Антитіло до pd-l1 та його застосування для посилення функції t-клітин

Реферат: Винахід належить до антитіла до PD-L1, нуклеїнової кислоти, що кодує таке антитіло, його застосування для посилення функції Т-клітин in vitro, для лікування Т-клітинного дисфункціонального розладу, включаючи інфекцію, наприклад, гостру і хронічну, і пухлинний імунітет. UA 109108 C2 (12) UA 109108 C2 UA 109108 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Споріднені заявки Дана заявка запитує пріоритет згідно з § 35 USC 119(e) на підставі попередньої заявки на видачу патенту № 61/121092, поданої 9 грудня 2008 року, опис якої включений в даний опис шляхом посилання в повному об'ємі. Галузь техніки, якої стосується винахід Даний винахід, загалом, належить до імунної функції і до посилення функції T-клітин, включаючи підвищену регуляцію опосередкованих клітинами імунних відповідей, і до лікування T-клітинних дисфункціональних розладів. Рівень техніки Костимуляція або надання двох окремих сигналів T-клітинам є широко поширеною моделлю активації спочиваючих T-лімфоцитів антигенпрезентуючими клітинами (APC, АПК). Lafferty et al., Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci. 53: 27-42 (1975). Така модель додатково передбачає здатність відрізняти своє від чужого й імунну толерантність. Bretscher et al., Science 169: 1042-1049 (1970); Bretscher, P.A., P.N.A.S. USA 96: 185-190 (1999); Jenkins et al., J. Exp. Med. 165: 302-319 (1987). Трансдукція першого сигналу або специфічного для антигену сигналу здійснюється через Tклітинний рецептор (TCR) після розпізнавання чужорідного антигенного пептиду, презентованого в контексті головного комплексу гістосумісності (MHC). Другий або костимулюючий сигнал доставляється до T-клітин костимулюючими молекулами, що експресуються на антигенпрезентуючих клітинах (АПК), і індукує T-клітини, стимулюючи клональну експансію, секрецію цитокінів і ефекторну функцію. Lenschow et al., Ann. Rev. Immunol. 14: 233 (1996). Під час відсутності костимуляції T-клітини можуть ставати несприйнятливими до антигенної стимуляції, не забезпечують формування ефективної імунної відповіді і, крім того, можуть призвести до виснаження або толерантності до чужорідних антигенів. Проста основана на двох сигналах модель може бути надмірним спрощенням, оскільки інтенсивність сигналу TCR у дійсності впливає на активацію і диференціювання T-клітин. Viola et al., Science 273: 104-106 (1996); Sloan-Lancaster, Nature 363: 156-159 (1993). Крім того, активація T-клітин може відбуватися навіть під час відсутності костимулюючого сигналу, якщо інтенсивність сигналу TCR висока. Більш важливо те, що T-клітини одержують як позитивні, так і негативні вторинні костимулюючі сигнали. Регулювання таких позитивних і негативних сигналів є важливим для максимізації захисних імунних відповідей хазяїна при збереженні імунної толерантності і недопущенні аутоімунітету. Негативні вторинні сигнали, очевидно, необхідні для індукції T-клітинної толерантності, тоді як позитивні сигнали стимулюють активацію T-клітин. Хоча проста основана на двох сигналах модель все-таки дає правильне пояснення у випадку "ненавчених" лімфоцитів, імунна відповідь хазяїна є динамічним процесом, і T-клітини, що піддаються впливу антигену, також можуть одержувати костимулюючі сигнали. Механізм костимуляції становить терапевтичний інтерес, тому що показано, що управління костимулюючими сигналами забезпечує засіб або для посилення, або для припинення основаної на клітинах імунної відповіді. Нещодавно було виявлено, що порушення функції Tклітин або анергія виникає одночасно з індукованою і тривалою експресією інгібуючого рецептора, поліпептиду запрограмованої загибелі 1 (PD-1). У результаті ціленаправлений терапевтичний вплив, направлений на PD-1 і інші молекули, що передають сигнал за допомогою взаємодій з PD-1, такі як ліганд пептиду запрограмованої загибелі 1 (PD-L1) і ліганд пептиду запрограмованої загибелі 2 (PD-L2), належить до галузі підвищеного інтересу. Інгібування передачі сигналу PD-L1 було запропоноване як засіб посилення T-клітинного імунітету для лікування злоякісної пухлини (наприклад, пухлинного імунітету) і інфекції, включаючи як гостру, так і хронічну (наприклад, персистуючу) інфекцію. Однак оскільки оптимальний терапевтичний засіб, направлений до мішені в такому шляху, повинен бути всетаки поставлений на комерційну основу, в галузі медицини існує значна незадоволена потреба в таких засобах. Суть винаходу Даний винахід належить до антитіл до PD-L1, включаючи кодуючу їх нуклеїнову кислоту і композиції, що містять такі антитіла, і до їх застосування з метою посилення функції T-клітин для здійснення підвищувальної регуляції опосередкованих клітинами імунних відповідей, і для лікування T-клітинних дисфункціональних розладів, включаючи інфекцію (наприклад, гостру і хронічну) і пухлинний імунітет. В одному варіанті винахід належить до виділеного поліпептиду варіабельної ділянки важкого ланцюга, що містить послідовність HVR-H1, HVR-H2 і HVR-H3, де: (a) послідовність HVR-H1 являє собою послідовність GFTFSX1SWIH (SEQ ID NO:1); 1 UA 109108 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (b) послідовність HVR-H2 являє собою послідовність AWIX2PYGGSX3YYADSVKG (SEQ ID NO:2); (c) послідовність HVR-H3 являє собою послідовність RHWPGGFDY (SEQ ID NO:3); і де: X1 означає D або G; X2 означає S або L; X3 означає T або S. В одному конкретному аспекті X1 означає D; X2 означає S, і X3 означає T. В іншому аспекті поліпептид додатково містить послідовності каркаса варіабельної ділянки важкого ланцюга, розташовані між HVR згідно з формулою: (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)(HVR-H3)-(HC-FR4). У ще одному аспекті каркасні послідовності одержані з консенсусних каркасних послідовностей людини. У наступному аспекті каркасні послідовності являють собою консенсусний каркас VH підгрупи III. У ще одному аспекті щонайменше одна з каркасних послідовностей являє собою наступну послідовність: HC-FR1 являє собою EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEQ ID NO:4) HC-FR2 являє собою WVRQAPGKGLEWV (SEQ ID NO:5) HC-FR3 являє собою RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO:6) HC-FR4 являє собою WGQGTLVTVSA (SEQ ID NO:7). У ще одному аспекті поліпептид важкого ланцюга додатково об'єднаний з варіабельною ділянкою легкого ланцюга, що містить HVR-L1, HVR-L2 і HVR-L3, де: (a) послідовність HVR-L1 являє собою RASQX4 × 5X6TX7 × 8A (SEQ ID NO:8); (b) послідовність HVR-L2 являє собою SASX9LX10S, (SEQ ID NO:9); (c) послідовність HVR-L3 являє собою QQX11 × 12 × 13 × 14PX15T (SEQ ID NO:10); і де: X4 означає D або V; X5 означає V або I; X6 означає S або N; X7 означає A або F; X8 означає V або L; X9 означає F або T; X10 означає Y або A; X11 означає Y, G, F або S; X12 означає L, Y, F або W; X13 означає Y, N, A, T, G, F або I; X 14 означає H, V, P, T або I; X15 означає A, W, R, P або T. У ще одному аспекті X4 означає D; X5 означає V; X6 означає S; X7 означає A; X8 означає V; X9 означає F; X10 означає Y; X11 означає Y; X12 означає L; X13 означає Y; X14 означає H; X15 означає A. У ще одному аспекті легкий ланцюг додатково містить каркасні послідовності варіабельної ділянки легкого ланцюга, розташовані між HVR згідно з формулою: (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4). У ще одному аспекті каркасні послідовності одержані з консенсусних каркасних послідовностей людини. У ще одному аспекті каркасні послідовності являють собою консенсусний каркас VL каппа I. У ще одному аспекті щонайменше одна з каркасних послідовностей являє собою наступну послідовність: LC-FR1 являє собою DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO:11) LC-FR2 являє собою WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO:12) LC-FR3 являє собою GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO:13) LC-FR4 являє собою FGQGTKVEIKR (SEQ ID NO:14). В іншому варіанті винахід належить до виділеного антитіла до PD-L1 або антигензв'язувального фрагмента, що містить послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга і легкого ланцюга, де: (a) важкий ланцюг містить HVR-H1, HVR-H2 і HVR-H3, і де: (i) послідовність HVR-H1 являє собою GFTFSX1SWIH; (SEQ ID NO:1) (ii) послідовність HVR-H2 являє собою AWIX2PYGGSX3YYADSVKG (SEQ ID NO:2) (iii) послідовність HVR-H3 являє собою RHWPGGFDY і (SEQ ID NO:3), (b) легкий ланцюг містить HVR-L1, HVR-L2 і HVR-L3, і де: (i) послідовність HVR-L1 являє собою RASQX4 × 5X6TX7 × 8A (SEQ ID NO:8) (ii) послідовність HVR-L2 являє собою SASX9LX10S; і (SEQ ID NO:9) (iii) послідовність HVR-L3 являє собою QQX11 × 12 × 13 × 14PX15T; (SEQ ID NO:10) і де: X1 означає D або G; X2 означає S або L; X3 означає T або S; X4 означає D або V; X5 означає V або I; X6 означає S або N; X7 означає A або F; X8 означає V або L; X9 означає F або T; X10 означає Y або A; X11 означає Y, G, F або S; X12 означає L, Y, F або W; X13 означає Y, N, A, T, G, F або I; X14 означає H, V, P, T або I; X15 означає A, W, R, P або T. У конкретному аспекті X1 означає D; X2 означає S і X3 означає T. В іншому аспекті X4 означає D; X5 означає V; X6 означає S; X7 означає A; X8 означає V; X9 означає F; X10 означає Y; X11 означає Y; X12 означає L; X13 означає Y; X14 означає H; X15 означає A. У ще одному аспекті X1 означає D; X2 означає S і X3 означає T, X4 означає D; X5 означає V; X6 означає S; X7 означає A; X8 означає V; X9 означає F; X10 означає Y; X11 означає Y; X12 означає L; X13 означає Y; X14 означає H і X15 означає A. У наступному аспекті варіабельна ділянка важкого ланцюга містить одну або більше каркасних послідовностей, розташованих між HVR у такий спосіб: (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4), і варіабельна ділянка легкого ланцюга містить одну або 2 UA 109108 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 більше каркасних послідовностей, розташованих між HVR у такий спосіб: (LC-FR1)-(HVR-L1)(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4). У ще одному аспекті каркасні послідовності одержані з консенсусних каркасних послідовностей людини. У ще одному аспекті каркасні послідовності важкого ланцюга одержані з послідовності підгрупи I, II або III за Кабатом. У ще одному аспекті каркасна послідовність важкого ланцюга являє собою консенсусний каркас підгрупи III VH. У ще одному аспекті одна або більше каркасних послідовностей важкого ланцюга являють собою наступні послідовності: У ще одному аспекті каркасні послідовності легкого ланцюга одержані з послідовності підгрупи каппа I, II, IIІ або IV за Кабатом. У ще одному аспекті каркасні послідовності легкого ланцюга являють собою консенсусний каркас VL каппа I. У ще одному аспекті одна або більше каркасних послідовностей легкого ланцюга являють собою наступні послідовності: У ще одному конкретному аспекті антитіло додатково містить константну ділянку людини або миші. У ще одному аспекті константна ділянка людини вибрана з групи, що складається з IgG1, IgG2, IgG2, IgG3, IgG4. У ще одному конкретному аспекті константна ділянка людини одержана з IgG1. У ще одному аспекті константна ділянка миші вибрана з групи, що складається з IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3. У ще одному аспекті константна ділянка миші одержана з IgG2A. У ще одному додатковому конкретному аспекті антитіло має знижену або мінімальну ефекторну функцію. У ще одному конкретному аспекті мінімальна ефекторна функція є результатом "Fс-мутації з втратою ефекторної функції" або відсутності глікозилування. У ще одному варіанті винаходу Fc-мутація з втратою ефекторної функції являє собою заміну N297A або D265A/N297A у константній ділянці. У ще одному варіанті винаходу пропонується антитіло до PD-L1, що містить послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга і легкого ланцюга, де: (a) важкий ланцюг додатково містить послідовність HVR-H1, HVR-H2 і HVR-H3, що має щонайменше 85 % ідентичність послідовності з послідовністю GFTFSDSWIH (SEQ ID NO:15), AWISPYGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO:16) і RHWPGGFDY (SEQ ID NO:3), відповідно, або (b) легкий ланцюг додатково містить послідовність HVR-L1, HVR-L2 і HVR-L3, що має щонайменше 85 % ідентичність послідовності з послідовністю RASQDVSTAVA (SEQ ID NO:17), SASFLYS (SEQ ID NO:18) і QQYLYHPAT (SEQ ID NO:19), відповідно. У конкретному аспекті ідентичність послідовності складає 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % чи 100 %. В іншому аспекті варіабельна ділянка важкого ланцюга містить одну або більше каркасних послідовностей, розташованих між HVR у такий спосіб: (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4), і варіабельні ділянки легкого ланцюга містять одну або більше каркасних послідовностей, розташованих між HVR у такий спосіб: (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVRL3)-(LC-FR4). У ще одному аспекті каркасні послідовності одержані з консенсусних каркасних послідовностей людини. У ще одному аспекті каркасні послідовності важкого ланцюга одержані з послідовності підгрупи I, II або III за Кабатом. У ще одному аспекті каркасна послідовність важкого ланцюга являє собою консенсусний каркас VH підгрупи III. У ще одному аспекті одна або більше каркасних послідовностей важкого ланцюга являють собою наступні послідовності: 3 UA 109108 C2 5 10 15 20 У ще одному аспекті каркасні послідовності легкого ланцюга одержані з послідовності каппа підгрупи I, II, IIІ або IV за Кабатом. У ще одному аспекті каркасні послідовності легкого ланцюга являють собою консенсусний каркас VL каппа I. У ще одному аспекті одна або більше каркасних послідовностей легкого ланцюга являють собою наступні послідовності: У ще одному конкретному аспекті антитіло додатково містить константну ділянку людини або миші. У ще одному аспекті константна ділянка людини вибрана з групи, що складається з IgG1, IgG2, IgG2, IgG3, IgG4. У ще одному конкретному аспекті константна ділянка людини одержана з IgG1. У ще одному аспекті константна ділянка миші вибрана з групи, що складається з IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3. У ще одному аспекті константна ділянка миші одержана з IgG2A. У ще одному додатковому конкретному аспекті антитіло має знижену або мінімальну ефекторну функцію. У ще одному конкретному аспекті мінімальна ефекторна функція є результатом "Fс-мутації з втратою ефекторної функції" або відсутності глікозилування. У ще одному варіанті винаходу Fc-мутація з втратою ефекторної функції являє собою заміну N297A або D265A/N297A у константній ділянці. У ще одному варіанті винаходу пропонується виділене антитіло до PD-L1, що містить послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга і легкого ланцюга, де: (a) послідовність важкого ланцюга має щонайменше 85 % ідентичність послідовності з послідовністю важкого ланцюга: або (b) послідовність легкого ланцюга має щонайменше 85 % ідентичність послідовності з послідовністю легкого ланцюга: 25 30 35 У конкретному аспекті ідентичність послідовності складає 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % чи 100 %. В іншому аспекті варіабельна ділянка важкого ланцюга містить одну або більше каркасних послідовностей, розташованих між HVR у такий спосіб: (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4), і варіабельні ділянки легкого ланцюга містять одну або більше каркасних послідовностей, розташованих між HVR у такий спосіб: (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVRL3)-(LC-FR4). У ще одному аспекті каркасні послідовності одержані з консенсусних каркасних послідовностей людини. У наступному аспекті каркасні послідовності важкого ланцюга одержані з послідовності підгрупи I, II або III за Кабатом. У ще одному аспекті каркасна послідовність важкого ланцюга являє собою консенсусний каркас VH підгрупи III. У ще одному аспекті одна або більше каркасних послідовностей важкого ланцюга являють собою наступні послідовності: 4 UA 109108 C2 У ще одному аспекті каркасні послідовності легкого ланцюга одержані з послідовності каппа підгрупи I, II, IIІ або IV за Кабатом. У ще одному аспекті каркасні послідовності легкого ланцюга являють собою консенсусний каркас VL каппа I. У ще одному аспекті одна або більше каркасних послідовностей легкого ланцюга являють собою наступні послідовності: 5 10 15 20 25 30 35 40 45 У ще одному конкретному аспекті антитіло додатково містить константну ділянку людини або миші. У ще одному аспекті константна ділянка людини вибрана з групи, що складається з IgG1, IgG2, IgG2, IgG3, IgG4. У ще одному конкретному аспекті константна ділянка людини одержана з IgG1. У ще одному аспекті константна ділянка миші вибрана з групи, що складається з IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3. У ще одному аспекті константна ділянка миші одержана з IgG2A. У ще одному додатковому конкретному аспекті антитіло має знижену або мінімальну ефекторну функцію. У ще одному конкретному аспекті мінімальна ефекторна функція є результатом продукування в прокаріотичних клітинах. У ще одному конкретному аспекті мінімальна ефекторна функція є результатом "Fс-мутації з втратою ефекторної функції" або відсутності глікозилування. У ще одному варіанті винаходу Fc-мутація з втратою ефекторної функції являє собою заміну N297A або D265A/N297A у константній ділянці. У ще одному варіанті винахід належить до композицій, що містять будь-яке з описаних вище антитіл до PD-L1 у поєднанні щонайменше з одним фармацевтично прийнятним носієм. У ще одному варіанті винахід належить до виділеної нуклеїнової кислоти, що кодує послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга або важкого ланцюга антитіла до PD-L1, де: (a) важкий ланцюг додатково містить послідовність HVR-H1, HVR-H2 і HVR-H3, що має щонайменше 85 % ідентичність послідовності з послідовністю GFTFSDSWIH (SEQ ID NO:15), AWISPYGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO:16) і RHWPGGFDY (SEQ ID NO:3), відповідно, і (b) легкий ланцюг додатково містить послідовність HVR-L1, HVR-L2 і HVR-L3, що має щонайменше 85 % ідентичність послідовності з послідовністю RASQDVSTAVA (SEQ ID NO:17), SASFLYS (SEQ ID NO:18) і QQYLYHPAT (SEQ ID NO:19), відповідно. У конкретному аспекті ідентичність послідовності складає 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % або 100 %. В одному аспекті варіабельна ділянка важкого ланцюга містить одну або більше каркасних послідовностей, розташованих між HVR у такий спосіб: (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4), і варіабельні ділянки легкого ланцюга містять одну або більше каркасних послідовностей, розташованих між HVR у такий спосіб: (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVRL3)-(LC-FR4). У ще одному аспекті каркасні послідовності одержані з консенсусних каркасних послідовностей людини. У наступному аспекті каркасні послідовності важкого ланцюга одержані з послідовності підгрупи I, II або III за Кабатом. У ще одному аспекті каркасна послідовність важкого ланцюга являє собою консенсусний каркас VH підгрупи III. У ще одному аспекті одна або більше каркасних послідовностей важкого ланцюга являють собою наступні послідовності: У ще одному аспекті каркасні послідовності легкого ланцюга одержані з послідовності каппа підгрупи I, II, IIІ або IV за Кабатом. У ще одному аспекті каркасні послідовності легкого ланцюга являють собою консенсусний каркас VL каппа I. У ще одному аспекті одна або більше каркасних послідовностей легкого ланцюга являють собою наступні послідовності: У ще одному конкретному аспекті антитіло додатково містить константну ділянку людини або миші. У ще одному аспекті константна ділянка людини вибрана з групи, що складається з 5 UA 109108 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 IgG1, IgG2, IgG2, IgG3, IgG4. У ще одному конкретному аспекті константна ділянка людини одержана з IgG1. У ще одному аспекті константна ділянка миші вибрана з групи, що складається з IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3. У ще одному аспекті константна ділянка миші одержана з IgG2A. У ще одному додатковому конкретному аспекті антитіло має знижену або мінімальну ефекторну функцію. У ще одному конкретному аспекті мінімальна ефекторна функція є результатом продукуванняв прокаріотичних клітинах. У ще одному конкретному аспекті мінімальна ефекторна функція є результатом "Fc-мутації з втратою ефекторної функції" або відсутності глікозилування. У ще одному варіанті Fc-мутація з втратою ефекторної функції являє собою заміну N297A або D265A/N297A у константній ділянці. У ще одному аспекті нуклеїнова кислота додатково міститься у векторі, що підходить для експресії нуклеїнової кислоти, що кодує будь-яке з раніше описаних антитіл до PD-L1. У ще одному конкретному аспекті вектор додатково міститься в клітині-хазяїні, що підходить для експресії нуклеїнової кислоти. У ще одному конкретному аспекті клітиною-хазяїном є еукаріотична клітина або прокаріотична клітина. У ще одному конкретному аспекті еукаріотичною клітиною є клітина ссавця, така як клітина яєчника китайського хом'ячка (CHO). У ще одному варіанті винахід належить до способу одержання антитіла до PD-L1 або його антигензв'язувального фрагмента, що включає культивування клітини-хазяїна, яка містить нуклеїнову кислоту, що кодує раніше описані антитіла до PD-L1 або антигензв'язувальний фрагмент, у формі, що підходить для експресії, в умовах, що підходять для продукування такого антитіла або фрагмента, і витягання антитіла або фрагмента. У ще одному варіанті винахід належить до композиції, що містить антитіло до PD-L1 або його антигензв'язувальний фрагмент, пропоновані у винаході, і щонайменше один фармацевтично прийнятний носій. У ще одному варіанті винахід належить до виробу виробництва, що включає ємність, яка містить терапевтично ефективну кількість композиції, описаної в даній публікації, і вкладиш в упаковку, в якому вказане застосування для лікування T-клітинного дисфункціонального розладу. У ще одному варіанті винахід належить до виробу виробництва, що містить будь-яку з описаних вище композицій анти-PD-L1 у поєднанні щонайменше з однією молекулою BNCA. В одному аспекті молекули BNCA являють собою антитіло, антигензв'язувальний фрагмент антитіла, олігопептид BNCA, РНК-і BNCA або малу молекулу BNCA. В іншому аспекті негативна костимулююча молекула B7 вибрана з групи, що складається з: CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, B7.1, B7-H3 і B7-H4. У ще одному варіанті виріб виробництва містить будь-яку з описаних вище анти-PD-L1композицій у поєднанні з хіміотерапевтичним засобом. В одному аспекті хіміотерапевтичним засобом є гемцитабін. У ще одному варіанті винаходу пропонується виріб виробництва, що містить будь-яке з описаних вище антитіл до PD-L1 у поєднанні з одним або більше агоністами позитивної костимулюючої молекули. В одному аспекті позитивна костимулююча молекула являє собою костимулюючу молекулу сімейства B7. В іншому аспекті позитивна костимулююча молекула вибрана з групи, що складається з: CD28, CD80, CD86, ICOS/ICOSL. У ще одному аспекті позитивна костимулююча молекула являє собою костимулюючу молекулу сімейства TNFR. У наступному аспекті костимулююча молекула TNFR вибрана з групи, що складається з: OX40/OX40L, 4-1BB/4-1BBL, CD27/CD27L, CD30/CD30L і HVEM/LIGHT, і їх розчинних фрагментів, конструкцій і агоністичних антитіл. У ще одному варіанті винаходу пропонується виріб виробництва, що містить будь-яке з описаних вище антитіл до PD-L1 у поєднанні з одним або більше антибіотиками. В одному аспекті антибіотик вибраний із групи, що складається з противірусного засобу, антибактеріального засобу, протигрибкового засобу, протипротозойного засобу. В іншому аспекті противірусний засіб вибраний із групи, що складається з інгібіторів зворотної транскриптази, інгібіторів протеази, інгібіторів інтегрази, інгібіторів проникнення або злиття, інгібіторів дозрівання, інгібіторів вивільнення вірусів, підсилювачів імунної відповіді, противірусних синергетичних підсилювачів, вакцин, печіночних агоністів і терапевтичних засобів з рослинної сировини. У ще одному аспекті поєднання включає одну або більше категорій противірусних засобів. У ще одному варіанті винаходу пропонується виріб виробництва, що містить будь-яке з описаних вище антитіл до PD-L1 у поєднанні з однією або більше вакцинами. У ще одному варіанті винахід належить до способу посилення T-клітинної функції, що включає введення ефективної кількості будь-якого з описаних вище антитіл до PD-L1 або 6 UA 109108 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 композицій. В одному аспекті антитіло до PD-L1 або композиція робить дисфункціональні Tклітини недисфункціональними. У ще одному варіанті винахід належить до способу лікування T-клітинного дисфункціонального розладу, що включає введення терапевтично ефективної кількості будьякого з описаних вище антитіл до PD-L1 або композицій. В одному конкретному аспекті Tклітинним дисфункціональним розладом є інфекція або пухлинний імунітет. В іншому аспекті інфекція є гострою або хронічною. В іншому аспекті хронічна інфекція є персистуючою, латентною або такою, що повільно протікає. У ще одному аспекті хронічна інфекція є результатом дії патогену, вибраного з групи, що складається з бактерій, вірусів, грибів і найпростіших. У наступному аспекті рівень патогену в організмі хазяїна знижують. У ще одному аспекті спосіб додатково включає лікування вакциною. У ще одному аспекті спосіб додатково включає лікування антибіотиком. У ще одному аспекті патогеном є бактерії, і спосіб додатково включає введення антибактеріального засобу. У ще одному аспекті бактерії вибрані з групи, що складається з: Mycobacterium spp., Salmonella spp., Listeria spp., Streptococcus spp., Haemophilus spp., Neisseria spp., Klebsiella spp., Borrelia spp., Bacterioides fragillis, Treponema spp. і Helicobacter pylori. У ще одному аспекті патогеном є вірус, і спосіб додатково включає введення противірусного засобу. У ще одному аспекті вірус вибраний із групи, що складається з: вірусу гепатиту-B, -C, вірусу простого герпесу-I, -II, вірусу імунодефіциту людини -I, -II, цитомегаловірусу, вірусу Епштейн-Барр, вірусу папіломи людини, T-клітинних лімфотрофічних вірусів людини -I, -II, вірусу вітряної віспи. У ще одному аспекті патогеном є гриб, і спосіб додатково включає введення протигрибкового засобу. У ще одному аспекті розлад вибраний із групи, що складається з: аспергільозу, бластомікозу, кандидозу (Candida albicans), кокцидіоїдомікозу (Coccidioides immitis), гістоплазмозу, паракокцидіоїдомікозу, мікроспоридіозу. У ще одному аспекті патогеном є найпростіше, і спосіб додатково включає введення протипротозойного засобу. У ще одному аспекті розлад вибраний із групи, що складається з: лейшманіозу, плазмодіозу (тобто малярії), криптоспоридіозу, токсоплазмозу, трипаносомозу і гельмінтових інфекцій, включаючи інфекції, викликані трематодами (наприклад, шистосомоз), стрічковими черв'яками (наприклад, ехінококоз) і нематодами (наприклад, трихіноз, аскаридоз, філаріоз і стронгілоїдоз). У ще одному аспекті T-клітинним дисфункціональним розладом є пухлинний імунітет. У ще одному аспекті антитіло до PD-L1 або композицію поєднують у схемі лікування, що додатково включає традиційну терапію, вибрану з групи, що складається з: променевої терапії, хіміотерапії, цілеспрямованій терапії, імунотерапії, гормональної терапії, інгібування ангіогенезу і паліативного лікування. У ще одному конкретному аспекті хіміотерапевтичне лікування вибране з групи, що складається з: гемцитабіну, циклофосфаміду, доксорубіцину, паклітакселу, цисплатину. У ще одному конкретному аспекті пухлинний імунітет виникає в результаті наявності злоякісної пухлини, вибраної з групи, що складається з: раку молочної залози, легені, ободової кишки, яєчника, меланоми, раку сечового міхура, нирки, печінки, слинних залоз, шлунку, гліом, раку щитоподібної залози, вилочкової залози, епітеліального раку, раку голови і шиї, раку ШКТ і підшлункової залози. Короткий опис креслень Фігура 1 є графічною ілюстрацією, що зображує костимуляцію T-клітин молекулами клітинної поверхні сімейства B7. Фігура 2 є схематичним зображенням дизайну експерименту для аналізу стимуляції T-клітин PMEL/B16. Фігура 3 являє собою гістограму, що показує вплив антитіла до PD-L1 на антиген+ специфічну функцію T-клітин на підставі підвищеної продукції IFN-γ у T-клітинах CD8 PMEL у + відповідь на пептид меланоцитів gp100. Як процентний вміст IFN-γ-продукуючих T-клітин CD8 , так і рівні продукції ними IFN-γ підвищені при стимуляції в присутності антитіла до PD-L1. Фігура 4 являє собою гістограму, що показує вплив антитіла до PD-L1 на антигенспецифічну функцію T-клітин на підставі підвищення проліферації овальбумін-специфічних T+ клітин CD4 антитілом до PD-L1 YW243.55.S1 при вторинній стимуляції з використанням імпульсно оброблених овальбуміном B-клітин A20/АПК mPD-L1. Фігура 5 являє собою серію графіків FACS, що показують посилення проліферації T-клітин CD8 людини антитілом до PD-L1 YW243.55S1 у реакції змішаних лімфоцитів. Також вказаний відсоток проліферуючих клітин, вимірюваний при розведенні в одиницях інтенсивності CFSE. Фігура 6 є схемою дизайну експерименту з лікування хронічної інфекції LCMV химерною формою антитіла до PD-L1 YW243.55S70. Стрілками позначені часові точки для 6 доз анти-PD6 L1, починаючи з 14 дня після інфекції з використанням 210 БУО LCMV клону 13. 7 UA 109108 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Фігури 7A і 7B являють собою графіки, що показують посилену ефекторну функцію CD8 у клітинах ex vivo після лікування in vivo хронічної інфекції LCMV антитілом до PD-L1 YW243.55.S70. Блокада PD-L1 антитілом YW243.55.S70 збільшувала дегрануляцію T-клітин + CD8 (яку вимірювали за збільшенням поверхневого CD107A) (фіг. 7A) і збільшувала % IFNгамма-продукуючих клітин у відповідь на пептид gp33 LCMV (фіг. 7B). Частоту зустрічальності gp33-специфічних клітин виявляли фарбуванням H2-Db-gp33-пентамерами. На фігурах 8A і 8B показане зниження титрів LCMV у крові і тканині при хронічній інфекції LCMV після лікування in vivo антитілом до PD-L1. На фігурі 8A: титр вірусів у різних вказаних тканинах аналізували на 21 і 28 день, через один і два тижні після лікування антитілом, відповідно. На фігурі 8B: титри вірусів у сироватці аналізували в дні 0, 7, 14, 21 і 28, при цьому інокуляцію LCMV здійснювали в 0 день і лікування починали на 14 день. На фігурі 9A показане значуще зниження росту пухлини карциноми ободової кишки MC38.Ova у результаті застосування антитіла до PD-L1 після терапевтичного лікування 3 верифікованих пухлин (лікування починали на 14 день, коли пухлина мала розмір 250 мм ). Фігура 9B являє собою гістограму, що показує поверхневі рівні експресії PD-L1 на клітинах MC38.Ova у культурі тканини, що вимірювали протоковою цитометрією. PD-L2 не експресується клітинами MC38.Ova. Фігура 10 є графіком, який показує вплив лікування, що блокує PD-L1, окремо й у поєднанні або з анти-VEGF, або з гемцитабіном, на ріст пухлин MC38.Ova у мишей C57BL/6. На фігурах 11A-B показані послідовності варіабельних ділянок важкого і легкого ланцюга, відповідно, 11 антитіл до PD-L1, ідентифікованих за допомогою фагового дисплея. Заштриховані колонки показують CDR з різними визначеннями, тоді як поміщені в прямокутники ділянки показують довжину HVR. Докладний опис переважних варіантів здійснення Усі публікації, вказані в даному описі, спеціально включені шляхом посилання. Загальні способи При практичному здійсненні даного винаходу, якщо не обговорено особливо, будуть використані звичайні методики молекулярної біології (включаючи методику рекомбінантів), мікробіології, клітинній біології, біохімії й імунології, що відомі фахівцям у даній галузі. Такі методики повністю пояснені в літературі, наприклад, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989); Oligonecleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds 1987, and periodic updates), PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., ed., 1994); A Practical Guide to Molecular Cloning (Perbal Bernard V., 1988); Phage Display: A Laboratory Manual (Barbas et al., 2001). I. Імунітет хазяїна A. Розвиток і активація лімфоцитів У людини два основні типи лімфоцитів: T (що походять з тимуса) і B (що походять з кісткового мозку). Такі клітини походять з гематопоетичних стовбурових клітин у кістковому мозку і печінці плоду, що були комітовані до лімфоїдного шляху розвитку. Потомство таких стовбурових клітин іде за дивергентними шляхами, дозріваючи або до B-, або до T-лімфоцитів. Розвиток B-лімфоцитів людини відбувається повністю у кістковому мозку. З іншого боку, Tклітини розвиваються з незрілих попередників, що залишають кістковий мозок і переміщаються за кров'яним руслом в тимус, де вони проліферують і диференціюються в зрілі T-лімфоцити. Зрілі лімфоцити, що походять з тимусу або кісткового мозку, знаходяться в мовчазному або "спочиваючому" стані, тобто вони є мітотичними неактивними. При розподілі в кровообігу такі "нативні" або "ненавчені" лімфоцити переміщаються в різні вторинні або периферичні лімфоїдні органи, такі як селезінка, лімфатичні вузли або мигдалини. Більшість ненавчених лімфоцитів за своєю природою мають коротку тривалість життя і гинуть протягом декількох днів після того, як вони залишають кістковий мозок або тимус. Однак якщо така клітина одержує сигнали, що свідчать про присутність антигену, вони можуть активуватися і піддаватися послідовним раундам клітинного розподілу. Потім деякі з утворених клітин потомства повертаються до спочиваючого стану, стаючи лімфоцитами пам'яті - B- і T-клітинами, що власне кажучи примовані для наступної зустрічі зі стимулюючим алергеном. Іншим потомством активованих ненавчених лімфоцитів є ефекторні клітини, що живуть тільки протягом декількох днів, але здійснюють специфічні захисні активності. Активація лімфоцитів належить до серії упорядкованих подій, що проходить спочиваючий лімфоцит, коли він стимульований до розподілу й утворення клітин-нащадків, деякі з яких стають ефекторними клітинами. Повна відповідь включає як індукцію клітинної проліферації (мітогенез), так і експресію імунологічних функцій. Лімфоцити стають активованими, коли 8 UA 109108 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 специфічні ліганди зв'язуються з рецепторами на їх поверхні. Ліганди для T-клітин і B-клітин відрізняються, але підсумкові внутрішньоклітинні фізіологічні механізми подібні. Деякі чужорідні антигени можуть індукувати активацію лімфоцитів самі по собі, особливо великі полімерні антигени, що поперечно зшивають поверхневі імуноглобуліни на B-клітинах або інші глікопротеїни на T-клітинах. Однак більшість антигенів не є полімерами, і навіть пряме зв'язування з B-клітинами великих кількостей не може призвести до активації. Такі більш розповсюджені антигени активують B-клітини у випадку костимуляції сусідніми активованими хелперними T-лімфоцитами. Така стимуляція може здійснюватися лімфокінами, що секретуються T-клітиною, але найбільш ефективно може відбуватися при прямому контакті Bклітини з поверхневими білками T-клітини, що взаємодіють з деякими рецепторами на поверхні B-клітин, генеруючи вторинний сигнал. B. T-клітини T-лімфоцити не експресують імуноглобуліни, але замість цього виявляють наявність чужорідних речовин за допомогою поверхневих білків, що називаються T-клітинними рецепторами (TCR). Такі рецептори впізнають антигени або в результаті прямого контакту, або під впливом активності інших імунних клітин. Разом з макрофагами T-клітини належать до основного типу клітин, задіяних в опосередкований клітинами імунітет. На відміну від B-клітин, T-клітини можуть виявляти чужорідні речовини тільки в конкретних ситуаціях. Зокрема, T-лімфоцити будуть впізнавати чужорідний білок, тільки якщо він спочатку розщеплюється на невеликі пептиди, що потім представляються на поверхні другої клітини хазяїна, що називається антигенпрезентуючою клітиною (АПК). Багато типів клітин хазяїна можуть презентувати антигени у певних умовах, але деякі типи більш специфічно пристосовані для такої мети і є особливо важливими для регуляції активності T-клітин, включаючи макрофаги й інші B-клітини. Презентація антигенів частково залежить від конкретних білків, що називаються білками головного комплексу гістосумісності (MHC), на поверхні презентуючих клітин. Таким чином, щоб стимулювати опосередкований клітинами імунітет, чужорідні пептиди повинні бути презентовані T-клітинам у поєднанні з пептидами MHC, і таке поєднання повинно впізнаватися T-клітинним рецептором. Існують дві важливі підгрупи T-клітин: цитотоксичні T-лімфоцити (Tc-клітини або CTL) і хелперні T-клітини (TH), що можуть бути приблизно ідентифіковані на основі експресії на клітинній поверхні маркерів CD8 і CD4. T c-клітини важливі для захисту від вірусів і можуть безпосередньо вбивати віруси в результаті впізнавання деяких експресованих на клітинній поверхні вірусних пептидів. T H-клітини стимулюють проліферацію, дозрівання й імунологічну функцію інших клітинних типів, наприклад, секрецію лімфокінів для контролю активностей Bклітин, макрофагів і цитотоксичних T-клітин. Як ненавчені T-лімфоцити, так і T-лімфоцити пам'яті зазвичай залишаються в спочиваючому стані, і в такому стані вони не виявляють значущої хелперної або цитотоксичної активності. При активації такі клітини піддаються декільком раундам мітотичного розподілу, продукуючи дочірні клітини. Деякі з таких дочірніх клітин повертаються до спочиваючого стану у вигляді клітин пам'яті, а інші стають ефекторними клітинами, що активно виявляють хелперну або цитотоксичну активність. Такі дочірні клітини + + подібні зі своїми батьками: клітини CD4 можуть давати тільки потомство CD4 , тоді як клітини + + CD8 дають тільки потомство CD8 . Ефекторні T-клітини експресують маркери клітинної поверхні, що не експресуються на спочиваючих T-клітинах, таких як CD25, CD28, CD29, CD40L, рецептори трансферину і білки MHC класу II. Коли активуючі стимули скасовуються, цитотоксична або хелперна активність поступово знижується протягом періоду часу, що складає кілька днів, тому що ефекторні клітини або гинуть, або повертаються в спочиваючий стан. Подібно до активації B-клітин відповіді T-лімфоцитів на більшість антигенів також вимагають двох типів одночасних стимулів. Першим є антиген, що у тому випадку, якщо він відповідним чином представлений білками MHC на антигенпрезентуючій клітині, може бути впізнаний і зв'язаний T-клітинними рецепторами. Хоча такий комплекс антиген-MHC посилає сигнал всередину клітини, зазвичай він недостатній для того, щоб призвести до активації T-клітини. Повна активація, така, що відбувається за участю хелперних T-клітин, вимагає костимуляції іншими специфічними лігандами, що називаються костимуляторами, які експресуються на поверхні антигенпрезентуючої клітини. З іншого боку, активація цитотоксичної T-клітини зазвичай вимагає IL-2, цитокіну, що секретується активованими хелперними T-клітинами. C. Імунна відповідь Три основні функціональні властивості імунної системи ссавців, що відрізняють її від інших засобів захисту організму, включають: (1) специфічність - здатність впізнавати і відповідати або не відповідати окремо на величезну множину молекул-мішеней, (2) розпізнавання - здатність відрізняти своє від чужого так, щоб мирно співіснувати з усіма численними білками й іншою 9 UA 109108 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 органічною речовиною, і все-таки енергійно відповідати проти чужорідної речовини, що введена в організм, і (3) пам'ять - здатність діяти за шаблоном на підставі досвіду, так що наступні зустрічі з конкретним чужорідним патогеном будуть стимулювати більш швидку й енергійну відповідь, ніж відповідь, що має місце при початковій зустрічі. Коли одна або більше таких функцій порушені, виникає патологічний стан. Ненавчені лімфоцити безперервно вивільняються з первинних лімфоїдних органів у периферію, причому кожний несе поверхневі рецептори, які здатні до зв'язування антигену. Зв'язування антигенів у B-клітинах опосередковане поверхнево-зв'язаними імуноглобулінами, тоді як у T-клітинах зв'язування опосередковане T-клітинними рецепторами. Коли ненавчені лімфоцити активуються, вони проліферують, даючи дочірні клітини, що потім можуть піддаватися наступним циклам активації і проліферації. Швидкість і інтенсивність відповіді на даний антиген у значній мірі визначаються клональною селекцією: чим більше популяція дочірніх клітин або клонів, специфічних для конкретного антигену, тим більша кількість клітин, що можуть розпізнавати і брати участь в імунній відповіді. Кожна імунна відповідь являє собою складну і складно регульовану послідовність подій, в які задіяні кілька типів клітин. Вона запускається, коли імуноген проникає в організм і зустрічається зі спеціалізованим класом клітин, що називаються антигенпрезентуючими клітинами (АПК). Такі АПК захоплюють невелику кількість імуногена і презентують його у формі, яку можуть впізнавати антиген-специфічні хелперні T-лімфоцити. Потім хелперні T-клітини стають активованими і, у свою чергу, стимулюють активацію інших класів лімфоцитів, таких як B-клітини або цитотоксичні T-клітини. Потім активовані лімфоцити проліферують і здійснюють свої специфічні ефекторні функції. На кожній стадії вказаного процесу лімфоцити й АПК взаємодіють один з одним за допомогою прямого контакту або за допомогою секреції регуляторних цитокінів. Екзогенні антигени, що вловлюються АПК, піддаються серії змін, що називаються процесингом антигенів. Такий процесинг, особливо білкових імуногенів, полягає в денатурації і часткових протеолітичних розщепленнях, так що імуноген розщеплюється на короткі пептиди. Обмежена кількість одержаних у результаті пептидів потім нековалентно асоціюють з білками MHC класу II і транспортуються до поверхні АПК, такий процес відомий як презентація антигену. + Хелперний T-лімфоцит CD4 , що вступає в прямий контакт з АПК, може активуватися, але це відбудеться, якщо тільки він експресує білок T-клітинного рецептора, що може впізнавати і зв'язувати комплекс конкретного пептиду-MHC, презентований АПК. Хелперні T-клітини (TH-клітини) є головними організаторами імунної відповіді, оскільки вони необхідні для активації двох інших лімфатичних ефекторних клітин: цитотоксичних T-клітин (Tc) і секретуючих антитіла плазматичних клітин. Активація T H відбувається на початку імунної відповіді і вимагає щонайменше двох сигналів. Один сигнал обумовлений зв'язуванням Tклітинного рецептора антигену з комплексом антигенний пептид-MHC на поверхні АПК, і такий сигнал передається через комплекс білка CD3, тоді як другий костимулюючий сигнал через АПК, як припускають, є результатом зв'язування окремого передавального сигнал білка на поверхні T-клітини зі специфічним лігандом на АПК. Однією відомою взаємодією такого типу є взаємодія T-клітинного білка CD28 і сімейства поверхневих білків АПК, відомого як B7. Інші пари поверхневих білків також можуть опосередковувати костимуляцію. Процес костимуляції описаний більш докладно далі. Вважають, що антитіла до PD-L1 згідно із даним винаходом підсилюють костимуляцію за допомогою антагонізму негативного костимулюючого сигналу, обумовленого передачею сигналу через PD-L1. Два сигнали разом примушують хелперну T-клітину почати секрецію цитокіну інтерлейкіну-2 (IL-2), а також почати експресію специфічних високо афінних рецепторів IL-2 на її поверхні. IL-2 є високо активним мітогенним фактором для T-лімфоцитів і не є необхідним для проліферативної відповіді активованих T-клітин. Вплив IL-2 на клітину, з якої він секретується явище, відоме як аутокринний ефект. Крім того, було показано, що навіть якщо T-клітина одержала обидва сигнали, вона не буде проліферувати, якщо її власні поверхневі рецептори IL2 блоковані. IL-2 також може діяти на клітини, що знаходяться в безпосередній близькості, роблячи так називаний паракринний ефект. Такий ефект особливо важливий для активації T cклітин, що зазвичай не продукують достатньої кількості IL-2, щоб стимулювати їх власну проліферацію. Крім IL-2 активовані TH-клітини секретують інші цитокіни і стимулюють ріст, диференціювання і функції B-клітин, макрофагів і інших клітинних типів. Контакт між АПК і антиген-специфічною TH-клітиною також впливає на АПК - одним з найбільш важливих ефектів якого є вивільнення IL-1. Вважається, що такий цитокін діє аутокринним шляхом, збільшуючи поверхневу експресію білків MHC класу II і різних молекул адгезії, тим самим підсилюючи зв'язування T H-клітини і підсилюючи презентацію антигену. 10 UA 109108 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Одночасно IL-1 функціонує паракринним шляхом, діючи на T H-клітину, стимулюючи секрецію IL2 і експресію рецептора IL-2. Під час активації TH-клітин описаним вище чином деякі B-клітини також можуть захоплювати імуноген своїми рецепторами антигенів, що являють собою зв'язані з мембраною форми антитіл, які вони будуть пізніше секретувати. На відміну від T-клітин, B-клітини впізнають імуноген у його вільній, непроцесованій формі. Специфічне зв'язування антигену забезпечує один тип сигналу, що може призводити до активації B-клітин. Другий тип забезпечується активованими TH-клітинами, що експресують білки, які допомагають активувати B-клітину шляхом зв'язування з неімуноглобуліновими рецепторами на її поверхні. Такі одержані від T H сигнали, що діють на будь-яку B-клітину, незалежно від її антигенної специфічності, відомі як хелперні фактори. Такі хелперні фактори включають IL-2, IL-4 і IL-6. Однак допомога більш ефективно досягається за допомогою контакту клітини з клітиною, що забезпечує можливість білкам на поверхні T-клітини безпосередньо контактувати з білками на B-клітині. Найбільш ефективна форма опосередкованої контактом допомоги має місце в тому випадку, коли білок, який називається лігандом CD40 (CD40L), що експресується на T H-клітинах тільки після того, як вони стануть активованими, зв'язується з білком, який називається CD40, на B-клітинах. У процесі, відомому як активація свідків, контакт з активованою B-клітиною вже може бути достатнім для того, щоб активувати спочиваючі B-клітини, навіть якщо їх поверхневі імуноглобуліни не були зайняті антигеном. Tc-лімфоцити функціонують, винищуючи клітини, що експресують чужорідні антигени на своїй поверхні, такі як інфіковані вірусом клітини хазяїна. Більшість T c-клітин експресує CD8, а не CD4, і тому впізнають антигени в асоціації з білками MHC класу I, а не класу II. Коли соматична клітина інфікована вірусом, деякі імуногенні вірусні білки можуть піддаватися процесингу в клітині, і потім одержані пептиди можуть з'являтися у вигляді поверхневих комплексів з молекулами MHC класу I. Потім такі комплекси пептид-MHC можуть розпізнаватися T-клітинним рецептором антиген-специфічного клону, генеруючи один із двох сигналів, необхідних для активації T c-клітин. Такий перший сигнал окремо індукує високо афінні IL-2рецептори на Tc-клітині. Другий сигнал забезпечується IL-2, секретованим із сусіднього активованого TH-лімфоцита. При одержанні обох сигналів активована T c-клітина набуває цитотоксичної активності, що дозволяє їй вбивати клітину, з якою вона зв'язана, а також будь-які інші клітини, що несуть такі ж комплекси пептид-MHC класу I. У деяких випадках загибель має місце в зв'язку з тим, що Tc вивільняє специфічні токсини в клітину-мішень; в інших випадках T c змушує клітина-мішень зробити суїцид за допомогою апоптозу. Активована T c-клітина також проліферує, даючи початок додатковим T c-клітинам з такою самою антигенною специфічністю. D. Костимуляція надсімейством імуноглобулінів: 1. B7.1/B7.2-CD28/CTLA-4 Мабуть, найбільш добре охарактеризованим шляхом костимуляції T-клітин є шлях, що передає сигнали через B7.1(CD80)/B7.2(CD86)-CD28/CTLA-4CD152). Такий шлях передачі сигналів необхідний для активації і толерантності T-клітин. Karandikar et al., J. Neuroimmunol. 89: 10-18 (1988); Oosterwegal et al., Curr. Opin Immunol. 11: 294-300 (1999); Salomon et al., Annu. Rev. Immunol. 19: 225-252 (2001); Sansom, D.M., Immunol. 101: 169-177 (2000); Chambers et al., Annu. Rev. Immunol. 19: 565-592 (2001). B7.1 [Freeman et al., J. Exp. Med. 174: 625-631 (1991); Freedman et al., J. Immunol. 137: 32603267 (1987); Yokochi et al., J. Immunol. 128: 823-827 (1982)] і B7.2 [Freeman et al., Science 262: 909-911 (1993); Freeman et al., J. Exp. Med. 178: 2185-2192 (1993); Azuma et al., Nature 366: 76-79 (1993)] мають подвійну специфічність відносно двох стимулюючих рецепторів CD-28 і CTLA-4. Aruffo et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 84: 8573-8577 (1987); Gross et al., J. Immunol. 144: 32013210 (1990). CD28 конститутивно експресується на поверхні T-клітин [Gross et al, J. Immunol. 149: 380-388 (1992)], тоді як CTLA-4, рецептор з більш високою афінністю, має експресію, що піддається швидкій підвищувальній регуляції після активації T-клітин. Peach et al., J. Exp. Med. 180: 2049-2058 (1994); Linsley et al., J. Exp. Med. 176: 1595-1604 (1992); Kinsley et al., Immunity 1: 793-801 (1994); Linsley et al., Immunity 4: 535-543 (1996). Більшість популяцій АПК експресують B7.2 конститутивно на низькому рівні, що піддається швидкій підвищувальній регуляції, тоді як B7.1 індукованим чином експресується пізніше після активації. Freeman et al., Science 262: 909911 (1993); Hathcock et al., J. Exp. Med. 180: 631-640 (1994). Завчасна експресія B7.2 і дані про нокаут у мишей свідчать про те, що B7.2 є більш важливою костимулюючою молекулою для ініціації імунних відповідей, але у всьому іншому дві молекули мають функції, що у значній мірі перекриваються. McAdam et al., Immuno. Rev. 165: 631-640 (1994). CD28 взаємодіє з B7.1 і B7.2, передаючи сигнал, що діє синергетично з TCR-сигналом, стимулюючи активацію T-клітин. Lenschow et al., Annu. Rev. Immunol 165: 233-258 (1996); 11 UA 109108 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Lanzavecchia et al., Cell 96: 1-4 (1999). Під час відсутності TCR-сигналу передача сигналу CD28 не має фізіологічного значення. Передача сигналу CD28 регулює поріг активації T-клітин і значно знижує кількість зайнятих TCR, необхідних для активації T-клітин. Viola et al, Science 273: 104-106 (1996). Активація CD28 підтримує T-клітинні відповіді, стимулюючи життєздатність Tклітин, тим самим забезпечуючи можливість ініціації цитокінами клональної експансії і диференціювання T-клітин. Thompson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1333-1337 (1989); Lucas et al., J. Immunol. 154: 5757-5768 (1995); Shahinian et al., Science 261: 609-612 (1993); Sperling et al., J. Immunol. 157: 3909-3917 (1996); Boise et al., Immunity 3: 87-98 (1995). CD28 також оптимізує відповіді раніше активованих T-клітин, стимулюючи продукцію інтерлейкіну 2 (IL-2) і життєздатність T-клітин. Хоча деякі відповіді не залежать від CD28, ще не ясно, чи є така незалежність від костимуляції результатом сильних антигенних стимулів або результатом залежності від інших невідомих костимулюючих шляхів. Активація CTLA-4 викликає негативний сигнал, що інгібує TCR- і CD-28-опосередковану сигнальну трансдукцію. Залучення CTLA-4 призводить до інгібування синтезу IL-2 і проходження клітинного циклу і термінації T-клітинних відповідей. Walunas et al., Immunity 1: 405-413 (1994); Walunas et al., J. Exp. Med. 183: 2541-2550 (1996); Krummel et al., J. Exp. Med. 182: 459-466 (1995); Brunner et al., J. Immunol. 162: 5813-5820 (1999); Greenwald et al., Immunity 14: 145-155 (2001). CTLA-4 відіграє важливу роль у регуляції T-клітинних відповідей, включаючи периферичну T-клітинну толерантність. Хоча не ясно, як координується передача сигналу через CTLA-4 і CD28, деякі можливі варіанти включають витиснення CD28 з конкуренції за зв'язування з B7, індукцію імуносупресивних цитокінів, прямий антагонізм передачі сигналів CD28 і/або TCRопосередковану передачу сигналів. У результаті антагонізм CTLA-4 (наприклад, антагоністичні антитіла до CTLA) і/або агонізм B7.1/B7.2/CD28 можуть бути застосовні для посилення імунних відповідей при лікуванні інфекції (наприклад, гострої і хронічної) і пухлинного імунітету. 2. Передача сигналу ICOS/ICOSL: Інший шлях взаємодії між АПК і T-клітинами здійснюється через ICOS (CD278) і ICOSL (B7H2, CD275). Передача сигналу ICOS/ICOSL стимулює диференціювання і ефекторну функцію Tхелперних клітин і особливо важлива для продукції інтерлейкіну-10 (IL-10), але грає більш скромну роль у регуляції експансії T-клітин і продукції IL-2, включаючи регуляторні T-клітини, Tклітинну толерантність і аутоімунітет. На відміну від CD28, ICOS не експресується конститутивно на нативних T-клітинах, але швидко індукується на T-клітинах після залучення TCR. Hutloff et al., Nature 397: 263-266 (1999); Yoshinaga et al., Nature 402: 827-832 (1999); Beier et al., Eur. J. Immunol. 30: 3707-3717 (2000); Coyle et al., Immunity 13: 95-105 (2000); Mages et al., Eur. J. Immunol. 30: 1040-1047 (2000); McAdam et al., J. Immunol. 165: 5035-5040 (2000). Це свідчить про те, що ICOS надає костимулюючий сигнал активованим T-клітинам. Хоча костимуляція CD28 підсилює експресію ICOS, і експресія ICOS знижується під час відсутності B7.1 і B7.2, ICOS не повністю залежить від сигналів CD28. McAdam et al., J. Immunol. 165: 5035-5040 (2000); Aicher et al., J. Immunol. 164: 4689-4696 (2000); Kopf et al, J. Exp. Med. 192: 53-61 (2000). ICOS піддається підвищувальній регуляції на T-хелперних клітинах обох типів 1 і 2 (T H1 і TH2) під час початкової фази диференціювання, але рівні залишаються високими на T H2-клітинах і знижуються на TH1клітинах. Картина експресії ICOS на T-клітинах у зародкових центрах (Beier et al., Eur. J. Immunol. 30: 3707-3717 (2000); Mages et al., Eur. J. Immunol. 30: 1040-1047 (2000)) свідчить про роль ICOS у T-клітинній допомозі B-клітинам. Функціональні дослідження це підтвердили, і навіть була підтверджена експресія ICOS на B-клітинах щурів, хоча і не на інших видах. Tezuka et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 276: 335-345 (2000); McAdam et al., Nature 409: 102-105 (2001); Dong et al., Nature 409: 97-101 (2001); Dong et al., J. Immunol. 166: 3659-3662 (2001); Tafuri et al., Nature 409: 105-109 (2001). Однією з ролей передачі сигналу ICOS/ICOSL, очевидно, є регуляція продукції цитокінів (наприклад, IL-4, IL-13) нещодавно активованими, а також ефекторними T-клітинами. Hutloff et al., Nature 397: 263-266 (1999); Coyle et al., Immunity 13: 95-105 (2000); Dong et al., Nature 409: 97-101 (2001). У дослідженнях алергійного захворювання дихальних шляхів ефекторна функція TH2, але не диференціювання TH2 забезпечується блокадою ICOS. Tesciuba et al., J. Immunol. 167: 1996-2003 (2001). На підставі свідчень про те, що ICOS також може регулювати ефекторну функцію TH1, продукування цитокінів як T H1, так і TH2, може бути пригнічене злитим білком ICOS-Ig при реактивації in vitro. Kopf et al., J. Exp. Med. 192: 53-61 (2000). Інша можлива роль ICOS належить до підтримки відповідей T H1. В експериментальній моделі аутоімунного енцефаломієліту (EAE) для дослідження розсіяного склерозу, + захворювання TH1, опосередкованого мієлін-специфічними T-клітинами CD4 , показано, що 12 UA 109108 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 результат блокади ICOS може відрізнятися у випадку костимуляції під час примування T-клітин від результату у випадку костимуляції під час ефекторної фази EAE. Dong et al., Nature 409: 97101 (2001); Rottman et al., Nature Immunol. 2: 605-611 (2001); Sporici et al., Clin. Immunol. 100: 277-288 (2001). EAE, індукований мієліновим глікопротеїном олігодендроцитів (MOG), у значній -/мірі загострюється у нокаутованих мишей ICOS з підвищеною продукцією IFN-γ у порівнянні з диким типом. Аналогічно, блокада ICOS під час індукції EAE загострювала захворювання, також призводячи до підвищеної продукції IFN-γ. Отже, блокада ICOS під час примування призводить до TH1-поляризації відповіді. Цікаво, що примування мієлін-специфічних трансгенних за TCR Tклітин in vitro у присутності ICOS-Ig інгібувало їх здатність індукувати EAE, що абсолютно протилежно результатам блокади ICOS-Ig, що спостерігається in vivo. Sporici et al., див. вище. Розходження, пов'язане з протилежними результатами in vitro і in vivo, ще не зрозуміле, але може відображати роль ICOS для IL-10-продукуючих регуляторних T-клітин, а також ефекторних T-клітин під час блокади ICOS in vivo. Костимуляція за допомогою IL-10 дуже ефективна у відношенні підвищення продукції IL-10 і більш ефективна, ніж костимуляція за допомогою CD28. Hutloff et al., див. вище. Регуляторна петля IL-10, IL-12 необхідна для регуляції EAE, тому що у мишей IL-10 -/-, але не в мишей IL4 -/- розвивається більш глибока форма EAE. Segal et al., J. Exp. Med. 187: 537-546 (1998). Ще однією можливою роллю ICOS є посилення залежних від T-клітин гуморальних -/-/відповідей B-клітин. У мишей ICOS і ICOSL показано, що ICOS потрібний для залежних від Tклітин B-клітинних відповідей. Hutloff et al., Nature 397:263-66 (1999); Chapoval et al., Nat. Immunol. 2:269-74 (2001); Coyle et al., Immunity 13: 95-105 (2000); McAdam et al., Nature 409: 1025 (2001); Tafuri et al., Nature 409: 105-9 (2001); Suh et al., Nat. Immunol. 4:899-906 (2003). У мишей -/ICOS також показані зменшені зародкові центри у відповідь на первинну імунізацію, глибокі дефекти в утворенні зародкових центрів у відповідь на вторинну стимуляцію і дефекти в переключенні класів IgG. Роль ICOS у взаємодії T:B-клітин додатково підтвердили в результаті ідентифікації гомозиготної втрати ICOS у T-клітинах у пацієнтів із загальним варіабельним імунодефіцитним захворюванням дорослих. Grimbacher et al., Nat. Immunol. 4: 261-68 (2003). У результаті агонізм ICOS/ICOSL (наприклад, агоністичні антитіла до ICOS, розчинний ліганд ICOS/ICOSL) може бути застосований для посилення імунної відповіді при лікуванні інфекції (наприклад, гострої і хронічної) і/або пухлинного імунітету. 3. Шлях PD-1: Важливий негативний костимулюючий сигнал, що регулює активацію T-клітин, дає рецептор запрограмованої загибелі - 1 (PD-1)(CD279) і партнери-ліганди PD-L1 (B7-H1, CD274) і PD-L2 (B7-DC, CD273), що зв'язуються з ним. Негативна регуляторна роль PD-1 була виявлена за -/допомогою нокаутів по PD-1 (Pdcd1 ), у випадку яких існує схильність до аутоімунітету. Nishimura et al., Immunity 11: 141-51 (1999); Nishimura et al., Science 291: 319-22 (2001). PD-1 є спорідненим CD28 і CTLA-4, але не має проксимального до мембрани цистеїну, що забезпечує можливість гомодимеризації. Цитоплазматичний домен PD-1 містить оснований на тирозині мотив інгібування імунорецептора (ITIM, V/IxYxx/V). PD-1 зв'язується тільки з PD-L1 і PD-L2. Freeman et al., J. Exp. Med. 192: 1-9 (2000); Dong et al., Nature Med. 5: 1365-1369 (1999); Latchman et al., Nature Immunol. 2: 261-268 (2001); Tseng et al., J. Exp. Med. 193: 839-846 (2001). PD-1 може бути експресований на T-клітинах, B-клітинах, природних T-клітинах-кілерах, активованих моноцитах і дендритних клітинах (DC, ДК). PD-1 експресується активованими, але + + не експресується нестимульованими T-клітинами CD4 і CD8 , B-клітинами і мієлоїдними клітинами людини. Це контрастує з більш обмеженою експресією CD28 і CTLA-4. Nishimura et al., Int. Immunol. 8: 773-80 (1996); Boettler et al., J. Virol. 80: 3532-40 (2006). Існує щонайменше 4 варіанти PD-1, що були клоновані з активованих T-клітин людини, включаючи транскрипти, в яких відсутній (i) екзон 2, (ii) екзон 3, (iii) екзони 2 і 3 або (iv) екзони 2-4. Nielsen et al., Cell. Immunol. 235: 109-16 (2005). За винятком PD-1Δex3, усі варіанти експресуються на подібних рівнях у вигляді повнорозмірного PD-1 у спочиваючих мононуклеарних клітинах периферичної крові (PBMC). Експресія усіх варіантів у значній мірі індукується при активації T-клітин людини за допомогою анти-CD3 і анти-CD28. Варіант PD-1Δex3 не має трансмембранного домену і схожий на розчинний CTLA-4, що відіграє важливу роль в аутоімунітеті. Ueda et al., Nature 423: 506-11 (2003). Вказаним варіантом збагачені синовіальна рідина і сироватка пацієнтів з ревматоїдним артритом. Wan et al., J. Immunol. 177: 8844-50 (2006). Два ліганди PD-1 відрізняються за своїми картинами експресії. PD-L1 конститутивно експресується на мишачих T- і B-клітинах, ДК, макрофагах, мезенхімальних стовбурових клітинах і одержаних з кісткового мозку гладких клітинах. Yamazaki et al., J. Immunol. 169: 553845 (2002). PD-L1 експресується на широкому колі негематопоетичних клітин (наприклад, клітинах роговиці, легені, судинного епітелію, непаренхімних клітинах печінки, мезенхімальних 13 UA 109108 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 стовбурових клітинах, клітинах панкреатичних острівців, синцитіотрофобластах плаценти, кератиноцитах і т.д.) [Keir et al., Annu. Rev. Immunol. 26: 677-704 (2008)] і піддається підвищувальній регуляції в ряді клітинних типів після активації. Обидва типи інтерферонів (IFN) I і II є підвищувальними регуляторами PD-L1. Eppihimer et al., Microcirculation 9: 133-45 (2002); Schreiner et al., J. Neuroimmunol. 155: 172-82 (2004). Експресія PD-L1 у клітинних лініях знижується при інгібуванні My88, TRAF6 і MEK. Liu et al., Blood 110: 296-304 (2007). JAK2 також задіяний в індукцію PD-L1. Lee et al., FEBS Lett. 580: 755-62 (2006); Liu et al., Blood 110: 296-304 (2007). Втрата або інгібування фосфатази і гомолога тензину (PTEN), клітинної фосфатази, що модифікує фосфатидилінозитол-3-кіназу (PI3K) і передачу сигналу Akt, підвищували посттранскрипційну експресію PD-L1 у злоякісних пухлинах. Parsa et al., Nat. Med. 13: 84-88 (2007). Експресія PD-L2 більш обмежена, ніж PD-L1. PD-L2 індукованим чином експресується на ДК, макрофагах і одержаних з кісткового мозку гладких клітинах. PD-L2 також експресується приблизно на половині-двох третинах спочиваючих перитоніальних B1-клітин, але не експресується на звичайних B-клітинах B2. Zhong et al., Eur. J. Immunol. 37: 2405-10 (2007). Клітини B1 PD-L2+ зв'язують фосфатидилхолін і можуть бути важливими для природжених імунних відповідей проти бактеріальних антигенів. Індукція PD-L2 інтерфероном-γ, зокрема, залежить від NF-KB. Liang et al., Eur. J. Immunol. 33: 2706-16 (2003). PD-L2 також може бути індукований на моноцитах і макрофагах під дією GM-CF, IL-4 і IFN-γ. Yamazaki et al., J. Immunol. 169: 5538-45 (2002); Loke et al., PNAS 100: 5336-41 (2003). Передача сигналу PD-1 зазвичай робить більший ефект на продукцію цитокінів, ніж на проліферацію клітин, при цьому значний вплив робить на продукцію IFN-γ, TNF-α і IL-2. Опосередкована PD-1 передача інгібуючого сигналу також залежить від інтенсивності передачі сигналу TCR, при цьому більш сильне інгібування відбувається при більш низьких рівнях стимуляції TCR. Таке зниження може бути подолане костимуляцією за допомогою CD28 [Freeman et al., J. Exp. Med. 192: 1027-34 (2000)] або в присутності IL-2 [Carter et al., Eur. J. Immunol. 32: 634-43 (2002)]. Одержано докази того, що передача сигналу через PD-L1 і PD-L2 може бути двонаправленою. Тобто, на додаток до модифікації передачі сигналів TCR або BCR, сигнал також може бути доставлений назад у клітини, що експресують PD-L1 і PD-L2. Хоча не виявлено, що обробка дендритних клітин природним антитілом до PD-L2 людини, виділеним з організму пацієнта з макроглобулінемією Вальденстрема, призводить до підвищувальної регуляції MHC II або костимулюючих молекул B7, такі клітини продукували більшу кількість протизапальних цитокінів, особливо TNF-α і IL-6, і стимулювали проліферацію T-клітин. Nguyen et al., J. Exp. Med. 196: 1393-98 (2002). Обробка мишей таким антитілом також (1) підвищувала резистентність до трансплантованої меланоми b16 і швидко індукувала специфічні для пухлини CTL. Radhakrishnan et al., J. Immunol. 170: 1830-38 (2003); Radhakrishnan et al., Cancer Res. 64: 4965-72 (2004); Heckman et al., Eur. J. Immunol. 37: 1827-35 (2007); (2) блокувала розвиток запального захворювання дихальних шляхів у мишачій моделі алергійної астми. Radhakrishnan et al., J. Immunol. 173: 1360-65 (2004); Radhakrishnan et al, J. Allergy Clin. Immunol. 116: 668-74 (2005). Додатковим доказом зворотної передачі сигналу в дендритні клітини ("ДК") є результат досліджень ДК, одержаних з кісткового мозку, культивованих з розчинним PD-1 (домен EC PD-1, злитий з константною ділянкою Ig - "s-PD-1"). Kuipers et al., Eur. J. Immunol. 36: 2472-82 (2006). Такий sPD-1 інгібував активацію ДК і збільшував продукцію IL-10, і така дія була зворотна завдяки введенню анти-PD-1. Крім того, у декількох дослідженнях показаний рецептор для PD-L1 або PD-L2, що не залежить від PD-1. B7.1 вже ідентифікований як зв'язувальний партнер для PD-L1. Butte et al., Immunity 27: 111-22 (2007). Дослідження хімічного перехресного зшивання свідчать про те, що PD-L1 і B7.1 можуть взаємодіяти за допомогою їх IgV-подібних доменів. Взаємодії B7.1:PD-L1 + можуть індукувати інгібуючий сигнал для T-клітин. Лігування PD-L1 на T-клітинах CD4 за + допомогою B7.1 або лігування B7.1 на T-клітинах CD4 за допомогою PD-L1 генерує інгібуючий сигнал. У випадку T-клітин, що не мають CD28 і CTLA-4, виявлені знижена проліферація і знижена продукція цитокінів при стимуляції кульками, покритими анти-CD3 плюс B7.1. У Tклітинах, в яких відсутні всі рецептори для B7.1 (тобто CD28, CTLA-4 і PD-L1), проліферація Tклітин і продукція цитокінів більше не інгібувалася кульками, покритими анти-CD3 плюс B7.1. Одержані дані свідчать про те, що B7.1 діє специфічно через PD-L1 на T-клітині під час відсутності CD28 і CTLA-4. Подібним чином, у T-клітинах, що не мають PD-1, виявлені знижена проліферація і продукція цитокінів при стимуляції в присутності кульок, покритих анти-CD3 плюс PD-L1, що свідчить про інгібуючу дію лігування PD-L1 з B7.1 на T-клітинах. У випадку T-клітин, в 14 UA 109108 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 яких відсутні всі відомі рецептори для PD-L1 (тобто немає PD-1 і B7.1), проліферація T-клітин більше на порушувалася кульками, покритими анти-CD3 плюс PD-L1. Таким чином, PD-L1 може робити інгібуючий вплив на T-клітини або через B7.1, або через PD-1. Пряма взаємодія між B7.1 і PD-L1 свідчить про те, що сучасні представлення про костимуляції є неповними, і підкреслює важливість експресії таких молекул на T-клітинах. -/Дослідження T-клітин PD-L1 показують, що PD-L1 на T-клітинах може призводити до знижуючої регуляцію продукції T-клітинних цитокінів. Latchman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101: 10691-96 (2004). Оскільки і PD-L1 і B7.1 експресуються на T-клітинах, B-клітинах, ДК і макрофагах, існує можливість для напрямлених взаємодій між B7.1 і PD-L1 на таких типах клітин. Крім того, PD-L1 на негематопоетичних клітинах може взаємодіяти з B7.1, а також PD-1 на T-клітинах, викликаючи питання про те, чи задіяний PD-L1 у їх регуляцію. Одним можливим поясненням інгібуючого впливу взаємодії B7.1:PD-L1 є те, що PD-L1 T-клітин може вловлювати або виділяти B7.1 АПК із взаємодії з CD28. У результаті, антагонізм передачі сигналу через PD-L1, включаючи блокування PD-L1, що перешкоджає взаємодії з PD-1, B7.1 або обома молекулами, що тим самим попереджає передачу PD-L1 негативного костимулюючого сигналу до T-клітин і інших антигенпрезентуючих клітин, ймовірно, підсилює імунітет у відповідь на інфекцію (наприклад, гостру і хронічну) і пухлинний імунітет. Крім того, антитіла до PD-L1 згідно із даним винаходом можна поєднати з антагоністами інших компонентів передачі сигналу PD-1:PD-L1, наприклад, антагоністичними антитілами до PD-1 і до PD-L2. 4. B7-H3 Костимулюючі сигнали також передаються через B7-H3 (B7RP-2, CD276, PRO352), що широко експресується в лімфоїдних і нелімфоїдних тканинах. Chapoval et al., Nat. Immunol. 2: 269-74 (2001). У людини B7-H3 має два варіанти 41g і 21g, причому форма 41g є переважною, тоді як варіант 21g переважає у миші. Sun et al., J. Immunol. 168: 6294-97 (2002); Steinberger et al., J. Immunol. 172: 2352-59 (2004); Ling et al, Genomics 82: 365-77 (2003). Нещодавні дослідження показали, що B7-H3 є і стимулятором і інгібітором T-клітинних відповідей. Доказом стимулюючої активації є наступні факти: (1) у поєднанні з анти-CD3 злиття + + B7-H3/Ig костимулювали проліферацію T-клітин CD4 і CD8 і стимулювали IFN-γ і CD8-літичну активність (Chapoval et al., Nat. Immunol. 2: 269-74 (2001)); і (2) ін'єкція експресуючої B7-H3 плазміди в пухлині моделі лімфоми EL-4 призводила до повної регресії 50 % пухлин, що + залежала від T-клітин CD8 і NK-клітин. Однак у декількох нещодавніх дослідженнях показана -/інгібуюча роль такої молекули. Нокаути АПК B7-H3 показують дворазове збільшення проліферації алореактивних T-клітин у реакції MLR. Активація T-клітин CD4 антитілами до CD3 і до CD28 була інгібована в HLA-DR2, трансфікованих будь-якою формою B7-H3. Ling et al., Genomics 82: 365-77 (2003). Результатом була знижена проліферація і знижена продукція IFN-γ, TNF-α, IL-10 і GM-CSF. Узгодження суперечливих результатів таких досліджень може бути основане на існуванні двох рецепторів для B7-H3 із протилежними функціями, подібно тому, як CD28 і CTLA-4 регулюють передачу сигналу через B7.1 і B7.2. У результаті, блокада передачі сигналу B7-H3 може робити внесок у посилення імунної відповіді на інфекцію і пухлинний імунітет у поєднанні з антитілами до PD-L1 відповідно до винаходу. 5. B7-H4 Самим останнім доповненням до сімейства B7 є B7-H4 (B7x, B7-S1, B7-H.5, VTCN1, PRO1291), що є негативним регулятором T-клітинних відповідей. Zang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (18), 10388-10392 (2003); Watanabe et al., Nat. Immunol. 4(7), 670-679 (2003); Prasad, et al., Immunity 18(6), 863-873 (2003); Sica et al., Immunity 18(6), 849-861 (2003). B7-H4 людини і миші широко експресуються як у лімфоїдних (селезінка і тимус), так і нелімфоїдних органах (включаючи легеню, печінку, сім'яник, яєчник, плаценту, кістяковий м'яз, підшлункову залозу і тонкий кишечник). B7-H4 не виявлений у нормальних тканинах людини при IHC (ІГХ) і не виявлена регуляція B7-H4 на рівні трансляції. ІГХ показує, що B7-H4 у високій мірі експресується в пухлинах легені і яєчника, і аналіз полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) у режимі реального часу показує, що мишачий B7-H4 також у високій мірі експресується в лініях клітин карциноми простати, легені й ободової кишки. B7-H4 зв'язує ще невідомий рецептор на активованих, але не на нативних T-клітинах, що відрізняється від CTLA-4, ICOS, PD-I і рецептора для B7-H3. Хоча спочатку повідомляли, що BTLA є лігандом B7-H4, описане -/зв'язування злиттів B7-H4/Ig із клітинами дикого типу, але не з клітинами BTLA змушує зробити висновок про те, що HVEM, а не BTLA, є унікальним лігандом B7-H4. Sedy et al., Nat. Immunol. 6: 90-98 (2004). 15 UA 109108 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Дослідження трансфектантів B7-H4 і іммобілізованих злиттів B7-H4/Ig показують, що B7-H4 + + доставляє сигнал, що інгібує TCR-опосередковану проліферацію T-клітин CD4 і CD8 , проходження клітинного циклу у фазі G0/G1 і продукцію IL-2. Sica et al., Immunity 18: 849-61 (2003); Zang et al., PNAS 100: 10388-92 (2003); Prasad et al., Immunity 18: 863-73 (2003). Костимуляція B7.1 не може подолати B7-H4/Ig-індуковане інгібування. Блокуюче антитіло до B7H4 підсилювало T-клітинну проліферацію і продукцію IL-2 in vitro. Введення in vivo антитіла до B7-H4 порівняно з введенням гемоціаніну морського блюдця "замкова шпарина" (KLH) у повному ад'юванті Фрейнда (CFA) призводило до невеликого збільшення продукції IgМ-антитіла проти KLH і дво-триразового збільшення T-клітинної проліферації і продукції IL-2 при повторній стимуляції in vitro з використанням KLH, що свідчить про більш високе примування T-клітин in vivo в присутності анти-B7-H4. Блокуюче антитіло до B7-H4 помітно прискорювало появу і + + + збільшувало вагу EAE з підвищенням кількості T-клітин CD4 і CD8 і макрофагів CD11b у головному мозку в оброблених анти-B7-H4 мишей у моделі аутоімунного захворювання. Об'єднані наявні експериментальні дані про B7-H4 свідчать про те, що він може здійснювати знижувальну регуляцію імунних відповідей у периферичних тканинах і відіграє роль у регуляції T-клітинної толерантності. Експресія B7-H4 також може відігравати роль в вислизанні пухлинного імунітету від імунних реакцій хазяїна. Choi et al., J. Immunol. 171: 4650-54 (2003). У результаті, антагонізм B7-H4 може бути застосовний для посилення імунної відповіді на інфекцію і пухлинний імунітет при поєднанні з антитілами до PD-L1 відповідно до винаходу. 6. BTLA: Представник B7-сімейства BTLA (CD272, BTLA-1) функціонально подібний з PD-1 і CTLA. Вихідним чином ідентифікований як селектований маркер Th1-клітин BTLA експресується тільки на лімфоцитах. Подібно до CTLA-4, ICOS і PD-1, BTLA індукується на T-клітинах під час активації. Однак на відміну від ICOS, що залишається підвищеним на Th2-клітинах, але піддається понижувальній регуляції в Th1-клітинах, BTLA продовжує експресуватися на Th1клітинах, але не на Th2-клітинах. Подібно до PD-1, BTLA також експресується на B-клітинах. Gavrieli et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 312: 1236-43 (2003). Однак BTLA експресується як на спочиваючих, так і на активованих B-клітинах, тоді як PD-1 піддається підвищувальній регуляції на активованих B-клітинах. BTLA має два мотиви ITIM. BTLA робить інгібуючий вплив і на B- і на T-лімфоцити. Watanabe et al., Nat. Immunol. 4: 670-/79 (2003). B-клітини BTLA помірковано реагують на анти-IgМ, але виявляють підвищену -/реакцію на анти-CD3 in vitro. У поляризованих Th1-клітинах BTLA спостерігається дворазове -/збільшення відповіді на вплив антигену in vitro. In vivo у мишей BTLA спостерігається триразове збільшення гаптен-специфічних гуморальних відповідей і підвищена чутливість до -/-/EAE. Фенотип мишей BTLA схожий на фенотип мишей PD-1 , виявляючи підвищену чутливість до аутоімунітету, але такі фенотипи є більш слабко вираженими, ніж у мишей CTLA-/4 . Однак, з урахуванням ролі BTLA як негативний регулятор, його блокада може бути корисною для посилення імунної відповіді на інфекцію і протипухлинного імунітету в поєднанні з антитілами до PD-L1 відповідно до винаходу. Цікаво, як нещодавно було показано, що представник надсімейства Ig BTLA також взаємодіє з представником TNFR-сімейства HVEM. Sedy et al., Nat. Immunol. 6: 90-98 (2005); Gonzalez et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 1116-1121 (2005). Огляд даних відносно HVEM наведений нижче в розділі "Костимулятори сімейства TNFR". E. Костимулятори сімейства TNFR 1. OX40/OX40L (CD134) Миші з недостатністю OX40 (CD 134, TXPG1L, TNFRSF4) і OX40L (CD134L, CD252, GP34, + TNFSF4, TXGP1) мають знижені первинні відповіді T-клітин CD4 як на вірусні, так іна загальні білкові антигени в реакціях контактної чутливості. Chen et al., Immunity 11: 689-698 (1999); Kopf et al., Immunity 11: 699-708 (1999); Murata et al., J. Exp. Med. 191: 365-374 (2000); Gramaglia et al., J. Immunol. 165: 3043-3050 (2000). Більш низька частота антиген-специфічних ефекторних Tклітин створюється наприкінці первинної реакції і розвивається менше T-клітин пам'яті. Gramaglia et al., див. вище. На відміну від T-клітин з недостатністю CD27, рання проліферація не + порушена в популяціях нативних T-клітин CD4 , що мають недостатність OX40. Однак знижена проліферація і помітна апоптозна загибель клітин відбувається через 4-5 днів після активації, що призводить до того, що залишається мало тривало живучих T-клітин. Rogers et al., Immunity + 15: 445-455 (2001). У випадку OX40-дефіцитних T-клітин CD8 , початковий клітинний поділ не зачіпається, але накопичення первинних ефекторних клітин помітно знижене через 3-6 днів після зустрічі з антигеном. Croft et al., Nat. Immunol. 3: 609-620 (2003). Трансгенна експресія OX40L дендритними клітинами або T-клітинами підвищувала кількість + T-клітин, що відповідають на антиген, CD4 і викликала аутоімунно-подібні симптоми, що 16 UA 109108 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 асоційовані з аномальною активацією T-клітин. Brocker et al., Eur. J. Immunol. 29: 1610-1616 (1999); Murata et al., J. Immunol. 169: 4628-4636 (2002). Після імунізації ін'єкція агоністичних + антитіл до OX40 призводить до накопичення більшої кількості антиген-реактивних T-клітин CD4 у точці максимуму первинної відповіді і супутнього збільшення кількості утворених T-клітин пам'яті. Gramaglia et al., див. вище, Bansai-Pakala et al., Nature Med. 7: 907-912 (2001), Maxwell et al., J. Immunol. 164: 107-112 (2000); Weatherill et al., Cell. Immunol. 209: 63-75 (2001). Посилене накопичення первинних ефекторних CTL відбувається, коли примованих антигеном мишей обробляють агоністичним антитілом, специфічним для OX40. De Smedt et al., J. Immunol. 168: 661-670 (2002). Вважають, що OX40 дає пізно діючий сигнал, що забезпечує життєздатність новостворених ефекторних клітин у точці максимуму первинної імунної відповіді. Також є гарні докази того, що OX40 функціонує нижче CD28 - на додаток до підвищеної експресії OX40, опосередкованої сигналами CD28, функціональні аналізи недостатності CD28 у порівнянні з недостатністю OX40 показали, що ранні первинні T-клітинні відповіді помітно порушені під час відсутності сигналів CD28, але під час відсутності сигналів OX40 порушені тільки пізні відповіді. Rogers et al., Immunity 15: 445-455 (2001); Bertram et al., J. Immunol. 168: 3777-3785 (2002). У результаті, ймовірним є те, що активація OX40/OX40L, наприклад, за допомогою застосування агоністичних антитіл, може бути корисною в поєднанні з антитілами до PD-L1 відповідно до винаходу для лікування T-клітинних дисфункціональних розладів. 2. 4-1BB (CD137)/4-1BBL Подібно до випадку з OX40/OX40L, у випадку T-клітин, що мають недостатність за 4-1BB (CD 137, TNFRSF9) і 4-1BBL (TNFSF9), спостерігають менше накопичення антиген-реактивних + T-клітин CD8 при первинних відповідях, коли 4-1BBL відсутній, і розвиток меншої кількості Tклітин пам'яті. DeBenedette et al., J. Immunol. 163: 4833-4841 (1999); Tan et al., J. Immunol. 163: 4859-4868 (1999); Tan et al., J. Immunol. 164: 2320-2325 (2000). Також блокування 4-1BBL не змінює початкову проліферативну відповідь T-клітин CD8+, але пригнічує накопичення ефекторних CTL у точці максимуму первинної відповіді через 3-6 днів, примушуючи до апоптозу клітини, які поділилися кілька разів. Cooper et al., Eur. J. Immunol. 32: 521-529 (2002). Агоністичні антитіла до 4-1BB і анти-4-1BBL-трансфіковані АПК також давали подібні результати: відповіді CTL і T-клітин CD4+ помітно зростають in vivo. Melero et al., Nature Med. 3: 682-685 (1997); Melero et al., Eur. J. Immunol. 28: 1116-1121 (1998); Takahashi et al., J. Immunol. 162: 5037-5040 (1999); Guinn et al., J. Immunol. 162: 5003-5010 (1999); Halstead et al., Nature Immunol. 3: 536-541 (2002); Takahashi et al., Immunol. Lett. 76: 183-191 (2001); Bansal-Pakala et al., J. Immunol. 169: 5005-5009 (2002). 4-1BB-специфічне антитіло не змінює початкову проліферативну відповідь, що підтверджує висновки експериментів з блокування 4-1BBL і підкреслює наявність пізньої активності 4-1BB у забезпеченні сигналом життєздатності клітин. Подібно до OX40, як вважають, 4-IBB дає пізно діючий сигнал, що забезпечує життєздатність новостворених ефекторних клітин у точці максимуму первинної імунної відповіді. Також одержані гарні докази того, що 4-1BB функціонує пізніше, ніж CD28 - на додаток до підвищеної експресії OX40 і 4-1BB, опосередкованих сигналами CD28, функціональний аналіз недостатності CD28 у порівнянні з недостатністю 4-1BB показав, що ранні первинні відповіді Tклітин помітно порушені під час відсутності сигналів CD28, але під час відсутності сигналів OX40 порушені тільки пізні відповіді. Rogers et al., Immunity 15: 445-455 (2001); Bertram et al., J. Immunol. 168: 3777-3785 (2002). Агоністичне антитіло до CD137 може індукувати регресію пухлин у випадку злоякісної пухлини, в якій CTL CD8+ відіграють центральну роль. Melero et al., Nat. Med. 3: 682-5 (1997); Hirano et al, Cancer Res. 65(3): 1089-96 (2005). Конститутивна і індукована експресія PD-L1 надає резистентність таким пухлинам, яка зворотна при блокаді PD-L1. Hirano et al. У результаті, ймовірним є те, що активація 4-1BB/4-BBL, наприклад, за допомогою застосування агоністичних антитіл, особливо в поєднанні з антагоністами PD-L1 (наприклад, антитілом до PD-L1) може бути корисною для лікування T-клітинних дисфункціональних розладів. 3. CD27/CD27L (CD70) Важливість передачі сигналу CD27 (TNFRSF7, S152) і CD27L (CD70, TNFSF7) для початкових стадій T-клітинної відповіді показана в дослідженнях блокування in vitro, при якому порушували взаємодії CD27/CD70. Oshima et al., Int. Immunol. 10: 517-526 (1998); Agematsu et al., J. Immunol. 153: 1421-1429 (1994); Hintzen et al., J. Immunol. 154: 2612-2623 (1995). T-клітини, в яких відсутній CD27, спочатку поділяються нормально, але потім проліферують слабко через 3 або більше днів після активації. Hendriks et al., Nature Immunol. 1: 433-440 (2000). Одержані дані свідчать про те, що CD27 бере участь у стимуляції початкової експансії популяції нативних 17 UA 109108 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 T-клітин, або завдяки ранній супресії загибелі T-клітин, або завдяки дії на клітинний цикл, забезпечуючи підтримку розподілу через 2-3 дня після активації. Це підтверджено дослідженнями in vivo CD27-дефіцитних мишей, в яких менша кількість антиген-специфічних відповідей (дні 4-8) і розвивається менше T-клітин пам'яті протягом 3 або більше тижнів. Hendriks et al., див. вище. Експресія CD27 рано піддається підвищувальній регуляції після активації T-клітин, свідчачи про те, що він, головним чином, доставляє сигнали, що підтримують ранню проліферацію до максимальної точки ефекторної відповіді. У результаті, ймовірним є те, що активація CD27/CD27L, включаючи активацію за допомогою застосування агоністичних антитіл, особливо в поєднанні з антитілами до PD-L1, описаними в даній публікації, може бути корисною при лікуванні T-клітинних дисфункціональних розладів. 4. CD30/CD30L (CD153) Передача сигналу CD30 (TNFRSF8, Ki-1) і CD30L (CD153, TNFSF8) є костимулюючою для декількох T-клітинних функцій in vitro. Del Prete et al., J. Exp. Med. 182: 1655-1661 (1995), Bowen et al., J. Immunol. 156: 442-449 (1995). Блокуючі CD30L реагенти пригнічували розвиток Th2клітин і підсилювали розвиток Th1-клітин in vitro. Така активність відповідає даним, що показують, що CD30 переважно експресується Th2-клітинами і цитотоксичними клітинами типу 2 Tc2. Del Prete et al., див. вище, Nakamura et al., J. Immunol. 158: 2090-2098 (1996). CD30 експресується через 3-4 дня після активації нативних T-клітин при неполяризованих первинних відповідях (Nakamura et al., див. вище), свідчачи про те, що його роль не обмежена пригнічуваними цитокіном типу 2 відповідями. Хоча точні механізми передачі сигналу CD30/CD30L не з'ясовані, передбачалося, що він може бути подібний з OX40 і 4-1BB. Коли адаптивно переносимі антиген-специфічні T-клітини + CD8 переносять CD30L-дефіцитним мишам, вони не накопичуються у великих кількостях у максимальній точці первинної відповіді, і розвивається менше T-клітин пам'яті. У результаті, CD30 також може надавати сигнали проліферації і/або життєздатності, забезпечуючи можливість утворення великих кількостей антиген-специфічних T-клітин у максимальній точці первинних відповідей. У результаті, ймовірним є те, що активація CD27/CD27L, включаючи активацію за допомогою застосування агоністичних антитіл, особливо в поєднанні з антитілами до PD-L1, описаними в даній публікації, може бути корисною для лікування T-клітинних дисфункціональних розладів. 5. HVEM/LIGHT Вплив HVEM (HVEA, ATAR, LIGHTR, TNFRSF14, PRO509) і LIGHT (CD258, HVEML, TR2, TNFSF14, PRO726) на костимуляцію T-клітин є складним через 1) здатність LIGHT також зв'язувати рецептор лімфотоксину-β (LTβR) і 2) здатність HVEM зв'язувати розчинний LTα3. Таким чином, у будь-якому дослідженні ефекту HVEM/LIGHT варто також враховувати вплив інших зв'язувальних партнерів у випадку такої системи передачі сигналів. Блокування LIGHT може рано інгібувати проліферацію T-клітин і секрецію цитокінів у реакціях змішаних алогенних лімфоцитів (MLR). Tamada et al., J. Immunol. 164: 4105-4110 (200), Kwon et al., J. Biol. Chem. 272: 14272-14276 (1997); Harrop et al., J. Immunol. 161: 1786-1794 (1988); Tamada et al., Nature Med. 6: 283-289 (200). Продукування протизапальних цитокінів пригнічується, коли LIGHT блокований в алотрансплантатах серця, що не збігаються за MHC. Ye et al., J. Exp. Med. 195: 795-800 (2002). Крім того, алогенні трансплантати шкіри відторгаються з уповільненою кінетикою у реципієнтів, що мають недостатність як LIGHT, так і CD28. Scheu et al., J. Exp. Med. 195: 1613-1624 (2002). Припускають, що уповільнене відторгнення трансплантата може вказувати на раннє пригнічення клональної експансії T-клітин або продукції цитокінів. Такий висновок підтверджується (i) дослідженнями in vitro, що показують, що LIGHT-дефіцитні спленоцити, які відповідають на алоантиген, мали знижену продукцію як TH1-, так і TH2-цитокінів і слабке формування активності цитотоксичних T-лімфоцитів (CTL) [Sheu et al., див. вище], і (ii) дослідженнями in vivo, що показують, що блокування LIGHT знижує утворення алореактивних CTL. Tamada et al., Nature Med. 6: 283-289 (2000). У результаті, вплив на HVEM/LIGHT, наприклад, за допомогою застосування агоністичних антитіл, особливо в поєднанні з антитілами до PD-L1, описаними в даній публікації, може бути корисним для лікування T-клітинних дисфункціональних розладів. II. Визначення "Алерген" або "імуноген" являє собою будь-яку молекулу, що запускає імунну відповідь. У використовуваному в даному описі сенсі термін охоплює або саму антигенну молекулу, або її джерело, таке як пальцеве зерно, лупа тварин, отрута комах або харчовий продукт. Вказаний термін відрізняється від терміна "антиген", що належить до молекули, яка може специфічно 18 UA 109108 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 впізнаватися імуноглобуліном або T-клітинним рецептором. Будь-яка чужорідна речовина, здатна індукувати імунну відповідь, є потенційним алергеном. Відомо, що множина різних хімічних речовин як природного, так і синтетичного походження є алергенними. Складні природні органічні хімічні речовини, особливо білки, ймовірно, викликають опосередковану антитілами алергію, тоді як прості органічні сполуки, неорганічні хімічні речовини і метали більш переважно викликають опосередковану T-клітинами алергію. У деяких випадках той самий алерген може бути відповідальним за більше ніж один тип алергії. Вплив алергену може здійснюватися при вдиханні, ін'єкції або контакті зі шкірою. "Дисфункція" у контексті імунної дисфункції належить до стану зниженої імунної реактивності при антигенній стимуляції. Термін включає загальні елементи виснаження і/або анергії, при якій може відбуватися впізнавання антигену, але формована у результаті імунна відповідь є неефективною, щоб боротися з інфекцією або ростом пухлини. "Толерантність" або "імунологічна толерантність" означає нездатність імунної системи формувати захисну імунну відповідь відносно конкретного антигену. Толерантність може бути природною або аутотолерантністю, коли організм не атакує свої власні білки й антигени, або вона може бути індукованою, виникаючою в результаті обробки імунної системи. Центральна толерантність виникає в процесі розвитку лімфоцитів і діє в тимусі і кістковому мозку. У ході цього процесу T- і B-лімфоцити, що впізнають власні антигени, знищуються до того, як вони розів'ються в повністю імунокомпетентні клітини. Вказаний процес є найбільш активним під час розвитку плоду, але продовжується протягом життя в міру утворення незрілих лімфоцитів. Периферична T-клітинна толерантність належить до функціональної нечутливості до аутоантигенів, що присутні в периферичних тканинах, і має місце після того, як T- і B-клітини дозрівають і надходять на периферію. Такі процеси включають пригнічення аутореактивних клітин "регуляторними" T-клітинами і формування гіпореактивності (анергії) у лімфоцитах, що зустрічаються з антигеном, під час відсутності костимулюючих сигналів, що супроводжують запалення. "Надбана" або "індукована толерантність" належить до адаптації імунної системи до зовнішніх антигенів, що характеризується відсутністю специфічної реактивності лімфоїдних тканин на даний антиген, що в іншому випадку, ймовірно, може індукувати опосередкований клітинами або гуморальний імунітет. У дорослих толерантність може бути індукована клінічно за допомогою багаторазового введення дуже великих доз антигену або малих доз, що нижче порога, необхідного для стимуляції імунної відповіді, наприклад, за допомогою внутрішньовенного або під'язикового введення розчинних антигенів. Імуносупресія також сприяє індукції толерантності. Порушення аутотолерантності може призводити до аутоімунітету. "Посилення T-клітинної функції" означає, що T-клітину індукують, примушують або стимулюють так, щоб вона мала тривало діючу або посилену біологічну функцію, чи обновляють або реактивують виснажені або неактивні T-клітини. Приклади посилення T+ клітинної функції включають: підвищену секрецію γ-інтерферону з T-клітин CD8 , підвищену проліферацію, підвищену реактивність відносно антигену (наприклад, елімінація вірусів або патогенів) у порівнянні з рівнями перед втручанням. В одному варіанті здійснення винаходу рівень посилення складає щонайменше 50 %, альтернативно 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 120 %, 150 %, 200 %. Спосіб вимірювання такого посилення відомий фахівцю в даній галузі. "T-клітинний дисфункціональний розлад" являє собою розлад або стан T-клітин, що характеризується зниженою реактивністю відносно антигенноїстимуляції. У конкретному варіанті T-клітинний дисфункціональний розлад являє собою розлад, що специфічно асоційований з невідповідною підвищеною передачею сигналу через PD-1. В іншому варіанті Tклітинний дисфункціональний розлад являє собою розлад, при якому T-клітини є анергічними або мають знижену здатність секретувати цитокіни, проліферувати або виявляти цитолітичну активність. У конкретному аспекті знижена реактивність призводить до неефективного контролю патогену або пухлини, що експресує імуноген. Приклади T-клітинних дисфункціональних розладів, що характеризуються порушенням функції T-клітин, включають невирішену гостру інфекцію, хронічну інфекцію і пухлинний імунітет. "Хронічна інфекція" належить до інфекції, при якій інфекційний агент (наприклад, патогени, такі як віруси, бактерії, паразитичні найпростіші, гриби або тому подібне) індукував імунну відповідь в інфікованого хазяїна, але який не був вилучений або елімінований з організму даного хазяїна як під час гострої інфекції. Хронічні інфекції можуть бути персистуючими, латентними або повільно перебігаючими. У той час як гострі інфекції зазвичай розв'язуються імунною системою протягом декількох діб або тижнів (наприклад, грип), персистуючі інфекції можуть продовжуватися на відносно низькому рівні протягом місяців, років, десятиліть або всього життя (наприклад, гепатит B). Навпаки, латентна інфекція характеризується тривалим періодом безсимптомної активності, змінюваним періодом швидко наростаючої вираженої 19 UA 109108 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 інфекції і підвищених рівнів патогену (наприклад, простий герпес). Нарешті, повільно перебігаюча інфекція являє собою інфекцію, що характеризується поступовим і безперервним збільшенням симптомів захворювання, таких як тривалий інкубаційний період, з наступним затягнутим і прогресуючим перебігом хвороби, починаючи після появи клінічних симптомів. На відміну від латентних і персистуючих інфекцій, повільно перебігаюча інфекція може не починатися з початком гострого періоду розмноження вірусу (наприклад, пікорнавірусна інфекція, віснавірус, скріпи, хвороба Крейцфельдта-Якоба). Прикладами інфекційних агентів, здатних індукувати хронічну інфекцію, є віруси (наприклад, цитомегаловірус, вірус ЕпштейнБарр, вірус гепатиту B, вірус гепатиту C, вірус простого герпесу типів I і II, вірус імунодефіциту людини типів 1 і 2, вірус папіломи людини, лімфотрофичні віруси T-лімфоцитів людини типів 1 і 2, вірус вітряної віспи тощо), бактерії (наприклад, Mycobacterium tuberculosis, Listeria spp., Klebsiella pneumoniae, Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Borrelia spp., Helicobacter pylori тощо), паразитичні найпростіші (наприклад, Leishmania spp., Plasmodium falciparum, Schistosoma spp., Toxoplasma spp., Trypanosoma spp., Taenia carssiceps тощо) і гриби (наприклад, Aspergillus spp., Candida albicans, Coccidioides immitis, Histoplasma capsulatum, Pneumocystis carinii тощо). Додаткові інфекційні агенти включають пріони або неправильно згорнуті білки, що уражують головний мозок або структуру нейронів у результаті подальшого поширення неправильного фолдингу білка в таких тканинах, що призводить до утворення амілоїдних бляшок, що викликають загибель клітин, ушкодження тканини і можливу смерть. Приклади захворювання, що виникає в результаті пріонної інфекції, включають: хворобу Крейцфельдта-Якоба і її варіанти, синдром Герстманна-Штаусслера-Шейнкера (GSS), фатальне сімейне безсоння (sFI), куру, скріпи, коров'ячу губчасту енцефалопатію (BSE) у великої рогатої худоби (також відому як "коров'ячий сказ") і різні інші форми енцефалопатії у тварин [наприклад, трансмісивна енцефалопатія норок (TME), хронічний вастинг-синдром (CWD) у білохвостого оленя, лося і чорнохвостого оленя, губчаста енцефалопатія кішок, енцефалопатія екзотичних копитних тварин (EUE) антилопи ньяла, антилопи бейза і великого куду, губчаста енцефалопатія страуса]. "Пухлинний імунітет" належить до процесу, при якому пухлини вислизають від впізнавання й елімінації імунною системою. Таким чином, як терапевтична концепція, пухлинний імунітет "лікується", коли таке вислизання послаблюють, і пухлини впізнаються й атакуються імунною системою. Приклади впізнавання пухлини включають зв'язування пухлини, скорочення пухлини і видалення пухлини. "Антагоніст негативного костимулюючого B7" ("BNCA") являє собою агент, що знижує, блокує, інгібує, скасовує або перешкоджає негативний костимулюючий сигнал, опосередкований прямо або опосередкований через білки клітинної поверхні, що експресуються на T-лімфоцитах, представником сімейства B7. В одному аспекті BNCA може або окремо, або в поєднанні з антитілами до PD-1 відповідно до винаходу робити дисфункціональну T-клітину недисфункціональною. В іншому аспекті BNCA може являти собою агент, що інгібує синтез нуклеїнової кислоти або білка, експресію, передачу сигналу і/або процесинг після експресії негативної костимулюючої молекули B7. У ще одному аспекті BNCA являє собою антитіло, антигензв'язувальний фрагмент антитіла, олігопептид BNCA, РНК-і BNCA або малу молекулу BNCA, що знижує, блокує, інгібує, скасовує або перешкоджає сигнальній трансдукції негативною костимулюючою молекулою B7. Приклади негативних костимулюючих молекул B7 включають: CTLA-4, PD-L1, PD-1, B7.1 (експресований на T-клітинах), PD-L2, B7-H3 і B7-H4. Позитивний костимулюючий агоніст являє собою молекулу, що збільшує, підсилює, підвищує або полегшує костимулюючий сигнал, опосередкований прямо або через білки клітинної поверхні, що експресуються на T-лімфоцитах. В одному аспекті позитивна костимулююча молекула може являти собою позаклітинний домен, розчинну конструкцію або агоністичне антитіло, що активує позитивний костимулюючий шлях. Приклади позитивних костимулюючих молекул включають молекули надсімейства B7, наприклад, B7.1, B7.2, CD28 і ICOS/ICOSL. Додаткові приклади включають костимулюючі молекули сімейства TNFR, наприклад, OX40/OX40L, 41-BB/41-BBL, CD27/CD27L, CD30/CD30L і HVEM/LIGHT. "Мала молекула" або "мала органічна молекула" являє собою молекулу, що має молекулярну масу нижче приблизно 500 дальтон. "Інтерферуюча РНК", "РНК-і", являє собою РНК довжиною 10-50 нуклеотидів, що знижує експресію гена-мішені, при цьому частини нитки в достатній мірі комплементарні (наприклад, мають щонайменше 80 % ідентичність з геном-мішенню). Спосіб інтерференції РНК належить до специфічного для мішені пригнічення експресії гена (тобто "сайленсингу гена"), що відбувається на посттранскрипційному рівні (наприклад, на рівні трансляції), і включає всі посттранскрипційні і транскрипційні механізми опосередкованого РНК інгібування експресії гена, 20 UA 109108 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 такі як механізми, описані в публікації P.D. Zamore, Science 296: 1265 (2002) і Hannan and Rossi, Nature 431: 371-378 (2004). Як використовується в даному описі, РНК-і може бути у формі малої інтерферуючої РНК (міРНК), короткої шпилькової РНК (кшРНК) і/або мікро-РНК (мікро-РНК). Такі молекули РНК-і часто являють собою двониткові комплекси РНК, що можуть бути експресовані у формі окремих комплементарних або частково комплементарних ниток РНК. Способи конструювання двониткових комплексів РНК добре відомі в даній галузі. Наприклад, опис конструювання і синтезу придатних кшРНК і міРНК можна знайти в публікації Sandy et al., BioTechniques 39: 215-224 (2005). "Мала інтерферуюча РНК" або міРНК являє собою дуплекс двониткової РНК (днРНК) довжиною від 10 до 50 нуклеотидів, що знижує експресію гена-мішені, в якому частини першої нитки в достатній мірі комплементарні (наприклад, мають щонайменше 80 % ідентичність з геном-мішенню). міРНК спеціально конструюють так, щоб уникнути противірусної відповіді, характеризованої підвищеним синтезом інтерферону, інгібуванням неспецифічного синтезу білка і розпадом РНК, що часто призведе до суїциду і загибелі клітини, асоційованої з використанням РНК-і в клітинах ссавців. Paddison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(3): 1443-8. (2002). Термін "шпилька" належить до утворюючої петлю структури РНК із 7-20 нуклеотидів. "Коротка шпилькова РНК" або кшРНК являє собою однониткову РНК довжиною від 10 до 50 нуклеотидів, що характеризується вигином у вигляді шпильки, що знижує експресію гена-мішені, при цьому частини нитки РНК у достатній мірі комплементарні (наприклад, мають щонайменше 80 % ідентичність з геном-мішенню). Термін "стебло-петля" належить до спарювання основ між двома ділянками однієї і тієї ж молекули з утворенням подвійної спіралі, що закінчується короткою неспареною петлею, даючи структуру у формі льодяника на паличці. "Мікро-РНК" (раніше відома як "stRNA") являє собою однониткову РНК довжиною приблизно від 10 до 70 нуклеотидів, що спочатку транскрибується у вигляді перед-мікро-РНК, що характеризується структурою "стебло-петля", що потім процесується в зрілу мікро-РНК після додаткового процесинга через індукований РНК комплекс сайленсинга (RISC). "Інтерферуюча РНК BNCA" або "РНК-і BNCA" зв'язується, переважно специфічно, з нуклеїновою кислотою BNCA і знижує її експресію. Це значить, що експресія негативної костимулюючої молекули B7 нижче в присутності BNCA-РНК-і в порівнянні з експресією негативної костимулюючої молекули B7 у контролі, коли BNCA-РНК-і відсутній. BNCA-РНК-і може бути ідентифікована і синтезована з використанням відомих способів (Shi Y., Trends in Genetics 19(1): 9-12 (2003), WO2003056012, WO2003064621, WO2001/075164, WO2002/044321. "Олігопептид BNCA" означає олігопептид, що зв'язується, переважно специфічно, з негативним костимулюючим поліпептидом B7, включаючи рецептор, ліганд або компонент передачі сигналу, відповідно, які описані в даній публікації. Такі олігопептиди можуть бути синтезовані хімічно з використанням відомої методики синтезу олігопептидів або можуть бути одержані й очищені з використанням методики рекомбінантів. Такі олігопептиди зазвичай мають довжину щонайменше приблизно 5 амінокислот, альтернативно щонайменше довжину приблизно 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 або 100 амінокислот або більше. Такі олігопептиди можуть бути ідентифіковані без зайвого експериментування з використанням добре відомих способів. У цьому відношенні слід зазначити, що методика скринінгу олігопептидних бібліотек у відношенні олігопептидів, що здатні специфічно зв'язуватися з поліпептидом-мішенню, добре відомі в даній галузі (див., наприклад, патенти США № 5556762, 5750373, 4708871, 4833092, 5223409, 5403484, 5571689, 5663143; публікації PCT № WO 84/03506 і WO84/03564; Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81: 3998-4002 (1984); Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82: 178-182 (1985); Geysen et al., in Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986); Geysen et al., J. Immunol. Meth. 102: 259-274 (1987); Schoofs et al., J. Immunol. 140: 611-616 (1988), Cwirla, S.E. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 6378 (1990); Lowman, H.B. et al. Biochemistry, 30: 10832 (1991); Clackson, T. et al. Nature, 352: 624 (1991); Marks, J.D. et al., J. Mol. Biol., 222: 581 (1991); Kang, A.S. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 8363 (1991), і Smith, G. P., Current Opin Biotechnol., 2: 668 (1991). "Низькомолекулярний антагоніст BNCA" або "мала молекула BNCA" являє собою органічну молекулу, яка відрізняється від олігопептиду або антитіла, як визначено в даному описі, що інгібує, переважно специфічно, негативний костимулюючий поліпептид B7. Таке інгібування передачі негативного костимулюючого сигналу B7 переважно робить дисфункціональні Tклітини такими, що відповідають на антигенну стимуляцію. Приклад малих молекул BNCA 21 UA 109108 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 можна ідентифікувати і хімічно синтезувати з використанням відомої методики (див., наприклад, публікації PCT № WO2000/00823 і WO2000/39585). Такі малі молекули BNCA зазвичай мають розмір менше ніж приблизно 2000 дальтон, альтернативно менше ніж приблизно 1500, 750, 500, 250 або 200 дальтон, здатні зв'язуватися, переважно специфічно, з негативним стимулюючим поліпептидом B7, як описано в даній публікації, і можуть бути ідентифіковані без зайвого експериментування з використанням добре відомої методики. У цьому відношенні слід зазначити, що методика скринінгу бібліотек органічних молекул у відношенні молекул, що здатні зв'язуватися з поліпептидом-мішенню, добре відомі в даній галузі (див., наприклад, публікації PCT № WO00/00823 і WO00/39585). Термін "антибіотик" включає будь-яку молекулу, що специфічно інгібує або припиняє ріст мікроорганізмів, таких як віруси, бактерії, гриби і найпростіші, але не є летальними для хазяїна при концентрації, що вводиться, і у використовуваних інтервалах введення доз. Як використовується в даному описі, термін антибіотик включає антибактеріальний засіб, противірусний засіб, протигрибковий засіб і протипротозойний засіб. У конкретному аспекті антибіотик є нетоксичним для хазяїна при концентрації, що вводиться, і в інтервалах дозування. Антибактеріальні антибіотики або антибактеріальні засоби можуть бути в широкому сенсі класифіковані або як бактерицидні (тобто безпосередньо вбиваючі), або як бактеріостатичні (тобто такі, що попереджують розподіл) засоби. Бактерицидні антибіотики можна додатково класифікувати як антибіотики вузького спектра (тобто такі, що діють тільки на невеликий клас підгрупи бактерій, наприклад, грамнегативних, і т.д.) або широкого спектра (тобто такі, що діють на широкий клас). Приклади антибіотиків включають: (і) аміноглікозиди, наприклад, амікацин, гентаміцин, канаміцин, неоміцин, нетилміцин, стрептоміцин, тобраміцин, пароміцин, (ii) ансаміцини, наприклад, гелданаміцин, гербіміцин, (iii) карбацефеми, наприклад, лоракарбеф, (iv) карбапенеми, наприклад, ертапенум, дорипенем, іміпенем/циластатин, меропенем, (v) цефалоспорини (першого покоління), наприклад, цефадроксил, цефазолін, цефалотин, цефалексин, (vi) цефалоспорини (другого покоління), наприклад, цефлаклор, цефамандол, цефокситин, цефпрозил, цефуроксим, (vi) цефалоспорини (третього покоління), наприклад, цефіксим, цефдинір, цефдиторен, цефоперазон, цефотаксим, цефподоксим, цефтазідім, цефтибутен, цефтизоксим, цефтріаксон, (vii) цефалоспорини (четвертого покоління), наприклад, цефепім, (viii) цефалоспорини (п'ятого покоління), наприклад, цефтобіпрол, (ix) глікопептиди, наприклад, тейкопланін, ванкоміцин, (x) макроліди, наприклад, акситроміцин, кларитроміцин, диритроміцин, еритроміцин, рокситроміцин, тролеандоміцин, телітроміцин, спектиноміцин, (xi) монобактами, наприклад, акстреонам, (xii) пеніциліну, наприклад, амоксицилін, ампіцилін, акслоцилін, карбеніцилін, клоксацилін, диклоксацилін, флуклоксацилін, мезлоцилін, метицилін, нафцилін, оксацилін, пеніцилін, пеперацилін, тикарцилін, (xiii) поліпептидні антибіотики, наприклад, бацитрацин, колістин, поліміксин B, (xiv) хінолони, наприклад, ципрофлоксацин, еноксацин, гатифлоксацин, левофлоксацин, лемефлоксацин, моксифлоксацин, норфлоксацин, орфлоксацин, тровафлоксацин, (xv) сульфонаміди, наприклад, мафенід, пронтосил, сульфацетамід, сульфаметизол, сульфаніламід, сульфасалазин, сульфізоксазол, триметоприм, триметоприм-сульфаметоксазол (TMP-SMX), (xvi) тетрацикліни, наприклад, демеклоциклін, доксициклін, міноциклін, окситетрациклін, тетрациклін і (xvii) інші, такі як арспенамін, хлорамфенікол, кліндаміцин, лінкоміцин, етамбутол, фосфоміцин, фусидова кислота, фуразолідон, ізоніазид, лінезолід, метронідазол, мупіроцин, нітрофурантоїн, платензиміцин, піразинамід, хінупристин/далфопристин, рифампін/рифампіцин або тинідазол. Термін "противірусний засіб" включає будь-яку молекулу, що інгібує або припиняє ріст, хвороботворність і/або життєздатність вірусів. Термін включає лікарські засоби проти ретровірусів, такі як (1) інгібітори зворотної транскриптази, включаючи, наприклад: (a) інгібітори зворотної транскриптази, що є аналогами нуклеозидів (NRTI) (наприклад, ацикловір (ZOVIRAX, ZOVIR), цидофовір, азидотимідин/зидовудин (AZT, RETROVIR), диданозин (ddI, VIDEX; зальцитабін (ddC, HIVID); ставудин (d4T, ZERIT; ламівудин (3TC, EPIVIR); абакавір (ZIAGEN); емтрицитабін (EMTRIVA); бривудин (HELPIN); ентекавір (BARACLUDE); ідоксуридин; вірамідин (тарибавірин, Valeant Pharmacueticals), інгібітор полімерази, що є нуклеозидним аналогом цитидину, PCI-6130 і варіанти проліків (наприклад, R7128), Pharmasset/Roche; інгібітор, що є нуклеозидним аналогом, Merck/Isis PharmaceuticalsMK-0608, (b) інгібітори зворотної транскриптази, що є нуклеотидними аналогами (NtRTI) (наприклад, тенофовір (VIREAD); адефовір (PREVEON, HEPSERA; фомівірсен (VITRAVENE); (c) ненуклеозидні аналоги зворотної транскриптази, (NNRTI), ефавіренц (SUSTIVA, STOCRIN); невірапін (VIRAMUNE), делавірдин (RESCRIPTOR), етравірин (INTELENCE), ловірид; ненуклеозидний інгібітор РНК-залежної РНК-полімерази HCV, 22 UA 109108 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ViroChem Pharma-VCH-759, ненуклеозидний інгібітор полімерази HCV, Pfizer-PF-868554; і (d) інгібітори полімерази, включаючи: РНК-залежну РНК-полімеразу вірусу гепатиту C, Boehringer Ingelheim-BILB-1941, інгібітор РНК-полімерази Roche-R1626; ACH-0137171 - інгібітор реплікази Achillion Pharmaceuticals, R7128 - інгібітор полімерази Roche/Pharmasset, ABT-333 і ABT-072 інгібітори полімерази Abbott, BI 207127 - інгібітор полімерази Boehringer Ingelheim, PSI-7851 інгібітор полімерази Pharmasset, ANA598 - інгібітор полімерази Anadys Pharmaceuticals, MK3281 - інгібітор полімерази Merck, IDX184 - інгібітор полімерази Idenix, GSK 625433 - інгібітор полімерази Glaxo Smith Kline, INX-189 - інгібітор полімерази Inhibitex, NM283 - інгібітор полімерази Idenix, HCV796 - інгібітор полімерази Wyeth, GL60667 і GS9190 - інгібітори полімерази Gilead, PF-008685540 - інгібітор полімерази Pfizer, VCH759, VCH916, VX222 і VX759 - інгібітори полімерази Virochem, IDX184 і IDX375 - інгібітори полімерази Idenix, BMS650032 інгібітор полімерази Bristol Myers Squibb; (2) інгібітори протеази, включаючи, наприклад: саквінавір (FOROVASE/INVIRASE), ритонавір (NORVIR), індинавір (CRIXIVAN), нелфінавір (VIRACEPT), ампренавір (AGENERASE), лопінавір (KALETRA), атазанавір (REYATAZ), фосампренавір (LEXIVA), типранавір (APTIVUS), дарунавір (PREZISTA), телаправір (VX-950); інгібітори протеаз HCV другого покоління Vertex Pharmaceuticals-VX-500 і VX-813; інгібітор протеази NS3/4A Intermune/Roche-ITMN-191/R-7227, боцепревір, інгібітор протеази Schering-Plough-SCH 503034, інгібітор протеази NS3/4A HCV Medivir/TibotecTMC435/TMC435350, ACH-1625 - інгібітор протеази Achillion Pharmaceuticals, ACH-806 - інгібітор протеази Achillion/Gilead, BI201335 і BILN 2061 - інгібітори протеази Boehringer Ingelheim, SCH 900518/SP900518 (нарлапревір) - інгібітор протеази Schering-Plough, MK-7009 - інгібітор протеази Merck, BMS-650032, BMS-790052 і BMS-791325 - інгібітори протеази Bristol Myeres Squibb, R7227 - інгібітор протеази Roche, PHX1766 - інгібітор протеази Phenomix, AVL-181 інгібітор протеази Avila Therapeutics, биливердин, CTS-1027 - інгібітор протеази Roche Biosciences, VX985 - інгібітор протеази Vertex, VCH-759 і VCH-917 - інгібітори протеази Virochem/Vertex, IDX-136 і 316 - інгібітори протеази Idenix, ABT-450 - інгібітор протеази Abbott, VBY 376 - інгібітор протеази Virobay; (3) інгібітори інтегрази, включаючи, наприклад: ралтегравір (ISENTRESS), елвітегравір; (4) комбінована терапія інгібіторами нуклеозидними аналогами/нуклеотидними аналогами, атриплу (тенофовір + ембрицитабін + ефавіренц), комбівір (ламівудеїн + зидовудин), (5) інгібітори проникнення і злиття, включаючи, наприклад: маравірок, енфувіртид, докозанол, антитіло до CD4, антитіло до gp120, антитіло до CCR5, антагоністи NS5a HCV: (a) A-831, A-689 і AZD 2836 Arrow Therapeutics, (b) BMS-790052 і BMS824393 Bristol Myers Squibb, (c) GSK-625433 Glaxo Smith Kline, (d) антагоністи NS4a ACH-1095; (5) інгібітори дозрівання, включаючи, наприклад: бевіримат і вівекон; (6) інгібітори вивільнення вірусів, включаючи, наприклад: занамівір (RELENZA), оселтамівір (TAMIFLU), арбідол; (7) підсилювачі імунної відповіді, включаючи, наприклад, інтерферон-α (наприклад, BLX-883 і BLX883 CR Biolex Therapeutics, белерофон Nautilus Biotech, IFN-α тривалої дії, IFN-α SR LG Life Sciences, IFN-α2b CR тривалої дії і IFN-α2b XL Flamel Technologies, пегільований IFN-α (наприклад, ПЕГ-IFN-α-2a, PEGASYS; ПЕГ-IFN-α-2b, PEGINTRON), злитий білок IFN-α2bсироватковий альбумін людини (ALBUFERON); інтерферон-β, включаючи IFN-β-1b (BETASERON), інтерферон-γ, інтерферон-λ, пегільований інтерферон-λ (наприклад, ПЕГ-rIL29 ZymoGenetics/Novo Nordisk), інтерферон-ω/лейкоцитарний інтерферон II (наприклад, Intarcia Therapeutics), агоністи toll-подібного рецептора 7, включаючи іміквімод, ісаторибін і їх пролікарські варіанти (наприклад, ANA-975 і ANA-971) Anadys Pharmaceuticals, оглуфанид (IM862, L-Glu-L-Trp-OH) і їх варіанти, кон'юговані з ліпідами або глікозилом, Implicit Bioscience, NOV-205 (наприклад, Molixan - пептидний противірусний засіб Novelos Therapeutics, Inc.), противірусний EHC18 Enzo Biochem, гамма-D-глутаміл-L-триптофан (наприклад, SCV-07, SciClone Pharmaceuticals/Verta), алоферон (наприклад, алоферон-1-HGVSGHGQHGVHG, алоферон-2-GVSGHGQHGVHG), CPG 10101 - агоніст TLR-9 Coley Pharmaceuticals/Actilon; (8) противірусні синергетичні підсилювачі, тобто які мало виявляють або не виявляють противірусних властивостей по окремості, але посилюють ефект інших противірусних засобів наприклад, хлорохін, сік грейпфрута, гідроксисечовина, лефлуномід, мікофенолова кислота, ресвератрол, ритонавір; а також інші противірусні лікарські засоби, такі як амантадин, едоксудин, фамцикловір (FAMVIR), пенцикловір, фаскарнет, фосфонет, ганцикловір (CYTOVENE, CYMEVENE, VITRASERT), гардасил, ібацитабін, імуновір, мороксидин, нексавір, перамівір, плеконарил, подофілотоксин, рибавірин, римантадин, трифлуридин, тризивір, тромантадин, трувада, валацикловір, валганцикловір, відарабін, і підсилювачі інтерферону, такі як EMZ702 Transition Therapeutics, дигідрохлорид гістаміну (наприклад, Ceplene + IFN-α); і (9) різноманітні або некласифіковані противірусні засоби, такі як: KPE02003002 (артенімол) Kemin Pharmaceuticals, мітохінон - агоніст антіоксиданту коензиму Q10 23 UA 109108 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Antipodean Pharmaceuticals, інгібітори альфа-глюкозидази I (наприклад, MX-3253 - целгосивір Migenix Pharmaceuticals, кастаноспермін, антагоністи глюкокортикоїдів (наприклад, інгібітори IRES HCV, міфепристон, VGX-410C VGX Pharmaceuticals), печіночні агоністи (наприклад, PYN17 Phynova Pharmaceuticals), противірусні засоби на основі традиційної терапії рослинними засобами, наприклад, PYN18 Phynova Pharmaceuticals, інгібітори каспази (наприклад, LB-84451LG Life Sciences, емрикасан - PF-03491390/IDN-6556 Pfizer), аналоги циклоспорину, що інгібують реплікацію вірусів, запобігаючи зв'язування з циклофіліном A (наприклад, SDZ NIM 911 Novartis, Debio-025 Debiopharm), Термін "протигрибковий засіб" включає будь-яку молекулу, що інгібує або припиняє ріст, хвороботворність і/або життєздатність грибів. Термін включає, наприклад, (1) полієнові протигрибкові засоби, такі як натаміїн, римоцидін, філіпін, ністатин, амфотерицин B, кандицин; (2) імідазоли, такі як міконазол, кетоконазол (LOTRIMIN), еконазол, біфоназол, бутоконазол, фентиконазол, ізоконазол, оксиконазол, сертаконазол (ERTACZO), сулконазол, тіоконазол, (3) триазоли, такі як флуконазол, ітраконазол, ісавуконазол, равуконазол, посаконазол, вориконазол, терконазол; (4) аліламіни, такі як тербінафін (LAMISIL), аморолфін, нафтифін (Naftin), бутенафін (LOTRIMIN ULTRA); (5) ехінокандини, такі як анідулафунгін, каспофунгін, мікафунгін, і інші речовини з протигрибковими властивостями, такі як бензойна кислота, циклопікс, флуцитозин, гризеофульвін, генціановий фіолетовий, галопрогін, толнафтат (TINACTIN, DESENEX, AFTATE), ундециленова кислота, олія чайного дерева - ISO 4730 (масло Melaleuca, типу терпінен-4-олу), цитронелова олія, сорго лимонна, апельсинова олія, пальмарозова олія, пачулі, лимонний мирт, німова олія, кокосова олія. Термін "протипротозойний засіб" або "засіб проти найпростіших" включає будь-яку молекулу, що інгібує або припиняє ріст, хвороботворність і/або життєздатність найпростіших організмів. Приклади протипротозойних засобів включають: (1) протималярийние засоби, наприклад, хінін, хінімакс, хінідин, хінімакс, хлорохін (ARALEN), гідроксихлорохін (PLAQUENIL), амодіахін, піриметамін (DARAPRIM), сульфадоксин, прогуаніл, мефлохін (LARIAM), галофантрин, примахін, артемезинін і його похідні (наприклад, артеметер, артенсунат, дигідроартемізинін, артеєтер), кліндаміцин і їх поєднання; (2) інгібітори протеази і лікарські засоби бензнідазол, бупарваквон, карбарсон, кліохінол, дисульфірам, ефлорнітин, еметин, фуразолідон, меглумін антимоніат, меларсопрол, метронідазол (FLAGYL), мілтефосин, ніфуртимокс, нітазоксанід, орнідазол, сульфат паромоміцину, пентамідин, піриметамін (DARAPRIM), секнідазол, тинідазол. Термін "вакцина", використовуваний у даному описі, належить до будь-якого непатогенного імуногену, що у випадку щеплення хазяїну індукує захисний імунітет проти конкретного патогену. Вакцини можуть бути в різних формах. Вакцини можуть являти собою цілі організми, що мають загальні важливі антигени з патогеном, але самі по собі не є патогенними (наприклад, вакцина коров'ячої віспи). Вакцини також можуть бути одержані з вбитих (наприклад, вакцина проти поліомієліту Солка) або послаблених організмів (що втратили здатність викликати захворювання - наприклад, вакцина проти поліомієліту Себіна). Вакцини також можуть бути одержані з очищених макромолекул, виділених з патогенного організму. Наприклад, токсоїдні вакцини (наприклад, проти правця і дифтерії), що містять неактивну форму розчинного бактеріального токсину - які призводять до продукції антитіл проти токсинів, а не до імунітету проти інтактних бактерій. Вакцини на основі субодиниць (наприклад, гепатиту B) містять тільки один імуногенний білок, виділений з представляючого інтерес патогену. Вакцини на основі кон'югату гаптену, в яких деякі вуглеводневі або поліпептидні епітопи, виділені з представляючого інтерес патогену, зв'язані з імуногенним носієм, таким як правцевий анатоксин. У вказаних методиках власне кажучи використовують епітопи як гаптени, щоб індукувати продукцію антитіл, що потім впізнають такий самий епітоп у нативному патогені. Однак для максимальної ефективності такі вакцини повинні включати як B-клітинні, так і Tклітинні епітопи, і T-клітинні епітопи необхідно вибирати так, щоб вони могли бути такими, що впізнаються, презентованими і викликати відповідь імунних систем хазяїнів. У ДНК-вакцинах використовують здатність клітин-хазяїнів захоплювати і експресувати ДНК, що кодують патогенні білки, які ін'єктують внутрішньом'язово. Прикладами противірусних вакцин, які можна використовувати в поєднанні з антитілами до PD-L1 у способах, описаних у даній публікації, є: HCV-вакцина (вірасом) Pevion Biotech., TG4040 (MVA-HCV Transgene viron, призначена для посилення клітинної (цитотоксичних T-лімфоцитів CD4+ і CD8+) імунної відповіді проти NS3, NS4 і NS5B, CHRONVAC - ДНК-вакцина N53/4a з оптимізованими кодонами Inovio Biomedical, HCV/CpG-вакцини Novartis, GI-5005-HCV-вакцина Globeimmune, суміш синтетичних пептидів IC41, що мають HCV-епітопи для T-клітин CD4 і CD8, у поєднанні з полі-L-аргініном, Intercell. 24 UA 109108 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Відповіді хазяїна на імуногени можуть бути посилені, якщо їх вводять у суміші з ад'ювантами. Імунні ад'юванти функціонують одним або більше з наступних шляхів: (1) продовжують термін утримування імуногена, (2) збільшують ефективний розмір імуногена (і, відповідно, стимулюють фагоцитоз і презентацію макрофагам), (3) стимулюють приплив макрофагів або інших імунних клітин до місця ін'єкції або (4) стимулюють локальну продукцію цитокінів і інших імунологічних активностей. Приклади ад'ювантів включають: повний ад'ювант Фрейнда (CFA), солі алюмінію й одержані з мікобактерій білки, такі як мураміліди- або трипептиди. Термін "антитіло" включає моноклональні антитіла (включаючи повнорозмірні антитіла, що мають Fc-ділянку імуноглобуліну), композиції антитіл з поліепітопною специфічністю, поліспецифічні антитіла (наприклад, біспецифичні антитіла, діатіла й одноланцюжкові молекули, а також фрагменти антитіл (наприклад, Fab, F(ab") 2 і Fv). Термін "імуноглобулін" (Ig) використовують у даному описі взаємозамінно з терміном "антитіло". Основна 4-ланцюжкова одиниця антитіла являє собою гетеротетрамерний глікопротеїн, що складається з двох ідентичних легких (L) ланцюгів і двох ідентичних важких (H) ланцюгів. IgMантитіло складається з 5 основних гетеротетрамерних одиниць разом з додатковим поліпептидом, що називається J-ланцюгом, і містить 10 антигензв'язувальних ділянок, тоді як IgA-антитіла містять 2-5 основних 4-ланцюжкових одиниць, що можуть полімеризуватися з утворенням полівалентних блоків у поєднанні з J-ланцюгом. У випадку IgG 4-ланцюжкова одиниця зазвичай складає приблизно 150000 дальтон. Кожен L-ланцюг зв'язаний з H-ланцюгом одним ковалентним дисульфідним зв'язком, тоді як два H-ланцюги зв'язані один з одним одним або більше дисульфідними зв'язками, залежно від ізотипу H-ланцюга. Кожен H- і L-ланцюг також має регулярно розташовані внутрішньоланцюжкові дисульфідні містки. Кожен H-ланцюг має на N-кінці варіабельний домен (VH), за яким ідуть три константні домени (CH) для кожного α- і γланцюгів і чотири CH-домени для μ- і ε-ізотипів. Кожен L-ланцюг має на N-кінці варіабельний домен (VL), за яким іде константний домен на його іншому кінці. VL розташований вздовж VH, а CL розташований уздовж першого константного домену важкого ланцюга (C H1). Вважають, що конкретні амінокислотні залишки утворюють зону контакту між варіабельними доменами легкого ланцюга і важкого ланцюга. Спарювання VH і VL разом створює одну антигензв'язувальну ділянку. Структуру і властивості різних класів антитіл, див., наприклад, у публікації Basic and th Clinical Immunology, 8 Edition, Daniel P. Sties, Abba I. Terr and Tristram G. Parsolw (eds), Appleton and Lange, Norwalk, CT, 1994, page 71 and Chapter 6. L-ланцюг будь-якого виду хребетних може бути віднесений до одного з двох типів, що явно відрізняються, які називаються каппа і лямбда, на підставі амінокислотних послідовностей їх константних доменів. Залежно від амінокислотної послідовності константного домену важких ланцюгів (CH) імуноглобуліни можуть бути віднесені до різних класів або ізотипів. Існує п'ять класів імуноглобулінів: IgA, IgD, IgE, IgG і IgM, що мають важкі ланцюги, які позначаються α, δ, ε, γ і μ, відповідно. Класи γ і α додатково поділяють на підкласи на підставі відносно невеликих розходжень у послідовності CH і функції, наприклад, у людини експресуються наступні підкласи: IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3, IgG4, IgA1 і IgA1. "Виділеним" антитілом є антитіло, що було ідентифіковане, відділене і/або витягнуте з компонентів середовища, в якому воно одержане (наприклад, природного або рекомбінантного). Переважно, виділений поліпептид не асоційований з усіма іншими компонентами середовища, в якому він одержаний. Забруднюючими компонентами середовища його одержання, такими як компоненти з рекомбінантних трансфікованих клітин, є речовини, що можуть заважати дослідницьким, діагностичним або терапевтичним застосуванням антитіла, і можуть включати ферменти, гормони й інші білкові або небілкові розчинені речовини. У переважних варіантах здійснення винаходу поліпептид буде очищений: (1) у ступені, що складає більше ніж 95 мас. % антитіла, що визначають, наприклад, способом Лоурі, і в деяких варіантах більше ніж 99 мас. %, (2) у такому ступені, що достатній для одержання щонайменше 15 залишків N-кінцевої або внутрішньої амінокислотної послідовності з використанням секвенатору з обертальним циліндром або (3) до гомогенності за оцінкою в SDS-PAGE у встановлюваних або не відновлюваних умовах з використанням фарбування Кумассі синім або, переважно, сріблом. Виділене антитіло включає антитіло, що знаходиться in situ у рекомбінантних клітинах, тому що щонайменше один компонент із природного середовища антитіла не буде присутній. Однак зазвичай виділений поліпептид або антитіло можуть бути одержані щонайменше за допомогою однієї стадії очищення. "Варіабельна ділянка" або "варіабельний домен" антитіла належить до аміноконцевих доменів важкого або легкого ланцюга антитіла. Варіабельні домени важкого ланцюга і легкого ланцюга можуть бути названі "VH" і "VL", відповідно. Такі домени зазвичай є найбільше 25 UA 109108 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 варіабельними частинами антитіла (відносно інших антитіл такого ж класу) і містять антигензв'язувальні ділянки. Термін "варіабельний" належить до того факту, що деякі частини варіабельних доменів у значній мірі розрізняються за послідовністю серед антитіл. V-домен опосередковує зв'язування антигену і визначає специфічність конкретного антитіла відносно його конкретного антигену. Однак варіабельність нерівномірно розподілена за довжиною варіабельних доменів. Навпаки, вона сконцентрована в трьох ділянках, що називаються гіперваріабельними ділянками (HVR), у варіабельних доменах як легкого ланцюга, так і важкого ланцюга. Більш високо консервативні частини варіабельних доменів називають каркасними ділянками (FR). Кожний з варіабельних доменів нативних важкого і легкого ланцюгів містить чотири ділянки FR, в основному такі, що приймають конфігурацію β-шарів, з'єднаних трьома HVR, що утворюють петлі, які зв'язують, а в деяких випадках утворюючі частину бета-шарової структури. HVR у кожному ланцюзі утримуються разом у безпосередній близькості ділянками FR і з HVR з іншого ланцюга вносять вклад в утворення антигензв'язувальної ділянки антитіл (див. Kabat et al., Sequences of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Константні домени безпосередньо не задіяні в зв'язування антитіла з антигеном, але виявляють різні ефекторні функції, такі як участь антитіла в залежній від антитіл клітинній токсичності. Термін "моноклональне антитіло", використовуваний у даному описі, належить до антитіла, одержаного з популяції власне кажучи гомогенних антитіл, тобто окремі антитіла, що складають популяцію, є ідентичними, за винятком можливих природних мутацій і/або посттрансляційних модифікацій (наприклад, ізомеризації, амідування), що можуть бути присутніми у мінорних кількостях. Моноклональні антитіла є високо специфічними, будучи спрямованими проти однієї антигенної ділянки. На відміну від препаратів поліклональних антитіл, що зазвичай містять різні антитіла, спрямовані проти різних детермінант (епітопів), кожне моноклональне антитіло спрямоване проти однієї детермінанти на антигені. Крім своєї специфічності, моноклональні антитіла мають перевагу, що полягає в тому, що вони синтезуються в культурі гібридом, не містять домішок інших імуноглобулінів. Визначення "моноклональне" вказує на природу антитіла як антитіла, одержаного з власне кажучи гомогенної популяції антитіл, і його не слід розглядати як антитіло, що потребує одержання, будь-яким конкретним способом. Наприклад, моноклональні антитіла, використовувані згідно із даним винаходом, можуть бути одержані різними способами, включаючи, наприклад, спосіб на основі гібридом (наприклад, Kohler and Milstein, Nature, 256:495-97 (1975); Hongo et al., Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow et al., nd Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2 ed. 1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)), способи на основі рекомбінантної ДНК (див., наприклад, патент США № 4816567), способи на основі фагового дисплея (див., наприклад, Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); and Lee et al., J. Immunol. Methods 284 (1-2): 119-132 (2004) і способи одержання антитіл людини або антитіл, подібних до антитіл людини, у тварин, що мають частини або повні локуси імуноглобулінів людини, або гени, що кодують послідовності імуноглобулінів людини (див., наприклад, WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993); патенти США №№ 5545807; 5545806; 5569825; 5625126; 5633425; і 5661016; Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996); і Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995). Термін "голе антитіло" належить до антитіла, що не кон'юговане з цитотоксичним залишком або радіоактивною міткою. Терміни "повнорозмірне антитіло", "інтактне антитіло" або "ціле антитіло" використовують взаємозамінно відносно антитіла власне кажучи в його інтактній формі, на противагу фрагменту антитіла. Зокрема, цілі антитіла включають антитіла з важкими і легкими ланцюгами, включаючи Fc-ділянку. Константні домени можуть являти собою константні домени з нативною послідовністю (наприклад, константні домени з нативною послідовністю людини) або їх варіанти за амінокислотною послідовністю. У деяких випадках інтактне антитіло може мати одну або більше ефекторних функцій. "Фрагмент антитіла" містить частину інтактного антитіла, переважно антигензв'язувальну і/або варіабельну ділянку інтактного антитіла. Приклади фрагментів антитіла включають фрагменти Fab, Fab", F(ab")2 і Fv; діатіла, лінійні антитіла (див. патент США 5641870, приклад 2; 26 UA 109108 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Zapata et al, Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]); одноланцюжкові молекули антитіл і поліспецифічні антитіла, утворені з фрагментів антитіл. Розщеплення антитіл папаїном дає два ідентичні антигензв'язувальні фрагменти, що називаються "Fab»-фрагментами, і інший фрагмент "Fc", позначення якого відображає здатність легко кристалізуватися. Fab-фрагмент складається з повного L-ланцюга разом з доменом варіабельної ділянки H-ланцюга (VH) і першого константного домену одного важкого ланцюга (CH1). Кожен Fab-фрагмент є моновалентним відносно зв'язування антигену, тобто він має одну антигензв'язувальну ділянку. Обробка антитіла пепсином дає один великий F(ab") 2-фрагмент, що приблизно відповідає двом зв'язаним дисульфідом Fab-фрагментам, які мають різну антигензв'язувальну активність, і ще здатний перехресно зв'язувати антиген. Fab'-фрагменти відрізняються від Fab-фрагментів наявністю декількох додаткових залишків на карбоксильному кінці домену C H1, включаючи один або більше цистеїнів із шарнірної ділянки антитіла. Fаb'-SH у даному описі є позначенням Fab", вякому залишок(ки) цистеїну константних доменів несуть вільну тіольну групу. F(ab") 2фрагменти антитіл початково були одержані у вигляді пари Fab'-фрагментів, між якими були присутні цистеїни шарніру. Також відомі інші хімічні сполуки фрагментів антитіл. Fc-фрагмент містить частини карбоксильних кінців обох H-ланцюгів, що утримуються разом дисульфідами. Ефекторні функції антитіл визначаються послідовностями в Fc-ділянці, ділянці, що також розпізнається Fc-рецепторами (Fc), знайденими на деяких типах клітин. Фрагмент "Fv" є мінімальним фрагментом антитіла, що містить повний сайт впізнавання і зв'язування антигену. Такий фрагмент складається з димеру одного домену варіабельної ділянки важкого ланцюга й одного домену варіабельної ділянки легкого ланцюга в тісній нековалентній асоціації. У результаті фолдингу таких двох доменів утворюються шість гіперваріабельних петель (по 3 петлі з кожного H і L ланцюга), що надають амінокислотні залишки для зв'язування антигену і надають антитілу специфічність зв'язування антигену. Однак навіть один варіабельний домен (або половина Fv, що містить тільки три HVR, специфічні відносно антигену) має здатність впізнавати і зв'язувати антиген, хоча зазвичай з більш низькою афінністю, ніж повна ділянка зв'язування. "Одноланцюжкові Fv", що також скорочено називаються "sFv" або "scFv", являють собою фрагменти антитіл, що містять VH- і VL-домени антитіла, зв'язані в одному поліпептидному ланцюзі. Переважно, sFv-поліпептид додатково містить поліпептидний лінкер між доменами VH і VL, що дозволяє sFv утворювати структуру, необхідну для зв'язування антигену. Огляд, присвячений sFv, див. у публікації Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994). "Функціональні фрагменти" антитіл відповідно до винаходу містять частину інтактного антитіла, зазвичай включаючи антигензв'язувальну або варіабельну ділянку інтактного антитіла або Fc-ділянку антитіла, що зберігає або має модифіковану здатність зв'язувати FcR. Приклади фрагментів антитіл включають лінійне антитіло, молекули одноланцюжкових антитіл і поліспецифічні антитіла, утворені з фрагментів антитіл. Термін "діатіла" належить до невеликих фрагментів антитіл, одержаних за допомогою конструювання sFv-фрагментів (див. попередній абзац) з короткими лінкерами (приблизно 5-10 залишків) між доменами VH і VL, так щоб досягти міжланцюжкового, а не внутрішньоланцюжкового спарювання V-доменів, з одержанням при цьому бівалентного фрагмента, тобто фрагмента, що має дві антигензв'язувальні ділянки. Біспецифичні діатіла є гетеродимерами двох "схрещених" sFv-фрагментів, в яких домени VH і VL двох антитіл присутні в різних поліпептидних ланцюгах. Діатіла більш докладно описані, наприклад, у EP 404097, WO 93/11161, Hollinger et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993). Моноклональні антитіла відповідно до винаходу, зокрема, включають "химерні" антитіла (імуноглобуліни), в яких частина важкого і/або легкого ланцюга ідентична або гомологічна відповідним послідовностям в антитілах, одержаних від конкретного виду або відносно до конкретного класу або підкласу антитіл, при цьому інша частина ланцюга (ланцюгів) ідентична або гомологічна відповідним послідовностям в антитілах, одержаних від іншого виду або відносно до іншого класу або підкласу антитіл, а також фрагменти таких антитіл, за умови, що вони виявляють необхідну біологічну активність (патент США № 4816567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855 (1984)). Антитіла, що представляють інтерес, згідно з винаходом включають приматизовані (PRIMATIZED) антитіла, в яких антигензв'язувальна ділянка антитіла одержана з антитіла, продукованого, наприклад, при імунізації макак антигеном, що представляє інтерес. Використовуваний у даному описі термін "гуманізоване антитіло" використовують для підгрупи "химерних антитіл". "Гуманізовані" форми антитіл тварин, відмінних від людини (наприклад, мишей), являють собою химерні антитіла, що містять мінімальну послідовність, одержану з імуноглобуліну 27 UA 109108 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 тварини, відмінної від людини. В одному варіанті здійснення винаходу гуманізоване антитіло являє собою імуноглобулін людини (реципієнтне антитіло), в якому залишки з HVR (визначення наведене нижче) реципієнта замінені залишками з HVR виду, відмінного від людини (донорне антитіло), такого як миша, щур, кролик або примат, відмінний від людини, що має необхідну специфічність, афінність і/або ємністю. У деяких випадках залишки каркаса (FR) імуноглобуліну людини заміняють відповідними залишками тварини, відмінної від людини. Крім того, гуманізовані антитіла можуть містити залишки, що не зустрічаються ні в реципієнтному антитілі, ні в донорному антитілі. Такі модифікації можуть бути здійснені для того, щоб додатково підвищити ефективність антитіла, наприклад, афінність зв'язування. Як правило, гуманізоване антитіло буде містити власне кажучи всі з щонайменше одного і зазвичай двох варіабельних доменів, в яких всі або власне кажучи всі гіперваріабельні петлі відповідають петлям послідовності імуноглобуліну тварини, відмінної від людини, і всі або власне кажучи всі ділянки FR є ділянками FR з послідовності імуноглобуліну людини, хоча ділянки FR можуть містити одну або більше замін окремих залишків FR, що поліпшують ефективність антитіла, наприклад, афінність зв'язування, ізомеризацію, імуногенність і т.д. Кількість таких амінокислотних замін у FR зазвичай складає не більше 6 у H-ланцюзі і не більше 3 у L-ланцюзі. Гуманізоване антитіло необов'язкове також буде містити щонайменше частину константної ділянки імуноглобуліну (Fc), зазвичай константної ділянки імуноглобуліну людини. Більш докладний опис див. у публікаціях Jones et al, Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); і Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992). Див. також, наприклад, публікації Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech., 5:428-433 (1994); і патенти США №№ 6982321 і 7087409. "Людським антитілом" є антитіло, що має амінокислотну послідовність, яка відповідає амінокислотній послідовності антитіла, продукованого в організмі людини і/або одержаного з використанням будь-якого способу одержання людських антитіл, що описаний у даній публікації. Таке визначення людського антитіла спеціально включає гуманізоване антитіло, що містить антигензв'язувальні залишки тварини, відмінної від людини. Людські антитіла можуть бути одержані з використанням різних способів, відомих у даній галузі, включаючи бібліотеки у фаговому дисплеї. Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991). Також придатними для одержання людських моноклональних антитіл є способи, описані в публікаціях Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991). Див. також van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5: 368-74 (2001). Людські антитіла також можуть бути одержані введенням антигену трансгенній тварині, що була модифікована для одержання таких антитіл у відповідь на антигенну стимуляцію, але ендогенні локуси в якій були зроблені недієздатними, наприклад, імунізована ксеномиша (див., наприклад, патенти США №№ 6075181 і 6150584 у відношенні методики XENOMOUSE). Див. також, наприклад, публікацію Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006) у відношенні людських антитіл, створених з використанням методики гібридом B-клітин людини. Термін "гіперваріабельна ділянка", "HVR" або "HV" при використанні в даному описі належить до ділянок варіабельного домену антитіла, що є гіперваріабельними за послідовністю і/або утворюють структурно обмежені петлі. Як правило, антитіла містять шість HVR; три в VH (H1, H2, H3) і три в VL (L1, L2, L3). У нативних антитілах H3 і L3 виявляють найбільше різноманіття шести HVR, і зокрема, вважають, що H3 відіграє унікальну роль у наданні високої специфічності антитілам. Див., наприклад, публікації Xu et al., Immunity 13:37-45 (2000); Johnson and Wu, у Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003). Дійсно, природні антитіла камелід, що складаються тільки з важкого ланцюга, є функціональними і стабільними під час відсутності легкого ланцюга. Див., наприклад, публікації Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993); Sheriff et al., Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996). Використовують кілька варіантів визначення границь HVR, і вони розглядаються в даному описі. Ділянки, що визначають комплементарність (CDR) відповідно до системи Kabat основані на варіабельності послідовностей і найбільш широко використовуються (Kabat et al., Sequences th of Proteins of Immunological Interest, 5 Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). Замість цього Chothia розглядає положення структурних петель (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). HVR AbМ являють собою компроміс між HVR згідно з Kabat і структурними петлями згідно з Chothia і використовуються в комп'ютерній програмі для моделювання антитіл AbМ Oxford Molecular. "Контактні" HVR основані на аналізі наявних кристалічних структур комплексів. Залишки для кожної з таких HVR вказані нижче. 28