-кінцем HCVR. Найпоширенішим лінкером є пептид довжиною у 15 залишків (Gly4Ser)3, однак у цій галузі відомі також інші лінкери. Антитіла можуть також продукуватись у вигляді різноманітних скорочених форм за допомогою генів антитіл, до яких у 3'-5'-напрямку відносно природного стоп-сайта був введений один або декілька стоп-кодонів. Наприклад, химерний ген, який кодує частину важкого ланцюга F(ab')2, може конструюватись таким чином, щоб включати послідовності ДНК, які кодують СН1 домен і шарнірну ділянку важкого ланцюга. 92504 22 Вибір фрагментів антитіл із бібліотек за допомогою методів збагачення, наприклад, проявлення у фагах (Меттьюз Д.Дж. (Matthews D.J.), Уеллс Дж.А. (Wells J.A.), Science, 260:1113-7, 1993), проявлення у рибосомах (Хейнс (Hanes) та інші, Ргос. Nail. Acad. Sci. (USA), 95:14130-5, 1998), проявлення у бактеріях (Семюелсон П. (Samuelson Ρ,) та інші, Journal of Biotechnology, 96:129-154, 2002) або проявлення у дріжджах (Кік М.К. (Kieke M.C.) та інші, Protein Engineering, 10:1303-1310, 1997), виявився успішною альтернативою класичній гібридомній технології (нещодавня оглядова стаття: Літл М. (Little Μ.) та інші, Immunology Today, 21:364-370, 2000). Варіантні антитіла Вихідним антитілом є мишаче моноклональне антитіло або людське антитіло (яке одержали, наприклад, у трансгенній миші), яке одержали проти міостатину або проти білка, який містить імуногенну антигенну детермінанту за цим винаходом. Мишаче вихідне антитіло може додатково змінюватись для одержання химерної або гуманізованої форми антитіла за допомогою методів, добре відомих у цій галузі. Такі химерні або гуманізовані антитіла можуть правити за вихідні антитіла для додаткової варіації або мутагенезу. Вихідні антитіла за цим винаходом можуть додатково зазнавати мутагенезу, наприклад, у межах гіперваріабельної ділянки(-ок) (дивись, наприклад, Фіг.6 і Фіг.7) для одержання варіантного антитіла з оптимізованою властивістю, яка становить інтерес, наприклад, зв'язувальною спорідненістю, ІС50, специфічністю тощо. Перевага віддається варіантному антитілу із амінокислотною заміною, у якого щонайменше один амінокислотний залишок молекули вихідного антитіла був видалений, і на його місце вставлений інший залишок. Сайтами найбільшого інтересу для замісного мутагенезу є гіперваріабельні ділянки, однак передбачаються також зміни каркасної ділянки. Перевага віддається замінам консервативних амінокислот. Якщо наслідком таких замін є зміна біологічної активності антитіла, у такому разі можуть здійснюватись більш суттєві зміни, тобто зміни неконсервативних амінокислот з перевіркою одержаних продуктів. Зручним способом одержання замісних варіантів є "визрівання афінності" із застосуванням проявлення у фагах. Стисло, декілька сайтів гіперваріабельної ділянки піддають мутації із здійсненням усіх можливих амінокислотних замін на кожному сайті. Варіанти антитіл, які одержують таким чином, проявляються моновалентним чином із нитчастих фагових частинок як гібриди з продуктом гена III Μ13, які заповнюють кожну частинку. Після цього варіанти з проявленням у фагах перевіряють на їхню біологічну активність (наприклад, зв'язувальну спорідненість, специфічність, ІС50), як розкривається у цьому описі. Для ідентифікування сайтів-кандидатів гіперваріабельної ділянки для модифікування може здійснюватись мутагенез методом ідентифікування аланіну для ідентифікування залишків гіперваріабельної ділянки, які значною мірою сприяють зв'язуванню антигену. За альтернативним варіантом або на додаток до цього корисним може бути проведення аналізу крис 23 талічної структури комплексу антиген-антитіло для ідентифікування ділянок контактування між антитілом і міостатином. Такі контактні залишки і сусідні залишки є кандидатами на заміну за методами, розробленими за цим винаходом або відомими у цій галузі. За альтернативним варіантом або на додаток до цього неспецифічний мутагенез може здійснюватись на одній або декількох послідовностях гіперваріабельної ділянки на одному або декількох положеннях залишків у той час, коли CDR є функціонально зв'язаною з варіабельною ділянкою або у той час, коли CDR є незалежною від іншої послідовності варіабельної ділянки з подальшим повертанням зміненої CDR до варіабельної ділянки за допомогою методу рекомбінантних ДНК. Після одержання таких варіантних антитіл, панель варіантів піддають перевірці як описано у цьому описі, і антитіла з найкращими властивостями у одному або декількох відповідних аналізах можуть відбиратись для додаткової розробки. Будь-який залишок цистеїну, не залучений до підтримання відповідної конформації антиміостатинового антитіла за цим винаходом, може замінюватись, як правило, на серин, для поліпшення стійкості згаданої молекули до окиснення та запобігання хибного перехресного зв'язування. І, навпаки, цистеїновий(-і) зв'язок(-ки) може(-уть) додаватись до згаданого антитіла для поліпшення його стійкості (зокрема, коли згадане антитіло являє собою фрагмент антитіла, наприклад, Fvфрагмент). Амінокислотний варіант згаданого антитіла іншого типу змінює вихідну схему глікозилування згаданого антитіла. Термін "змінює" означає видалення однієї або декількох вуглеводних складових, присутніх у складі антитіла, та/або додання одного або декількох сайтів глікозилування, не присутніх у вихідному антитілі. Глікозилування антитіл є, як правило, Nзв'язаним або О-зв'язаним. N-зв'язане означає приєднання вуглеводної складової до бічного ланцюга залишку аспарагіну. Трипептидні послідовності аспарагін-Х-серин та аспарагін-Х-треонін, де X являє собою будь-яку амінокислоту окрім проліну, є визнаними послідовностями для ферментативного приєднання вуглеводної складової до бічного ланцюга аспарагіну. Таким чином, присутність будь-якої із цих трипептидних послідовностей у поліпептиді створює потенційний сайт глікозилування. О-зв'язане глікозилування означає приєднання одного із цукрів, N-ацетилгалактозаміну, галактози або ксилози, до оксіамінокислоти, найчастіше, серину або треоніну, хоча застосовуватись може також 5-гідроксипролін або 5гідроксилізин. Додання сайтів глікозилування до антитіла, як правило, супроводжується зміною амінокислотної послідовності таким чином, що вона містить одну або декілька з вищеописаних трипептидних послідовностей (для N-зв'язаних сайтів глікозилування). Зміна може також здійснюватись шляхом додання або заміни одного або декількох залишків серину або треоніну на послідовність вихідного антитіла (для О-зв'язаних сайтів глікозилування). 92504 24 Послідовність Моноклональне антитіло за цим винаходом, якому віддається перевага, має LCVR, що містить пептид із послідовністю, вибраною з групи, яка включає ПОСЛІДОВНОСТІ №74-102, №140, №141 та №142 (Фіг.9) та/або HCVR, що містить пептид із послідовністю, вибраною з групи, яка включає ПОСЛІДОВНОСТІ №103-138 (Фіг.10). За варіантом здійснення, якому віддається перевага, антитіло за цим винаходом, яке містить LCVR поліпептид, який містить амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ, представлену у наведеній у цьому описі Таблиці 1, додатково містить HCVR поліпептид, який містить амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ HCVR поліпептиду, який відповідає конкретній LCVR у Таблиці 1. Досвідченому фахівцю буде зрозуміло, що антитіла за цим винаходом не обмежуються вказаними послідовностями HCVR та LCVR, які представлені на наведених у цьому описі Фіг.9 та Фіг.10, але включають також варіанти цих послідовностей, які зберігають антигензв'язувальну здатність та інші функціональні властивості антитіл за цим винаходом. Такі варіанти можуть одержуватись із наведених послідовностей за допомогою методів, відомих у цій галузі, як описано у цьому описі. На додаток до цього моноклональне антитіло за цим винаходом являє собою антитіло, зв'язування якого зі зрілим людським міостатином (або його частиною) конкурентно пригнічується конкуруючим моноклональним антитілом, яке містить два поліпептиди з послідовностями, представленими групою, яка включає (і) ПОСЛІДОВНОСТІ №98 та №138 та (іі) ПОСЛІДОВНОСТІ №74 та №103. Таке конкурентне пригнічення між антитілами може визначатись за допомогою аналізів, добре відомих фахівцю у цій галузі, наприклад, за допомогою конкурентного ELISA. За варіантом, якому віддається перевага, антитіло за цим винаходом, яке конкурує з конкуруючим антитілом, визначеним вище, додатково відрізняється переважним зв'язуванням із GDF-8 порівняно з GDF-11 щонайменше на 20%, 30% або 40%, що визначається за допомогою методу, доступного у цій галузі, наприклад, конкурентного ELISA, або за допомогою аналізу BIACORE або KINEXA, для демонстрування щонайменше на 20%, 30% або 40% більшої спорідненості (тобто меншої KD) згаданого антитіла до GDF-8 порівняно з GDF-11. За варіантом, якому віддається перевага, антитіло за цим винаходом, яке конкурує з конкуруючим антитілом, визначеним вище, додатково відрізняється KD до міостатину меншою за приблизно 4,2 10-9Μ або 4,0 10-9Μ, за варіантом, якому віддається перевага, меншою за приблизно 4,6 10-10Μ, 4,0 10-10Μ або 2 10-10Μ, та за варіантом, якому віддається більша перевага, меншою за приблизно 8 10-11Μ, 7 10-11Μ, 5 10-12Μ або 1,4 10-12Μ; за альтернативним варіантом відрізняється KD до міостатину, що не перевищує приблизно 4,2 10-9Μ або 4,0 10-9Μ, за варіантом, якому віддається перевага, що не перевищує приблизно 4,6 10-10Μ, 4,0 10-10Μ або 2 10-10М, та за варіантом, якому віддається більша перевага, що не перевищує приблизно 8 10-11Μ, 7 10-11Μ, 5 10-12Μ або 1,4 10-12Μ, та/або додатково відрізняється 25 ІС50, меншою за або такою, що дорівнює приблизно 40нМ, 30нМ, 20нМ або 10нМ, за варіантом, якому віддається більша перевага, меншою за або такою, що дорівнює приблизно 5нМ, 4нМ, 3нМ, 2нМ або 1нМ у in vitro репортерному аналізі з комбінацією міостатину/SBE. За варіантом, якому віддається ще більша перевага, антитіло за цим винаходом, яке конкурує з конкуруючим антитілом, визначеним вище, додатково відрізняється ІС50 y in vitro репортерному аналізі з комбінацією міостатину/SBE , меншою за або такою, що дорівнює приблизно 40нМ, 30нМ, 25нМ, 20нМ або 10нМ, за варіантом, якому віддається більша перевага, меншою за або такою, що дорівнює приблизно 5нМ, 4нМ, 3нМ, 2нМ або 1нМ у in vitro репортерному аналізі з комбінацією міостатину/SBE. За варіантом, якому віддається ще більша перевага, ІС50 антиміостатинового моноклонального антитіла у in vitro репортерному аналізі з комбінацією міостатину/SBE є щонайменше приблизно у два рази, три рази або чотири рази нижчою за ІС50 згаданого антитіла у in vitro репортерному аналізі з комбінацією GDF-11/SBE (як описано у Прикладі 5, який наведено у цьому описі). За варіантом, якому віддається ще більша перевага, антитіло за цим винаходом, яке конкурує з конкуруючим антитілом, визначеним вище, додатково відрізняється тим, що воно не зв'язує пептид, який містить амінокислоти 40-64 (включно), 43-57 або 45-59 зрілого міостатину, за варіантом, якому віддається перевага, людського міостатину. За одним із варіантів здійснення антиміостатинове антитіло за цим винаходом має варіабельну ділянку важкого ланцюга і варіабельну ділянку легкого ланцюга, де варіабельна ділянка важкого ланцюга містить гіперваріабельні ділянки з наведеними нижче амінокислотними послідовностями: CDRH1 (ПОСЛІДОВНІСТЬ №42), CDRH2 (ПОСЛІДОВНІСТЬ №71) та CDRH3 (ПОСЛІДОВНІСТЬ №72) (дивись Фіг.7); та/або, де варіабельна ділянка легкого ланцюга містить гіперваріабельні ділянки з наведеними нижче амінокислотними послідовностями: CDRL1 (ПОСЛІДОВНІСТЬ №12), CDRL2 (ПОСЛІДОВНІСТЬ №154) та CDRL3 (ПОСЛІДОВНІСТЬ №37). За варіантом, якому віддається перевага, гіперваріабельні ділянки важкого ланцюга антитіла за цим винаходом представлені на Фіг.7, а гіперваріабельні ділянки легкого ланцюга антитіла за цим винаходом представлені на Фіг.6. Додатково передбачається, що антиміостатинове антитіло за цим винаходом містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка містить CDRH1 з послідовністю, вибраною з групи, яка включає ПОСЛІДОВНОСТІ №38-41, та/або CDRH2 з послідовністю, вибраною з групи, яка включає ПОСЛІДОВНОСТІ №43-70 і №73, та/або CDRH3 з ПОСЛІДОВНІСТЮ №72. За іншим варіантом здійснення антиміостатинове антитіло за цим винаходом містить варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка містить CDRL1 з послідовністю, вибраною з групи, яка включає ПОСЛІДОВНОСТІ №911, та/або CDRL2 з послідовністю, вибраною з групи, яка включає ПОСЛІДОВНОСТІ №13-23, та/або CDRL3 з послідовністю, вибраною з групи, яка включає ПОСЛІДОВНОСТІ №24-36. За варіан 92504 26 том здійснення, якому віддається перевага, антиміостатинове антитіло за цим винаходом містить CDRH1 з послідовністю, вибраною з групи, яка включає ПОСЛІДОВНОСТІ №38-42, та/або CDRH2 з послідовністю, вибраною з групи, яка включає ПОСЛІДОВНОСТІ №43-70 і №73, та/або CDRH3 з ПОСЛІДОВНІСТЮ №72, і додатково містить варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка містить CDRL1 з послідовністю, вибраною з групи, яка включає ПОСЛІДОВНОСТІ №9-11, та/або CDRL2 з послідовністю, вибраною з групи, яка включає ПОСЛІДОВНОСТІ №13-23, та/або CDRL3 з послідовністю, вибраною з групи, яка включає ПОСЛІДОВНОСТІ №24-36. Структурою для розміщення CDR за цим винаходом буде, як правило, послідовність важкого або легкого ланцюга антитіла або значна їхня частина, у якій CDR займає положення, яке відповідає положенню CDR природної HCVR та LCVR (Кебот (Kabat) та інші, Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept of HHS, 1991). Три гіперваріабельні ділянки (CDR) кожного ланцюга, легкого і важкого, надаються у межах каркасної ділянки як прилегла безперервна послідовність, представлена наведеною нижче формулою: FR1CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. FR1, FR2, FR3 та FR4 важкого ланцюга або легкого ланцюга об'єднуються з утворенням повного каркаса у разі розміщення у вигляді прилеглої безперервної послідовності з гіперваріабельними ділянками у зазначеному порядку. За варіантом, якому віддається перевага, каркасні ділянки антитіла за цим винаходом мають людське, гуманізоване або по суті людське походження. У гуманізованого антитіла, призначеного для терапевтичного застосування на людях, каркасна послідовність за варіантом, якому віддається перевага, має повністю або значною мірою людське походження (тобто щонайменше 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% або 99% людського походження). За варіантом, якому віддається перевага, каркасна ділянка легкого ланцюга гуманізованого, людського або химерного антитіла за цим винаходом виглядає так, як показано на Фіг.9, і складається з FR1 з ПОСЛІДОВНІСТЮ №143, FR2 з ПОСЛІДОВНІСТЮ №144, FR3 з ПОСЛІДОВНІСТЮ №145 і FR4 з ПОСЛІДОВНІСТЮ №146 або №147. За варіантом, якому віддається перевага, каркасна ділянка важкого ланцюга гуманізованого, людського або химерного антитіла за цим винаходом виглядає так, як показано на Фіг.10, і складається з FR1 з ПОСЛІДОВНІСТЮ №148 або №149, FR2 з ПОСЛІДОВНІСТЮ №150 або №151, FR3 з ПОСЛІДОВНІСТЮ №152 або №153 і FR4 з ПОСЛІДОВНІСТЮ №139. Наприклад, антитіло 3-74/С1Е4 містить варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка містить FR1 з ПОСЛІДОВНІСТЮ №143, CDR1 з ПОСЛІДОВНІСТЮ №9, FR2 з ПОСЛІДОВНІСТЮ №144, CDR2 з ПОСЛІДОВНІСТЮ №18, FR3 з ПОСЛІДОВНІСТЮ №145, CDR3 з ПОСЛІДОВНІСТЮ №25 і FR4 з ПОСЛІДОВНІСТЮ №146. Антитіло 374/С1Е4 додатково містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка містить FR1 з ПОСЛІДОВНІСТЮ №149, CDR1 з ПОСЛІДОВНІСТЮ №40, FR2 з ПОСЛІДОВНІСТЮ №151, CDR2 з ПОСЛІДОВНІС 27 ТЮ №60, FR3 з ПОСЛІДОВНІСТЮ №153, CDR3 з ПОСЛІДОВНІСТЮ №72 і FR4 з ПОСЛІДОВНІСТЮ №139. Послідовність каркасної ділянки антитіла для застосування на тваринах окрім людини може по суті походити з людського геному (за варіантом, якому віддається перевага, застосовується на тварині окрім людини, коли вона є зародком або новонародженою) або з геному тварини, на якій воно буде застосовуватись із терапевтичною метою. За одним із варіантів здійснення антиміостатинове антитіло за цим винаходом, де уся або частина варіабельної ділянки обмежується конкретною послідовністю, яка представлена наведеною у цьому описі ПОСЛІДОВНІСТЮ, додатково відрізняється тим, що воно являє собою химерне, гуманізоване або повністю людське антитіло або його антигензв'язувальний домен, що антагонізує або нейтралізує щонайменше одну активність міостатину in vivo або in vitro. Антиміостатинове антитіло за цим винаходом, де уся або частина варіабельної ділянки обмежується конкретною послідовністю, яка представлена наведеною у цьому описі ПОСЛІДОВНІСТЮ, додатково відрізняється тим, що воно переважно зв'язує GDF-8 порівняно з GDF-11 щонайменше на 20%, 30% або 40% більше, що визначається за допомогою методу, доступного у цій галузі, наприклад, конкурентного ELISA, або за допомогою аналізу BIACORE або KINEXA для демонстрування щонайменше на 20%, 30% або 40% більшої спорідненості (тобто меншої KD) згаданого антитіла до GDF-8 порівняно з GDF-11. За варіантом, якому віддається перевага, антитіло за цим винаходом, де уся або частина варіабельної ділянки обмежується конкретною послідовністю, яка представлена наведеною у цьому описі ПОСЛІДОВНІСТЮ, додатково відрізняється ΚD до міостатину меншою за приблизно 4,2 10-9Μ або 4,0 10-9Μ, за варіантом, якому віддається перевага, меншою за приблизно 4,6 1010 Μ, 4,0 10-10Μ або 2 10-10Μ, та за варіантом, якому віддається більша перевага, меншою за приблизно 8 10-11Μ, 7 10-11Μ, 5 10-12Μ або 1,4 10-12Μ; або, за альтернативним варіантом, відрізняється KD до міостатину, що не перевищує приблизно 4,2 10-9Μ або 4,0 10-9Μ, за варіантом, якому віддається перевага, що не перевищує приблизно 4,6 10-10М, 4,0 10-10Μ або 2 10-10Μ, та за варіантом, якому віддається більша перевага, що не перевищує приблизно 8 10-11Μ, 7 10-11Μ, 5 10-12Μ або 1,4 10-12Μ, та/або додатково відрізняється ІС50, меншою за або такою, що дорівнює приблизно 40нМ, 20нМ або 10нМ, за варіантом, якому віддається більша перевага, меншою за або такою, що дорівнює приблизно 5нМ, 4нМ, 3нМ, 2нМ або 1нМ у in vitro репортерному аналізі з комбінацією міостатину/SBE . За варіантом, якому віддається ще більша перевага, антитіло за цим винаходом, де уся або частина варіабельної ділянки обмежується конкретною послідовністю, яка представлена наведеною у цьому описі ПОСЛІДОВНІСТЮ, додатково відрізняється ІС50 У in vitro репортерному аналізі з комбінацією міостатину/SBE , меншою за або такою, що дорівнює приблизно 40нМ, 30нМ, 25нМ, 92504 28 20нМ або 10нМ, за варіантом, якому віддається більша перевага, меншою за або такою, що дорівнює приблизно 5нМ, 4нМ, 3нМ, 2нМ або 1нМ у in vitro репортерному аналізі з комбінацією міостатину/SBE. За варіантом, якому віддається ще більша перевага, ІС50 антиміостатинового моноклонального антитіла у in vitro репортерному аналізі з комбінацією міостатину/SBE є щонайменше приблизно у два рази, три рази або чотири рази нижчою за ІС50 згаданого антитіла у in vitro репортерному аналізі з комбінацією GDF-11/SBE (як описано у Прикладі 5, який наведено у цьому описі). За варіантом, якому віддається ще більша перевага, антитіло за цим винаходом, де уся або частина варіабельної ділянки обмежується конкретною послідовністю, яка представлена наведеною у цьому описі ПОСЛІДОВНІСТЮ, додатково відрізняється тим, що воно не зв'язує пептид, який містить амінокислоти 40-64 (включно), 43-57 або 4559 зрілого міостатину, за варіантом, якому віддається перевага, людського міостатину. Експресія антитіл Цей винахід спрямовано також на лінії клітин, що експресують антиміостатинове моноклональне антитіло за цим винаходом або його частину. Одержання і виділення ліній клітин, що продукують моноклональне антитіло за цим винаходом, може здійснюватись за допомогою стандартних методів, відомих у цій галузі. Лініями клітин, яким віддається перевага, є COS (культура клітин яєчника мавпи), СНО (культура клітин яєчника китайського хом'ячка), SP2/0, NS0 та дріжджові клітини (доступні із загальнодоступних сховищ, наприклад, АТСС (Американська колекція типових культур), Manassas, штат Вірджинія). Для експресії антитіла за цим винаходом можуть застосовуватись найрізноманітніші експресійні системи-хазяї, у тому числі прокаріотні (бактеріальні) та еукаріотні експресійні системи (наприклад, дріжджі, бакуловірус, рослинні клітини, клітини ссавців та інших тварин, трансгенні тварини та клітини гібридом), а також експресійні системи проявлення у фагах. Прикладом відповідного бактеріального експресійного вектора є pUC119, і відповідним еукаріотним експресійним вектором є модифікований вектор pcDNA3.1 з ослабленою системою вибору DHFR (дигідрофолатредуктаза). У цій галузі відомі також інші системи експресії антитіла і вони охоплюються цим винаходом. Антитіло за цим винаходом можна одержати шляхом рекомбінантної експресії імуноглобулінових генів легкого і важкого ланцюгів у клітиніхазяїні. Для експресії антитіла рекомбінантним шляхом, клітина-хазяїн трансформується, трансдукується, інфікується тощо одним або декількома векторами рекомбінантної експресії, що несуть фрагменти ДНК, які кодують імуноглобулінові легкі та/або важкі ланцюги антитіла таким чином, що згадані легкі та/або важкі ланцюги експресуються у клітині-хазяїні. Важкий ланцюг і легкий ланцюг можуть експресуватись незалежно з різних промоторів, з якими вони функціонально зв'язані, у одному векторі, або за альтернативним варіантом важкий ланцюг і легкий ланцюг можуть експресуватись 29 незалежно з різних промоторів, з якими вони функціонально зв'язані, у двох векторах - один із них експресує важкий ланцюг і один із них експресує легкий ланцюг. Факультативно важкий ланцюг і легкий ланцюг можуть експресуватись у різних клітинах-хазяях. За варіантом, якому віддається перевага, рекомбінантні антитіла секретуються до середовища, у якому культивують клітини-хазяї, з якого антитіла можуть бути виділені або очищені. Стандартні методи рекомбінантних ДНК застосовуються для одержання генів важкого і легкого ланцюгів антитіла, включення цих генів до рекомбінантних експресійних векторів і введення цих векторів до клітин-хазяїв. Опис таких стандартних методів рекомбінантних ДНК наведено, наприклад, у Сембрук (Sambrook), Фріч (Fritsch), Маніатіс (Maniatis) (редактори), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, друге видання, Cold Spring Harbor, N. Υ., 1989; Осбел (Ausubel) та інші (редактори) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, 1989. Виділена ДНК, що кодує HCVR, може бути перетворена на непроцесований ген важкого ланцюга шляхом функціонального зв'язування ДНК, що кодує HCVR, з іншою молекулою ДНК, що кодує константні ділянки важкого ланцюга (СН1, СН2 та СН3). Послідовності людських генів константної ділянки важкого ланцюга відомі у цій галузі. Дивись, наприклад, Кебот (Kabat) та інші, Sequences of Proteins of Immunological Interest, п'яте видання, U.S. Department of Health and Human Services, публікація NIH №91-3242 (1991). Фрагменти ДНК для цих ділянок можуть бути одержані, наприклад, шляхом стандартної ПЛР-ампліфікації. Константна ділянка важкого ланцюга може бути константною ділянкою будь-якого типу (наприклад, IgG, IgA, IgE, IgM або IgD), класу (наприклад, IgG1, IgG2, IgG3 та IgCU) або підкласу і будь-яким алотиповим варіантом, як описано у Кебот (supra). За альтернативним варіантом антигензв'язувальним фрагментом може бути (Fab-фрагмент, Fab'-фрагмент, F(аb')2фрагмент, Fd-фрагмент або одноланцюговий Fvфрагмент (scFv). Для гена Fab-фрагмента важкого ланцюга, ДНК, що кодує HCVR, може функціонально зв'язуватись з іншою молекулою ДНК, що кодує лише константну ділянку СН1 важкого ланцюга. Виділена ДНК, що кодує LCVR, може бути перетворена на непроцесований ген легкого ланцюга (а також ген Fab-фрагмента легкого ланцюга) шляхом функціонального зв'язування ДНК, що кодує LCVR, з іншою молекулою ДНК, що кодує константну ділянку легкого ланцюга, CL. Послідовності людських генів константної ділянки легкого ланцюга відомі у цій галузі. Дивись, наприклад, Кебот (Kabat), supra. Фрагменти ДНК для цих ділянок можуть бути одержані, наприклад, шляхом стандартної ПЛР-ампліфікації. Константна ділянка легкого ланцюга може бути константною ділянкою легкого ланцюга типу каппа або лямбда. Для одержання scFv гена фрагменти ДНК, що кодують HCVR і LCVR, функціонально зв'язують з іншим фрагментом, який кодує гнучкий лінкер, наприклад, який кодує амінокислотну послідовність (Gly4-Ser)3, завдяки чому HCVR та LCVR послідов 92504 30 ності можуть експресуватись як суміжний безперервний одноланцюговий білок із LCVR та HCVR ділянками, які з'єднуються гнучким лінкером. Дивись, наприклад, Берд (Bird) та інші, Science, 242:423-426, 1988; Хастон (Huston) та інші, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883, 1988; Маккафферті (McCafferty) та інші, Nature, 348:552-554, 1990. Для експресії антитіла за цим винаходом ДНК, що кодує частковий або повномірний легкий та/або важкий ланцюг, одержану, як було описано вище, вводять до експресійного вектора таким чином, що ген функціонально зв'язується з контрольними послідовностями транскрипції та трансляції. Експресійний вектор та контрольні послідовності експресії вибирають таким чином, щоб вони були сумісними із застосовуваними експресійними клітинами-хазяями. Ген легкого ланцюга антитіла і ген важкого ланцюга антитіла можуть вводитись до окремих факторів, або, за більш типовим варіантом, обидва гени вводять до одного й того самого експресійного вектора. Гени антитіла вводять до експресійного вектора за допомогою стандартних методів. На додаток до цього, рекомбінантний експресійний вектор може кодувати сигнальний пептид, що полегшує секрецію легкого та/або важкого ланцюга антиміостатинового моноклонального антитіла з клітини-хазяїна. Ген легкого та/або важкого ланцюга антиміостатинового моноклонального антитіла може клонуватись до вектора таким чином, що сигнальний пептид виявляється функціонально зв'язаним у межах рамки зчитування з амінокінцем гена ланцюга антитіла. Згаданий сигнальний пептид може бути імуноглобуліновим сигнальним пептидом або гетерологічним сигнальним пептидом. Окрім гена(-ів) важкого та/або легкого ланцюга антитіла, рекомбінантний експресійний вектор за цим винаходом несе регуляторні послідовності, що контролюють експресію гена(-ів) ланцюга антитіла у клітині-хазяїні. Термін "регуляторна послідовність" означає промотори, енхансери та інші контрольні елементи експресії (наприклад, сигнали поліаденілування) за потребою, що контролюють транскрипцію або трансляцію гена(-ів) ланцюга антитіла. Конструкція експресійного вектора, з включенням вибору регуляторних послідовностей, може залежати від таких факторів, як вибір клітини-хазяїна, яка зазнає трансформування, рівня експресії бажаного білка. Переважними регуляторними послідовностями для експресії клітинамихазяями ссавців є вірусні елементи, які забезпечують високі рівні експресії білка у клітинах ссавців, наприклад, промотори та/або енхансери, які одержують із цитомегаловірусу (CMV), мавпячого вірусу 40 (SV40), аденовірусу (наприклад, головний пізній промотор аденовірусу (AdMLP)) та вірусу поліоми. На додаток до генів важкого та/або легкого ланцюга антитіла і регуляторних послідовностей, рекомбінантні експресійні вектори за цим винаходом можуть нести додаткові послідовності, наприклад, послідовності, які регулюють реплікацію вектора у клітинах-хазяях (наприклад, точки початку реплікації) та один або декілька маркерних селек 31 товних генів. Маркерні селектовні гени полегшують селекцію клітин-хазяїв, до яких було введено вектор. Наприклад, за типовим варіантом, маркерний селектовний ген наділяє стійкістю до лікарського засобу, наприклад, G418, гігроміцину або метотрексату, клітину-хазяїна, до якої було введено згаданий вектор. Маркерними селектовними генами, яким віддається перевага, є ген дигідрофолатредуктази (DHFR) (для застосування у клітинаххазяях без DHFR із селекцією/ампліфікацією метотрексатом), пео ген (для G418 селекції) та глютамат-аміак-лігази (GS) у лінії клітин, яким бракує GS (наприклад, NS0) для селекції/ампліфікації. Для експресії легких та/або важких ланцюгів експресійний(-ні) вектор (-и), що кодує(-ють) важкі та/або легкі ланцюги, вводять до клітини-хазяїна за допомогою стандартних методів, наприклад, шляхом електропорації, осадження фосфатом кальцію, трансфікування DEAE (діетиламіноетилцелюлоза)декстрану, трансдукування, інфікування тощо. Незважаючи на теоретичну можливість експресії антитіл за цим винаходом у прокаріотних або еукаріотних клітинах-хазяях, перевага віддається еукаріотним клітинам і за варіантом, якому віддається найбільша перевага, клітинам-хазяям ссавців, оскільки такі клітини з більшою ймовірністю складають і секретують відповідно укладене і імунологічно активне антитіло. Клітинами-хазяями ссавців для експресії рекомбінантних антитіл за цим винаходом, яким віддається перевага, є клітини яєчника китайського хом'ячка (клітини СНО) (у тому числі DHFR-СНО клітини, опис яких наведено у роботі Урлауб (Urlaub) і Чейсін (Chasin), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216-4220, 1980), що застосовуються з DHFR селектовним маркером, наприклад, як описано у Кауфман (Kaufman) і Шарп (Sharp), J. Моl. Віоі, 159:601-621, 1982, клітини мієломи лінії NS0, клітини COS та клітини SP2/0. У разі, коли рекомбінантні експресійні вектори, які кодують гени, антитіла, вводять до клітин-хазяїв ссавців, антитіла продукуються шляхом культивування клітин-хазяїв впродовж періоду часу, достатнього для забезпечення експресії згаданого антитіла у клітинах-хазяях, або за варіантом, якому віддається більша перевага, секреції антитіла до культурального середовища, у якому вирощують клітини-хазяї. Антитіла можуть виділятись із клітини-хазяїна та/або культурального середовища за допомогою стандартних методів очищення. Клітини-хазяї можуть також застосовуватись для продукування частин або фрагментів інтактних антитіл, наприклад, Fab-фрагментів або scFv молекул, за традиційними методами. Досвідченому фахівцю буде зрозуміло, що варіанти вищезгаданих методів входять до обсягу цього винаходу. Наприклад, може виникнути необхідність трансфікування клітини-хазяїна ДНК, яка кодує легкий ланцюг або важкий ланцюг антитіла за цим винаходом. Метод рекомбінантних ДНК може також застосовуватись для видалення певної частини або усієї ДНК, яка кодує будь-який або обидва (легкий і важкий) ланцюги, які не є необхідними для зв'язування з міостатином. Молекули, що експресуються такими скороченими молекулами ДНК, також належать до антитіл за цим винаходом. 92504 32 У системі для рекомбінантної експресії антитіла за цим винаходом, якій віддається перевага, рекомбінантний експресійний вектор, що кодує як важкий ланцюг антитіла, так і легкий ланцюг антитіла, вводять до DHFR-СНО клітин шляхом, наприклад, трансфікування, опосередкованого фосфатом кальцію. У межах рекомбінантного експресійного вектора кожен із генів важкого і легкого ланцюгів антитіла функціонально зв'язаний із енхансером/промоторним регуляторним елементом (який, наприклад, одержують з SV40, CMV (цитомегаловірус), аденовірусу тощо, наприклад, CMV енхансер/AdMLP промоторний регуляторний елемент або SV40 енхансер/AdMLP промоторній регуляторний елемент) для стимулювання високих рівнів транскрипції генів. Рекомбінантний експресійний вектор несе також DHFR ген, який забезпечує селекцію клітин СНО, які були трансфіковані згаданим вектором шляхом селекції/ампліфікації метотрексатом. Селектовані клітини-хазяїтрансформанти культивують для забезпечення експресії важких і легких ланцюгів антитіла, і інтактне антитіло виділяють із культурального середовища. Стандартні методи молекулярної біології застосовують для одержання рекомбінантного експресійного вектора, трансфікування клітинхазяїв, селекції трансформантів, культивування клітин-хазяїв та виділення антитіла з культурального середовища. Антитіла або їх антигензв'язувальні частини за цим винаходом можуть експресуватись у тварині (наприклад, миші), що є трансгенною за людськими імуноглобуліновими генами (дивись, наприклад, Тейлор (Taylor) та інші, Nucleic Acids Res., 20:6287-6295, 1992). Після завершення експресії, інтактні антитіла, їхні димери, окремі легкі і важкі ланцюги або інші форми імуноглобулінів за цим винаходом можуть бути очищені за стандартними методами, прийнятими у цій галузі, у тому числі шляхом фракціонування сульфатом амонію, за допомогою іонообмінної, афінної, з оберненою фазою, гідрофобної хроматографії на колонках, гель-електрофорезу тощо. Для фармацевтичного застосування перевага віддається по суті чистим імуноглобулінам, які мають щонайменше приблизно 90%, 92%, 94% або 96% однорідність, і найбільша перевага віддається імуноглобулінам, які мають 98%-99% або більший ступінь однорідності. Після завершення очищення, часткового або до однорідності, за потребою, пептиди у подальшому можуть застосовуватись із терапевтичними або профілактичними цілями, як вказується у цьому описі. Химерне антитіло Термін "химерне антитіло", у значенні, вживаному у цьому описі, означає моновалентні, двовалентні або полівалентні імуноглобуліни. Моновалентне химерне антитіло являє собою димер, утворений химерним важким ланцюгом, зв'язаним через дисульфідні містки з химерним легким ланцюгом. Двовалентне химерне антитіло являє собою тетрамер, утворений двома димерами важкий ланцюг-легкий ланцюг, зв'язаними щонайменше одним дисульфідним містком. Химерний важкий ланцюг антитіла містить антигензв'язувальний домен, який одержують із важ 33 кого ланцюга нелюдського антитіла, специфічного відносно міостатину, який є функціонально зв'язаним із принаймні частиною константної ділянки людського або по суті людського (або виду, який відрізняється від того виду, від якого походить антигензв'язувальний домен) важкого ланцюга, наприклад, СН1 або СН2, або за варіантом, якому віддається перевага, з повномірною константною ділянкою важкого ланцюга. Химерний легкий ланцюг антитіла для застосування на людях містить антигензв'язувальний домен, який повністю або значною мірою одержують із легкого ланцюга нелюдського антитіла, специфічного відносно міостатину, який є функціонально зв'язаним із принаймні частиною константної ділянки (CL) людського або по суті людського (або виду, який відрізняється від того виду, від якого походить антигензв'язувальний домен) легкого ланцюга, або, за варіантом, якому віддається перевага, з повномірною константною ділянкою легкого ланцюга. Антитіла, фрагменти або похідні, які мають химерні важкі ланцюги і легкі ланцюги з такою самою або іншою зв'язувальною специфічністю варіабельної ділянки, можуть також одержуватись шляхом відповідного зв'язування окремих полшептидних ланцюгів за допомогою стадій відомих методів. У разі подібного варіанта підходу хазяїв, які експресують химерні важкі ланцюги, культивують окремо від хазяїв, що експресують химерні легкі ланцюги, а імуноглобулінові ланцюги виділяють окремо з подальшим об'єднанням. Альтернативно хазяї можуть бути сумісно культивовані із забезпеченням умов для спонтанного об'єднання ланцюгів у культуральному середовищі з подальшим виділенням зібраного імуноглобуліну або фрагмента. Методи продукування химерних антитіл є відомими у цій галузі (дивись, наприклад, патенти США №6,284,471; №5,807,715; №4,816,567; та №4,816,397). Гуманізовані антитіла За варіантом, якому віддається перевага, антитіло за цим винаходом, призначене для застосування у терапевтичних цілях, повинно мати послідовність каркаса та константної ділянки (тією мірою, у якій вона існує у антитіла), одержану від ссавця, у якого воно повинно бути застосоване як терапевтичний засіб, для того, щоб зменшити ймовірність того, що у ссавця виникне імунна реакція проти терапевтичного антитіла. Гуманізовані антитіла становлять особливий інтерес, оскільки вони вважаються цінними для терапевтичного застосування і запобігають утворенню людських антимишачих антитіл, що часто спостерігається у разі антитіл гризунів. Окрім того, у гуманізованих антитіл ефекторна частина є людською, завдяки чому вона може краще взаємодіяти з іншими частинами людської імунної системи (наприклад, із більшою ефективністю знищувати клітини-мішені шляхом комплементзалежної цитотоксичності або антитілозалежної клітинної цитотоксичності). Введені гуманізовані антитіла можуть також мати період напіввиведення, який більше нагадує відповідний показник природних людських антитіл, порівняно з, наприклад, мишачими антитілами, що надає можливість введення менших і рідших доз. 92504 34 Термін "гуманізоване антитіло", у значенні, вживаному у цьому описі, означає антитіло, яке містить частини антитіл різного походження, де щонайменше одна частина має людське походження. Наприклад, гуманізоване антитіло може містити частини, одержані з антитіла нелюдського походження з необхідною специфічністю, наприклад, мишачого, і з антитіла людського походження, об'єднані разом хімічним шляхом за допомогою традиційних методів (наприклад, синтетичних) або одержані у вигляді безперервного суміжного поліпептиду за допомогою методів генної інженерії. За варіантом, якому віддається перевага, "гуманізоване антитіло" має гіперваріабельні ділянки, які походять із нелюдського антитіла (за варіантом, якому віддається перевага, мишачого моноклонального антитіла), у той час як каркас і константна ділянка, тією мірою, до якої вона присутня (або її суттєва чи значна частина, тобто щонайменше приблизно 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% або 99%) кодуються інформацією нуклеїновокислотної послідовності, яка знаходиться на людській імуноглобуліновій ділянці ембріонального типу (дивись, наприклад, міжнародну базу даних ImMunoGeneTics) або її рекомбінованих чи мутованих формах, незалежно від того, чи продукуються згадані антитіла у людській клітині. Гіперваріабельні ділянки гуманізованого антитіла можуть оптимізуватись із гіперваріабельних ділянок нелюдського вихідного антитіла, з якого вони походять, для одержання бажаних властивостей, наприклад, специфічності, афінності і потенціалу. Оптимізовані гіперваріабельні ділянки можуть мати амінокислотні заміни, додання та/або делеції порівняно з вихідними гіперваріабельними ділянками. Наприклад, амінокислотні положення гіперваріабельних ділянок, підкреслені та виділені жирним шрифтом на Фіг.6 та Фіг.7, являють собою положення, які були оптимізовані з вихідних гіперваріабельних ділянок, як показано на Фіг.5. Гуманізовані форми нелюдських (наприклад, мишачих) антитіл включають інтактне антитіло, по суті інтактне антитіло, частину антитіла, яка містить антигензв'язувальний домен або частину антитіла, яка містить Fab-фрагмент, Fab'-фрагмент, F(аb')2-фрагмент або одноланцюговий Fvфрагмент. Гуманізовані антитіла за варіантом, якому віддається перевага, містять мінімальну послідовність, яка була одержана з нелюдського імуноглобуліну. Гуманізовані антитіла можуть також містити залишки, яких немає ні у антитілареципієнта, ні у занесених CDR або каркасних послідовностей. Взагалі, гуманізоване антитіло буде містити по суті усі із щонайменше однієї, а як правило, двох варіабельних ділянок, у яких усі або по суті усі амінокислоти гіперваріабельних ділянок відповідають амінокислотам нелюдського імуноглобуліну, і усі або по суті усі амінокислоти каркасних ділянок відповідають амінокислотам консенсусної послідовності людського імуноглобуліну. Гуманізоване антитіло за оптимальним варіантом містить також принаймні частину константної ділянки (Fc) імуноглобуліну, як правило, константної ділянки людського імуноглобуліну. [Джоунс (Jones) 35 та інші, Nature, 321:522-525 (1986); Річмен (Riechmann) та інші, Nature, 332:323-329 (1988); та Преста (Presta), Curr. Op. Struct. Вiol., 2:593-596 (1992)]. Гуманізовані антитіла можуть бути піддані in vitro мутагенезу за методами повсякденного застосування у цій галузі (або, у разі застосування тварини, трансгенної за послідовностями людського Ig, in vivo соматичному мутагенезу) і, таким чином, амінокислотні послідовності каркасної ділянки HCVR та LCVR гуманізованих рекомбінантних антитіл являють собою послідовності, які, незважаючи на походження від послідовностей, споріднених із людськими HCVR та LCVR послідовностями ембріонального типу, можуть не існувати за природних умов у межах репертуару людських антитіл ембріонального типу in vivo. Передбачається, що такі амінокислотні послідовності каркасних ділянок HCVR та LCVR гуманізованих рекомбінантних антитіл є щонайменше на 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 98% або, за варіантом, якому віддається найбільша перевага, щонайменше на 99% ідентичними людській послідовності ембріонального типу. За варіантом, якому віддається перевага, будуть збереженими ті каркасні залишки вихідного антитіла (наприклад, мишачого антитіла або, взагалі, того антитіла, похідним якого є гуманізоване антитіло), які підтримують або впливають на структуру антигензв'язувальних центрів антитіла. Ці залишки можуть ідентифікуватись, наприклад, шляхом рентгенівської кристалографії вихідного антитіла або Fab-фрагмента, з ідентифікацією, тим самим, об'ємної структури антигензв'язувального центру антитіла. Гуманізоване антитіло за цим винаходом може містити або бути похідним з каркаса легкого ланцюга людської зародкової лінії. За конкретними варіантами здійснення послідовність легкого ланцюга ембріонального типу вибрана з-посеред людських VK послідовностей, у тому числі (але без обмеження) А1, А10, A11, А14, А17, А18, А19, А2, А20, А23, А26, А27, A3, А30, А5, А7, В2, В3, L1, L10, L11, L12, L14, L15, L16, L18, L19, L2, L20, L22, L23, L24, L25, L4/18a, L5, L6, L8, L9, O1, O11, O12, O14, O18, O2, O4 та O8. За певними варіантами здійснення цей каркас легкого ланцюга людської зародкової лінії вибраний з-посеред V1-11, V1-13, V1-16, V1-17, V1-18, V1-19, V1-2, V1-20, V1-22, V13, V1-4, V1-5, V1-7, V1-9, V2-1, V2-11, V2-13, V2-14, V2-15, V2-17, V2-19, V2-6, V2-7, V2-8, V3-2, V3-3, V3-4, V4-1, V4-2, V4-3, V4-4, V4-6, V5-1, V5-2, V5-4 та V5-6. Дивись опис різних послідовностей ембріонального типу у WO 2005/005604. За іншими варіантами здійснення гуманізоване антитіло за цим винаходом може містити або бути похідним із каркаса важкого ланцюга людської зародкової лінії. За конкретними варіантами здійснення каркас важкого ланцюга людської зародкової лінії вибирають з-посеред VH1-18, VH1-2, VH1-24, VH1-3, VH1-45, VH1-46, VH1-58, VH1-69, VH1-8, VH2-26, VH2-5, VH2-70, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-16, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-35, VH3-38, VH3-43, VH3-48, VH3-49, VH3-53, VH3-64, VH3-66, VH3-7, VH3-72, VH3-73, VH3-74, VH3-9, VH4-28, VH4-31, VH4-34, VH4-39, 92504 36 VH4-4, VH4-59, VH4-61, VH5-51, VH6-1 та VH7-81. Дивись опис різних послідовностей ембріонального типу у WO 2005/005604. За конкретними варіантами здійснення варіабельна ділянка легкого ланцюга та/або варіабельна ділянка важкого ланцюга містить каркасну ділянку або принаймні частину каркасної ділянки (таку, наприклад, що містить 2 або 3 субрайони, наприклад, FR2 та FR3). За певними варіантами здійснення принаймні FRL1, FRL2, FRL3 або FRL4 є повністю людськими. За іншими варіантами здійснення принаймні FRH1, FRH2, FRH3 або FRH4 є повністю людськими. За деякими варіантами здійснення принаймні FRL1, FRL2, FRL3 або FRL4 являють собою послідовність ембріонального типу (наприклад, людської зародкової лінії) або містять людські консенсусні послідовності для конкретного каркаса. За іншими варіантами здійснення принаймні FRH1, FRH2, FRH3 або FRH4 являють собою послідовність ембріонального типу (наприклад, людської зародкової лінії) або містять людські консенсусні послідовності для конкретного каркаса. За варіантами здійснення, яким віддається перевага, каркасна ділянка являє собою людську каркасну ділянку. Взагалі, гуманізовані антитіла можуть продукуватись шляхом одержання нуклеїновокислотних послідовностей, які кодують HCVR та LCVR антитіла, наприклад, мишачого антитіла або антитіла, що продукується гібридомою, яке зв'язує антигенну детермінанту міостатину за цим винаходом, виявлення гіперваріабельних ділянок на згаданих HCVR та LCVR (нелюдських) і пересадження таких нуклеїновокислотних послідовностей, які кодують гіперваріабельні ділянки, на вибрані нуклеїновокислотні послідовності, які кодують людський каркас. За факультативним варіантом гіперваріабельна ділянка може оптимізуватись шляхом піддання мутагенезу довільно або у конкретних місцях для заміни однієї або декількох амінокислот гіперваріабельної ділянки на іншу амінокислоту перед пересадженням згаданої гіперваріабельної ділянки до каркасної ділянки. За альтернативним варіантом гіперваріабельна ділянка може оптимізуватись після введення до людської каркасної ділянки за допомогою способів, доступних фахівцю у цій галузі. За варіантом, якому віддається перевага, амінокислотні послідовності людського каркаса вибирають таким чином, щоб антитіло, яке одержують, було ймовірно придатним для in vivo введення людям. Це може визначатись, наприклад, виходячи з попереднього застосування антитіл, які містять таку людську каркасну послідовність. За варіантом, якому віддається перевага, людська каркасна послідовність сама по собі не буде мати значної імуногенності. Альтернативно амінокислотні послідовності каркасів для антитіла, яке призначається для гуманізації, можуть порівнюватись з амінокислотними послідовностями відомих людських каркасів, призначених для пересадження гіперваріабельних ділянок, і вибиратись виходячи з того, що вони містять послідовності, дуже подібні до послідовностей вихідного антитіла, наприклад, мишачого антитіла, яке зв'язує міостатин. У цій галузі були ви 37 ділені численні людські каркасні послідовності з повідомленням їхніх послідовностей. Це підвищує ймовірність того, що одержане гуманізоване антитіло з пересадженими гіперваріабельними ділянками, яке містить гіперваріабельні ділянки вихідного (наприклад, мишачого) антитіла або оптимізовані гіперваріабельні ділянки вихідного антитіла, пересаджені на вибрані людські каркаси (і, можливо, також людську константну ділянку), по суті збережуть антигензв'язувальний центр антитіла і тим самим збережуть зв'язувальну афінність вихідного антитіла. Для значного збереження антигензв'язувальної спорідненості вибраними людськими каркасними ділянками будуть, за варіантом, якому віддається перевага, ті ділянки, які, як очікується, є придатними для in vivo введення, тобто неімуногенними. За будь-яким методом одержують послідовність ДНК, яка кодує HCVR і LCVR ділянки, за варіантом, якому віддається перевага, мишачого антиміостатинового антитіла. Методи клонування нуклеїновокислотних послідовностей, які кодують імуноглобуліни, є добре відомими у цій галузі. Ці методи можуть, наприклад, включати ампліфікацію послідовностей, які кодують імуноглобуліни, призначених для клонування із застосуванням відповідних праймерів за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (PCR). У літературі представлені праймери, придатні для ампліфікування імуноглобулінових нуклеїновокислотних послідовностей і, конкретно, мишачих HCVR та LCVR послідовностей. Після завершення клонування таких послідовностей, які кодують імуноглобуліни, їх піддають секвенуванню за методами, добре відомими у цій галузі. Після перенесення послідовностей, які кодують гіперваріабельні ділянки, на вибрані послідовності, які кодують людський каркас, одержані послідовності ДНК, які кодують "гуманізовані" послідовності варіабельних ділянок важкого ланцюга і варіабельних ділянок легкого ланцюга, експресують з одержанням гуманізованого Fv або гуманізованого антитіла, яке зв'язує міостатин. Гуманізовані HCVR і LCVR можуть експресуватись як частина цілої молекули антиміостатинового антитіла, тобто як гібридний білок із послідовностями людських константних ділянок, де послідовності ДНК, які їх кодують, були одержані з комерційно доступної бібліотеки або за допомогою, наприклад, одного з вищеописаних методів одержання послідовностей ДНК або таких, які існують у цій галузі. Однак послідовності HCVR та LCVR можуть також експресуватись за відсутності константних послідовностей для продукування гуманізованого антиміостатинового Fv. Незважаючи на це, злиття людських константних послідовностей з варіабельною ділянкою є потенційно бажаним, оскільки одержане у результаті цього гуманізоване антиміостатинове антитіло може мати людські ефекторні функції. Методи синтезування ДНК, які кодують білок відомої послідовності, добре відомі у цій галузі. За допомогою таких методів синтезують послідовності ДНК, які кодують цільові гуманізовані послідовності HCVR та LCVR (з константними ділянками 92504 38 або без них), після чого експресують їх у векторній системі, придатній для експресії рекомбінантних антитіл. Це може здійснюватись у будь-якій векторній системі, яка забезпечує можливість експресії цільових гуманізованих послідовностей HCVR та LCVR у вигляді гібридного білка з людськими послідовностями константних ділянок і об'єднання з одержанням функціональних (антигензв'язувальних) антитіл або фрагментів антитіл. Людські послідовності константних ділянок добре відомі у цій галузі і наведені у літературі. Людськими послідовностями константних ділянок легкого ланцюга, яким віддається перевага, є послідовності константних ділянок легких ланцюгів типу каппа і лямбда. Людськими послідовностями константних ділянок важких ланцюгів, яким віддається перевага, є людський IgG1, людський IgG2, людський IgG3, людський IgG4 та їхні мутовані варіанти, які забезпечують одержання зміненої ефекторної функції, наприклад, збільшеного in vivo періоду напіввиведення, зменшеного зв'язування Fc рецептора або зміненого профілю деамідування. У разі присутності, людські каркасні ділянки за варіантом, якому віддається перевага, одержують із варіабельної ділянки людського антитіла, яке має схожість послідовності з аналогічною або еквівалентною ділянкою донора антигензв'язувального центра (тобто вихідного антитіла). Іншими джерелами каркасних ділянок для частин людського походження гуманізованого антитіла є людські консенсусні послідовності варіабельної ділянки (дивись, наприклад, Кеттлборо К.А. (Kettleborough C.A.) та інші, Protein Engineering, 4:773-783 (1991); Картер (Carter) та інші, WO 94/04679). Наприклад, послідовність антитіла або варіабельної ділянки, яка застосовується для одержання нелюдської частини, може порівнюватись із людськими послідовностями, як описано у Кебот (Kabat) та інші, Sequences of Proteins of Immunological Interest, п'яте видання, NIH, U.S. Government Printing Office (1991). За варіантом здійснення, якому віддається особлива перевага, каркасні ділянки ланцюга гуманізованого антитіла одержують із людської варіабельної ділянки, яка має щонайменше приблизно 60% загальну ідентичність послідовності, за варіантом, якому віддається перевага, щонайменше приблизно 70% загальну ідентичність послідовності, і за варіантом, якому віддається більша перевага, щонайменше приблизно 85% загальну ідентичність послідовності з варіабельною ділянкою нелюдського донора. Людська частина може також одержуватись із людського антитіла, яке має щонайменше приблизно 65% ідентичність послідовності, а за варіантом, якому віддається перевага, щонайменше приблизно 70% ідентичність послідовності у межах конкретної частини (наприклад, FR), яка застосовується, у разі порівняння з еквівалентною частиною (наприклад, FR) нелюдського донора. Додатковими джерелами з описом методів, залучених до гуманізації мишачого антитіла, які можуть застосовуватись, є, наприклад, такі як Квін (Queen) та інші, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:2869, 1991; патент США №5,693,761; патент США 39 №4,816,397; патент США№5,225,539; комп'ютерні програми ABMOD та ENCAD, опис яких наведено у Левітт М. (Levitt M.), J. Моl. Biol, 168:595-620, 1983; гуманізація може по суті здійснюватись за методом Вінтер (Winter) та співробітників [Джоунс (Jones) та інші, Nature, 321:522-525 (1986); Річмен (Riechmann) та інші, Nature, 332:323-327 (1988); Веройєн (Verhoeyen) та інші, Science, 239:15341536 (1988)]. Людські антитіла Альтернативою гуманізації є одержання людських антитіл. Людські антитіла можна одержати за допомогою різних методів, відомих у цій галузі, у тому числі за допомогою бібліотек проявлення у фагах. Хугенбум (Hoogenboom), Вінтер (Winter), J. Моl. Biol, 227:381 (1991); Маркс (Marks) та інші, J. Моl. Biol, 222:581 (1991). Методи Коул (Cole) та інших і Бернер (Boerner) та інших також доступні для одержання людських моноклональних антитіл. Коул (Cole) та інші, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, стор.77 (1985) та Бернер (Boerner) та інші, J. Immunol, 147(l):86-95 (1991). Подібним же чином людські антитіла можна одержати шляхом введення людських імуноглобулінових локусів трансгенним тваринам, наприклад, мишам, у яких ендогенні імуноглобулінові гени були частково або повністю інактивовані. Після імунізації, наприклад, антигеном, який містить імуногенну антигенну детермінанту за цим винаходом, одержують продукування повного репертуару людських антитіл, яке, в усіх відношеннях, близько нагадує те, що спостерігається у людей, у тому числі реаранжування генів, складання і репертуар антитіл. Цей варіант підходу описано, наприклад, у патентах США №5,545,807; №5,545,806; №5,569,825; №5,589,369; №5,591,669; №5,625,126; №5,633,425; №5,661,016 і у наведених далі наукових публікаціях: Маркс (Marks) та інші, BioTechnology, 10:779-783, 1992; Лонберг (Lonberg) та інші, Nature, 368: 856-859, 1994; Моррісон (Morrison), Nature, 368: 812-813, 1994; Фішвайлд (Fishwild) та інші, Nature Biotechnology, 14:845-851, 1996; Нюбергер (Neuberger), Nature Biotechnology, 14: 826 (1996); Лонберг (Lonberg) та Хушар (Huszar), Intern. Rev. Immunol., 13: 65-93 (1995) і Джобкобовіц (Jobkobovits) та інші, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551, 1993. Людські імуноглобулінові гени, введені мишам, з одержанням, тим самим, трансгенних мишей, здатних реагувати на антигени антитілами, що мають людські послідовності, описані також у Брюггеманн (Bruggemann) та інші, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 86:6709-6713 (1989)]. Існує декілька стратегій одержання ссавців, що продукують людські антитіла. Зокрема, існує "мінілокусний" підхід, за яким екзогенний Ig локус імітується шляхом включення частинок (окремих генів) Ig локусу (дивись, наприклад, патенти США №5,545,807, №5,545,806, №5,625,825, №5,625,126, №5,633,425, №5,661,016, №5,770,429, №5,789,650 та №5,814,318, №5,612,205, №5,721,367, №5,789,215), введення до YAC (штучна дріжджова хромосома) великих і значною мірою ембріональних фрагментів Ig локусів [дивись Мендес 92504 40 (Mendez) та інші, Nature Genetics, 15:146-156 (1997), Грін (Green) та Джакобовіц (Jakobovits), J. Exp. Med., 188:483-495 (1998)], та введення повних або по суті повних локусів шляхом злиття мініатюрних клітин (дивись заявку на Європатент №ЕР 0 843 961 А1). Будь-яка трансгенна миша, здатна до реагування на імунізацію антитілами, що мають людські послідовності, може застосовуватись для продукування антиміостатинового антитіла за цим винаходом у разі застосування методів, доступних фахівцю у цій галузі, наприклад, коли таку мишу імунізують поліпептидом, що містить імуногенну антигенну детермінанту за цим винаходом. Варіанти застосування Антитіла за цим винаходом придатні для терапевтичного, профілактичного, діагностичного та науково-дослідного застосування, як описано у цьому описі. Антитіло за цим винаходом може застосовуватись для діагностування розладу або захворювання, яке пов'язується з експресією людського міостатину. Подібним чином, антитіло за цим винаходом може застосовуватись у аналізі для контролювання рівнів міостатину у суб'єкта, якого піддають лікуванню з приводу стану, пов'язаного з міостатином. Варіант науково-дослідного застосування включає методи, за якими антитіло за цим винаходом і мітку застосовують для виявлення міостатину у зразку, наприклад, у рідині у тілі людини або у клітинному чи тканинному екстракті. Антитіла за цим винаходом можуть застосовуватись із модифікуванням або без нього і мітитись шляхом ковалентного або нековалентного приєднання виявлюваної складової. Виявлюваною складовою може бути будь-яка складова, здатна до продукування, безпосередньо або опосередковано, виявлюваного сигналу. Виявлюваною складовою може бути, наприклад, радіоактивний ізотоп, наприклад, 3Н, 14С, 32Р, 35S або 125І, флуоресцентна або хемілюмінесцентна сполука, наприклад, флуоресцеїнізотіоціанат, родамін або люциферин; або фермент, наприклад, лужна фосфатаза, бета-галактозидаза або пероксидаза з хрону. Може застосовуватись будь-який метод, відомий у цій галузі, для окремого кон'югування антитіла з виявлюваною складовою, у тому числі методи, описані Хантер (Hunter) та інші, Nature, 144:945, 1962; Девід (David) та інші, Biochemistry, 13: 1014, 1974; Пейн (Pain) та інші, J. Immunol. Meth., 40: 219, 1981; та Нігрен (Nygren), J. Histochem. And Cytochem., 30: 407, 1982. У цій галузі відомі різноманітні традиційні методи визначення рівнів міостатину, у тому числі, наприклад, ELISA (твердофазний імуноферментний аналіз), RIA (радіоімунологічний аналіз) і FACS (клітинний сортер із збудженням флуоресценції), які становлять основу для діагностування змінених або патологічних рівнів експресії міостатину. Нормальні або стандартні рівні експресії встановлюють за допомогою будь-якого відомого у цій галузі методу, наприклад, шляхом об'єднання зразка, який містить поліпептид міостатин з, наприклад, антитілами, за умов, придатних для утворення комплексу антиген: антитіло. Згадане антитіло безпосередньо або опосередковано мі 41 тять виявною речовиною для полегшення виявлення зв'язаного або незв'язаного антитіла. Придатними виявними речовинами є різні ферменти, простетичні групи, флуоресцентні матеріали, люмінесцентні матеріали та радіоактивні матеріали. Приклади придатних ферментів включають пероксидазу з хрону, лужну фосфатазу, β-галактозидазу або ацетилхолінестеразу; приклади придатних комплексів простетичних груп включають стрептавідин/біотин та авідин/біотин; приклади придатних флуоресцентних матеріалів включають умбеліферон, флуоресцеїн, флуоресцеїнізотіоціанат, родамін, діхлоротриазиніламінфлуоресцеїн, дансилу хлорид або фікоеритрин; прикладом люмінесцентного матеріалу є люмінол; приклади радіоактивного матеріалу включають 125І, 131І, 35S або 3Н. (Дивись, наприклад, Золя (Zola), Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987)). Кількісне визначення утвореного стандартного комплексу здійснюють різними методами, наприклад, фотометричним методом. Кількість поліпептиду міостатину, експресованого у зразках, після цього порівнюють із стандартними значеннями. Для зручності антитіло за цим винаходом може надаватись у вигляді набору, запакованої комбінації реактивів у попередньо визначених кількостях з інструкціями для здійснення діагностичного аналізу. У разі, коли антитіло мітять ферментом, згаданий набір буде включати субстрати і кофактори, які необхідні для згаданого фермента (наприклад, попередник субстрату, який забезпечує виявний хромофор або флуорофор). Окрім того, можуть включатись інші додаткові речовини, наприклад, стабілізатори, буфери (наприклад, блокувальний буфер або лізисний буфер) тощо. Відносні кількості різних реактивів можуть коливатись у широких межах для забезпечення концентрацій у розчині реактивів, які по суті оптимізують чутливість згаданого аналізу. Зокрема, реактиви можуть постачатись у вигляді сухих порошків, як правило, ліофілізованих, у тому числі наповнювачів, які, у разі розчинення, забезпечать одержання розчину реактивів, який має відповідну концентрацію. Варіанти терапевтичного застосування антитіла Міостатин відіграє роль у процесі розвитку м'язів та у ряді пов'язаних з ним розладів або захворювань. У дорослих мРНК міостатину виявляють, головним чином, у скелетних м'язах, хоча менші концентрації знаходять також у жировій тканині і серцевій тканині (Шарма Μ. (Sharma Μ.) та інші, J. Cell Physiol, 180:1, 1999). Маса м'язів у мишей з блокованим міостатином у два-три рази перевищує відповідний показник у одноприплідних тварин дикого типу. Збільшена маса м'язів є наслідком гіпертрофії і гіперплазії волокна (Макферрон A. (McPherron А.) та інші, Nature, 387:83-90, 1997 і Жу Кс. (Zhu X.) та інші, FEBS Letters, 474:71). На додаток до цього, миші з блокованим міостатином накопичують менше жирового компонента тіла, аніж одноприплідні тварини дикого типу, але виглядають нормальними і здоровими у всіх інших відношеннях. Нещодавно було показано, що міостатин є важливим регулятором адіпо 92504 42 генезу (Реббапрагада A. (Rebbapragada А.) та інші, Моl. and Cell. Bio., 23:7230-7242, 2003). На додаток до цього, нещодавно у мишей з дефіцитом міостатину досліджували структуру ї вміст кісткової тканини (Хемрік М.В. (Hamrick M.W.) та інші, J. Orthopaedic Research, 21:1025, 2003; Хемрік М.В. (Hamrick M.W.) та інші, Calcif Tissue Int, 71:63, 2002). Таким чином, фармацевтична композиція, яка містить антиміостатинове моноклональне антитіло за цим винаходом, може застосовуватись для збільшення м'язової маси, підвищення густини кісткової тканини, зменшення виснаження м'язів або може застосовуватись для лікування або профілактики станів, у разі яких присутність міостатину спричинює або сприяє виникненню небажаних патологічних ефектів або зниження рівнів міостатину терапевтично ефективно діє на ссавців, за варіантом, якому віддається перевага, людей, у тому числі (але без обмеження) у разі виснаження м'язів, пошкодження м'язів, хірургічного втручання, відновлення пошкодженого м'яза, слабкості, вікової саркопенії, атрофії від бездіяльності, остеопорозу, остеоартриту, росту і відновлення зв'язок, ожиріння, пригнічення накопичення жирового компонента тіла, ожиріння, дистрофії м'язів будь-якого типу, міопатії у разі інтенсивної терапії і реанімації, алкогольної міопатії, кахексії (наприклад, ракової кахексії або кахексії у разі ВІЛ, кахексії унаслідок COPD, хронічної хвороби легень, видужання від сепсису, ниркової недостатності, печінкової недостатності, серцевої недостатності або захворювання), порушення обміну речовин, післяопікового виснаження м'язів та діабету типу II. Атрофія від бездіяльності може бути наслідком численних причин або випадків, у тому числі будь-якого розладу, захворювання або стану, що обумовлює тривалу непорушність, бездіяльність або постільний режим, у тому числі (але без обмеження) трансплантації паренхіматозних органів, протезування суглобів, інсульту, пошкодження спинного мозку, видужання від тяжкого опіку, стаціонарного хронічного гемодіалізу, видужання після сепсису та впливу зменшеної сили тяжіння. Оскільки послідовність і функція міостатину є висококонсервативними у різних видів тварин, антитіла за цим винаходом можуть застосовуватись для збільшення м'язової маси, підвищення густини кісткової тканини або лікування чи профілактики станів у ссавців окрім людини чи видів птахів [наприклад, домашніх тварин (наприклад, собак і кішок), спортивних тварин (наприклад, коней), сільськогосподарських тварин (наприклад, великої рогатої худоби, свиней і овець), видів птахів (наприклад, курок, індиків, інших мисливських або домашніх птахів), де присутність міостатину спричинює або сприяє виникненню небажаних патологічних ефектів або зниження рівнів міостатину має сприятливий терапевтичний ефект. Цим винаходом передбачається застосування антиміостатинового моноклонального антитіла за цим винаходом для лікування або профілактики щонайменше одного з вищезгаданих розладів, у разі якого активність міостатину є шкідливою або корисним для якого є зниження рівнів біоактивного 43 міостатину. На додаток до цього, передбачається застосування антиміостатинового моноклонального антитіла за цим винаходом при виготовленні лікарського засобу для лікування щонайменше одного з вищезгаданих розладів. Терміни "лікування", "лікувати" тощо, у значенні, вживаному у цьому описі, означає досягнення бажаного фармакологічного та/або фізіологічного ефекту. Згаданий ефект може бути профілактичним з точки зору повного або часткового запобігання захворюванню або його симптому та/або може бути терапевтичним з точки зору часткового або повного вилікування від захворювання та/або позбавлення від негативного впливу, пов'язаного із захворюванням. Термін "лікування", у значенні, вживаному у цьому описі, означає введення сполуки за цим винаходом для лікування захворювання або стану у ссавця, зокрема, у людини, і включає: (а) запобігання виникненню захворювання у суб'єкта, що є схильним до згаданого захворювання, але який ще не був діагностований як такий, що має згадане захворювання; (b) пригнічення захворювання, тобто припинення його розвитку; і (c) полегшення симптомів захворювання, тобто спричинення зворотного розвитку захворювання або розладу чи полегшення його симптомів або ускладнень. Схеми приймання лікарського засобу можуть підбиратись таким чином, щоб забезпечити оптимальну бажану реакцію (наприклад, терапевтичну або профілактичну реакцію). Наприклад, може вводитись одноразова ударна доза, впродовж певного періоду часу можуть вводитись декілька менших доз або доза може пропорційно зменшуватись або збільшуватись у залежності від вимог терапевтичної ситуації. Фармацевтична композиція Антитіло за цим винаходом може включатись до складу фармацевтичних композицій, придатних для введення суб'єкту. Сполуки за цим винаходом можуть вводитись самостійно або у поєднанні з фармацевтично прийнятним носієм, розріджувачем та/або наповнювачами у вигляді одно- чи багаторазових доз. Фармацевтичні композиції для введення розробляються таким чином, щоб бути придатними для вибраного способу введення і відповідним чином застосовуються фармацевтично прийнятні розріджувачі, носії, та/або наповнювачі, наприклад, диспергувальні речовини, буфери, поверхнево-активні речовини, консерванти, солюбілізатори, агенти для регулювання ізотонічності тощо. Згадані композиції розробляються за традиційними методами, опис яких наведено, наприклад, у довіднику Remington. The Science and Practice of Pharmacy, 19-е видання, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, штат Пенсільванія, 1995, який надає стислий опис способів одержання лікарських форм, які є загальновідомими лікарям-практикам. Фармацевтична композиція, що містить антиміостатинове моноклональне антитіло за цим винаходом, може вводитись суб'єкту, якому загрожує або який демонструє патології, опис яких наведено, за допомогою стандартних методів введення, у тому числі шляхом перорального, внутрішньовенного, внутрішньоочеревинного, підшкірного, леге 92504 44 невого, черезшкірного, внутрішньом'язового, інтраназального, защічного, сублінгвальнового або супозиторного введення. Фармацевтична композиція за цим винаходом за варіантом, якому віддається перевага, являє собою "терапевтично ефективну кількість" або "профілактично ефективну кількість" антитіла за цим винаходом. "Терапевтично ефективна кількість" означає кількість, ефективну, у дозах та впродовж необхідних періодів часу, для досягнення бажаного терапевтичного результату. Терапевтично ефективна кількість антитіла може змінюватись у залежності від таких факторів, як стан захворювання, вік, стать і маса особи, здатність антитіла або частини антитіла до викликання бажаної реакції у індивіда. Терапевтично ефективною кількістю є також кількість, для якої будь-який токсичний або шкідливий ефекти антитіла переважаються терапевтично сприятливими ефектами. "Профілактично ефективна кількість" означає кількість, ефективну, у дозах та впродовж необхідних періодів часу, для досягнення бажаного профілактичного результату. Як правило, оскільки профілактична доза застосовується до суб'єктів перед або на початковій стадії захворювання, профілактично ефективна кількість буде меншою, аніж терапевтично ефективна кількість. Терапевтично ефективна або профілактично ефективна кількість є принаймні мінімальною дозою, але меншою за токсичну дозу активного агента, яка є необхідною для корисної дії на суб'єкта. Інакше кажучи, терапевтично ефективною кількістю антитіла за цим винаходом є кількість, яка у ссавців, за варіантом, якому віддається перевага, людей, збільшує м'язову масу, підвищує густину кісткової тканини або лікує стани, у разі яких присутність міостатину спричинює або сприяє виникненню небажаних патологічних ефектів або наслідком зниження рівнів міостатину є корисний терапевтичний ефект у ссавця, за варіантом, якому віддається перевага, людини, у тому числі (але без обмеження) у разі виснаження м'язів, пошкодження м'язів, хірургічного втручання, слабкості, вікової саркопенії, атрофії від бездіяльності, остеопорозу, остеоартриту, росту і відновлення зв'язок, ожиріння, пригнічення накопичення жирового компонента тіла, дистрофії м'язів будь-якого типу, міопатії у разі інтенсивної терапії і реанімації, кахексії (наприклад, ракової кахексії або кахексії у разі ВІЛ, кахексії унаслідок COPD, ниркової недостатності, печінкової недостатності, серцевої недостатності або захворювання), порушення обміну речовин та діабету типу II. Атрофія від бездіяльності може бути наслідком численних причин або випадків, у тому числі будь-якого розладу, захворювання або стану, що обумовлює тривалу непорушність, бездіяльність або постільний режим, у тому числі (але без обмеження) трансплантації паренхіматозних органів, протезування суглобів, інсульту, пошкодження спинного мозку, видужання від тяжкого опіку, стаціонарного хронічного гемодіалізу, видужання після сепсису та впливу зменшеної сили тяжіння. Шлях введення антитіла за цим винаходом може бути пероральним, парентеральним, інгаля 45 ційним або місцевим. За варіантом, якому віддається перевага, антитіла за цим винаходом можуть включатись до складу фармацевтичної композиції, придатної для парентерального введення. Термін "парентеральне", у значенні, вживаному у цьому описі, означає внутрішньовенне, внутрішньом'язове, підшкірне, ректальне, вагінальне або внугрішньоочеревинне введення. Перевага віддається периферичній системній доставці шляхом внутрішньовенного, внутрішньоочеревинного або підшкірного введення. Придатні носії для такого введення відомі у цій галузі. Фармацевтична композиція за типовим варіантом повинна бути стерильною і стійкою за умов виготовлення і збереження у наданому контейнері, у тому числі, наприклад, герметизованому флаконі або шприці. Таким чином, фармацевтичні композиції можуть фільтруватись за стерильних умов після їх виготовлення або їх мікробіологічна прийнятність повинна забезпечуватись іншими способами. Типова композиція для внутрішньовенного вливання повинна містити 250-1000мл рідини, наприклад, стерильного розчину Рінгера, фізіологічного розчину, розчину декстрози, розчину Хенкса, і терапевтично ефективну дозу (наприклад, від 1мг/мл до 100мг/мл або більше) концентрації антитіла. Доза може змінюватись у залежності від типу і тяжкості захворювання. Як добре відомо у галузі медицини, дози для будь-якого із суб'єктів залежать від багатьох факторів, у тому числі розміру хворого, площі поверхні тіла, віку, конкретної сполуки, призначеної для введення, статі, часу і шляху введення, загального стану здоров'я та інших лікарських засобів, які вводяться одночасно. Типова доза може бути, наприклад, у межах від 0,001мкг до 1000мкг; передбачаються, однак, дози, які є меншими або більшими за цей зразковий діапазон, особливо приймаючи до уваги вищезгадані фактори. За схемою приймання лікарського засобу, добова доза повинна становити приблизно від 0,1мкг/кг до приблизно 100мг/кг загальної маси тіла, за варіантом, якому віддається перевага, від приблизно 0,3мкг/кг до приблизно 10мг/кг, за варіантом, якому віддається більша перевага, від приблизно 1мкг/кг до 1мг/кг, за варіантом, якому віддається ще більша перевага, від приблизно 0,5мкг/кг до 10мг/кг маси тіла на добу. Розвиток може контролюватись шляхом періодичних визначень. Для повторних введень впродовж декількох днів або довше, у залежності від стану, лікування повторюють доти, доки не відбудеться бажаного пригнічення симптомів захворювання. Корисними, однак, можуть бути інші схеми приймання лікарського засобу, які не виключаються з цього винаходу. Бажана доза може доставлятись шляхом введення одноразової ударної дози, шляхом багаторазового введення ударної дози або шляхом безперервного вливання антитіла, у залежності від характеру фармакокінетичних показників, яких бажає досягти лікар-практик. Такі запропоновані кількості антитіла приймаються, значною мірою, за розсудом лікаря. Ключовим фактором у виборі відповідної дози і схеми застосування лікарського засобу є одержаний результат. Факторами, які повинні прийматись до 92504 46 уваги у цьому контексті, є конкретний розлад, який піддають лікуванню, конкретний ссавець, якого піддають лікуванню, клінічний стан індивідуального хворого, причина захворювання, місце введення антитіла, конкретний тип антитіла, спосіб введення, схема застосування та інші фактори, відомі лікарям-практикам. Терапевтичні агенти за цим винаходом можуть заморожуватись або ліофілізуватись для збереження та відновлюватись у відповідному стерильному носії перед застосуванням. Наслідком ліофілізації і відновлення може бути втрата активності антитіла різного ступеня. Дози повинні регулюватись для компенсування можливої втрати активності. Взагалі, перевага віддається рН у межах 6-8. Готові вироби За іншим варіантом здійснення цього винаходу пропонується готовий виріб, який включає в себе матеріали, придатні для лікування або запобігання розладів або станів, опис яких наведено вище. Готовий виріб включає в себе контейнер і етикетку. Відповідними контейнерами є, наприклад, флакони, ампули, шприци і контрольні пробірки. Контейнери можуть виготовлятись із різноманітних матеріалів, наприклад, скла або пластика. Контейнер вміщує композицію за цим винаходом, що є ефективною для запобігання або лікування розладу чи стану, і може мати стерильний вхідний отвір (наприклад, контейнер може бути пластиковим пакетом із розчином для внутрішньовенного введення або флаконом із пробкою, яку проколюють голкою шприца для підшкірних ін'єкцій). Активним агентом у згаданій композиції є антиміостатинове антитіло за цим винаходом. На етикетці, яка розміщується на контейнері або додається до нього, зазначається, що композиція застосовується для лікування відповідного стану. Готовий виріб може додатково включати другий контейнер, який вміщує фармацевтично прийнятний буфер, наприклад, забуферений фосфатом фізіологічний розчин, розчин Рінгера і розчин декстрози. Він може додатково включати інші матеріали, необхідні з комерційної точки зору або точки зору споживача, у тому числі інші буфери, розріджувачі, фільтри, голки, шприци і пакувальні вкладки з інструкціями для застосування. Наведені нижче приклади пропонуються лише з ілюстративними цілями і не призначені для будьякого обмеження обсягу цього винаходу. Приклади Приклад 1: Твердофазні імуноферментні аналізи А. Планшети, сенсибілізовані міостатином та GDF-11 Мишачі/людські химерні антиміостатинові Fabs за цим винаходом перевіряють шляхом проведення ELISA (твердофазний імуноферментний аналіз), за допомогою якого визначають зв'язування Fab зі зрілим міостатином (димерна форма), нанесеним із різними концентраціями на 96-лунковий планшет. Перевіряють також зв'язування Fabs з GDF-11. Кожну лунку двох 96-лункових планшетів сенсибілізують 50мкл рекомбінантного людського міостатину (компанія R&D systems, без носія, спочат 47 ку ресуспендованого у 4мМ розчині НСl із подальшим нанесенням (1мкг/мл) у карбонатному буфері, рН9,6) або 50мкл рекомбінантного людського GDF11 (компанія Peprotech, Inc., номер за каталогом 120-11, без носія, спочатку ресуспендованого у 4мМ розчині НСI з подальшим нанесенням (1мкг/мл) у карбонатному буфері, рН9,6). Планшети інкубують при температурі 4°С впродовж ночі. Вміст лунок відсмоктують, і лунки двічі промивають PBST (PBS (забуферений фосфатом фізіологічний розчин)+0,1% Твін-20). Планшети блокують 200мкл блокувального буфера на лунку (1% BSA (бичачий сироватковий альбумін) у PBST впродовж 1год.). Fabs з периплазматичних екстрактів, призначені для перевірки, серійно розбавляють у PBST. До сенсибілізованих GDF-8 та GDF-11 стовпчиків планшетних лунок додають 50мкл розчину кожного Fab. Планшети інкубують впродовж 1год. при кімнатній температурі. Лунки після цього тричі промивають PBST. До кожної лунки додають кон'юговане з лужною фосфатазою (АР) друге антитіло (50мкл козячого антимишачого каппа АР (компанія Southern Biotech), розбавленого 1:1000 у PBST) та інкубують впродовж 30хв. при кімнатній температурі. Лунки після цього тричі промивають PBST. До кожної лунки додають 50мкл хромогенного субстрату (АМР/РМР) і витримують із проявленням при кімнатній температурі. Оптичну густину лунок визначають при OD=560нм. Для кожного Fab визначають титраційну криву, і вказують відносну OD у середній точці кривої еталонного Fab. Ці данні демонструють, що усі перевірені Fabs зв'язуються з нанесеним на планшет людським зрілим міостатином із перехресною реактивністю з GDF-11. В. ELISA із захопленням Fab 96-лунковий планшет сенсибілізують 50мкл розчину козячого антилюдського каппа антитіла (2мкг/мл) у карбонатному буфері. Планшети інкубують при температурі 4°С впродовж ночі. Вміст лунок відсмоктують, і лунки двічі промивають PBST (PBS+0,1% Твін-20). Планшети блокують 200мкл блокувального буфера на лунку (1% BSA у PBST впродовж 1год.). Fabs з периплазматичних екстрактів, призначені для перевірки, іммобілізують у стовпчиках лунок на планшетах впродовж 2год. при температурі 37°С. Після триразового промивання PBST до кожного стовпчика іммобілізованих Fabs додають 50мкл двократних серійних розведень біотинілованого міостатину (від 100нМ до 780пМ), та інкубують впродовж 1год. при температурі 37°С. Після цього планшет промивають PBST та інкубують із PBST при температурі 37°С впродовж 1-3год. До кожної лунки додають нютравідин (NeutrAvidin), кон'югований з лужною фосфатазою (компанія Pierce, 1:1000 у PBST), та інкубують впродовж 2хв. при кімнатній температурі. Після цього лунки тричі промивають PBST. До кожної лунки додають 50мкл хромогенного субстрату (АМР/РМР), і витримують з проявленням при кімнатній температурі. Оптичну густину лунок визначають при OD=560нм. Відносну OD визначають 92504 48 шляхом порівняння з максимальною OD еталонного Fab. Усі перевірені Fabs за цим винаходом зв'язують розчинний людський зрілий міостатин. Приклад 2: Аналіз нейтралізації міостатину Ектодермальні експлантати відбирають із бластули зародків Xenopus 8-9 стадії стандартними методами і культивують у 0,5Х MBS (1Х MBS: 88мМ розчин NaCl, 1мМ розчин KСl, 0,7мМ розчин СаСl2, 1мМ розчин MgSO4, 5мМ розчин ГЕПЕС, 2,5мМ розчин NaHCO3, 1:1000 (у об'ємному відношенні) гентаміцину, 0,1% розчин сироваткового альбуміну великої рогатої худоби) з доданням фактора росту (GDF8 або GDF11) (додатково або за показаннями), впродовж 18год. при температурі 18°С. За цей час контрольні зародки досягають стадії ранньої нейрули (стадія 15-16). Експлантати фотографують і довжину кожного експлантата визначають за допомогою алгоритму аналізу зображень, розробленого для кількісного визначення тваринних кепів. Експлантати, які не оброблялись ні фактором росту, ні Fab (контролі), згортаються у кульки епідермісу. Міостатин і GDF-11 індукують мезодерму у цих ектодермальних експлантатів, завдяки чому експлантати видовжуються і утворюють гантелеподібні структури. Антитіла або Fabs у разі їх перевірки на нейтралізуючу активність додаються до культурального середовища, яке містить міостатин, впродовж усього періоду культивування, і оцінюється їхня здатність до пригнічення індукованих фактором росту видовжувальних рухів. Міостатин додають до експлантатів із концентрацією 25нг/мл. Антитіла або Fabs, призначені до перевірки, додають із концентрацією 20мкг/мл. Fab, яке одержали проти стороннього антигену, застосовують як контроль. Комерційно доступне моноклональне антитіло проти мишачого GDF-8 може випробуватись як контроль; це антитіло продукується козами, імунізованими очищеним мишачим GDF-8, і виробники продемонстрували, що воно нейтралізує видовження кепів Xenopus, утворення яких було викликане 25нг/мл мишачого GDF-8 у разі його присутності з концентрацією приблизно 10-20мкг/мл (компанія R&D Systems, номер за каталогом МАВ788). Для обробки зображень застосовують апарат ImagePro (v4.5.1.22, від компанії Media Cybernetics). Для автоматизації обробки зображень пишуть макрос. Макрос обробляє зображення і реєструє довжину у бітах. Як відомо у цій галузі, може застосовуватись альтернативний спосіб вимірювання. Спостерігається, що антитіла за цим винаходом нейтралізують активність GDF-8 у аналізі кепів тварин і не мають активності щодо нейтралізації GDF-11. Приклад 3: Визначення афінності непропесованих моноклональних антитіл (Fabs) Афінність (KD) та швидкості kоn і kоff антиміостатинових Fabs за цим винаходом визначають за допомогою приладу ВІАсоrе® 2000, який включає в себе сенсорний чіп СМ4. ВІАсоrе® застосовує оптичні властивості поверхневого плазмонного резонансу для виявлення змін концентрації білка молекул, які взаємодіють, у межах декстранової біосенсорної матриці. За виключенням означеного, 49 92504 усі реактиви і матеріали закутаються від компанії ВІАсоrе® АВ (Upsala, Швеція). Усі вимірювання здійснюють при температурі 25°С. Зразки, які містять Fabs, розчиняють у буфері HBS-EP (150мМ розчин хлориду натрію, 3мМ розчин EDTA (етилендіамінтетраоцтова кислота), 0,05% розчин (у відношенні маси до об'єму) поверхнево-активної речовини Р-20 і 10мМ розчин ГЕПЕС, рН7,4). Міостатин або GDF-11 (компанія R&D Systems) іммобілізують у протокових кюветах чіпу СМ4 засобами аміносполучної хімії. Протокові кювети (14) активізують сумішшю (1:1) 0,1Μ розчину Nгідроксисукциніміду та 0,1Μ розчину 3-(Ν,Νдиметиламіно)пропіл-N-етилкарбодііміду зі швидкістю потоку 20мкл/хв. Міостатин або GDF-11 (2,5мкг/мл у 10мМ розчині ацетату натрію, рН4,5) вручну вводять у окремі протокові кювети зі швидкістю потоку 10мкл/хв. Поверхневу густину контролюють доти, доки у кожній протоковій кюветі вона не досягне рівня ~150 реакційних одиниць (RU). Поверхні блокують шляхом введення 50мкл 1Μ розчину етаноламіну-НСІ, рН8,5 (10мкл/хв). Для забезпечення повного видалення будь-якого нековалентно зв'язаного міостатину або GDF-11, двічі вводять 15мкл 10мМ розчину гліцину, рН1,5. Протоковий буфер, який застосовують для кінетичних експериментів, містить 10мМ розчин ГЕПЕС, рН7,4, 150мМ розчин NaCl, 0,005% розчин Р20. Дані кінетичного зв'язування збирають при максимальній швидкості потоку (100мкл/хв). Кожний аналітичний цикл включає: (і) введення 250мкл Fab (діапазон концентрацій від 50нМ до 0,4нМ із двохкратним прирощенням розведення) до всіх 4 50 протокових кювет, де протокова кювета 1 відіграє роль еталонної кювети, (іі) 20хв. дисоціацію (потік буфера), (iiі) регенерацію поверхні GDF-8 або GDF-11 шляхом дворазового введення 15мкл 10мМ розчину гліцину, рН1,5, (iv) контрольне введення 15мкл протокового буфера, і (ν) стабілізаційний період тривалістю 2хв. перед початком наступного циклу. Сигнал контролюють таким чином: протокова кювета 2 мінус протокова кювета 1, протокова кювета 3 мінус протокова кювета 1, протокова кювета 4 мінус протокова кювета 1. Зразки і контрольний буфер вводять із повторенням у довільному порядку. Дані обробляють за допомогою програми SCRUBBER (Аналітичний центр біомолекулярних взаємодій (Center for Biomolecular Interaction Analysis), Університет штату Юта). Швидкість асоціації та дисоціації для кожного циклу визначають шляхом підбирання біосенсорних даних за простою моделлю асоціації із застосуванням програми ClampXP (Аналітичний центр біомолекулярних взаємодій, Університет штату Юта) для добування констант kоn та koff; константу зв'язування у стані рівноваги Kd обчислюють за допомогою залежності Kd=koff/kon. Визначена за допомогою вищезгаданого аналізу спорідненість Fabs 41-1 та 412-6 до GDF-8 дорівнює 4,16нМ (4,16 10-9М) та 0,46нМ (4,6 10-10Μ) відповідно, і до GDF-11 8,96нМ та 0,81нМ відповідно; відносна специфічність обох Fabs була приблизно у 2 рази більшою до GDF-8 порівняно з GDF-11 (Таблиця 2). Таблиця 2 Fab 41-1 412-6 kon (M-1c-1) 1Д6 3,59 GDF-8 koff (с-1) 4,82 1,66 Kd (нM) обчисл. 4,16 0,46 Приклад 4: Визначення афінності моноклональних антитіл (Mabs) Визначення зв'язувальної спорідненості непроцесованих моноклональних антитіл за цим винаходом здійснюють за допомогою аналізу Sapidyne KINEXA. NHS (N-гідроксисукцинімід)активовані сефарозні кульки для швидкопротокового аналізу (компанія GE Healthcare) попередньо сенсибілізують антитілом за цим винаходом (50мкг антиміостатинового антитіла на 1мл кульок) і блокують розчином (10мг/мл) BSA у 1Μ трис-НСІ, рН8,0. Після цього 2пМ, 4пМ, 40пМ антитіла за цим винаходом (наприклад, 3-74/С1Е4) інкубують із різними концентраціями (наприклад, від 2,4пМ до 10нМ, серійні розведення) міостатину у протоковому буфері (PBS, 0,005% (у об'ємному відношенні) Твін-20 та 1мг/мл овальбуміну) впродовж 10год. при кімнатній температурі. Для визначення кількості вільного антитіла, присутнього у стані рівноваги, кожен зразок пропускають через кульки, вкриті міостатином. Після цього кількість зв'язаного з кульками антитіла визначають шляхом пропускання через кульки розчину міченого флуорофо kon (M-1c-1) 1,04 5,09 GDF-11 koff (с-1) 9,32 4,10 Kd (нM) обчисл. 8,96 0,81 ром (Су5) козячого антилюдського Fc антитіла (компанія Jackson Immuno Research) у розведенні 1:4000 у протоковому буфері. Визначений флуоресцентний сигнал є пропорційним до концентрації вільного антитіла у стані рівноваги. Кожну концентрацію міостатину визначають із повторенням. Константу дисоціації у стані рівноваги (ΚD) визначають за нелінійною регресією конкурентних кривих із застосуванням однофакторної моделі однорідного зв'язування з великою кількістю кривих (програма ΚΙΝΕΧΑ). Константу асоціації (kon) у разі зв'язування GDF-8 також визначають за допомогою аналізу Sapidyne ΚΙΝΕΧΑ. Змішують 2пМ антитіла з 20пМ GDF-8 за таких самих умов, опис яких наведено вище. У різні часові точки зразки зондують на присутність вільного антитіла за умов, опис яких було наведено вище для зв'язування у стані рівноваги, після чого визначену часову залежність підбирають за допомогою програми ΚΙΝΕΧΑ для визначення швидкості асоціації (kon). Константу дисоціації (koff) обчислюють за формулою koff=KD kon. 51 92504 Непроцесоване моноклональне антитіло 374/С1Е4 (функціонально зв'язане з Fc-фрагментом IgG4) випробували за допомогою аналізу, опис 52 якого наведено; одержані результати наведені нижче у Таблиці 3. Таблиця 3 Mab 3-74/С1Е4 KD, пМ (95% довірчий інтервал) 1,39 (0,20-3,58) kon, М-1с-1 (95% довірчий інтервал) 1,49 106 (1,39-1,58 106) Приклад 5: Репортерний аналіз з комбінацією міостатину/SBE У цьому репортерному аналізі плазміда, яка кодує репортерний ген, тобто ген люциферази у 5'3' напрямку відносно SMAD-зв'язувального елемента ("SBE"), конкретніше, (CAGA)^, експресує білок люциферази, коли молекула, наприклад, міостатину, GDF-11 або іншого члену надродини TGF-β зв'язує свій власний рецептор, з ініціюванням, тим самим, передавання сигналу SMAD, наслідком чого є утворення фосфорилованого комплексу SMAD, який є здатним до зв'язування SBE. Раніше повідомлялось, що послідовність CAGA являє собою TGF-β-реагуючу послідовність у межах промотору ТСР-β-індукованого β гена РАІ-1 (Деннер (Denner) та інші, ЕМВО J., 17:3091-3100, 1998). Кількість активного міостатину, яка впливає на клітини, є прямо пропорційною кількості продукованого фермента люциферази, яка є прямо пропорційною кількості продукованого і вимірного світла. Присутність інгібітора (наприклад, антитіла, яке зв'язує міостатин) зменшує кількість міостатину, здатного активізувати SBE, наслідком чого, зрештою, є зменшене продукування світла. Опис цього аналізу наведено також у включеній до цього опису WO 2004/037861. Передбачається, що репортерний аналіз з комбінацією міостатину/SBE не обмежується точними умовами, опис яких наведено; можуть застосовуватись клітини інших типів, наприклад, 293НЕК (культура клітин нирок людського ембріона) (АТСС (Американська колекція типових культур)) або клітини рабдоміосаркоми лінії А204 (дивись, наприклад, Уіттмор (Whittemore) та інші, BBRC, 200:965-971, 2003); можуть застосовуватись "репортерні" групи інших типів, наприклад, CAT (хлорамфеніколацетилтрансфераза), β-gal (βгалактозидаза), GFP (зелений флуоресцентний білок), та інші умови культивування клітин та проведення аналізу, у тому числі можуть застосовуватись змінні кількості міостатину у реакції. Фахівцю у цій галузі буде легко встановити, чи вписується будь-який аналіз у межі обсягу згаданого репортерного аналізу з комбінацією міостатину/SBE , оскільки при проведенні цього аналізу повинен застосовуватись вектор, який містить SBE елемент у 3'5'-напрямку відносно репортерного гена, який було введено до клітини-хазяїна, де застосовуваний SBE елемент реагує на SMAD, продукований у відповідь на зв'язування міостатином свого рецеп koff, с-1, обчислена 2,08 10-6 тора. Р.С. Тіз (R.S. Thies) та інші, Growth Factors, 18:251-259, 2001, описує подібний аналіз, у той час як Уіттмор Л. (Wittemore L.) та інші, BBRC, 300:965-971, 2003, описує SBE елемент, який реагує на SMAD, продукований у відповідь на зв'язування міостатином свого рецептора. У цьому аналізі клітини лінії 293Е (компанія Edge Biosystems) у матраці Т-75 культивують у живильному середовищі DMEM (модифіковане за способом Дульбекко середовище Iглa)/F12 (1:1) (компанія Gibco, номер за каталогом 10565-042) та 10% FBS (сироватка плоду корови). Згадані клітини трансфікують сумішшю 100мкл ліпофектаміну 2000 (компанія Invitrogen, номер за каталогом 11668-019), 5мл середовища OptiMEM І (компанія Gibco, номер за каталогом 51985-034) та 30мкг SBДНК люциферази впродовж 4год. при температурі 37°С. Після цього трансфекційну суміш видаляють, і додають живильне середовище повного складу впродовж 1год. при температурі 37°С. Після цього клітини трипсинізують, ресуспендують у живильному середовищі повного складу (50мкл (2 106клітин/мл) у кожній лунці 96-лункового планшету Biocoat (компанія BD, номер за каталогом 35-6461)) та інкубують впродовж 1год. при температурі 37°С. Після закінчення інкубації, живильне середовище замінюють на 100мкл кожного Fab, яке піддають випробуванню, у серійному розведенні 1:2, попередньо інкубованого впродовж 1год. при температурі 37°С із розчином (1:1) 40нг/мл міостатину (компанія R&D Systems, номер за каталогом 788-G8) або GDF-11 (компанія R&D Systems) у живильному середовищі повного складу. Планшети витримують впродовж ночі при температурі 37°С у 5% СО2; наступного дня до кожної лунки додають 100мкл суміші (1:1) лізисного буфера Glo та реактиву люциферази Bright- Glo (компанія Promega) і перемішують шляхом піпетування. Переносять 150мкл цієї суміші на білий 96лунковий планшет, і за допомогою люмінометра визначають люмінесценцію. Після цього результати визначення люмінесценції наносять на криву залежності від концентрації Fab і обчислюють ІС5о для кожного Fab для міостатину і GDF-11. При випробуванні Fabs за умов, опис яких наведено вище, були одержані значення ІС50, наведені у представленій нижче Таблиці 4. 53 92504 Таблиця 4 Fab 41Н-А7 41L3F12 41С1А2 41С1А4 41С1Е4 41С12А4 41С2А4 3-74/С1Е4 IC50 GDF8 10нМ 40нМ 1нМ 1нМ 1нМ 1нМ 1нМ 1нМ IC50 GDF11 40нМ 100нМ 1,2нМ 2нМ 4нМ 4нМ 4нМ 4нМ Приклад 6: Фармакокінетика Фармакокінетика (РK) антитіл за цим винаходом може оцінюватись на мишах лінії C57B6/SCID у дозі 1мг/кг після одноразового внутрішньовенного (IV) або внутрішньоочеревинного (IP) введення. Тварини одержують суміш неміченого і 125Іміченого антитіла у дозі, опис якої наведено вище, і концентрацію у сироватці визначають, виходячи з радіоактивності 125І у сироватці і питомої активності введеної дози. На криву наносять концентрацію у сироватці антитіла, введеного IV або IP, у залежності від часу. Приклад 7: In vivo вплив на масу і силу м'язів Для визначення того, чи блокує антитіло за цим винаходом активність міостатину in vivo, антитіло за цим винаходом може перевірятись на статевозрілих мишах лінії SCID. Миші лінії SCID страждають на тяжкий комбінований імунодефіцит і, унаслідок цього, у них не може виникнути імунологічної реакції після введення антитіла за цим винаходом. Масу м'язів застосовують як індикатор активності міостатину у мишей, яким ввели антитіло за цим винаходом. 54 Мишей-самців лінії SCID/CB17 (компанія Taconic Biotechnology) зважують і розподіляють на групи по 10 голів. Антитіло за цим винаходом (41С1Е4) у PBS буфері мишам вводять підшкірним шляхом у різних дозах (10мг/кг, 5мг/кг та 2мг/кг) на 0 день та 7 день. У контрольній групі мишам на 0 день та 7 день підшкірним шляхом вводять IgG у дозі 10мкг/кг. На 14 день силу м'язів, силу передньої лапки, визначають за допомогою приладу для визначення сили лапки (наприклад, модель 1027 csx, компанія Columbus Instruments). Тварин умертвляють і масу м'язів визначають за ядерним магнітним резонансом (ЯМР). Визначають як масу тіла, так і сиру масу литкового і чотириголового м'яза. Результати, середні значення і середні квадратичні помилки для різних параметрів наведені у представленій нижче Таблиці 5. Для нормалізації даних їх піддають перетворенню за методом перетворення Box Сох. Значення кожного параметра, які різко відхиляються, визначають за статистичними середніми значеннями за допомогою програми JMP 5.1 (компанія SAS, Inc.) і виключають з набору даних. Статистичну значущість визначали за допомогою дисперсійного аналізу та за tкритерієм Стьюдента. Значущим вважали значення р, менше за 0,05. Антитіла, перевірені з концентрацією 5мг/кг та 10мг/кг, дали статистично значущі результати, відносно контрольної IgG групи, за всіма перевіреними параметрами. Антитіло, перевірене з концентрацією 2мг/кг, дало статистично значущі результати, відносно контрольної IgG групи, за параметрами маси м'язів (ЯМР), сирої маси литкового і сирої маси чотириголового м'язів. Таблиця 5 Сира маса чоти- Сира маса Експериментальна Початкова Кінцева маса Маса м'язів риголового м'яза литкового група маса тіла (г) тіла (г) (ЯМР) (г) (мг) м'яза (мг) Контрольна (IgG) 19,82±0,35 20,89±0,33 15,17±0,27 159,92±4,13 92,84±1,99 41С1Е4 2мг/кг 19,92±0,32 21,78±0,22 16,27±0,13 172,07±1,53 102,13±0,88 41С1Е4 5мг/кг 19,94±0,34 21,9±0,37 16,54±0,39 185,27±4,67 108,16±2,3 41С1Е4 10мг/кг 19,9±0,34 22,3±0,4 16,99±0,27 190,03±3,2 109,5±2,03 BW=Maca тіла Сила м'яза (Ньютони) 2,89±0,08 2,99±0,07 3,23±0,04 3,18±0,08 55 92504 56 57 92504 58 59 92504 60