Гуманізоване антитіло до фактора d і його застосування

Реферат: Винахід належить до гуманізованого моноклонального антитіла до фактора D людини. Також, винахід належить до клітини-хазяїна, вектора, що несуть ці антитіла, і їх застосування для одержання композицій і лікарських засобів для лікування захворювань і порушень, асоційованих з надлишковою або неконтрольованою активацією системи комплементу, таких, як очне захворювання. UA 101603 C2 (12) UA 101603 C2 UA 101603 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Рівень техніки Система комплементу відіграє центральну роль у процесах кліренсу імунних комплексів і імунної відповіді на інфекційні агенти, чужорідні агенти, інфіковані вірусом клітини і пухлинних клітин. Однак комплемент також задіяний у патологічне запалення і в аутоімунні захворювання. Таким чином, інгібування надлишкової або неконтрольованої активації каскаду комплементу могло б принести клінічну користь пацієнтам з такими захворюваннями і станами. Система комплементу охоплює два окремі шляхи активації, що називаються класичним і альтернативним шляхами (V.M. Holers, In Clinical Immunology: Principles and Practice, ed. R.R. Rich, Mosby Press; 1996, 363-391). Класичний шлях являє собою кальцій/магній-залежний каскад, що зазвичай активується за рахунок утворення комплексів антиген-антитіло. Альтернативний шлях являє собою магній-залежний каскад, що активується шляхом депонування та активації C3 на визначених чутливих поверхнях (наприклад, на полісахаридах клітинної стінки дріжджів і бактерій, і на визначених біополімерних матеріалах). Активація шляху комплементу генерує біологічно активні фрагменти білків комплементу, наприклад, анафілатоксинів C3a, C4a і C5a і мембраноатакуючих комплексів C5b-9 (MAC), які опосередковують активності запалення, що включають хемотаксис лейкоцитів, активацію макрофагів, нейтрофілів, тромбоцитів, опасистих клітин і ендотеліальних клітин, проникність судин, цитоліз і ушкодження тканин. Фактор D являє собою високоспецифічну серинову протеазу, необхідну для активації альтернативного шляху комплементу. Вона розщеплює фактор B, зв'язаний з C3b, генеруючи фермент C3b/Bb, що є активним компонентом конвертаз C3/C5 альтернативного шляху. Фактор D може являти собою придатну мішень для інгібування, оскільки його концентрація в плазмі людей є дуже низької (1,8 мкг/мл), і було показано, що він є обмежуючим ферментом для активації альтернативного шляху комплементу (P.H. Lesavre and H.J. Müller-Eberhard. J. Exp. Med., 1978; 148: 1498-1510; J.E. Volanakis et al., New Eng. J. Med., 1985; 312: 395-401). Було продемонстровано на тваринах-моделях і в дослідженнях ex vivo, що пригнічення (даун-регуляція) активації системи комплементу є ефективним при лікуванні деяких симптомів захворювань, наприклад, при системному червоному вовчаку і гломерулонефриті (Y. Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci.; 1996, 93: 8563-8568), ревматоїдному артриті (Y. Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 1995; 92: 8955-8959), штучному кровообізі і гемодіалізі (C.S. Rinder, J. Clin. Invest, 1995; 96: 1564-1572), надгострому відторгненні при трансплантації органів (T.J. Kroshus et al., Transplantation, 1995; 60: 1194-1202), інфаркті міокарда (J.W. Homeister et al., J. Immunol., 1993; 150: 1055-1064; H.F. Weisman et al., Science, 1990; 249: 146-151), реперфузионном ушкодженні (E.A. Amsterdam et al., Am. J. Physiol., 1995; 268: H448-H457) і при синдромі порушення подиху в дорослих (R. Rabinovici et al., J. Immunol., 1992; 149: 1744-1750). Крім того, інші запальні стани і захворювання аутоімунного/імунного комплексу також тісно асоційовані з активацією системи комплементу (V.M. Holers, ibid., B.P. Morgan. Eur. J. Clin. Invest, 1994: 24: 219-228), включаючи термічне ушкодження, важкий астматичний стан, анафілактичний шок, запалення кишечнику, кропивницю, агніоедему, васкуліт, розсіяний склероз, міастенію гравіс, мембранопроліферативний гломерулонефрит і синдром Шегрена. Існує потреба в терапії за допомогою антитіл в області порушень, опосередкованих системою комплементу, і гуманізовані антитіла за даним винаходом являють собою високоафінні антитіла, використовувані для задоволення цієї потреби. Суть винаходу Даний винахід стосується, в основному, антитіл, що включають послідовності варіабельних доменів важкого ланцюга і легкого ланцюга мишачого антитіла 166-32, що являє собою антитіло, здатне до інгібування біологічних активностей, асоційованих з фактором D. Наприклад, можна спостерігати істотне інгібування активності альтернативного шляху комплементу при концентрації, що складає 18 мкг/мл (еквівалентне приблизно перевищенню в 1,5 рази молярної концентрації фактора D у крові; молярне співвідношення антитіла до фактора D і фактора D складає приблизно 1,5:1) (див., наприклад, патент США № 6956107). Даний винахід також стосується гуманізованих антитіл мишачого антитіла MAb 166-32. Винахід включає амінокислотні послідовності варіабельних ділянок важкого і легкого ланцюга антитіл і їх відповідні нуклеотидні послідовності. Інший варіант здійснення винаходу включає послідовності CDR цих антитіл. Інший варіант здійснення даного винаходу включає композиції, що включають антитіло за винаходом. В іншому варіанті здійснення винахід представляє клітинні лінії і вектори, що несуть послідовності антитіл за даним винаходом. В одному аспекті винахід включає спосіб одержання антитіл і композицій за винаходом. 1 UA 101603 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Іншим варіантом здійснення даного винаходу є застосування цих гуманізованих антитіл для одержання лікарського засобу або композиції для лікування порушень, асоційованих з надлишковою або неконтрольованою активацією системи комплементу. Вони включають активацію системи комплементу під час операцій штучного кровообігу; активацію системи комплементу з причини ішемії-реперфузії після гострого інфаркту міокарда, аневризми, інсульту, геморагічного шоку, ушкодження з розтрощенням тканин, поліорганної недостатності, гіповолемічного шоку, кишкової ішемії або інших подій, що викликають ішемію. Також було показано, що активація системи комплементу асоційована з запальними станами, такими як важкі опіки, ендотоксемія, септичний шок, синдром порушення подиху у дорослих, гемодіаліз; анафілактичний шок, важкий астматичний стан, ангіоедема, хвороба Крона, серпоподібноклітинна анемія, постстрептококовий гломерулонефрит і панкреатит. Порушення може бути результатом побічної дії лікарського засобу, алергії на лікарський засіб, індукованого за допомогою IL-2 синдрому просочування з судин або алергії на рентгеноконтрастні засоби. Порушення також включає аутоімунне захворювання, таке як системний червоний вовчак, міастенія гравіс, ревматоїдний артрит, хвороба Альцгеймера і розсіяний склероз. Активація системи комплементу також асоційована з відторгненням трансплантата. Активація системи комплементу також асоційована з очними захворюваннями, такими як вікова дегенерація жовтої плями, діабетична ретинопатія. Короткий опис фігур На фіг.1A і 1B зображена амінокислотна послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга мишачого антитіла MAb 166-32 (фіг.1A) і варіабельної ділянки легкого ланцюга (фіг.1B). На фіг.2A і 2B зображена нуклеотидна послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга мишачого антитіла MAb 166-32 (фіг.2A) і варіабельної ділянки легкого ланцюга (фіг.2B). На фіг.3 зображене порівняння важкого ланцюга мишачого антитіла MAb 166-32. На фіг.4 зображене порівняння легкого ланцюга мишачого антитіла MAb 166-32. На фіг.5 зображені амінокислотні послідовності варіабельної ділянки важкого ланцюга і варіабельної ділянки легкого ланцюга для кожного клону #56, #111, #250 і #416 гуманізованого антитіла. На фіг.6 зображені результати гемолітичного аналізу для клонів #56, #111, #250 і #416 гуманізованого антитіла Fab. На фіг.7 зображено інгібування активності альтернативного шляху комплементу за допомогою клонів #56, #111, #250 і #416 гуманізованого антитіла Fab. На фіг.8A-B (консенсусні каркасні ділянки варіабельних ділянок важкого ланцюга (VH)) і фіг.9A-B (консенсусні каркасні ділянки варіабельних ділянок легкого ланцюга (VL)) зображені характерні акцепторні людські консенсусні каркасні послідовності, що можуть бути використані в практичному застосуванні даного винаходу з наступними ознаками послідовностей: (фіг.8A-B) підгрупа I людських консенсусних каркасних послідовностей VH під час відсутності CDR-ділянок за Kabat (SEQ ID NO: 28), підгрупа I людських консенсусних каркасних послідовностей VH під час відсутності протяжних гіперваріабельних ділянок (SEQ ID NO: 29-31), підгрупа II людських консенсусних каркасних послідовностей VH під час відсутності CDR-ділянок за Kabat (SEQ ID NO: 32), підгрупа II людських консенсусних каркасних послідовностей VH під час відсутності протяжних гіперваріабельних ділянок (SEQ ID NO: 33-35), підгрупа III людських консенсусних каркасних послідовностей VH під час відсутності CDR-ділянок за Kabat (SEQ ID NO: 36), підгрупа III людських консенсусних каркасних послідовностей VH під час відсутності протяжних гіперваріабельних ділянок (SEQ ID NO: 37-39), підгрупа VII людських консенсусних каркасних послідовностей VH під час відсутності CDR-ділянок за Kabat (SEQ ID NO: 55), підгрупа VII людських консенсусних каркасних послідовностей VH під час відсутності протяжних гіперваріабельних ділянок (SEQ ID NO: 56-58), підгрупа людської акцепторної каркасної ділянки VH під час відсутності CDR-ділянок за Kabat (SEQ ID NO: 40), підгрупа людської акцепторної каркасної ділянки VH під час відсутності протяжних гіперваріабельних ділянок (SEQ ID NO: 4142), підгрупа 2 людські акцепторні каркасні ділянки VH під час відсутності CDR-ділянок за Kabat (SEQ ID NO: 43) і підгрупа 2 людські акцепторні каркасні ділянки VH під час відсутності протяжних гіперваріабельних ділянок (SEQ ID NO: 44-46) і (Фіг.9A-B) підгрупа I людського консенсусного каркасної ділянки ланцюга VL каппа (SEQ ID NO: 47), підгрупа ІІ людської консенсусної каркасної ділянки ланцюга VL каппа (SEQ ID NO: 48), підгрупа III людського консенсусного каркасної ділянки ланцюга каппа (SEQ ID NO: 49) і підгрупа IV людського консенсусного каркасної ділянки ланцюга каппа (SEQ ID NO: 50). 2 UA 101603 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Докладний опис винаходу Визначення Терміни, використовувані за всім текстом заявки, варто тлумачити за допомогою звичайного і типового значення для фахівців у даній галузі. Однак авторам даного винаходу бажано, щоб наступним термінам були дані конкретні визначення, як визначено нижче. Фраза "власне кажучи ідентичний" відносно поліпептидної послідовності ланцюга антитіла може бути витлумачена як ланцюг антитіла, ідентичний еталонній поліпептидній послідовності щонайменше на 70 % або на 80 %, або на 90 % або на 95 %. Термін "відносно нуклеотидної послідовності" може бути витлумачений як послідовність нуклеотидів, ідентична еталонній нуклеотидній послідовності щонайменше приблизно на 85 % або на 90 %, або на 95 %, або на 97 %. Термін "ідентичність" або "гомологія" варто тлумачити як позначення відсотку амінокислотних залишків у кандидатній послідовності, що ідентичні залишку відповідної послідовності, з яким її порівнюють, після вирівнювання послідовностей і введення пробілів, якщо необхідно, для досягнення максимального відсотка ідентичності з цільною послідовністю, і не розглядаючи ніяких консервативних замін у вигляді частини ідентичності послідовності. Ні Nкінцеві, ні C-кінцеві подовження, ні вставки не слід тлумачити як такі, що зменшують ідентичність або гомологію. Методи і комп'ютерні програми для вирівнювання добре відомі в даній галузі. Ідентичність послідовності може бути вимірювана з використанням пакета програмного забезпечення для аналізу послідовностей. Термін "антитіло" використовується в широкому сенсі і, конкретно, охоплює моноклональні антитіла (включаючи повнорозмірні моноклональні антитіла), поліклональні антитіла і мультиспецифічні антитіла (наприклад, біспецифічні антитіла). Антитіла (Ab) і імуноглобуліни (IgG) являють собою глікопротеїни, що мають однакові структурні характеристики. У той час як антитіла демонструють специфічність зв'язування зі специфічною мішенню, імуноглобуліни включають як антитіла, так і інші антитіло-подібні молекули, що позбавлені специфічності до мішені. Нативні антитіла й імуноглобуліни зазвичай являють собою гетеротетрамерні глікопротеїни молекулярної маси, що складає приблизно 150000 дальтон, що складаються з двох ідентичних легких (L) ланцюгів і двох ідентичних важких (H) ланцюгів. Кожен важкий ланцюг містить на одному кінці варіабельний домен (V H), за яким ідуть константні домени. Кожен легкий ланцюг містить на одному кінці варіабельний домен (V L) і константні домени на його іншому кінці. Як використовується в даному описі, термін "антитіло до фактора D людини" позначає антитіло, що специфічно зв'язується з фактором D людини таким чином, щоб інгібувати або власне кажучи зменшувати активацію системи комплементу. Термін "варіабельний" у контексті варіабельного домену антитіл означає той факт, що певні ділянки варіабельних доменів істотно відрізняються серед антитіл за послідовністю і використовуються при зв'язуванні і визначенні специфічності кожного конкретного антитіла для його конкретної мішені. Однак варіабельність не розподілена рівномірно за варіабельними доменами антитіл. Вона концентрується в трьох сегментах, що називаються ділянками, які визначають комплементарність (CDR), також відомими як гіперваріабельні ділянки (HVR) у варіабельних доменах як легкого ланцюга, так і важкого ланцюга. Більш висококонсервативні ділянки називають каркасними ділянками (FR). Кожний з варіабельних доменів нативних важких і легких ланцюгів включає чотири FR-ділянки, які по більшій частині приймають конфігурацію листа, зв'язаних трьома ділянками CDR, що утворюють петлі, що зв'язують і, у деяких випадках, що утворюють частину структури -листа. Ділянки CDR у кожному ланцюзі містяться разом у тісній близькості з ділянками CDR з іншого ланцюга за допомогою FR-ділянок, сприяючи утворенню сайту зв'язування антитіл з мішенню (див. публікацію Kabat et al.). Як використовується в даному описі, нумерацію амінокислотних залишків імуноглобулінів проводять відповідно до системи нумерації амінокислотних залишків імуноглобулінів за Kabat et al., (Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institute of Health, Bethesda, Md. 1987), якщо не вказано інакше. Термін "гіперваріабельна ділянка", "HVR" або "HV", при використанні в даному описі, стосується ділянок варіабельного домену антитіла, що є гіперваріабельними за послідовністю і/або утворюють визначені структурою петлі. Як правило, антитіла включають шість гіперваріабельних ділянок: три в області VH (H1, H2, H3) і три в області VL (L1, L2, L3). Використовується ряд описів гіперваріабельних ділянок, що включені в даний документ. Ділянки, що визначають комплементарність за Kabat (CDR), визначаються на основі варіабельності послідовності і мають широке застосування (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. 3 UA 101603 C2 5 (1991)). Chothia замість цього використовує позначення локалізації структурних петель (Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Гіперваріабельні ділянки антитіла Ab являють собою компроміс між визначенням CDR за Kabat і визначенням структурних шпильок за Chothia і використовуються в Оксфордському пакеті програмного забезпечення для молекулярного моделювання антитіл Ab. "Контактні" гіперваріабельні ділянки визначаються на основі аналізу доступних кристалічних структур комплексів. Залишки кожної з цих гіперваріабельних ділянок вказані нижче. Петля L1 L2 L3 H1 H1 15 20 25 30 35 40 45 50 H31-H35 H2 H3 10 Kabat L24-L34 L50-L56 L89-L97 H31-H35B H50-H65 H95-H102 AbM L24-L34 L50-L56 L89-L97 H26-H35B (Нумерація за Kabat) H26-H35 (Нумерація за Chothia) H50-H58 H95-H102 Chothia L26-L32 L50-L52 L91-L96 H26-H32 Контакт L30-L36 L46-L55 L89-L96 H30-H35B H26-H32 H30-H35 H53-H55 H96-H101 H47-H58 H93-H101 Гіперваріабельні ділянки можуть включати наступні "протяжні гіперваріабельні ділянки": 2436 або 24-34 (L1), 46-56 або 50-56 (L2) і 89-97 (L3) у VL і 26-35 (H1), 50-65 або 49-65 (H2) і 93102, 94-102 або 95-102 (H3) у VH. Залишки варіабельних доменів пронумеровані згідно з Kabat et al., як описано вище, для кожного з цих класів. Залишки "каркасної ділянки" або "FR-ділянки" являють собою залишки варіабельного домену, відмінні від залишків гіперваріабельної ділянки або від залишків ділянки CDR, визначених у даному описі. Термін "нумерація за Kabat залишків варіабельного домену" або "нумерація за Kabat положення амінокислоти" і їх варіації означає систему нумерації, використовувану для варіабельних доменів важкого ланцюга або варіабельних доменів легкого ланцюга в компіляції антитіл за Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991). При використанні цієї системи нумерації дійсна лінійна амінокислотна послідовність може містити меншу кількість амінокислот або додаткові амінокислоти, що відповідають укороченим FR- або CDR-ділянкам варіабельного домену або вставкам у FR- або CDR-ділянки варіабельного домену. Наприклад, варіабельний домен важкого ланцюга може включати одну амінокислотну вставку (залишок 52a згідно з Kabat) після залишку 52 з H2 і вставлені залишки (наприклад, залишки 82a, 82b, і 82c і т.д. згідно з Kabat) після залишку 82 FR-ділянки важкого ланцюга. Нумерація залишків за Kabat може бути визначена для даного антитіла шляхом порівняння гомологічних ділянок послідовності антитіла зі "стандартною" послідовністю з нумерацією за Kabat. Систему нумерації за Kabat, як правило, використовують при позначенні залишку у варіабельному домені (приблизно залишки 1-107 легкого ланцюга і залишки 1-113 важкого ланцюга) (наприклад, Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991) ). "EU-система нумерації" або "EUіндекс", як правило, використовується для позначення залишку в константній ділянці важкого ланцюга імуноглобуліну (наприклад, EU-індекс, описаний вище в Kabat et al.; шарнірна ділянка в константному домені важкого ланцюга приблизно являє собою залишки 216-230 (EU-нумерація) важкого ланцюга). "EU-індекс за Kabat" позначає нумерацію залишків людського антитіла IgG1 EU. Якщо в даному описі не вказано інакше, позначення номерів залишків у варіабельному домені антитіл означають нумерацію залишків за системою нумерації Kabat. Якщо в даному описі не вказано інакше, позначення номерів залишків у константному домені антитіл означають нумерацію залишків за EU-нумерацією (наприклад, див. попередню заявку США No. 60/640323, фігури для EU-нумерації). Термін "фрагмент антитіла" позначає частину повнорозмірного антитіла, як правило, ділянка зв'язування з мішенню або варіабельна ділянка. Приклади фрагментів антитіл включають Fab, Fab", F(ab")2 і Fv-фрагменти. Фраза "функціональний фрагмент або аналог" антитіла стосується сполуки, що має якісну біологічну активність подібно до поовнорозмірного антитіла.Наприклад, функціональний фрагмент або аналог антитіла до фактора D людини являє собою фрагмент, що може зв'язуватися з фактором D таким чином, щоб запобігти або власне кажучи зменшити активацію системи комплементу. Як використовується в даному описі, "функціональний фрагмент" відносно антитіл стосується фрагментів Fv, F(ab) і F(ab") 2. Фрагмент "Fv" являє 4 UA 101603 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 собою мінімальний фрагмент антитіла, що містить повний сайт розпізнавання і зв'язування з мішенню. Ця ділянка складається з димеру одного варіабельного домену важкого ланцюга й одного варіабельного домену легкого ланцюга, що знаходяться в тісній нековалентній асоціації (димер VH-VL). Він знаходиться в такій конфігурації, що три CDR-ділянки кожного варіабельного домену взаємодіють із встановленням сайту зв'язування з мішенню на поверхні димеру VH-VL. Сумарно, шість ділянок CDR надають антитілу специфічність зв'язування з мішенню. Однак навіть один варіабельний домен (або половина фрагмента Fv, що включає тільки три ділянки CDR, специфічні для мішені) має здатність розпізнавати мішень і зв'язуватися з нею. "Одноланцюжковий фрагмент Fv" або фрагмент "sFv" антитіла включає домени V H і VL антитіла, де ці домени присутні в одному поліпептидному ланцюзі. Як правило, Fv-поліпептид додатково включає поліпептидний лінкер між доменами VH і VL, що дає можливість фрагменту sFv утворювати цільову структуру для зв'язування з мішенню. Fab-фрагмент містить константний домен легкого ланцюга і перший константний домен (CH1) важкого ланцюга. Fab'-фрагменти відрізняються від Fab-фрагментів декількома доданими залишками на карбоксильному кінці домену CH1 важкого ланцюга, що включає один або більше цистеїнів із шарнірної ділянки антитіла. F(ab")-фрагменти одержують шляхом розщеплення дисульфідного зв'язку шарнірних цистеїнів продукту гідролізу пепсином F(ab") 2. Додаткові хімічні зв'язування фрагментів антитіла відомі фахівцям у даній галузі. Використовуваний у даному описі термін "моноклональне антитіло" стосується антитіла, одержаного з популяції власне кажучи гомогенних антитіл, тобто індивідуальні антитіла, включені в популяцію, є ідентичними, за винятком можливих природних мутацій, що можуть бути присутніми у мінорних кількостях. Моноклональні антитіла є високоспецифічними, причому спрямовані проти одного цільового сайту. Крім того, на відміну від традиційних препаратів антитіл (поліклональних), що зазвичай включають різні антитіла, спрямовані проти різних детермінант (епітопів), кожне моноклональне антитіло спрямоване проти однієї детермінанти на мішені. На додаток до їх специфічності, перевага моноклональних антитіл полягає в тому, що вони можуть бути синтезовані за допомогою гібридомної культури, що не містить домішок інших імуноглобулінів. Позначення "моноклональне" вказує на характер антитіла, що було одержане з власне кажучи гомогенної популяції антитіл, і не повинно бути витлумачене як необхідність одержання антитіла будь-яким конкретним методом. Наприклад, моноклональні антитіла, призначені для застосування за даним винаходом, можуть бути виділені з фагових бібліотек антитіл з використанням добре відомих методів. Батьківські моноклональні антитіла, призначені для застосування згідно із даним винаходом, можуть бути одержані гібридомним методом, вперше описаним у публікації Kohler and Milstein, Nature 256, 495 (1975), або можуть бути одержані рекомбінантними методами. "Гуманізовані" форми відмінних від людських (наприклад, мишачих) антитіл являють собою імуноглобуліни, ланцюги імуноглобулінів або їхні фрагменти (такі як Fv, Fab, Fab", F(ab") 2 або інші фрагменти послідовностей антитіл, що зв'язуються з мішенню), що містять мінімальну послідовність, виділену з відмінного від людського імуноглобуліну. Як правило, гуманізоване антитіло включає власне кажучи всі з щонайменше одного, а зазвичай з двох варіабельних доменів, в яких всі або власне кажучи всі з ділянок CDR відповідають ділянкам CDR відмінного від людського імуноглобуліну, і всі або власне кажучи всі з ділянок FR являють собою консенсусну послідовність людського імуноглобуліну. Гуманізоване антитіло також може включати щонайменше частину константної ділянки (Fc) імуноглобуліну, зазвичай з вибраного як матриці людського імуноглобуліну. Методи гуманізації відмінних від людських антитіл добре відомі в даній галузі. Як правило, гуманізоване антитіло містить один або більше амінокислотних залишків, введених у нього з джерела, відмінного від людини. Ці відмінні від людських амінокислотні залишки часто позначаються як "імпортовані" залишки, що зазвичай беруться з "імпортованого" варіабельного домену. Гуманізацію можна власне кажучи здійснювати відповідно до методу Вінтера і співробітників [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)], шляхом заміни ділянок CDR гризунів або послідовностей CDR на відповідні послідовності людського антитіла. Відповідно, такі "гуманізовані" антитіла є химерними антитілами (патент США № 4816567), де ділянка, власне кажучи менше, ніж людський інтактний варіабельний домен, замінювали на відповідну послідовність з відмінного від людини виду. На практиці гуманізовані антитіла зазвичай являють собою людські антитіла, в яких деякі залишки ділянки CDR і, можливо, деякі залишки ділянки FR заміняють на залишки з аналогічних сайтів антитіл гризунів. Вибір людських варіабельних доменів обох ланцюгів, легкого і важкого, які будуть використовувати при одержанні гуманізованих антитіл, у деяких випадках може бути важливим 5 UA 101603 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 з погляду зменшення антигенності і/або реакції на HAMA (людське анти-мишаче антитіло), коли антитіло призначене для використання в терапії людини. Зменшення або виключення реакції на HAMA, як правило, являє собою істотний аспект клінічної розробки придатних терапевтичних агентів. Див., наприклад, Khaxzaeli et al., J. Natl. Cancer Inst. (1988), 80:937; Jaffers et al., Transplantation (1986), 41:572; Shawler et al., J. Immunol. (1985), 135:1530; Sears et al., J. Biol. Response Mod. (1984), 3:138; Miller et al., Blood (1983), 62:988; Hakimi et al., J. Immunol. (1991), 147:1352; Reichmann et al., Nature (1988), 332:323; Junghans et al., Cancer Res. (1990), 50:1495. Як описано в даному документі, у винаході пропонуються антитіла, що гуманізовані так, щоб реакція на HAMA була зменшена або виключена. Варіанти цих антитіл додатково можуть бути одержані з використанням звичайних способів, відомих у даній галузі, деякі з яких додатково описані нижче. Згідно з так званим "оптимізованим" методом, послідовність варіабельного домену антитіла гризуна скринували проти повної бібліотеки відомих людських послідовностей варіабельних доменів. Ідентифікували послідовність людського V-домену, що є близькою такій послідовності гризуна, і людську каркасну ділянку (FR) всередині її акцептували для гуманізованого антитіла (Sims et al., J. Immunol. 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). В іншому методі використовують конкретну каркасну ділянку, виділену з консенсусної послідовності всіх людських антитіл конкретної підгрупи легкого і важкого ланцюгів. Така ж каркасна ділянка може бути використана для декількох різних гуманізованих антитіл (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993)). Наприклад, як описано в даному документі, амінокислотна послідовність з антитіла служить як стартова (батьківська) послідовність для різноманіття каркасних і/або гіперваріабельних послідовностей. Вибрана каркасна послідовність, з якою зв'язується стартова гіперваріабельна послідовність, позначається в даному описі як людська акцепторна каркасна ділянка. У той час як людські акцепторні каркасні ділянки можуть бути з людського імуноглобуліну або можуть бути виділені з людського імуноглобуліну (його ділянок VL і/або VH), людські акцепторні каркасні ділянки можуть бути з консенсусної послідовності людської каркасної ділянки або можуть бути виділені з консенсусної послідовності людської каркасної ділянки, як такі були продемонстровані каркасні ділянки, що мають мінімальну імуногенність, або вона відсутня у пацієнтів-людей. "Людська акцепторна каркасна ділянка", призначена для цілей даного винаходу, являє собою каркасну ділянку, що включає амінокислотну послідовність каркасної ділянки VL або VH, виділеної з каркасної ділянки людського імуноглобуліну або з консенсусної послідовності людської каркасної ділянки. Акцепторна людська каркасна ділянка, "виділена з" каркасної ділянки людського імуноглобуліну або з консенсусної послідовності людської каркасної ділянки, може включати їхню амінокислотну послідовність, або може містити раніше існуючі амінокислотні заміни. Там де присутні раніше існуючі амінокислотні заміни, вони присутні в кількості, що складає, переважно, не більше ніж 5 і, переважно, 4 або менше, або 3 або менше. В одному варіанті здійснення людська акцепторна каркасна ділянка VH ідентична послідовності каркасної ділянки VH людського імуноглобуліну або консенсусній послідовності людської каркасної ділянки. В одному варіанті здійснення людська акцепторна каркасна ділянка VL ідентична послідовності каркасної ділянки VL людського імуноглобуліну або консенсусній послідовності людської каркасної ділянки. "Консенсусна послідовність людської каркасної ділянки" являє собою каркасну ділянку, що являє собою амінокислотні залишки, що найбільш часто зустрічаються, у вибірці каркасних послідовностей VL або VH людського імуноглобуліну. Як правило, вибірка послідовностей VL або VH людського імуноглобуліну представлена з підгрупи послідовностей варіабельного домену. Як правило, підгрупа послідовностей являє собою підгрупу за Kabat et al. В одному варіанті здійснення, для VL, підгрупа являє собою підгрупу каппа I за Kabat et al. В одному з варіантів здійснення, для VH, підгрупа являє собою підгрупу III за Kabat et al. Там де акцепторна послідовність виділена з людського імуноглобуліну, фахівець необов'язково може вибрати послідовність людської каркасної ділянки, що вибирається на основі її гомології з донорною послідовністю каркасної ділянки шляхом порівняння донорної послідовності каркасної ділянки з різноманітними послідовностями людської каркасної ділянки з колекції послідовностей людської каркасної ділянки, і вибрати найбільш гомологічну послідовність каркасної ділянки як акцептор. Акцепторна послідовність людської каркасної ділянки може бути з зародкових послідовностей людського антитіла або може бути виділена з зародкових послідовностей людського антитіла, доступних із загальних баз даних. В одному варіанті здійснення представлені в даному описі людські консенсусні послідовності каркасної ділянки являють собою послідовності з підгрупи VH VII і/або з підгрупи VL каппа I консенсусних послідовностей каркасної ділянки, або являють собою послідовності, 6 UA 101603 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 виділені з підгрупи VH VII і/або з підгрупи VL каппа I консенсусних послідовностей каркасної ділянки. В одному варіанті здійснення матриця людської каркасної ділянки, використовувана для одержання антитіла до фактора D, може включати послідовності каркасної ділянки з матриці, що включають комбінацію VI-4.1 b+ (сімейство VH7) і JH4d для VH ланцюга (фіг.3) і/або комбінацію DPK4 (сімейство VI) і JK2 для VL ланцюга (фіг.4). Таким чином, акцепторна людська каркасна ділянка VH може включати одну, дві, три або усі з наступних послідовностей каркасної ділянки: FR1, що включає QX1QLVQSGX2ELKKPGASVKVSCKAS (амінокислоти 1-25 послідовності SEQ ID NO: 27), де X 1 являє собою I або V, X2 являє собою P або S; FR2, що включає WVX 3QAPGQGLE (амінокислоти 36-46 послідовності SEQ ID NO: 27), де X3 являє собою K або R; FR3, що включає RFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAX4YYCX5R (амінокислоти 67-98 послідовності SEQ ID NO: 27), де X4 являє собою T або V, X5 являє собою E або A; FR4, що включає WGQGTLVTVSS (амінокислоти 105-115 послідовності SEQ ID NO: 8 або амінокислоти 105-115 послідовності SEQ ID NO: 27) Приклади консенсусних каркасних ділянок VH включають: підгрупу VH I консенсусної послідовності людської каркасної ділянки без ділянок CDR за Kabat (SEQ ID NO:28); підгрупу VH I консенсусної послідовності людської каркасної ділянки без протяжних гіперваріабельних ділянок (SEQ ID NO: 29-31); підгрупу VH II консенсусної послідовності людської каркасної ділянки без ділянок CDR за Kabat (SEQ ID NO:32); підгрупу VH II консенсусної послідовності людської каркасної ділянки без протяжних гіперваріабельних ділянок (SEQ ID NO: 33-35); підгрупу VH III консенсусної послідовності людської каркасної ділянки без ділянок CDR за Kabat (SEQ ID NO:36); підгрупу VH III консенсусної послідовності людської каркасної ділянки без протяжних гіперваріабельних ділянок (SEQ ID NO: 37-39); підгрупу VH VII консенсусної послідовності людської каркасної ділянки без ділянок CDR за Kabat (SEQ ID NO:55); підгрупу VH VII консенсусної послідовності людської каркасної ділянки без протяжних гіперваріабельних ділянок (SEQ ID NO: 56-58); акцепторна людська каркасна ділянка VH без ділянок CDR за Kabat (SEQ ID NO: 40); акцепторна людська каркасна ділянка VH без протяжних гіперваріабельних ділянок (SEQ ID NO: 41-42); акцепторна людська каркасна ділянка VH 2 без ділянок CDR за Kabat (SEQ ID NO: 43); або акцепторна людська каркасна ділянка VH 2 без протяжних гіперваріабельних ділянок (SEQ ID NO: 44-45). В одному варіанті здійснення акцепторна людська каркасна ділянка VH включає одну, дві, три або усі з наступних послідовностей каркасної ділянки: FR1, що включає QVQLVQSGPELKKPGASVKVSCKAS (амінокислоти 1-25 послідовності SEQ ID NO: 8), FR2, що включає WVRQAPGQGLE (амінокислоти 36-46 послідовності SEQ ID NO: 8), FR3, що включає RFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCER (амінокислоти 67-98 послідовності SEQ ID NO: 8), RFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCE (амінокислоти 67-97 послідовності SEQ ID NO:8), RFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYC (амінокислоти 67-96 послідовності SEQ ID NO: 8), RFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCS (SEQ ID NO: 51) або RFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCSR (SEQ ID NO: 52); FR4, що включає WGQGTLVTVSS (амінокислоти 105-115 послідовності SEQ ID NO: 8 або амінокислоти 105-115 послідовності SEQ ID NO: 27). Акцепторна людська каркасна ділянка VL може включати одну, дві, три або усі з наступних послідовностей каркасної ділянки: FR1, що включає DIQX6TQSPSSLSX7SVGDRVTITC (амінокислоти 1-23 послідовності SEQ ID NO: 26), де X6 являє собою V або M, X7 являє собою M або A; FR2, що включає WYQQKPGKX8PKLLIX9 (амінокислоти 35-49 послідовності SEQ ID NO: 26), де X8 являє собою P або V, X9 являє собою S або Y; FR3, що включає GVPSRFSX10SGSGX11DFTLTISSLQPEDVATYYC (амінокислоти 57-88 послідовності SEQ ID NO: 26), де X10 являє собою S або G, X11 являє собою A або T; FR4, що включає FGQGTKX12EIK (SEQ ID NO: 54), де X12 являє собою V або L. 7 UA 101603 C2 Приклади консенсусних послідовностей каркасних ділянок VL включають: підгрупу VL каппа I консенсусної послідовності людської каркасної ділянки (SEQ ID NO: 47); підгрупу VL каппа II консенсусної послідовності людської каркасної ділянки (SEQ ID NO: 48); підгрупу VL каппа III консенсусної послідовності людської каркасної ділянки (SEQ ID NO: 49); 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 або підгрупу VL каппа IV консенсусної послідовності людської каркасної ділянки (SEQ ID NO: 50). В одному варіанті здійснення акцепторна послідовність людської каркасної ділянки може включати одну, дві, три або усі з наступних послідовностей каркасної ділянки: FR1, що включає DIQVTQSPSSLSASVGDRVTITC (амінокислоти 1-23 послідовності SEQ ID NO: 7), FR2, що включає WYQQKPGKVPKLLIS (амінокислоти 35-49 послідовності SEQ ID NO: 7), FR3, що включає GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYC (амінокислоти 57-88 послідовності SEQ ID NO: 7), FR4, що включає FGQGTKLEIK (амінокислоти 98-107 послідовності SEQ ID NO: 7) або FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 53). У той час як акцепторна послідовність може бути ідентична вибраній послідовності людської каркасної ділянки або тій, яка з людського імуноглобуліну, або тій, яка з консенсусної послідовності людської каркасної ділянки, у даному винаході передбачається, що акцепторна послідовність може включати раніше існуючі амінокислотні заміни відносно послідовності людського імуноглобуліну або до консенсусної послідовності людської каркасної ділянки. Раніше існуючі заміни переважно є мінімальними; мають зазвичай чотири, три, дві або одну відмінності за амінокислотами тільки відносно послідовності людського імуноглобуліну або до консенсусної послідовності каркасної ділянки. Залишки гіперваріабельної ділянки відмінного від людського антитіла вводять в акцепторні послідовності VL і/або VH людської каркасної ділянки. Наприклад, фахівець може ввести залишки, що відповідають залишкам ділянки CDR за Kabat, залишкам гіперваріабельної петлі за Chothia, залишкам Abm і/або залишкам контактної ділянки. Необов'язково вводяться наступні залишки протяжної гіперваріабельної ділянки: 24-34 (L1), 50-56 (L2) і 89-97 (L3), 26-35 (H1), 5065 або 49-65 (H2) і 93-102, 94-102 або 95-102 (H3). В одному аспекті винаходу пропонується антитіло, що включає щонайменше одну, дві, три, чотири, п'ять або шість ділянок HVR, вибраних з (a) ділянки HVR-H 1, що включає амінокислотну послідовність, вибрану з SEQ ID NO: 13 і SEQ ID NO: 25; (b) ділянки HVR-H2, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 14; (c) ділянки HVR-H3, що включає амінокислотну послідовність, вибрану з SEQ ID NO: 15 і SEQ ID NO: 20; (d) ділянки HVR-L1, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 16; (e) ділянки HVR-L2, що включає амінокислотну послідовність, вибрану з SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO; 21 і SEQ ID NO: 24; і (f) ділянки HVR-L3, що включає амінокислотну послідовність, вибрану з SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 22 і SEQ ID NO: 19. В одному аспекті винаходу пропонується антитіло до фактора D, що включає щонайменше одну, дві, три, чотири, п'ять або шість ділянок HVR, вибраних з (a) ділянки HVR-H1, що включає амінокислотну послідовність, ідентичну щонайменше, на 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % або 99 % амінокислотній послідовності, вибраній з SEQ ID NO: 13 і SEQ ID NO: 25; (b) ділянки HVR-H2, що включає амінокислотну послідовність, ідентичну щонайменше на 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % або 99 % амінокислотній послідовності SEQ ID NO: 14; (c) ділянки HVR-H3, що включає амінокислотну послідовність, ідентичну щонайменше на 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % або 99 % амінокислотній послідовності, вибраної з SEQ ID NO: 15 і SEQ ID NO: 20; (d) ділянки HVR-L1, що включає амінокислотну послідовність, ідентичну щонайменше на 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % або 99 % амінокислотній послідовності SEQ ID NO: 16; (e) ділянки HVR-L2, що включає амінокислотну послідовність, ідентичну щонайменше на 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % або 99 % амінокислотній послідовності, вибраній з SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO; 21 і SEQ ID NO: 24; і (f) ділянки HVR-L3, що включає амінокислотну послідовність, ідентичну щонайменше на 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % або 99 % амінокислотній послідовності, вибраній з SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 22 і SEQ ID NO: 19. У деяких варіантах здійснення ділянка HVR, що містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % або 99 % ідентичності послідовності, містить заміни, вставки або делеції відносно еталонної послідовності, але при цьому антитіло, що включає цю амінокислотну послідовність, зберігає здатність зв'язуватися з фактором D. У деяких варіантах здійснення заміняють, вставляють або делетують амінокислоти загальною кількістю, що складає 1-10, в еталонній послідовності, вибраній з групи, що 8 UA 101603 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 складається з SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 22 і SEQ ID NO: 24. У деяких варіантах здійснення винаходу пропонується антитіло, що включає щонайменше одну, дві, три, чотири, п'ять або шість ділянок HVR, вибраних з (a) ділянки HVRH1, що включає амінокислотну послідовність, вибрану з SEQ ID NO: 13 і SEQ ID NO: 25; (b) ділянки HVR-H2, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 14; (c) ділянки HVR-H3, що включає амінокислотну послідовність, вибрану з SEQ ID NO: 15 і SEQ ID NO: 20; (d) ділянки HVR-L1, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 16; (e) ділянки HVR-L2, що включає амінокислотну послідовність, вибрану з SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO; 21 і SEQ ID NO: 24; і (f) ділянки HVR-L3, що включає амінокислотну послідовність, вибрану з SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 22 і SEQ ID NO: 19. В одному аспекті винаходу пропонується антитіло, що містить варіабельний домен важкого ланцюга, вибраний з SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12. В одному аспекті винаходу пропонується антитіло, що містить варіабельний домен легкого ланцюга, вибраний з SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 і SEQ ID NO: 11. В одному аспекті винаходу пропонується антитіло, що містить варіабельний домен важкого ланцюга, що включає SEQ ID NO: 6. В одному аспекті винаходу пропонується антитіло, що містить варіабельний домен легкого ланцюга, що включає SEQ ID NO: 5. В одному аспекті винаходу пропонується антитіло, що містить варіабельний домен важкого ланцюга, що включає SEQ ID NO: 6, і варіабельний домен легкого ланцюга, що включає SEQ ID NO: 5. В одному аспекті винаходу пропонується антитіло, що містить варіабельний домен важкого ланцюга, що включає SEQ ID NO: 8. В одному аспекті винаходу пропонується антитіло, що містить варіабельний домен легкого ланцюга, що включає SEQ ID NO: 7. В одному аспекті винаходу пропонується антитіло, що містить варіабельний домен важкого ланцюга, що включає SEQ ID NO: 8, і варіабельний домен легкого ланцюга, що включає SEQ ID NO: 7. В одному аспекті винаходу пропонується антитіло, що містить варіабельний домен важкого ланцюга, що включає SEQ ID NO: 10. В одному аспекті винаходу пропонується антитіло, що містить варіабельний домен легкого ланцюга, що включає SEQ ID NO: 9. В одному аспекті винаходу пропонується антитіло, що містить варіабельний домен важкого ланцюга, що включає SEQ ID NO: 10, і варіабельний домен легкого ланцюга, що включає SEQ ID NO: 9. В одному аспекті винаходу пропонується антитіло, що містить варіабельний домен важкого ланцюга, що включає SEQ ID NO: 12. В одному аспекті винаходу пропонується антитіло, що містить варіабельний домен легкого ланцюга, що включає SEQ ID NO: 11. В одному аспекті винаходу пропонується антитіло, що містить варіабельний домен важкого ланцюга, що включає SEQ ID NO: 12, і варіабельний домен легкого ланцюга, що включає SEQ ID NO: 11. В одному аспекті винаходу пропонується антитіло до фактора D, що містить варіабельний домен важкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність, ідентичну щонайменше на 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % або 99 % амінокислотній послідовності, вибраній з групи, що складається з SEQ ID NO: 6, 8, 10 і 12. У деяких варіантах здійснення амінокислотна послідовність, що має щонайменше 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % або 99 % ідентичності послідовності, містить заміни, вставки або делеції відносно еталонної послідовності, але при цьому антитіло, що включає цю амінокислотну послідовність, зберігає здатність зв'язуватися з фактором D. У деяких варіантах здійснення заміняють, вставляють або делетують амінокислоти загальною кількістю, що складає 1-10, в еталонній послідовності, вибраній з групи, що складається з SEQ ID NO: 6, 8, 10 або 12. У деяких варіантах здійснення заміни, вставки або делеції здійснюються в ділянках, що розташовані поза HVR (тобто в ділянках FR). У деяких варіантах здійснення антитіло до фактора D містить варіабельний домен важкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NO: 6, 8, 10 або 12. У деяких варіантах здійснення винаходу пропонується антитіло до фактора D, що містить варіабельний домен легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність, ідентичну щонайменше на 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % або 99 % амінокислотній послідовності, вибраній з групи, що складається з SEQ ID NO: 5, 7, 9 і 11. У деяких варіантах здійснення амінокислотна послідовність, що має щонайменше 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % або 99 % ідентичності послідовності, містить заміни, вставки або делеції відносно еталонної послідовності, але при цьому антитіло, що включає цю амінокислотну послідовність, зберігає здатність зв'язуватися з фактором D. У деяких варіантах здійснення заміняють, вставляють або делетують амінокислоти загальною кількістю, що складає 1-10, у послідовності, вибраній з групи, що складається з SEQ ID NO: 5, 7, 9 і 11. У деяких варіантах здійснення заміни, вставки або делеції здійснюються в ділянках, що розташовані поза HVR 9 UA 101603 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 (тобто в ділянках FR). У деяких варіантах здійснення антитіло до фактора D містить варіабельний домен легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NO: 5, 7, 9 і 11. Антитіло до фактора D може включати будь-як придатну послідовність каркасної ділянки варіабельного домену за умови, що антитіло зберігає здатність зв'язування з фактором D. Наприклад, у деяких варіантах здійснення, антитіла до фактора D за винаходом включають послідовність каркасної ділянки варіабельного домену важкого ланцюга, що являє собою комбінацію Vl.4.1 b+ і JH4d (див. фіг.3). У деяких варіантах здійснення антитіло до фактора D за винаходом включає консенсусну послідовність людської каркасної ділянки важкого ланцюга підгрупи VII. У деяких варіантах здійснення антитіла до фактора D за винаходом включають послідовність людської каркасної ділянки варіабельного домену важкого ланцюга, що містить ділянку FR1, яка включає амінокислоти 1-25 послідовності SEQ ID NO: 8, ділянку FR2, що включає амінокислоти 36-46 послідовності SEQ ID NO: 8, ділянку FR3, яка включає амінокислоти 67-98 послідовності SEQ ID NO: 8, і ділянку FR4, що включає амінокислоти 105115 послідовності SEQ ID NO: 8. В одному варіанті здійснення цих антитіл послідовність варіабельного домену важкого ланцюга включає заміну(и) у положенні 40 і/або 88 (нумерація за Kabat). В одному варіанті здійснення цих антитіл амінокислота в положенні 40 являє собою цистеїн (C) або аланін (A), і/або амінокислота в положенні 88 являє собою цистеїн (C) або аланін (A). У деяких варіантах здійснення антитіла до фактора D за винаходом включають послідовність каркасної ділянки варіабельного домену легкого ланцюга, що являє собою комбінацію DPK4 і JK2 (див. фіг.4). У деяких варіантах здійснення антитіла до фактора D за винаходом включають консенсусну послідовність людської каркасної ділянки легкого ланцюга каппа I ((I). У деяких варіантах здійснення антитіла до фактора D за винаходом включають послідовність каркасної ділянки варіабельного домену легкого ланцюга, що містить ділянку FR1, що включає амінокислоти 1-23 послідовності SEQ ID NO: 7, ділянка FR2, що включає амінокислоти 35-49 послідовності SEQ ID NO: 7, ділянка FR3, що включає амінокислоти 57-88 послідовності SEQ ID NO: 7, і ділянка FR4, що включає амінокислоти 98-107 послідовності SEQ ID NO: 7. В одному варіанті здійснення цих антитіл послідовність каркасної ділянки варіабельного домену легкого ланцюга включає одну або більше замін у положенні 15, 43 і/або 104 (нумерація за Kabat). В одному варіанті здійснення цих антитіл амінокислота в положенні 15 являє собою цистеїн (C) або валін (V), амінокислота в положенні 43 являє собою цистеїн (C) або аланін (A) і/або амінокислота в положенні 104 являє собою валін (V) або лейцин (L). Крім того, антитіло до фактора D може включати будь-яку придатну послідовність константного домену за умови, що антитіло зберігає здатність зв'язування з фактором D. Наприклад, у деяких варіантах здійснення, антитіла до фактора D за винаходом включають щонайменше частину константного домену важкого ланцюга. В одному варіанті здійснення антитіла до фактора D за винаходом включають константний домен важкого ланцюга кожного з типів важкого ланцюга , , ,  і  або їх комбінації. Залежно від амінокислотної послідовності константного домену їхніх важких ланцюгів (CH), імуноглобуліни можуть бути віднесені до різних класів або ізотипів. Існує п'ять класів імуноглобулінів: IgA, IgD, IgE, IgG і IgM, що мають важкі ланцюги, позначені , , ,  і , відповідно. Класи  і  додатково підрозділяються на підкласи на підставі відносно мінорних розходжень у послідовності C H і у функції, наприклад, у людей експресуються наступні підкласи: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 і ІgA2. В одному варіанті здійснення антитіла до фактора D за винаходом містять константний домен важкого ланцюга, що включає заміни в положеннях амінокислот, що призводять у результаті до одержання цільового ефекту, що впливає на ефекторну функцію (наприклад, афінність зв'язування).В одному варіанті здійснення антитіла до фактора D за винаходом містять константний домен важкого ланцюга, що включає заміни в положеннях амінокислот, що не призводять у результаті до одержання ефекту, що впливає на ефекторну функцію (наприклад, афінність зв'язування). В одному варіанті здійснення антитіла до фактора D за винаходом містять константний домен важкого ланцюга імуноглобуліну типу IgG (наприклад, IgG1, IgG2, IgG3 або IgG4) і додатково включають заміну в положенні 114 (нумерація за Kabat; еквівалентно положенню 118 у EUнумерації), 168 (нумерація за Kabat; еквівалентно положенню 172 у EU-нумерації), 172 (нумерація за Kabat; еквівалентно положенню 176 у EU-нумерації) і/або 228 (EU-нумерація). В одному варіанті здійснення антитіла до фактора D за винаходом містять константний домен важкого ланцюга імуноглобуліну типу IgG (наприклад, IgG1, IgG2, IgG3 або IgG4) і додатково включають заміну в положенні 114, де амінокислота в положенні 114 являє собою цистеїн (C) або аланін (A), у положенні 168, де амінокислота в положенні 168 являє собою цистеїн (C) або аланін (A), у положенні 172, де амінокислота в положенні 172 являє собою цистеїн (C) або 10 UA 101603 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 аланін (A), і/або в положенні 228, де амінокислота в положенні 228 являє собою пролін (P), аргінін (R) або серин (S). Крім того, наприклад, у деяких варіантах здійснення, антитіла до фактора D за винаходом включають щонайменше частину константного домену легкого ланцюга. В одному варіанті здійснення антитіла до фактора D за винаходом включають константний домен легкого ланцюга кожного з типів легкого ланцюга - каппа або лямбда, або їхню комбінацію, оскільки легкий ланцюг з будь-якого виду хребетних може бути віднесений до одного з двох абсолютно різних типів, що називаються каппа і лямбда, на підставі амінокислотних послідовностей їх константних доменів. В одному варіанті здійснення антитіла до фактора D за винаходом містять константний домен легкого ланцюга, що включає заміни в положеннях амінокислот, що призводять у результаті до одержання цільового ефекту, що впливає на ефекторну функцію (наприклад, афінність зв'язування). В одному варіанті здійснення антитіла до фактора D за винаходом містять константний домен легкого ланцюга, що включає заміни в положеннях амінокислот, що не призводять у результаті до одержання ефекту, що впливає на ефекторну функцію (наприклад, афінність зв'язування). В одному варіанті здійснення антитіла до фактора D за винаходом містять константний домен легкого ланцюга типу каппа і додатково включають заміну в положенні 110, 144, 146 і/або 168 (нумерація за Kabat). В одному варіанті здійснення антитіла до фактора D за винаходом містять константний домен легкого ланцюга типу каппа і додатково включають заміну в положенні 110, де амінокислота в положенні 110 являє собою цистеїн (C) або валін (V), у положенні 144, де амінокислота в положенні 144 являє собою цистеїн (C) або аланін (A), у положенні 146, де амінокислота в положенні 146 являє собою ізолейцин (I) або валін (V), і/або в положенні 168, де амінокислота в положенні 168 являє собою цистеїн (C) або серин (S). В одному аспекті винаходу пропонуються антитіла, що конкурують з мишачим антитілом 166-32 і/або з клонами #56, #111, #250 або #416 гуманізованого антитіла до фактора D, і/або з антитілом, що включає варіабельний домен або HVR-послідовності клонів #56, #111, #250 або #416 гуманізованого антитіла до фактора D. Також пропонуються антитіла, що зв'язуються з тим самим епітопом, що і мишаче антитіло 166-32, і/або клони #56, #111, #250 або #416 гуманізованого антитіла до фактора D, і/або антитіло, що включає варіабельний домен або HVR-послідовності клонів #56, #111, #250 або #416 гуманізованого антитіла до фактора D. В одному варіанті здійснення винаходу пропонується антитіло до фактора D, де моновалентна афінність антитіла до фактора D (наприклад, афінність антитіла у вигляді Fabфрагмента до фактора D) нижче, наприклад щонайменше у 1 або в 2 рази, ніж моновалентна афінність химерного антитіла (наприклад, афінність химерного антитіла у вигляді Fabфрагмента до фактора D), що включає, що складається з або власне кажучи складається з варіабельного домену легкого ланцюга послідовності SEQ ID NO: 2 і варіабельного домену важкого ланцюга послідовності SEQ ID NO: 1. В одному варіанті здійснення винаходу пропонується антитіло до фактора D, де бівалентна афінність антитіла до фактора D (наприклад, афінність антитіла у вигляді IgG до фактора D) нижче, наприклад щонайменше у 1 або в 2 рази, ніж бівалентна афінність химерного антитіла (наприклад, афінність химерного антитіла у вигляді IgG до фактора D), що включає, що складається з або власне кажучи складається з варіабельного домену легкого ланцюга послідовності SEQ ID NO: 2 і варіабельного домену важкого ланцюга послідовності SEQ ID NO: 1. В іншому варіанті здійснення винаходу пропонується антитіло до фактора D, де моновалентна афінність антитіла до фактора D (наприклад, афінність антитіла у вигляді Fabфрагмента до фактора D) більше, наприклад щонайменше у 1 або в 2 рази, ніж моновалентна афінність химерного антитіла (наприклад, афінність химерного антитіла у вигляді Fabфрагмента до фактора D), що включає, що складається з або власне кажучи складається з варіабельного домену легкого ланцюга послідовності SEQ ID NO: 2 і варіабельного домену важкого ланцюга послідовності SEQ ID NO: 1. В іншому варіанті здійснення винаходу пропонується антитіло до фактора D, де бівалентна афінність антитіла до фактора D (наприклад, афінність антитіла у вигляді IgG до фактора D) більше, наприклад щонайменше у 1 або в 2 рази, ніж бівалентна афінність химерного антитіла (наприклад, афінність химерного антитіла у вигляді IgG до фактора D), що включає, що складається з або власне кажучи складається з варіабельного домену легкого ланцюга послідовності SEQ ID NO: 2 і варіабельного домену важкого ланцюга послідовності SEQ ID NO: 1. В іншому варіанті здійснення винаходу пропонується антитіло до фактора D, де афінність антитіла в його моновалентній формі до фактора D (наприклад, афінність антитіла у вигляді 11 UA 101603 C2 9 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Fab-фрагмента до фактора D) складає 1,0 нМ (110- M) або краще. В іншому варіанті здійснення винаходу пропонується антитіло до фактора D, де афінність антитіла в його моновалентній формі до фактора D (наприклад, афінність антитіла у вигляді Fab-фрагмента до 9 фактора D) складає 0,5 нМ (0,510- M) або краще. В іншому варіанті здійснення винаходу пропонується антитіло до фактора D, де афінність антитіла в його моновалентній формі до фактора D (наприклад, афінність антитіла у вигляді Fab-фрагмента до фактора D) складає 1,0 12 пМ (110- M) або краще. В іншому варіанті здійснення винаходу пропонується антитіло до фактора D, де афінність антитіла в його моновалентній формі до фактора D (наприклад, 12 афінність антитіла у вигляді Fab-фрагмента до фактора D) складає 0,5 пМ (0,510- M) або краще. В іншому варіанті здійснення винаходу пропонується антитіло до фактора D, де афінність антитіла в його бівалентній формі до фактора D (наприклад, афінність антитіла у вигляді IgG до 9 фактора D) складає 1,0 пМ (1,010- M) або краще. В іншому варіанті здійснення винаходу пропонується антитіло до фактора D, де афінність антитіла в його бівалентній формі до 9 фактора D (наприклад, афінність антитіла у вигляді IgG до фактора D) складає 0,5 пМ (0,510M) або краще. В іншому варіанті здійснення винаходу пропонується антитіло до фактора D, де афінність антитіла в його бівалентній формі до фактора D (наприклад, афінність антитіла у 12 вигляді IgG до фактора D) складає 1,0 пМ (110- M) або краще. В іншому варіанті здійснення винаходу пропонується антитіло до фактора D, де афінність антитіла в його бівалентній формі до фактора D (наприклад, афінність антитіла у вигляді IgG до фактора D) складає 0,5 пМ 12 (0,510- M) або краще. В іншому варіанті здійснення винаходу пропонується антитіло до фактора D, де афінність антитіла в його моновалентній формі до фактора D (наприклад, афінність антитіла у вигляді 6 12 Fab-фрагмента до фактора D) знаходиться в інтервалі між 0,5 мМ (0,510- M) і 0,5 пМ (0,510M). В іншому варіанті здійснення винаходу пропонується антитіло до фактора D, де афінність антитіла в його моновалентній формі до фактора D (наприклад, афінність антитіла у вигляді 9 9 Fab-фрагмента до фактора D) знаходиться в інтервалі між 15 нМ (1510- M) і 0,1 нМ (0,110M). В іншому варіанті здійснення винаходу пропонується антитіло до фактора D, де афінність антитіла в його моновалентній формі до фактора D (наприклад, афінність антитіла у вигляді 9 9 Fab-фрагмента до фактора D) знаходиться в інтервалі між 5,5 нМ (5,510- M) і 1 нМ (110- M). В іншому варіанті здійснення винаходу пропонується антитіло до фактора D, де афінність антитіла в його моновалентній формі до фактора D (наприклад, афінність антитіла у вигляді 12 12 Fab-фрагмента до фактора D) знаходиться в інтервалі між 0,5 пМ (0,510- M) і 2 пМ (210M). В іншому варіанті здійснення винаходу пропонується антитіло до фактора D, де афінність антитіла в його бівалентній формі до фактора D (наприклад, афінність антитіла у вигляді IgG до 6 12 фактора D) знаходиться в інтервалі між 0,5 мМ (0,510- M) і 0,5 пМ (0,510- M). В іншому варіанті здійснення винаходу пропонується антитіло до фактора D, де афінність антитіла в його бівалентній формі до фактора D (наприклад, афінність антитіла у вигляді IgG до фактора D) 9 9 знаходиться в інтервалі між 10 нМ (1010- M) і 0,05 нМ (0,0510- M). В іншому варіанті здійснення винаходу пропонується антитіло до фактора D, де афінність антитіла в його бівалентній формі до фактора D (наприклад, афінність антитіла у вигляді IgG до фактора D) 9 9 знаходиться в інтервалі між 5,5 нМ (5,510- M) і 1 нМ (110- M). В іншому варіанті здійснення винаходу пропонується антитіло до фактора D, де афінність антитіла в його бівалентній формі до фактора D (наприклад, афінність антитіла у вигляді IgG до фактора D) знаходиться в 12 12 інтервалі між 0,5 пМ (0,510- M) і 2 пМ (210- M). В іншому варіанті здійснення винаходу пропонується антитіло до фактора D, де афінність антитіла в його моновалентній формі до фактора D (наприклад, афінність антитіла у вигляді 10 Fab-фрагмента до фактора D) складає приблизно 0,37 нМ (3,710- M). В іншому варіанті здійснення винаходу пропонується антитіло до фактора D, де афінність антитіла в його моновалентній формі до фактора D (наприклад, афінність антитіла у вигляді Fab-фрагмента до 10 фактора D) складає приблизно 0,33 нМ (3,310- M). В іншому варіанті здійснення винаходу пропонується антитіло до фактора D, де афінність антитіла в його моновалентній формі до фактора D (наприклад, афінність антитіла у вигляді Fab-фрагмента до фактора D) складає 10 приблизно 0,51 нМ (5,110- M). В іншому варіанті здійснення винаходу пропонується антитіло до фактора D, де афінність антитіла в його моновалентній формі до фактора D (наприклад, 9 афінність антитіла у вигляді Fab-фрагмента до фактора D) складає приблизно 2,7 нМ (2,710M). В іншому варіанті здійснення винаходу пропонується антитіло до фактора D, де афінність антитіла в його моновалентній формі до фактора D (наприклад, афінність антитіла у вигляді 12 UA 101603 C2 9 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Fab-фрагмента до фактора D) складає приблизно 1,4 нМ (1,410- M). В іншому варіанті здійснення винаходу пропонується антитіло до фактора D, де афінність антитіла в його моновалентній формі до фактора D (наприклад, афінність антитіла у вигляді Fab-фрагмента до 12 фактора D) складає приблизно 1,4 пМ (1,410- M). В іншому варіанті здійснення винаходу пропонується антитіло до фактора D, де афінність антитіла в його бівалентній формі до фактора D (наприклад, афінність антитіла у вигляді IgG до фактора D) складає приблизно 1,1 12 пМ (1,110- M). В іншому варіанті здійснення винаходу пропонується антитіло до фактора D, де афінність антитіла в його моновалентній формі до фактора D (наприклад, афінність антитіла 9 у вигляді Fab-фрагмента до фактора D) складає приблизно 0,19 нМ (0,1910- M). В іншому варіанті здійснення винаходу пропонується антитіло до фактора D, де афінність антитіла в його бівалентній формі до фактора D (наприклад, афінність антитіла у вигляді IgG до фактора D) 9 складає приблизно 0,08 нМ (0,0810- M). В іншому варіанті здійснення винаходу пропонується антитіло до фактора D, де афінність антитіла в його моновалентній формі до фактора D (наприклад, афінність антитіла у вигляді Fab-фрагмента до фактора D) складає приблизно 12,3 9 нМ (12,310- M). В іншому варіанті здійснення винаходу пропонується антитіло до фактора D, де афінність антитіла в його бівалентній формі до фактора D (наприклад, афінність антитіла у 9 вигляді IgG до фактора D) складає приблизно 9 нМ (910- M). В іншому варіанті здійснення винаходу пропонується антитіло до фактора D, де афінність антитіла в його моновалентній формі до фактора D (наприклад, афінність антитіла у вигляді 12 Fab-фрагмента до фактора D) складає приблизно 1,4 пМ (1,410- M) +/- 0,5. В іншому варіанті здійснення винаходу пропонується антитіло до фактора D, де афінність антитіла в його бівалентній формі до фактора D (наприклад, афінність антитіла у вигляді IgG до фактора D) 12 складає приблизно 1,1 пМ (1,110- M) +/- 0,6. В іншому варіанті здійснення винаходу пропонується антитіло до фактора D, де афінність антитіла в його моновалентній формі до фактора D (наприклад, афінність антитіла у вигляді Fab-фрагмента до фактора D) складає 9 приблизно 0,19 нМ (0,1910- M) +/- 0,01. В іншому варіанті здійснення винаходу пропонується антитіло до фактора D, де афінність антитіла в його бівалентній формі до фактора D (наприклад, афінність антитіла у вигляді IgG до фактора D) складає приблизно 0,08 нМ 9 (0,0810- M) +/- 0,01. В іншому варіанті здійснення винаходу пропонується антитіло до фактора D, де афінність антитіла в його моновалентній формі до фактора D (наприклад, афінність 9 антитіла у вигляді Fab-фрагмента до фактора D) складає приблизно 12,3 нМ (12,310- M) +/- 2. В іншому варіанті здійснення винаходу пропонується антитіло до фактора D, де афінність антитіла в його бівалентній формі до фактора D (наприклад, афінність антитіла у вигляді IgG до 9 фактора D) складає приблизно 9,0 нМ (9,010- M) +/- 1. В іншому варіанті здійснення антитіло до фактора D може мати афінність антитіла в його моновалентній формі до фактора D (наприклад, афінність антитіла у вигляді Fab-фрагмента до фактора D), що складає приблизно 3,7 нМ (3,710-9 M) +/- 2. В іншому варіанті здійснення антитіло до фактора D може мати афінність антитіла в його моновалентній формі до фактора D (наприклад, афінність антитіла у вигляді Fab-фрагмента до фактора D), що складає приблизно 9 3,3 нМ (3,310- M) +/- 2. В іншому варіанті здійснення антитіло до фактора D може мати афінність антитіла в його моновалентній формі до фактора D (наприклад, афінність антитіла у 9 вигляді Fab-фрагмента до фактора D), що складає приблизно 5,1 нМ (5,110- M) +/- 2. В іншому варіанті здійснення антитіло до фактора D може мати афінність антитіла в його моновалентній формі до фактора D (наприклад, афінність антитіла у вигляді Fab-фрагмента до фактора D), що 9 складає приблизно 2,7 нМ (2,710- M) +/- 2. В іншому варіанті здійснення антитіло до фактора D може мати афінність антитіла в його моновалентній формі до фактора D (наприклад, афінність антитіла у вигляді Fab-фрагмента до фактора D), що складає приблизно 1,4 нМ 9 (1,410- M) +/- 2. В іншому варіанті здійснення антитіло до фактора D може мати афінність антитіла в його моновалентній формі до фактора D (наприклад, афінність антитіла у вигляді 12 Fab-фрагмента до фактора D), що складає приблизно 1,4 пМ (1,410- M) +/- 2. В іншому варіанті здійснення антитіло до фактора D може мати афінність антитіла в його бівалентній формі до фактора D (наприклад, афінність антитіла у вигляді IgG до фактора D), що складає 12 приблизно 1,1 пМ (1,110- M) +/- 2. В іншому варіанті здійснення антитіло до фактора D може мати афінність антитіла в його моновалентній формі до фактора D (наприклад, афінність 9 антитіла у вигляді Fab-фрагмента до фактора D), що складає приблизно 0,19 нМ (0,1910- M) +/- 2. В іншому варіанті здійснення антитіло до фактора D може мати афінність антитіла в його бівалентній формі до фактора D (наприклад, афінність антитіла у вигляді IgG до фактора D), що 9 складає приблизно 0,08 нМ (0,0810- M) +/- 2. В іншому варіанті здійснення антитіло до фактора D може мати афінність антитіла в його моновалентній формі до фактора D (наприклад, 13 UA 101603 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 афінність антитіла у вигляді Fab-фрагмента до фактора D), що складає приблизно 12,3 нМ 9 (12,310- M) +/- 2. В іншому варіанті здійснення антитіло до фактора D може мати афінність антитіла в його бівалентній формі до фактора D (наприклад, афінність антитіла у вигляді IgG до 9 фактора D), що складає приблизно 9,0 НМ (9,010- M) +/- 2. Як добре відомо з галузі техніки, афінність зв'язування ліганду з його рецептором може бути визначена з використанням кожного з різноманітних аналізів і може виражатися різноманітними кількісними величинами. Відповідно, в одному варіанті здійснення, афінність зв'язування виражається у вигляді величин Kd і відбиває справжню афінність зв'язування (наприклад, з мінімізованими ефектами авідності). Як правило і переважно, афінність зв'язування вимірюється in vitro, або в безклітинній системі або в системі, асоційованій з клітинами. Як описано в даному документі більш докладно, кратне розходження в афінності зв'язування може бути кількісно визначене за допомогою співвідношення величини моновалентної афінності зв'язування гуманізованого антитіла (наприклад, у формі Fab) і величини моновалентної афінності зв'язування еталонного/порівняльного антитіла (наприклад, у формі Fab) (наприклад, мишачого антитіла, що містить донорні послідовності гіперваріабельної ділянки), де величини афінності зв'язування визначаються при однакових умовах аналізу. Таким чином, в одному варіанті здійснення, кратне розходження в афінності зв'язування визначається як співвідношення величин Kd гуманізованого антитіла у формі Fab і вказаного еталонного/порівняльного антитіла Fab. Наприклад, в одному варіанті здійснення, якщо антитіло за винаходом (A) має афінність, що являє собою величину "у 3 рази нижче", ніж афінність еталонного антитіла (M), потім, якщо величина Kd для A складає 3, то величина Kd для M буде складати 1, і співвідношення Kd для A до Kd для M складе 3:1. Навпаки, в одному варіанті здійснення, якщо антитіло за винаходом (C) має афінність, що являє собою величину "у 3 рази більше", ніж афінність еталонного антитіла (R), потім, якщо величина Kd для C складає 1, те величина Kd для R буде складати 3, і співвідношення Kd для C і Kd для R складе 1:3. Будь-який з ряду аналізів, відомих у даній галузі, включаючи ті, що описані в даному документі, може бути використаний для одержання вимірювань афінності зв'язування, включаючи, наприклад, аналіз Biacore, радіоімуноаналіз (RIA) і ELISA. Крім того, величини Kd для антитіла за винаходом можуть змінюватися в залежності від умов конкретного використовуваного аналізу. Наприклад, в одному варіанті здійснення, вимірювання афінності зв'язування можуть бути одержані за допомогою аналізу, де Fab або антитіло є іммобілізованими, і вимірюється зв'язування ліганду, тобто фактора D, або, альтернативно, ліганд, тобто фактор D, для Fab або антитіла є іммобілізованим, і вимірюється зв'язування Fab або антитіла. В одному варіанті здійснення вимірювання афінності зв'язування можуть бути одержані за допомогою аналізу, де умови регенерації можуть включати (1) 10мМ або гліцин 4M MgCl2 при pН 1,5 і (2) значення pН, що знаходиться в інтервалі між 1 і 7,5, включаючи значення pН 1,5, pН 5,0, pН 6,0 і pН 7,2. В одному варіанті здійснення вимірювання афінності зв'язування можуть бути одержані за допомогою аналізу, де умови зв'язування можуть включати (1) сольовий розчин з буфером PBS або HEPES і (2) Tween-20, тобто 0,1 % Tween-20. В одному варіанті здійснення вимірювання афінності зв'язування можуть бути одержані за допомогою аналізу, де джерело ліганду, тобто фактора D, може бути одержане з комерційно доступних джерел. В одному варіанті здійснення вимірювання афінності зв'язування можуть бути одержані за допомогою аналізу, де (1) Fab або антитіло іммобілізовані, і вимірюється зв'язування ліганду, тобто фактора D, (2) умови регенерації включають 4M MgCl2 при pН 7,2 і (3) умови зв'язування включають сольовий розчин з буфером HEPES, pН 7,2, що містить 0,1 % Tween-20. В одному варіанті здійснення вимірювання афінності зв'язування можуть бути одержані за допомогою аналізу, де (1) ліганд, тобто фактор D, іммобілізований, і вимірюється зв'язування Fab або антитіла, (2) умови регенерації включають 10мМ гліцин при pН 1,5 і (3) умови зв'язування включають буфер PBS. Терміни "клітина", "клітинна лінія" і "культура клітин" включають потомство. Також зрозуміло, що все потомство не може бути в точності ідентичним за вмістом ДНК через навмисні або випадкові мутації. Також включений варіант потомства, що має таку ж функцію або біологічну властивість, які мали місце у вихідної трансформованої клітини. "Клітини-хазяїни", використовувані в даному винаході, як правило, являють собою прокаріотичні або еукаріотичні клітини-хазяїни. Термін "вектор" означає ДНК-конструкцію, що містить послідовність ДНК, яка функціонально зв'язана з придатною контрольною послідовністю, здатною впливати на експресію ДНК у придатному хазяїні. Такі контрольні послідовності включають промотор для впливу на транскрипцію, необов'язкову послідовність оператора для контролю такої транскрипції, послідовність, що кодує придатні сайти зв'язування мРНК із рибосомою, і послідовності, що 14 UA 101603 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 контролюють термінацію транскрипції і трансляції. Вектор може являти собою плазміду, фаговую частку або просто потенційну геномну вставку. Трансформований у придатного хазяїна вектор може реплікуватися і функціонувати незалежно від генома хазяїна або може, у деяких випадках, інтегруватися в сам геном. У даному описі "плазміда" і "вектор" іноді використовуються взаємозамінно, оскільки плазміда являє собою найбільш використовувану форму вектора. Однак розуміється, що винахід включає такі інші форми векторів, що виконують еквівалентну функцію, що є, або стають, відомими в даній галузі. Використовуване в даному описі слово "мітка" позначає детектовану сполуку або композицію, що можуть бути кон'юговані безпосередньо або побічно з молекулою або білком, наприклад, антитілом. Мітка може бути детектована сама по собі (наприклад, радіоізотопні мітки або флуоресцентні мітки) або, у випадку ферментної мітки, може каталізувати хімічну зміна сполуки субстрату або композиції, що можуть бути детектовані. Використовуваний у даному описі термін "тверда фаза" означає безводну форму, з якою може зчеплюватися антитіло за даним винаходом. Приклади твердих фаз, охоплених даним описом, включають тверді фази, утворені частково або цілком зі скла (наприклад, скло з контрольованим розміром пор), полісахаридів (наприклад, агарози), поліакриламідів, полістиролу, полівінілового спирту і силіконів. У визначених варіантах здійснення, залежно від контексту, тверда фаза може включати ямку аналітичного планшета; в інших випадках вона являє собою колонку для очищення (наприклад, колонку для афінної хроматографії). Одержання антитіл Селекція і трансформація клітин-хазяїнів Представлені в даному описі придатні клітини-хазяїни для клонування або експресії ДНК у векторах являють собою прокаріотичні, дріжджові клітини або клітини вищих еукаріот. Придатні для даних цілей прокаріоти включають як грампозитивні, так і грамнегативні організми, наприклад, ентеробактерії, такі як E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, Serratia і Shigella, а також Bacilli, Pseudomonas і Streptomyces. Переважним хазяїном для клонування типу E. coli є E. coli 294 (ATCC 31,446), хоча інші штами, такі як E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31,537) і E. coli W3110 (ATCC 27,325) також є придатними. Ці приклади є більш ілюстративними, ніж обмежуючими. Крім прокаріот, еукаріотичні мікроби, такі як міцеліальні гриби або дріжджі, є придатними хазяїнами для клонування або експресії векторів, що кодують антитіло. Saccharomyces cerevisiae є найбільше широко використовуваним серед нижчих еукаріотичних мікроорганізмівхазяїнів. Однак ряд інших родів, видів і штамів широко доступний і використовується в даному винаході, наприклад, Schizosaccharomyces pombe; Kluyveromyces; Candida; Thchoderma; Neurospora crassa; і міцеліальні гриби, такі як, наприклад, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, і організми-хазяїни Aspergillus, такі як A. nidulans і A. niger. Придатні клітини-хазяїни для експресії глікозильованих антитіл виділені з багатоклітинних організмів. В принципі, будь-яка культура вищих еукаріотичних клітин є працездатною, будь то культура клітин від хребетного або безхребетного. Приклади клітин безхребетного включають клітини рослин і комах, Luckow et al., Bio/Technology 6, 47-55 (1988); Miller et al., Genetic Engineering, Setlow et al. eds. Vol. 8, pp. 277-279 (Plenam publishing 1986); Mseda et al., Nature 315, 592-594 (1985). Були ідентифіковані численні бакуловірусні штами і варіанти і відповідні пермісивні клітини-хазяїни комах від хазяїнів, таких як Spodoptera frugiperda (гусінь), Aedes (комар), Drosophila melanogaster (плодова мушка) і Bombyx mori. Різноманітні вірусні штами є загальнодоступними, наприклад, L-1 варіант Autographa californica NPV і штам Bm-5 Bombyx mori NPV, і такі віруси можуть бути в даному описі використані як вірус згідно із даним винаходом, конкретно, для трансфекції клітин Spodoptera frugiperda. Крім того, культури рослинних клітин бавовни, кукурудзи, картоплі, сої, петунії, томата і тютюну також можуть бути використані як клітини-хазяїни. Клітини хребетних і ріст і розмноження клітин хребетних у культурі (тканинній культурі) є звичайною процедурою. Див. публікацію Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Patterson, eds. (1973). Прикладами придатних для використання клітинних ліній ссавців, що виступають у ролі клітин-хазяїнів, є клітини нирок мавпи; лінія ембріональних клітин нирки; клітини нирки новонародженого хом'яка; клітини яєчника китайського хом'ячка/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980)); мишачі клітини Сертолі (Sertoli); клітини карциноми шейки матки людини (HELA); клітини нирки собаки; клітини легені людини; клітини печінки людини; пухлинні клітини молочної залози; і клітини NSO. Клітини-хазяїни трансформуються вищеописаними векторами для продукування антитіла і культивуються в придатній поживному середовищі, модифікованому придатним чином для 15 UA 101603 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 індукування промоторів, селекції трансформантів або ампліфікації генів, що кодують цільові послідовності. Клітини-хазяїни, використовувані для продукування варіанта антитіла за даним винаходом, можна культивувати в різноманітних середовищах. Комерційно доступні середовища, такі як Ham F10 (Sigma), мінімальне підтримуюче середовище (MEM, Sigma), RPMI-1640 (Sigma) і модифіковане Дульбекко середовище Голка (DMEM, Sigma), є придатними для культивування клітин-хазяїнів. Крім того, кожне із середовищ, описаних у публікації Ham et al., Meth. Enzymol. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102: 255 (1980), патент США № 4767704; 4657866; 4560655; 5122469; 5712163; або 6048728, може бути використане як культуральне середовище для клітин-хазяїнів. Кожне з цих середовищ може бути за необхідністю забезпечене гормонами і/або іншими факторами росту (такими як інсулін, трансферин або фактор росту епідермісу), солями (такими як X-хлориди, де X являє собою натрій, кальцій, магній; і фосфати), буферами (такими як HEPES), нуклеотидами (такими як аденозин і тимідин), антибіотиками (такими як лікарський засіб ГЕНТАМІЦИН.TM.), слідовими елементами (визначеними як неорганічні сполуки, що зазвичай присутні в кінцевій концентрації, що знаходиться в мікромолярному діапазоні) і глюкозою або еквівалентним джерелом енергії. Будь-які інші необхідні добавки також включені в придатних концентраціях, що відомі фахівцю в даній галузі. Умови культивування, такі як температура, pН тощо, являють собою умови, що раніше використовувалися для клітин-хазяїнів, вибраних для експресії, і ці умови очевидні фахівцю в даній галузі. Очищення антитіл При використанні рекомбінантних методів антитіло може продукуватися внутрішньоклітинно в периплазматичному просторі або може безпосередньо секретуватися в середовище. Якщо варіант антитіла продукується внутрішньоклітинно, як перша стадія може віддалятися нерозчинний дебрис або у вигляді клітин-хазяїнів, або лізованих фрагментів шляхом центрифугування або ультрафільтрації. У публікації Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992) описана методика виділення антитіл, що секретуються в периплазматичний простір E. coli. У короткому викладі, клітинна маса розморожується в присутності ацетату натрію (pН 3,5), EDTA і фенілметилсульфонілфториду (PMSF) протягом приблизно 30 хвилин. Клітинний дебрис може бути вилучений центрифугуванням. У випадку, де варіант антитіла секретується в середовище, супернатанти з таких експресуючих систем, як правило, спочатку концентрують з використанням комерційно доступного фільтра для концентрації білка, наприклад, установки для ультрафільтрації фірми Amicon або Millipore Pellicon. Протеазний інгібітор, такий як PMSF, може бути включений на кожній з вищеописаних стадій для інгібування протеолізу, і антибіотики можуть бути включені для запобігання росту випадкових забруднень. Композиція, що містить антитіла, одержана з клітин, може бути очищена з використанням, наприклад, хроматографії з гідроксилапатитом, гель-електрофорезу, діалізу й афінної хроматографії, причому афінна хроматографія є переважним методом очищення. Придатність білка A як афінного ліганду залежить від виду і ізотопу будь-якого імуноглобулінового Fcдомену, що є присутнім у варіанті антитіла. Білок A може бути використаний для очищення антитіл на основі важких ланцюгів IgGI, IgG2 або IgG4 людини (Lindmark et al., J. Immunol Meth. 62: 1-13 (1983)). Білок G рекомендований для всіх мишачих ізотипів і для IgG3 людини (Guss et al., EMBO J. 5: 1567-1575 (1986)). Форма, до якої приєднується афінний ліганд, найбільш часто являє собою агарозу, але інші форми також доступні. Механічно стабільні форми, такі як скло з контрольованим розміром пор або полі(стиролдивініл)бензол, допускають більш високі швидкості потоку і менший час процесування, ніж ті, що можуть бути досягнуті з використанням агарози. У випадку, де варіант антитіла включає домен CH3, для очищення використовується смола Bakerbond ABXTM (J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.). Залежно від одержуваного варіанта антитіла також доступні інші методи очищення білка, такі як фракціонування на іонообмінній колонці, осадження етанолом, обернено-фазова ВЕРХ, хроматографія на силікагелі, хроматографія на гепарин-СЕФАРОЗІ, хроматографія на аніонообмінній або катіонообмінній смолі (така як з використанням колонки з поліаспарагіновою кислотою), хроматофокусування, SDS-PAGE і осадження сульфатом амонію. Після будь-якої попередньої стадії(й) очищення суміш, що містить варіант цікавлячого антитіла, і домішки можуть бути піддані хроматографії гідрофобної взаємодії при низькому pН з використанням буфера для елюювання, що має значення pН приблизно 2,5-4,5, причому хроматографію переважно здійснюють при низьких концентраціях солі (наприклад, приблизно від 0-0,25M солі). 16 UA 101603 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Фармацевтичні композиції Терапевтичні композиції, що містять поліпептид або антитіло, можуть бути одержані для збереження у вигляді ліофілізованих композицій або водних розчинів шляхом змішування поліпептиду, що має цільовий ступінь чистоти, з необов'язковими "фармацевтично прийнятними" носіями, ексципієнтами або стабілізаторами, зазвичай використовуваними в даній галузі (всі з яких позначаються терміном "ексципієнти"). Наприклад, буферні агенти, стабілізуючі агенти, консерванти, ізотонічні агенти, неіонні детергенти, антиоксиданти й інші різноманітні добавки. (Див. публікацію Remingtоn's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, A. Osol, Ed. (1980)). Такі добавки повинні бути нетоксичними для реципієнтів у використовуваних дозуваннях і концентраціях. Буферні агенти допомагають підтримувати рівень pН в інтервалі, що наближений до фізіологічних умов. Вони переважно присутні в концентрації, що знаходиться в інтервалі приблизно від 2 мМ до приблизно 50 мМ. Придатні буферні агенти для використання за даним винаходом включають як органічні, так і неорганічні кислоти, і їх солі, такі як цитратні буфери (наприклад, суміш мононатрію цитрату-динатрію цитрату, суміш лимонної кислоти-тринатрію цитрату, суміш лимонної кислоти-мононатрію цитрату і т.д.), сукцинатні буфери (наприклад, суміш бурштинової кислоти-мононатрію сукцинату, суміш бурштинової кислоти-натрію гідроксиду, суміш бурштинової кислоти-динатрію сукцинату і т.д.), тартратні буфери (наприклад, суміш винної кислоти-натрію тартрату, суміш винної кислоти-калію тартрату, суміш винної кислоти-натрію гідроксиду і т.д.), фумаратні буфери (наприклад, суміш фумарової кислотимононатрію фумарату, суміш фумарової кислоти-динатрію фумарату, суміш мононатрію фумарату-динатрію фумарату і т.д.), глюконатні буфери (наприклад, суміш глюконової кислотинатрію глюконату, суміш глюконової кислоти-натрію гідроксиду, суміш глюконової кислоти-калію глюконату, і т.д.), оксалатний буфер (наприклад, суміш щавлевої кислоти-натрію оксалату, суміш щавлевої кислоти-натрію гідроксиду, суміш щавлевої кислоти-калію оксалату і т.д.), лактатні буфери (наприклад, суміш молочної кислоти-натрію лактату, суміш молочної кислотинатрію гідроксиду, суміш молочної кислоти-калію лактату і т.д.) і ацетатні буфери (наприклад, суміш оцтової кислоти-натрію ацетату, суміш оцтової кислоти-натрію гідроксиду і т.д.). Додатково, можна відзначити фосфатні буфери, гістидинові буфери і солі триметиламіну, такі як Tris. Для затримки мікробного росту можуть бути додані консерванти в кількостях, що знаходяться в інтервалі, що складає 0,2 %-1 % (мас./об.). Придатні консерванти для використання за даним винаходом включають фенол, бензиловий спирт, метакрезол, метилпарабен, пропілпарабен, октадецилдиметилбензиламонію хлорид, бензалконію галогеніди (наприклад, хлорид, бромід, йодид), гексаметонію хлорид, алкілпарабени, такі як матилпарабен або пропілпарабен, катехін, резорцин, циклогексанол і 3-пентанол. Ізотонічні агенти, іноді відомі як "стабілізатори", можуть бути додані для гарантії ізотонічності рідких композицій за даним винаходом і включають багатоатомні цукрові спирти, переважно триатомні або вищі цукрові спирти, такі як гліцерин, еритрит, арабіт, ксиліт, сорбіт і маніт. Стабілізатори позначають широкий спектр ексципієнтів, функціональний інтервал яких може являти собою від наповнювача до добавки, що солюбілізує терапевтичний агент або допомагає запобігти денатурації або адгезії на стінці контейнера. Типові стабілізатори можуть являти собою багатоатомні цукрові спирти (перераховані вище); амінокислоти, такі як аргінін, лізин, гліцин, глутамін, аспарагін, гістидин, аланін, орнітин, L-лейцин, 2-фенілаланін, глутамінова кислота, треонін і т.д., органічні цукри або цукрові спирти, такі як лактоза, трегалоза, стахіоза, маніт, сорбіт, ксиліт, рибіт, міоінізит, галактит, гліцерин тощо, включаючи цикліти, такі як інозит; поліетиленгліколь; полімери амінокислот; сірковмісні відновні агенти, такі як сечовина, глутатіон, тіоктова кислота, натрію тіогліколят, тіогліцерин, альфа-монотіогліцерин і натрію тіосульфат; низькомолекулярні поліпептиди (тобто