Спосіб одержання гібридного насіння

1. Спосіб одержання штучного гібридного насіння для вирощування потомства гібридної рослини, що включає: (a) одержання індуцибельно стерильної трансгенної першої батьківської рослини, що містить у своєму геномі конструкцію рекомбінантної ДНК, яка містить промотор, функціонально зв’язаний з ДНК, яка транскрибується в РНК, що містить: 2 (19) 1 3 дегалогенази 2,2-дихлорпропіонової кислоти, синтетази ацетогідроксикислот, ацетолактатсинтази, галоарилнітрилази, модифікованої карбоксилази ацетил-коферменту A, дигідроптероатсинтази, поліпептиду фотосистеми II масою 32 кДа, антранілатсинтази, синтетази дигідродипіколінової кислоти, фітоендесатурази, гідроксифенілпіруватдіоксигенази, модифікованої протопорфіриногеноксидази I і арилоксіалканоатдіоксигенази. 7. Спосіб за п. 1, де: (a) вказана репродуктивна тканина являє собою чоловічу репродуктивну тканину, вказана перша батьківська рослина є індуцибельною відносно чоловічої стерильності, а вказана друга батьківська рослина є нормально фертильною; або (b) вказана репродуктивна тканина являє собою чоловічу репродуктивну тканину, вказана перша батьківська рослина є індуцибельною відносно чоловічої стерильності, а вказана друга батьківська рослина має жіночу стерильність; або (c) вказана репродуктивна тканина являє собою чоловічу репродуктивну тканину, вказана перша батьківська рослина є індуцибельною відносно чоловічої стерильності, а вказана друга батьківська рослина є індуцибельною відносно жіночої стерильності; або (d) вказана репродуктивна тканина являє собою жіночу репродуктивну тканину, вказана перша батьківська рослина є індуцибельною відносно жіночої стерильності, а вказана друга батьківська рослина є нормально фертильною; або (e) вказана репродуктивна тканина являє собою жіночу репродуктивну тканину, вказана перша батьківська рослина є індуцибельною відносно жіночої стерильності, а вказана друга батьківська рослина має чоловічу стерильність; або (f) вказана репродуктивна тканина являє собою жіночу репродуктивну тканину, вказана перша батьківська рослина є індуцибельною відносно жіночої стерильності, а вказана друга батьківська рослина є індуцибельною відносно чоловічої стерильності. 8. Спосіб за п. 1, де: (a) вказана репродуктивна тканина являє собою чоловічу репродуктивну тканину, вказана перша батьківська рослина є індуцибельною відносно чоловічої стерильності, а вказана друга батьківська рослина включає другу трансгенну батьківську рослину з індукованою жіночою стерильністю, що містить у своєму геномі конструкцію рекомбінантної ДНК, яка транскрибується в РНК, що містить: (і) щонайменше одну екзогенну ділянку розпізнавання мкРНК, яка розпізнається другою зрілою мкРНК, що специфічно експресується в жіночій репродуктивній тканині вказаної другої батьківської рослини, і (ii) другу матричну РНК, що кодує другий білок, який забезпечує стійкість до другого гербіциду; де вказана друга зріла мкРНК специфічно супресує експресію вказаного другого білка у вказаній жіночій репродуктивній тканині, і де жіноча стерильність вказаної другої батьківської рослини індукується застосуванням вказаного другого гербіциду до вказаної другої батьківської рослини; або 95614 4 (b) вказана репродуктивна тканина являє собою жіночу репродуктивну тканину, вказана перша батьківська рослина є індуцибельною відносно жіночої стерильності, а вказана друга батьківська рослина включає другу трансгенну батьківську рослину з індукованою чоловічою стерильністю, що містить у своєму геномі конструкцію рекомбінантної ДНК, яка транскрибується в РНК, що містить: (і) щонайменше одну екзогенну ділянку розпізнавання мкРНК, яка розпізнається другою зрілою мкРНК, що специфічно експресується в чоловічій репродуктивній тканині вказаної другої батьківської рослини, і (ii) другу матричну РНК, що кодує другий білок, який забезпечує стійкість до другого гербіциду; де вказана друга зріла мкРНК специфічно супресує експресію вказаного другого білка у вказаній чоловічій репродуктивній тканині, і де чоловіча стерильність вказаної другої батьківської рослини індукується застосуванням вказаного другого гербіциду до вказаної другої батьківської рослини. 9. Спосіб за п. 8, де вказаний перший гербіцид і вказаний другий гербіцид: (a) є ідентичними; або (b) є різними. 10. Спосіб за п. 8, де щонайменше один із вказаного першого гербіциду і вказаного другого гербіциду містить системний гербіцид. 11. Спосіб за п. 8, де щонайменше один із вказаного першого гербіциду і вказаного другого гербіциду містить щонайменше один гербіцид, вибраний із групи, яка складається з гліфосату, дикамби, глуфосинату, сульфонілкарбамідів, імідазолінонів, бромоксинілу, 2,2-дихлорпропіонової кислоти, інгібіторів ацетолактатсинтази, циклогександіону, арилоксифеноксипропіонату, сульфонамідних гербіцидів, триазинових гербіцидів, 5метилтриптофану, аміноетилцистеїну, піридазинонових гербіцидів, циклопропілізоксазолових гербіцидів, інгібіторів протопорфіриногеноксидази і гербіцидів, що містять аліроксіалканоатну групу. 12. Спосіб за п. 8, де вказана перша і вказана друга матрична РНК: (a) є ідентичними; або (b) є різними. 13. Спосіб за п. 1, де вказане штучне гібридне насіння являє собою насіння кукурудзи. 14. Потомство гібридної рослини, яке відрізняється покращеними аргономічними показниками і, яке одержане людиною, використовуючи індуцибельно стерильну, трансгенну першу батьківську рослину за п. 1. 15. Індуцибельно стерильна трансгенна рослина, що містить у своєму геномі конструкцію рекомбінантної ДНК, яка транскрибується в РНК, що містить: (a) щонайменше одну екзогенну ділянку розпізнавання мкРНК, яка розпізнається зрілою мкРНК, що специфічно експресується в репродуктивній тканині вказаної рослини; і (b) матричну РНК, що кодує білок, який забезпечує стійкість до гербіциду; 5 95614 6 де вказана зріла мкРНК специфічно супресує експресію вказаного білка в вказаній репродуктивній тканині, де стерильність вказаної трансгенної рослини індукується застосуванням вказаного гербіциду до вказаної рослини. 16. Індуцибельно стерильна трансгенна рослина за п. 15, де: (a) вказана репродуктивна тканина являє собою чоловічу репродуктивну тканину, а вказана стерильність являє собою чоловічу стерильність; або (b) вказана репродуктивна тканина являє собою жіночу репродуктивну тканину, а вказана стерильність являє собою жіночу стерильність. 17. Індуцибельно стерильна трансгенна рослина за п. 15, де вказана репродуктивна тканина містить запліднений насінний зачаток, а вказана стерильність є результатом нездатності заплідненого насінного зачатка розвиватися в життєздатне насіння. 18. Індуцибельно стерильна трансгенна рослина за п. 15, де вказана рослина являє собою сільськогосподарську культуру, вирощувану з насіння. 19. Індуцибельно стерильна трансгенна рослина за п. 15, де вказана рослина вибрана з кукурудзи, рису, пшениці, вівса, ячменю, жита, тритикале, проса, сорго, лободи, амаранту, гречки, кормових трав, дернових трав, люцерни, бавовни, сафлору, соняшника, каноли, сої, рапсу, льону, арахісу, бобових, гороху, сочевиці, люцерни, салату, спаржі, артишоку, селери, моркви, редису, капусти, кормової капусти, гірчиці, броколі, цвітної капусти, брюссельської капусти, турнепсу, кольрабі, огірка, кавуна, кабачків, гарбуза, цибульних, часнику, цибулі-порею, цибулі, шніт-цибулі, томатів, баклажанів, перцю, фізаліса, буряка, листового буряка, шпинату, декоративних рослин і лісових порід. 20. Конструкція рекомбінантної ДНК, яка транскрибується в РНК, що містить: (a) щонайменше одну екзогенну ділянку розпізнавання мкРНК, яка розпізнається зрілою мкРНК, що специфічно експресується в репродуктивній тканині рослини; і (b) матричну РНК, що кодує білок, який забезпечує стійкість до гербіциду. 21. Конструкція рекомбінантної ДНК за п. 20, де вказана щонайменше одна екзогенна ділянка розпізнавання мкРНК розташована щонайменше у межах однієї з: (a) області з 5'-кінця від кодуючої послідовності вказаної першої матричної РНК; (b) області з 3'-кінця від кодуючої послідовності вказаної першої матричної РНК; і (c) вказаної першої матричної РНК. 22. Конструкція рекомбінантної ДНК за п. 20, де вказана зріла мкРНК являє собою щонайменше одну, вибрану з мкРНК, визначених у таблицях 1, 2, 3, 4, 5 і 6. 23. Конструкція рекомбінантної ДНК за п. 20, де вказана конструкція рекомбінантної ДНК додатково містить щонайменше один елемент, вибраний з: (a) рослинного промотору; (b) елемента генної супресії; (c) інтрона; (d) елементу генної експресії: (e) ДНК, що транскрибується в аптамер РНК, здатний до зв'язування ліганду; (f) ДНК, що транскрибується в аптамер РНК, здатний до зв'язування ліганду і ДНК, що транскрибується в регуляторну РНК, здатну до регуляції експресії послідовності-мішені, що характеризується тим, що вказана регуляція залежить від конформації вказаної регуляторної РНК, і вказана конформація вказаної регуляторної РНК алостерично регулюється станом зв'язування вказаного аптамеру РНК; і (g) щонайменше однієї межі О-ДНК. 24. Конструкція рекомбінантної ДНК за п. 20, де вказаний білок, який забезпечує стійкість, являє собою щонайменше один білок, вибраний із групи, яка складається з 5-енолпірувілшикімат-3фосфатсинтази, 5-енолпірувілшикімат-3фосфатсинтази з лінії Agrobacterium tumefaciens CP4, гліфосатоксидоредуктази, гліфосатацетилтрансферази, гліфосатдекарбоксилази, pat, bar, монооксигенази дикамби, дегалогенази 2,2дихлорпропіонової кислоти, синтетази ацетогідроксикислот, ацетолактатсинтази, галоарилнітрилази, модифікованої карбоксилази ацетилкоферменту A, дигідроптероатсинтази, поліпептиду фотосистеми II масою 32 кДа, антранілатсинтази, синтетази дигідродипіколінової кислоти, фітоендесатурази, гідроксифенілпіруватдіоксигенази, модифікованої протопорфіриногеноксидази I і арилоксіалканоатдіоксигенази. Вимога пріоритету і посилання на зв’язані зая 2005 року), "38-21(54232)B.rpt" (розмір файлу 68 кілобайт, записаний 7 серпня 2006 року і поданий разом з попередньою заявкою США 60/836246 7 серпня 2006 року) і "38-21(54232)C.rpt" (розмір файлу 70 кілобайт, записаний 19 вересня 2006 року і поданий разом з попередньою заявкою США хх/хххххх 20 вересня 2006 року) включені в даний документ як посилання в повному обсязі. Галузь винаходу Даний винахід стосується способів одержання гібридного насіння і індуцибельно стерильних тра вки За даною заявкою вимагається пріоритет попередніх патентних заявок США № 60/726106, поданої 13 жовтня 2005 року, і 60/836246, поданої 7 серпня 2006 року, що включені в даний документ як посилання в повному обсязі. Включення списків послідовностей Списки послідовностей, що містяться у файлах "38-21(54232)A.rpt" (розмір файлу 61 кілобайт, записаний 12 жовтня 2005 року і поданий разом з попередньою заявкою США 60/726106 13 жовтня 7 нсгенних рослин і молекулярних конструкцій, що можуть використовуватися в таких способах. Гібридне насіння, тобто, насіння, отримане за допомогою схрещування або перехресного запилення близькородинних рослин, можна вирощувати в гібридні рослини-нащадки, що володіють "гетерозисом" або бажаним поєднанням властивостей, яких немає в кожної з батьківських рослин (які, як правило, є самозапилювальними рослинами). Гібридні рослини можуть виявляти чудові характеристики агрономічної ефективності, включаючи поліпшення розміру рослини, врожайність, харчовий склад, стійкість до хвороб, стійкість до гербіцидів, стійкість до стресів (жара, холод, посуха, поживні речовини, солі), кліматичну адаптацію й інші бажані властивості. Для ефективного одержання гібридного насіння необхідно, щоб перехресне запилення переважало над самозапиленням. Основним обмеженням при одержанні гібридного насіння для багатьох сільськогосподарських культур є відсутність простих, надійних і економічно вигідних способів формування стерильності щонайменше в одного батька (зокрема в чоловічого батька з формуванням чоловічої стерильності, залишаючи жіночі гамети недоторканими і доступними для запилення придатним донором пилка). Чоловіча стерильність також може використовуватися, якщо небажане поширення пилка, наприклад, від домашньої рослини до її диких родичів, або коли небажане запилення квітки, наприклад, у випадку декоративних квіткових рослин, властивості яких після запилення погіршуються. Чоловічої стерильності можна досягти, наприклад, за допомогою фізичного видалення органів, що містять чоловічі гамети. У деяких видів це нескладний, але трудомісткий і, отже, дорогий процес (наприклад, видалення мітелок у кукурудзи). В інших видів таке фізичне вихолощування ускладнене внаслідок анатомічних особливостей рослини. Альтернативні способи, до яких не належить ручне або фізичне вихолощування, можуть забезпечити значну економічну вигоду. Як спосіб одержання рослин, що володіють чоловічою стерильністю, також описані хімічні гаметоциди. Як правило, такий хімічний гаметоцид являє собою гербіцидну сполуку, що при нанесенні на рослину на відповідній стадії розвитку або до статевої зрілості, здатна до знищення або істотного обмеження розвитку чоловічих гамет рослини, залишаючи жіночі гамети рослини, або щонайменше значну їхню частину, здатними перетерплювати перехресне запилення. Наприклад, у кукурудзу генетично вбудована стійкість до гліфосату (патент США № 5554798), а застосування гербіциду гліфосату (N-фосфонометилгліцин) як гаметоциду і трансгенних рослин, які вегетативно і відносно жіночих гамет стійкі до гліфосату, але відносно чоловічих гамет чуттєві до гліфосату, описано в патенті США № 4735649 і в публікації міжнародної патентної заявки РСТ WO99/46396A2. Однак, рівні гліфосату, необхідні для знищення більшості чоловічих гамет, зберігаючи достатню кількість жіночих гамет здатними до запилення, часто приводить до затримки росту або хлорозу рослин. Таким 95614 8 чином, основною перешкодою для застосування гліфосату як гаметоциду, як це в більшості випадків вірно для більшості хімічних гаметоцидів, є фітотоксичні побічні ефекти, які є результатом відсутності достатньої міри селективності відносно гамет. Комерційне одержання гібридного насіння із застосуванням хімічних гаметоцидів в основному обмежено відсутністю в них, у більшості випадків, селективності відносно гамет. Сполуки, що володіють деякою селективністю відносно спрямованості в більшій мірі на гамети, чим на вегетативні тканини, як правило, є невиборними щодо статі гамет, які руйнуються. Таким чином, способи поліпшення селективності хімічного гаметоциду могли б бути дуже бажаними. Ще більш бажані способи, що дозволяють одержати першу батьківську рослину, що має чоловічу стерильність, і другу батьківську рослину, що має жіночу стерильність, таким чином, гарантуючи, що отримані насіння будуть результатом схрещування між двома батьківськими рослинами, а не самозапилення. Даний винахід стосується способів одержання гібридного насіння і додатково стосується конструкцій рекомбінантної ДНК, хромосом трансгенних рослин, клітин, рослин і насіння, що містять такі конструкції, придатні в цих способах. Конструкції рекомбінантної ДНК, хромосоми трансгенних рослин, клітини, рослини і насіння і способи їх застосування для одержання гібридного насіння надають значно поліпшений шлях для застосування гербіцидів як хімічних гаметоцидів. Конструкції рекомбінантної ДНК за даним винаходом включають екзогенну ділянку розпізнавання мікроРНК, забезпечуючи те, що експресія матричної РНК, що кодує білок, який забезпечує стійкість до гербіциду, знаходиться під контролем, мікроРНК, ендогенної для рослини, в якій транскрибується конструкція рекомбінантної ДНК. МікроРНК (мкРНК) являють собою некодуючі білки РНК, як правило, приблизно з 19-25 нуклеотидів (як правило, приблизно 20-24 нуклеотидів у рослинах), що регулюють розщеплення транскриптів-мішеней у транс-положенні, негативно регулюючи експресію генів, залучених у різні регуляторні шляхи і шляхи розвитку (Bartel (2004) Cell, 116:281-297). У деяких випадках, мкРНК служать для регуляції ін-фазної обробки первинних транскриптів міРНК (дивись Allen et al. (2005) Cell, 121:207-221). Ідентифіковані і знаходяться в загальному доступі в базі даних ("miRBase", доступна в інтерактивному режимі за адресою microma.sanger.ac.uk/sequences) деякі гени мікроРНК (гени MIR). Заявники описали нові гени MIR, зрілі мкРНК і ділянки розпізнавання мкРНК у патентній заявці США 11/303745, зареєстрованої 15 грудня 2005 року. Додаткові гени MIR і зрілі мкРНК також описані в публікаціях патентних заявок США 2005/0120415 і 2005/144669А1. Повідомлялося, що гени MIR у геномі зустрічаються в міжгенних областях, окремо або в кластерах, а також можуть бути частково або цілком розташовані в межах інтронів інших генів (кодуючих білки і не кодуючих білки). Як нещодавній огляд біогенезу 9 мкРНК, дивись Kim (2005) Nature Rev. Mol. Cell Biol., 6:376-385. Транскрипція генів MIR, щонайменше в деяких випадках, може знаходиться під власним контролем гена MIR. Імовірно, що транскрипція генів MIR, як правило, опосередковується РНК-полімеразою II (дивись, наприклад, Aukerman and Sakai (2003) Plant Cell, 15:2730-2741; Parizotto et al. (2004) Genes Dev., 18:2237-2242), i, таким чином, могла б піддаватися способам придушення транскрипції генів, що використовували для інших транскрибованих полімеразою II генів. Первинний транскрипт (який може бути поліцистронним) назвали "при-мкРНК", молекула-попередник мкРНК, що може бути дуже великою (кілька тисяч нуклеотидів), містить одну або декілька локальних дволанцюжкових або "шпилькових" областей, а також звичайний 5'-"кеп" і поліаденілований кінець мРНК. Дивись, наприклад, фігуру 1 у Kim (2005) Nature Rev. Mol. Cell Biol., 6:376-385. Думають, що в рослинних клітинах молекулипопередниці мікроРНК піддаються процессингу переважно в ядрі. У рослинах мкРНК і міРНК формуються особливими DICER-подібними (DCL) ферментами, а в Arabidopsis думають, що для утворення зрілої мкРНК необхідний ядерний фермент DCL (Xie et al. (2004) PLo Biol., 2:642-652). Додаткові огляди про біогенез і функцію мікроРНК знаходяться, наприклад, у Bartel (2004) Cell, 116:281297; Murchison and Harmon (2004) Curr. Opin. Cell Biol., 16:223-229; і Dugas and Bartel (2004) Curr. Opin. Plant Biol., 7:512-520. Таким чином, мікроРНК можна описати з погляду РНК (наприклад, послідовність РНК зрілої мкРНК або молекула РНК попередниця мкРНК), або з погляду ДНК (наприклад, послідовність ДНК, що відповідає послідовності РНК зрілої мкРНК або послідовність ДНК, що кодує ген MIR або фрагмент гена MIR або попередник мкРНК). Думають, що сімейства генів MIR нараховують 1% щонайменше деяких геномів і здатні впливати або регулювати експресію приблизно третини всіх генів (дивись, наприклад, Tomari et al. (2005) Curr Biol., 15:R61-64; G. Tang (2005) Trends Biochem. Sci., 30:106-14; Kim (2005) Nature Rev. Mol. Cell Biol., 6:376-385). Тому що мкРНК є важливими регуляторними елементами в еукаріот, включаючи тварин і рослини, трансгенна супресія мкРНК могла б, наприклад, привести до розуміння важливих біологічних процесів або дозволити регуляцію деяких шляхів (наприклад, регуляцію клітинного диференціювання, проліферації й апоптозу), застосовну, наприклад, у біотехнологічних додатках. Дивись, наприклад, O'Donnell et al. (2005) Nature, 435:839-843; Cai et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102:5570-5575; Morris and McManus (2005) Sci. STKE, pe41 (stke.sciencemag.org/cgi/reprint/sigtrans;2005/297/pe 41.pdf). Гени мікроРНК (MIR) мають характерні ознаки, включаючи консервативність серед видів рослин, стабільну самогібридизуючюся структуру і процесинг специфічного дуплекса мкРНК/мкРНК* Dicer-подібними ферментами (Ambros et al. (2003) РНК, 9:277-279). Ці ознаки використовують для ідентифікації мкРНК і відповідних їм генів у рослин (Хіе et al. (2005) Plant Physiol, 138:2145-2154; 95614 10 Jones-Rhoades and Bartel (2004) Mol. Cell, 14:787799; Reinhart et al. (2002) Genes Dev., 16:16161626; Sunkar and Zhu (2004) Plant Cell, 16:20012019). Загальнодоступні гени мікроРНК каталогізовані в miRBase (Griffiths-Jones et al. (2003) Nucleic Acids Res., 31:439-441). МкРНК у Arabidopsis експресуються в багатьох конкретних типах клітин (дивись, наприклад, Kidner and Martienssen (2004) Nature, 428:81-84, Millar and Gubler (2005) Plant Cell, 17:705-721). Супресія може обмежуватися бічним, крайовим або іншим розподілом між типами клітин, думають, що вона необхідна для правильного формування і специфікації типів клітин (дивись, наприклад, Palatnik et al. (2003) Nature, 425:257-263). У трансгенному Arabidopsis виявлено, що супресія репортерного гена GFP, що містить ендогенну ділянку розпізнавання mi171 обмежує експресію специфічними клітинами (Parizotto et al. (2004) Genes Dev., 18:2237-2242). Ділянки розпізнавання мкРНК були підтверджені у всіх областях мРНК, включаючи 5'нетрансльовану область, що кодує область і 3'нетрансльовану область, що свідчить, що положення дільниці-мішені мкРНК щодо кодуючої послідовності, не обов'язково може викликати супресію (дивись, наприклад, Jones-Rhoades and Bartel (2004). Mol. Cell, 14:787-799, Rhoades et al. (2002) Cell, 110:513-520, Allen et al. (2004) Nat. Genet., 36:1282-1290, Sunkar and Zhu (2004) Plant Cell, 16:2001-2019). Зрілі мкРНК, описані в даному документі, процесуються з генів MIR, що, як правило, належать до канонічних сімейств, консервативних у видів рослин, що знаходяться в далекому спорідненні. Ці гени MIR і кодовані ними зрілі мкРНК також придатні, наприклад, для модифікації напрямків розвитку, наприклад, впливаючи на диференціювання або морфогенез клітин (дивись, наприклад, Palatnik et al. (2003) Nature, 425:257-263; Mallory et al. (2004) Curr. Biol, 14:1035-1046); для того, щоб служити як джерела послідовностей для конструйованих (не зустрічаються в природі) мкРНК, що розробляють для придушення експресії послідовностей, відмінних від транскриптів, що є мішенями послідовностей, що зустрічаються в природі, мкРНК (дивись, наприклад, Parizotto et al. (2004) Genes Dev., 18:2237-2242; також дивись публікації патентних заявок США 2004/3411А1 і 2005/0120415), і для стабілізації длРНК. Ген MIR (або його природні 5'- або 3'-нетрансльовані області, або його природний промотор або інші елементи, залучені в його транскрипцію) сам придатний як ген-мішень для генної супресії (наприклад, способами за даним винаходом), де бажана супресія мкРНК, кодованої геном MIR. Промотори генів MIR можуть мати дуже специфічні профілі експресії (наприклад, клітинно-специфічний, тканиноспецифічний або часоспецифічний) і, таким чином, придатні в рекомбінантних конструкціях для індукції такої специфічної транскрипції послідовності ДНК, з якою вони функціонально зв'язані. Даний винахід стосується способів одержання гібридного насіння, із застосуванням конструкцій рекомбінантної ДНК, що включає ділянки розпізнавання, які відповідають новим зрілим мкРНК із 11 конкретними профілями експресії в сільськогосподарських культурах. Конструкції рекомбінантної ДНК за винаходом транскрибуються в РНК, що містить: (а) щонайменше одну екзогенну ділянку розпізнавання мкРНК, що розпізнається зрілою мкРНК, яка специфічно експресується в репродуктивній тканині рослини; і (b) матричну РНК, що кодує білок, який забезпечує стійкість до гербіциду. Ці конструкції придатні для одержання і застосування хромосом, клітин, саджанців і насіння трансгенних рослин, включаючи індуковано стерильні трансгенні рослини, придатні, наприклад, для одержання гібридного насіння. Суть винаходу В одному з аспектів даний винахід стосується способу одержання штучного гібридного насіння, що включає стадії: (а) одержання індуковано стерильної трансгенної першої батьківської рослини, що містить у своєму геномі конструкцію рекомбінантної ДНК, яка транскрибується в РНК, що містить: (і) щонайменше одну екзогенну ділянку розпізнавання мкРНК, яка розпізнається зрілою мкРНК, що специфічно експресується в репродуктивній тканині першої батьківської рослини; і (іі) першу матричну РНК, що кодує білок, який забезпечує стійкість до першого гербіциду, де зріла мкРНК специфічно супресує експресію білка в репродуктивній тканині, і де стерильність першої батьківської рослини індукується застосуванням першого гербіциду для першої батьківської рослини; (b) схрещування першої батьківської рослини з другою батьківською рослиною в умовах, де в першої батьківської рослини індукована стерильність, таким чином, одержуючи штучне гібридне насіння. В іншому аспекті даний винахід стосується способу одержання гібридного насіння, що включає стадії: (а) одержання першої батьківської рослини, включаючи трансгенну рослину, що виросла з клітини першої трансгенної рослини, яка містить у своєму геномі першу конструкцію рекомбінантної ДНК, що транскрибується в РНК, що містить (і) щонайменше одну екзогенну ділянку розпізнавання мкРНК, яка розпізнається першою зрілою мкРНК, і (іі) першу матричну РНК, що кодує білок, який забезпечує стійкість до першого гербіциду, де перша зріла мкРНК специфічно експресується в чоловічій репродуктивній тканині першої батьківської рослини, таким чином, специфічно супресуючи експресію білка в чоловічій репродуктивній тканині, і де чоловіча стерильність першої батьківської рослини індукується застосуванням першого гербіциду до першої батьківської рослини; (b) одержання другої батьківської рослини, включаючи трансгенну рослину, що виросла з клітини другої трансгенної рослини, яка містить у своєму геномі другу конструкцію рекомбінантної ДНК, що транскрибується в РНК, що містить (і) щонайменше одну екзогенну ділянку розпізнавання мкРНК, яка розпізнається другою зрілою мкРНК, і (іі) другу матричну РНК, що кодує білок, який забезпечує стійкість до другого гербіциду, де друга зріла мкРНК специфічно експресується в жіночій репродуктивній тканині другої батьківської рослини, таким чином, специфічно супресуючи експресію білка в жіночій 95614 12 репродуктивній тканині, і де жіноча стерильність другої батьківської рослини індукується застосуванням другого гербіциду до другої батьківської рослини; (с) застосування першого гербіциду і другого гербіциду до батьківських рослин, таким чином, індукуючи чоловічу стерильність у першій батьківській рослині і жіночу стерильність в другій батьківській рослині; (d) схрещування першої і другої батьківських рослин, де насінні зачатки першої батьківської рослини запилюються пилком другої батьківської рослини, таким чином, одержуючи гібридні насіння. У незалежному аспекті даний винахід стосується індуковано стерильної трансгенної рослини, що містить у своєму геномі конструкцію рекомбінантної ДНК, що транскрибується в РНК, що містить: (а) щонайменше одну екзогенну ділянку розпізнавання мкРНК, яка розпізнається зрілою мкРНК, що специфічно експресується в репродуктивній тканині рослини; і (b) матричну РНК, що кодує білок, який забезпечує стійкість до гербіциду; де зріла мкРНК специфічно супресує експресію білка в репродуктивній тканині, і де стерильність трансгенної рослини індукується застосуванням гербіциду до рослини. У ще одному додатковому аспекті даний винахід стосується конструкції рекомбінантної ДНК, що транскрибується в РНК, що містить: (а) щонайменше одну екзогенну ділянку розпізнавання мкРНК, яка розпізнається зрілою мкРНК, що специфічно експресується в репродуктивній тканині рослини; і (b) матричну РНК, що кодує білок, який забезпечує стійкість до гербіциду. Інші конкретні варіанти здійснення винаходу описані в наведеному далі докладному описі. Короткий опис креслень На Фіг. 1А схематично представлені необмежувальні конструкції рекомбінантної ДНК за винаходом як описано у прикладі 1. Для застосування в опосередкованій Agrobacterium трансформації рослинної клітини в кожну конструкцію включена щонайменше одна границя О-ДНК (не показана). Ці конструкції включають промоторний елемент ("pro"), інтрон, фланкований на одній або обох сторонах некодуючої білок ДНК, необов'язковий термінуючий елемент ("ter") щонайменше один перший елемент генної супресії ("GSE" або "GSE1") для супресії щонайменше одного першого гена-мішені, і може необов'язково включати щонайменше один другий елемент генної супресії ("GSE2") для супресії щонайменше одного другого гена-мішені щонайменше один елемент генної експресії ("GEE") для експресії щонайменше одного гена, що представляє інтерес, або обох. У варіантах здійснення, що включають елемент генної експресії, елемент генної експресії може бути розташований поруч (зовні) з інтроном. В одній з варіацій цього варіанта здійснення (не показано), елемент генної супресії (вбудований в інтрон, фланкований на одній або обох сторонах некодуючої білок ДНК) розташований з 3'-кінці термінатора. В інших конструкціях за винаходом (не показано), елемент генної супресії (не вбудований в інтрон) розташований з 3'-кінця термінатора (дивись приклад 22). На Фіг. 1B схематично предста 13 влені приклади конструкцій рекомбінантної ДНК, відмінних від конструкцій рекомбінантної ДНК за даним винаходом. Ці конструкції можуть містити елемент генної супресії, що розташований поруч з інтроном або між двома окремими інтронами (тобто, не вбудований в один інтрон), або може містити елемент генної експресії, що містить елемент генної супресії, вбудований у межах інтрона, що фланкований на обох сторонах кодуючої білок ДНК (наприклад, кодуючі білок екзони, що складають елемент генної експресії). На Фіг. 2 представлені різні необмежувальні приклади елементів генної супресії і транскрибованої екзогенної ДНК, застосовні в конструкціях рекомбінантної ДНК за винаходом як описано в прикладі 1. При зображенні у вигляді одного ланцюга (Фігури від 2А по 2Е), вони традиційно наведені в напрямку трансляції від 5' до 3' (зліва направо), де стрілки означають антисмислову послідовність (вістря стрілки вказує ліворуч), або смислову послідовність (вістря стрілки вказує праворуч). При зображенні у вигляді дволанцюжкових (антипаралельно) транскриптів (Фіг. 2F і 2G), транскрипційна спрямованість 5' і 3' є такою, як показано. Суцільні лінії, пунктирні лінії і лінії з крапок означають послідовності, що спрямовані до різних генів-мішеней. Ці елементи генної супресії і транскрибована екзогенна ДНК можуть містити: ДНК, що містить щонайменше один сегмент антисмислової ДНК, що є антисмисловим щонайменше для одного сегмента щонайменше одного першого гена-мішені, або ДНК, що містить кілька копій щонайменше одного сегмента антисмислової ДНК, що є антисмисловим щонайменше для одного сегмента щонайменше одного першого гена-мішені (Фіг. 2А); ДНК, що містить щонайменше один сегмент смислової ДНК, тобто щонайменше один сегмент щонайменше одного першого гена-мішені, або ДНК, що містить кілька копій щонайменше одного сегмента смислової ДНК, тобто щонайменше один сегмент щонайменше одного першого гена-мішені (Фіг. 2В); ДНК, що транскрибується в РНК для супресії щонайменше одного першого гена-мішені за допомогою формування подвійного ланцюга РНК, і містить щонайменше один сегмент антисмислової ДНК, що є антисмисловим щонайменше для одного сегмента щонайменше одного гена-мішені і щонайменше один сегмент смислової ДНК, тобто щонайменше один сегмент щонайменше одного першого гена-мішені (Фіг. 2С); ДНК, що транскрибується в РНК для супресії щонайменше одного першого гена-мішені за допомогою формування одного подвійного ланцюга РНК, і містить кілька послідовних сегментів антисмислової ДНК, що є антисмисловими щонайменше для одного сегмента щонайменше одного першого гена-мішені, і кілька послідовних сегментів смислової ДНК, що є щонайменше одним сегментом щонайменше одного першого гена-мішені (Фіг. 2D); ДНК, що транскрибується в РНК для супресії щонайменше одного першого гена-мішені за допомогою формування декількох подвійних ланцюгів РНК, і містить кілька сегментів антисмислової ДНК, що є антисмисловими щонайменше для одного сегмента щонайме 95614 14 нше одного першого гена-мішені і кілька сегментів смислової ДНК, що є щонайменше одним сегментом щонайменше одного першого гена-мішені, і де зазначені кілька сегментів антисмислової ДНК і кілька сегментів смислової ДНК розташовані в групах інвертованих повторів (Фіг. 2Е); і ДНК, що містить нуклеотиди, які походять з мкРНК, або ДНК, що містить нуклеотиди міРНК (Фіг. 2F). На Фіг. 2F представлені різні необмежувальні розташування дволанцюжкової РНК (длРНК), що може транскрибуватися з варіантів здійснення елементів генної супресії і транскрибованої екзогенної ДНК, придатної в конструкціях рекомбінантної ДНК за винаходом. Коли формується така длРНК, вона може супресувати один або кілька генів-мішеней і може формувати одну дволанцюжкову РНК або кілька подвійних ланцюгів РНК, або одне "стебло" длРНК або декілька "стебел". Там, де формується декілька "стебел" длРНК, вони можуть розташовуватися у вигляді "головки молотка" або "листа конюшини". Спейсерна ДНК є необов'язковою і може включати послідовність, що транскрибується в РНК (наприклад, велика петля антисмислової послідовності або мішені аптамера), що припускає вторинну структуру або тривимірну конфігурацію, що дає транскрипту бажану характеристику, таку як збільшена стабільність, збільшений час напівжиття in vivo або клітинну або тканинну специфічність. На Фіг. 3 наведені рівні експресії зазначених зрілих мкРНК у різних тканинах кукурудзи, як докладно описано в прикладі 2. На Фіг. 4 зображений необмежувальний приклад транскрибованої послідовності ДНК, що містить екзогенну ділянку розпізнавання мкРНК, спрямовану в хлоропласти ТІС809 з ділянкою розпізнавання мкРНК162 (напівжирним текстом), розташованою у 3'-нетрансльованій області (SEQ ID NO: 176), як докладно описано в прикладі 3. Також наведена трансльована амінокислотна послідовність. На Фіг. 5 зображений необмежувальний приклад транскрибованої послідовності ДНК, що містить екзогенну ділянку розпізнавання мкРНК, не спрямовану в хлоропласти ТІС809 з ділянкою розпізнавання мкРНК162 (напівжирним текстом), розташованою у 3'-нетрансльованій області (SEQ ID NO: 177), як докладно описано в прикладі 3. Також наведена трансльована амінокислотна послідовність. На Фіг. 6 наведена сильна і специфічна експресія мікроРНК mi167g (SEQ ID NO: 178) в ендоспермі, клонованому з ендосперму кукурудзи, як докладно описано в прикладі 4. "Нозерн"-блот РНК із тканин кукурудзи (LH59), гібридизованих з 22членним міченим на кінці зондом LNA зрілої ті 167, специфічним для SEQ ID NO: 178 (Фіг. 6А), або з геноспецифічним до mi167g зондом 400 п.н. (Фіг. 6В). Профілювання транскрипції тканин кукурудзи підтвердило результати "нозерн"-блота (Фіг. 6С); транскрипт, що відповідає mi167g був у великій кількості і специфічно експресований у тканині ендосперму (вміст класифікований у такий спосіб: >5000, високий вміст, 97 проміль; 700-5000, помірний вміст, 20 проміль; 400-700, середній вміст; 200-400, низький вміст;