Спосіб ідентифікації рослини, що містить функціональний ген-відновник для цитоплазматичної чоловічої стерильності с-типу кукурудзи

Реферат: Винахід належить до способу ідентифікації рослини, що містить функціональний ген-відновник для цитоплазматичної чоловічої стерильності С-типу кукурудзи. Спосіб включає стадії виділення молекул нуклеїнової кислоти з рослини і скринінгу виділених молекул нуклеїнових кислот відносно молекули нуклеїнової кислоти, що містить маркерний полінуклеотид, який міцно зчеплений з геном Rf4 або розташований в ньому. UA 114886 C2 (12) UA 114886 C2 UA 114886 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Домагання на пріоритет По даній заявці вимагається пріоритет на дату подачі тимчасової патентної заявки США з серійним номером 61/390526, поданої 6 жовтня 2010 року, і безумовної патентної заявки з серійним номером 13/244049, поданої 23 вересня 2011 року, обидві "MAIZE CYTOPLASMIC MALE STERILITY (CMS) C-TYPE RESTORER RF4 GENE, MOLECULAR MARKERS AND THEIR USE". Технічна галузь Даний винахід стосується генів фертильності рослин. У деяких варіантах здійснення винахід стосується Rf4, гена-відновника фертильності кукурудзи. У конкретних варіантах здійснення винахід стосується композицій і способів відновлення фертильності при цитоплазматичній чоловічій стерильності (CMS-C) С-типу, наприклад з використанням молекулярних маркерів, зчеплених з геном Rf4, або, що знаходяться в ньому. Конкретні варіанти здійснення стосуються способів використання конкретних послідовностей нуклеїнових кислот для ідентифікації рослин, які містять відновник фертильності CMS-C, і отримання гібридного насіння. Деякі конкретні варіанти здійснення стосуються поліпептидів, асоційованих з відновленням фертильності CMSC. Рівень техніки Розвиток розведення гібридних рослин зробив можливим значні досягнення з точки зору якості і кількості продукованих культур. Збільшений вихід і комбінування бажаних характеристик, таких як стійкість до захворювань і комах, толерантність до спеки і засухи, і варіювання складу рослини, є можливими, частково, завдяки методикам гібридизації. Методики гібридизації основані на внеску, що вноситься пилком з чоловічої батьківської рослини, в жіночу батьківську рослину, що приводить до отримання гібриду. Рослини можуть самозапилюватися, якщо пилок з однієї квітки переноситься на ту ж або іншу квітку однієї і тієї ж рослини. Рослини можуть перехресно запилюватися, якщо пилок походить з квітки з іншої рослини. Рослини кукурудзи (Zea mays) можна виводити способами як самозапилення, так і перехресного запилення. Рослини кукурудзи мають чоловічі квітки, які розташовані на волоті, і жіночі квітки, які розташовані на качані тієї ж рослини. Природне запилення кукурудзи відбувається, коли пилок з волоті досягає приймочок, які знаходяться зверху качанів, що зароджуються. Розробка гібридів кукурудзи заснована на системах чоловічої стерильності. Розробка гібридів кукурудзи вимагає розробки гомозиготних інбредних ліній, схрещування цих ліній і оцінки продуктів схрещування. Чистосортне розведення і рекурентна селекція є двома способами розведення використовуваних для розробки інбредних ліній з популяцій. Програми розведення комбінують бажані ознаки двох або більше інбредних ліній або різних універсальних джерел в депо розведення, з якого розробляють нові інбредні лінії шляхом самозапилювання і селекції бажаних фенотипів. Гібридний сорт кукурудзи є результатом схрещування двох таких інбредних ліній, кожна з яких може мати одну або декілька бажаних характеристик, відсутніх в одній, або доповнюючих іншу. Нові інбредні рослини схрещують з іншими інбредними лініями, і гібриди цих схрещувань оцінюють для визначення тих з них, які є бажаними. Гібридне потомство першого покоління позначають F 1. При виведенні гібридів, що шукають, є тільки гібриди F1. Гібрид F1, як правило, є більш сильним, ніж його інбредні батьківські рослини. Ця сила гібридів, звана гетерозисом, як правило, приводить, наприклад до підвищеного вегетативного росту і збільшеного виходу. Гібридну кукурудзу можна отримувати за допомогою системи чоловічої стерильності, що включає видалення волоті вручну. Для отримання гібридного насіння чоловічу волоть видаляють із жіночих інбредних батьківських рослин, що ростуть, які можна висівати за принципом рядів, що чергуються різним чином з чоловічими інбредними батьківськими рослинами. Отже, за умови, що існує достатня ізоляція від чужорідного пилку, качани жіночої інбредної рослини будуть запліднюватися тільки пилком чоловічої інбредної рослини. Отримане насіння являє собою гібридне насіння F1. Видалення волотей вручну є трудомістким і дорогим. Видалення волотей вручну часто є неефективним, наприклад, оскільки варіювання умов навколишнього середовища при виведенні рослин може приводити до рослин, у яких відбувається колосіння волотей у жіночій батьківській рослині після проведення видалення волотей вручну, або оскільки людина, що здійснює видалення волотей, не повністю видалила волоть з жіночої інбредної рослини. Якщо видалення волотей є неефективним, жіноча рослина буде продуктивно скидати пилок, і деякі жіночі рослини будуть самозапилюватися. Це приведе до того, що разом з гібридним насінням, продукованим нормально, буде зібране насіння жіночої інбредної рослини. Насіння жіночої інбредної рослини є не настільки продуктивним, як насіння F 1. Крім того, присутність жіночого 1 UA 114886 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 інбредного насіння може привести до ризику недостатнього збереження зародкової плазми для виробника гібридного насіння. Волоті з жіночої інбредної рослини також можна видаляти за допомогою пристрою. Механічне видалення волотей є приблизно настільки ж надійним, як і видалення волотей вручну, однак є більш швидким і дешевшим. Однак більшість пристроїв для видалення волотей приводить до більшого пошкодження рослин, ніж видалення волотей вручну. Таким чином, в даний час не існує повністю задовільної форми видалення волотей. Генетична чоловіча стерильність є альтернативним способом, який можна використати при отриманні гібридного насіння. Трудомісткого процесу видалення волотей можна уникнути в деяких генотипах з використанням інбредних рослин з цитоплазматичною чоловічою стерильністю (CMS). У відсутність гена-відновника фертильності, інбредні рослини CMS мають чоловічу стерильність внаслідок факторів, що відбуваються з цитоплазматичного, а не ядерного геному. Таким чином, характеристикою чоловічої стерильності є те, що вона успадковується виключно через жіночу рослину в рослинах кукурудзи, оскільки тільки жіноча рослина надає цитоплазму для заплідненого насіння. Рослини CMS запліднюють пилком іншої інбредної рослини, яка не має чоловічої стерильності. Пилок другої інбредної рослини може забезпечувати або може не забезпечувати гени, які приводять до наявності у гібридних рослин чоловічої фертильності. Звичайно насіння нормальної кукурудзи після видалення волотей і продуковані за допомогою CMS насіння того ж гібриду повинні бути змішані для забезпечення того, щоб достатнє навантаження пилком було доступне для запліднення, коли гібридні рослини вирощують, і для забезпечення цитоплазматичної різноманітності. Недоліки CMS як системи продукування гібридного насіння включають асоціацію конкретних варіантів CMS із схильністю до певних захворювань культур. Див., наприклад, Beckett (1971) Crop Science 11:724-6. Ця проблема, зокрема перешкоджає застосуванню варіанта CMS-T в продукуванні гібридного насіння кукурудзи і звичайно негативно відбивається на застосуванні CMS в кукурудзі. Цитоплазматична чоловіча стерильність (CMS) являє собою успадковану по материнській лінії нездатність продукувати функціональний пилок. Було знайдено більше за 40 джерел CMS, і вони були класифіковані на три основних групи по різних реакціях відновлення фертильності в кукурудзі. Ці групи позначають як CMS-T (Texas), CMS-S (USDA) і CMS-C (Charrua). Beckett (1971). У групі CMS-T для відновлення фертильності пилку потрібно два домінантних гени: Rf1 і Rf2, які розташовані на хромосомах 3 і 9, відповідно. Duvick (1965) Adv. Genetics 13:1-56. Sцитоплазма відновлюється за допомогою одного гена, Rf3, який картований на 2 хромосомі. Laughnan and Gabay (1978) "Nuclear and cytoplasmic mutations to fertility in S male-sterile maize", Maize Breeding and Genetics, pp. 427-446. У попередніх аналізах було виявлено, що, в порівнянні з CMS-T і CMS-S, відновлення фертильності CMS-C є дуже складним. Duvick (1972), "Potential usefulness of new cytoplasmic male sterile and sterility system", Proceeding of the 27th annual corn and sorghum research conference, pp. 197-201, виявив, що повне відновлення фертильності CMS-C контролюється домінантним алелем гена Rf4. Khey-Pour et al. (1981) також виявили, що цей ген є достатнім для відновлення CMS-C. Однак Josephson et al. (1978), "Genetics and inheritance of fertility restoration of male sterile cytoplasms in corn", Proceedings of the 33rd com and sorghum research conference 7:13, передбачили, що повне відновлення фертильності CMS-C обумовлюється взаємодоповнюючою дією домінантних алелів двох генів: Rf4 і Rf5, які відтоді були картовані на хромосомах 8 і 5, відповідно. Sisco (1991) Crop Sci. 31: 1263-6. Тим часом, Chen et al. (1979) Acta Agronom. Sin. 5(4):21-28, передбачили, що два домінантних гени-відновники при CMS-C мають дублюючі функції. Далі ускладнюючи систему, Vidakovic (1988), Maydica 33:51-65, продемонстрував існування трьох домінантних і комплементарних генів для повного відновлення фертильності при CMS-C, додавши ген Rf6. Vidakovic et al, (1997a) Maize Genet. Coop. News Lett. 71:10; (1997b) Maydica 42:313-6, пізніше повідомили, що ці взаємодоповнюючі гени, Rf4, Rf5 і Rf6, насправді не були єдиними генетичними механізмами для відновлення фертильності при CMS-C в кукурудзі. Таким чином, механізми відновлення фертильності при CMS-C залишаються непроясненими. У результаті важко вибрати лінії-відновники для деяких генотипічно стерильних ліній. Для прискорення процесу введення гена або локусів кількісних ознак (QTL) в елітний культивар або лінію виведення шляхом зворотного схрещування особливо придатні молекулярні маркери. Маркери, зчеплені з геном, можна використати для селекції рослин, що мають бажану ознаку, і маркери по всьому геному можна використати для селекції рослин, генетично схожих з рекурентною батьківською рослиною (Young and Tanksley (1989) Theor. Appl. Genet. 77:95-101; Hospital et al. (1992) Genetics 132:1199-210). 2 UA 114886 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Більшість генів-відновників фертильності рослин було клоновано за допомогою стратегії клонування на основі картування. На сьогоднішній день, було виділено дев'ять генів Rf з декількох видів рослин, включаючи кукурудзу (Zea Mays L.) (Cui et al. (1996) Science 272:1334-6; Liu et al. (2001) Plant Cell 13:1063-78), петунію (Petunia hybrida) (Bentolila et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:10887-92, хрін (Raphanus sativus L.) (Brown et al. (2003) Plant J. 35:262-72; Desloire et al. (2003) EMBO Rep. 4:1-7; Koizuka et al. (2003) Plant J. 34:407-15), сорго (Sorghum bicolor L.) (Klein et al. (2005) Theor. Appl. Genet. 111: 994-1012), рис (Oryza sativa L.) (Kazama і Toriyama (2003) FEBS Lett. 544:99-102; Akagi et al. (2004) Theor. Appl. Genet. 108: 1449-57; Komori et al. (2004) Plant J. 37:315-25; Wang et al. (2006) Plant Cell 18:676-87; і Fujii and Toriyama (2009) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106(23): 9513-8) і губастик (Mimulus guttatus) (Barr and Fishman (2010) Genetics 184:455-65). Всі із ідентифікованих генів-відновників, за винятком Rf2 в кукурудзі і Rf17 в рисі, кодують різні білки з пентатрикопептидними повторами (PPR). Геноми рослин кодують декілька сотень білків PPR, багато які з яких залучені до регуляції експресії генів органел. Lurin et al. (2004) Plant Cell 16:2089-103; і Schmitz-Linneweber and Small (2008) Trends Plant Sci. 12:663-70. Білок PPR містить від 2 до 27 повторів по 35 амінокислот, званих мотивами PPR. Small and Peeters, (2000) Trends Biochem. Sci. 25(2):46-7. Передбачено, що білки PPR зв'язуються з РНК (Delannoy et al. (2007) Biochemical Society Transactions 35:1643-7), і багато які білки PPR націлюються на мітохондрії, де розташовані асоційовані з CMS гени і продукти. Lurin et al. (2004), вище. Дані вказують на те, що білки PPR зв'язуються безпосередньо з транскриптами CMS. Akagi et al. (2004), вище; Gillman et al. (2007) Plant J. 49:217-27; і Kazama et al. (2008) Plant J. 55:619-28. Білки Rf знижують експресію асоційованих з CMS транскриптів шляхом зміни їх характеру процесингу (Kazama & Toriyama (2003), вище), зниження стабільності РНК (Wang et al. (2006), вище; і Ohta et al. (2010) Plant Cell Rep. 29:359-69), або запобігання їх трансляції (Kazama et al. (2008), вище). Додаткова інформація, що стосується генів-відновників фертильності з кукурудзи, рису, петунії і хрону, може бути знайдена в патентній заявці США з серійним номером № US2006/0253931, і в патентах США № 5981833; 5624842; 4569152; 6951970; 6392127; 7612251; 7314971; 7017375; 7164058 і 5644066. Опис винаходу У даному описі описане картування локусу Rf4 кукурудзи до невеликої області розміром 12 т.п.н., розташованої у верхній частині хромосоми 8. В цій області єдиним вірогідним кандидатом для Rf4 є ген, що кодує фактор транскрипції bHLH. Шляхом клонування локусу Rf4-bHLH з ліній CMS-C, ліній-невідновників і ліній-відновників, був ідентифікований ряд відмінностей в послідовності. На білковому рівні всі з ліній CMS-C і ліній-невідновників мають одну і ту ж послідовність, і відрізняються від алелів-відновників (також ідентичних один одному) на 4 амінокислотних заміни, включаючи консервативний гідрофільний залишок тирозину в домені bHLH (Y186), який замінений на гідрофобний залишок фенілаланіну (F 187) в лінії-відновнику. Ген Rf4 кукурудзи і кодований ним поліпептид представлені в даному описі, і крім того, описані молекули нуклеїнових кислот, що містять послідовність гена Rf4. Несподівано, ген Rf4 не є геном білка з пентатрикопептидним повтором (PPR), як практично всі інші гени-відновники фертильності. Більш того показано, що відновлення фертильності в зародковій плазмі системи CMS-C/Rf4 за даним винаходом контролюється Rf4 як єдиний домінантний ген-відновник, що було несподіваним внаслідок недавніх робіт декількох груп. Див. вище. Гідрофільний залишок тирозину в домені bHLH rf4-bHLH (Y186) кукурудзи, який замінений на гідрофобний залишок фенілаланіну (F187) в лініях відновників, є консервативним серед однодольних рослин. Таким чином, ідентифікація гена Rf4 і маркерів гена Rf4 значно сприяла розробці і широкому впровадженню ознаки відновлення фертильності CMS-C в зародковій плазмі рослин. У варіантах здійснення мутація консервативного залишку тирозину в положенні 186 rf4-bHLH на гідрофобний амінокислотний залишок (наприклад, фенілаланін) відповідальна за фенотип відновника в поліпептиді Rf4-bHLH. Таким чином, в даному описі описані гени Rf4-bHLH кукурудзи або ортологи генів Rf4-bHLH кукурудзи, які кодують гідрофобний амінокислотний залишок в цьому положенні (як визначають вирівнюванням послідовностей), де ці гени забезпечують фенотип відновника CMS-C при включенні в рослину. У даному описі описані молекулярні маркери нуклеїнових кислот, які зчеплені (наприклад, зчеплені; міцно зчеплені або надзвичайно міцно зчеплені) з геном Rf4 кукурудзи або які розташовані в ньому. У деяких варіантах здійснення маркери, які зчеплені (наприклад, зчеплені; міцно зчеплені або надзвичайно міцно зчеплені) з геном Rf4 кукурудзи або які розташовані в ньому, або саму послідовність гена Rf4 кукурудзи, можна використати для введення гена Rf4 кукурудзи в організми, наприклад, рослини (наприклад, кукурудза і інші однодольні рослини). 3 UA 114886 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Також в даному описі описані способи використання маркерів нуклеїнових кислот, які зчеплені з геном Rf4 або розташовані в ньому, наприклад і не обмежуючись цим, для ідентифікації рослин з функціональним геном-відновником для CMS С-типу; для введення Rf4 в нові генотипи рослин (наприклад, шляхом схрещування з використанням маркера або генетичної трансформації); і для отримання гібридного насіння від схрещувань чоловічих рослин, що містять молекулярні маркери нуклеїнових кислот, які зчеплені з геном Rf4 або розташовані в ньому, і жіночих рослин, що несуть CMS С-типу. Крім того, описані засоби для відновлення фертильності кукурудзи CMS-C, і засобу для ідентифікації рослин, що має ген відновлення фертильності кукурудзи CMS-C. У деяких прикладах засобу для відновлення фертильності кукурудзи CMS-C може являти собою маркер, який зчеплений (наприклад, зчеплений; міцно зчеплений або надзвичайно міцно зчеплений) з геном Rf4 кукурудзи або який розташований в ньому. У деяких прикладах засобу для ідентифікації рослин, що мають ген відновлення фертильності кукурудзи CMS-C, можуть являти собою зонд, який специфічно гібридизується з маркером, який зчеплений (наприклад, зчеплений; міцно зчеплений або надзвичайно міцно зчеплений) з геном Rf4 або який розташований в ньому. Також в даному описі описані способи, за допомогою яких можна отримувати гібридне насіння шляхом схрещувань чоловічої рослини, що містить молекулярні маркери нуклеїнових кислот, які зчеплені (наприклад, зчеплені; міцно зчеплені або надзвичайно міцно зчеплені) або з геном Rf4 кукурудзи або які розташовані в ньому, і жіночої рослини, маючого CMS С-типу. Отримання такого гібридного насіння може приводити до економії витрат внаслідок ручного або механічного усунення видалення волотей, і, крім того, можуть збільшити вихід насіння. Крім того, описані способи використання молекул нуклеїнових кислот, описаних в даному описі, для ідентифікації гомологічних послідовностей Rf4 з видів рослин, відмінних від кукурудзи (наприклад, шляхом порівняння послідовностей). У деяких варіантах здійснення систему CMSC/Rf4 для отримання гібридного насіння створюють способами інженерії у видах рослин, відмінних від кукурудзи. Короткий опис креслень На Фіг. 1 представлено 197 маркерів SNP, визначених як такі, що знаходяться в області гена Rf4, і їх положення на фізичній карті. На Фіг. 2 представлені тридцять чотири випадковим чином відібраних рекомбінантних рослини з їх фенотиповими даними і відповідними генетичними даними по 27 SNP-маркерах. На Фіг. 3 представлені відносні положення маркерів SNP для гена Rf4 і генів в межах о розміром 1,5 млн.п.н. на 8 хромосомі. На Фіг. 4 представлені відносні положення маркерів SNP для гена Rf4 і генів в межах області розміром 0,56 млн.п.н. і в межах області розміром 100 т.п.н. на 8 хромосомі. На Фіг. 5 представлене точне картування Rf4 в області розміром 12 т.п.н. Буквами вказані генотипи: А=гомозиготний за BE4207 (CMS); Н=гетерозиготний. Стрілками вказані лівий і правий пограничні маркери Rf4, і дві найбільш важливих рекомбінантних рослини. На Фіг. 6 представлене схематичне зображення геномної структури алеля Rf4-bHLH, що демонструє повну кодуючу область (від кодону ініціація до стоп-кодону - 1,38 т.п.н.), 5'UTR/промотор розміром 1,1 т.п.н., і 3'-UTR/термінатор розміром 0,75 т.п.н. На Фіг. 7 представлено вирівнювання послідовностей Rf4-bHLH з наступних генотипів кукурудзи: B73; BE4207; B104; XJH58; BE9515; і MLW03. Положення кодону ініціації трансляції, стоп-кодону і маркерів з DAS-CMS21 по DAS-CMS34, розташованих в гені, позначені. Положення SNP і InDel затемнені. На Фіг. 8 представлено вирівнювання передбаченої послідовності кДНК Rf4-bHLH з наступних генотипів кукурудзи: B73; BE4207; B104; XJH58; BE9515; і MLW03. Положення кодону ініціації трансляції, стоп-кодону і маркерів для DAS-CMS22-25, 28-29 і 31, розташованих в кДНК, позначені. На Фіг. 9 представлено вирівнювання передбачених білкових послідовностей Rf4-bHLH. Положення консервативного домену bHLH, сигналів ядерної локалізації (NLS) і положення відповідних маркерів для DAS-CMS22, 23 і 28 позначені. Заміна Tyr на Phe в домені bHLH викликана динуклеотидною заміною AC на TT в положенні 747 (передбаченої послідовності кДНК B73), практично поруч з маркером DAS-CMS24 (див. Фіг. 8 і поліморфізм ID 54 в таблиці 3). На Фіг. 10 представлені дані, що демонструють профілі експресії Rf4-HLH. L1=5 - слабе листя, L2=7 - слабе листя, L3=9 - слабе листя, Т=волоть з пиляками, що розвиваються, і пилком, Р=скидуваний пилок. А=гомозиготний по BE4207, Н=гетерозиготний, В=гомозиготний по XJH58. Дані відповідають середнім значенням для трьох рослин кожного генотипу для 4 UA 114886 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 сегрегуючих F3 і для 1 рослини кожної з батьківських рослин. Планки погрішностей відповідають стандартному відхиленню. На Фіг. 11 представлено вирівнювання Rf4-bHLH кукурудзи (з відновника XJH58 і невідновника BE4207) з їх ортологами з інших однодольних видів. Положення консервативного домену bHLH підкреслене. Чотири амінокислотних заміни між Rf4-bHLH XJH58 і Rf4-bHLH BE4207 позначені. Список послідовностей Послідовності нуклеїнових кислот, наведені в прикладеному списку послідовностей, представлені з використанням стандартних буквених позначень для нуклеотидних основ, як визначено в 37 C.F.R. § 1.822. Показаний тільки один ланцюг кожної послідовності нуклеїнової кислоти, однак потрібно розуміти, що при будь-якому відсиланні на представлений ланцюг включається комплементарний ланцюг. Для простоти при описі гена або локусу ген може бути описаний за допомогою мутантної форми гена (наприклад, Rf4, в протилежність rf4), навіть незважаючи на те, що істинна послідовність може являти собою форму гена дикого типу у відповідному положенні в геномі. Проте, зрозуміло, що обидва алелі мають різні послідовності, і з контексту зрозуміло, який алель мається на увазі. У прикладеному списку послідовностей: У SEQ ID NO: 1-197 представлені ілюстративні нуклеотидні послідовності маркерів, які зчеплені (наприклад, зчеплені; міцно зчеплені або надзвичайно міцно зчеплені) з геном Rf4 кукурудзи або які розташовані в ньому. У SEQ ID NO: 198-211 представлені нуклеотидні послідовності в області приблизно 0,56 млн.п.н. у верхній частині 8 хромосоми кукурудзи, в якої алель Rf4 був спочатку картований. SEQ ID NO: 203 являє собою алель Rf4-bHLH. SEQ ID NO: 212-216 являють собою ілюстративні відмінності нуклеотидних послідовностей між лініями CMS (BE4207) і відновника (XJH58). У SEQ ID NO: 217 представлена нуклеотидна послідовність інтервалу приблизно 12 т.п.н. з сорту кукурудзи B73, в якому був точно картований алель Rf4. У SEQ ID NO: 218 представлена нуклеотидна послідовність алеля rf4-bHLH з сортів кукурудзи B73 і BE4207. У SEQ ID NO: 219 представлена нуклеотидна послідовність алеля bHLH з сорту кукурудзи B104. У SEQ ID NO: 220 представлена нуклеотидна послідовність алеля Rf4-bHLH з сортів кукурудзи XJH58, BE9515 і MLW03. У SEQ ID NO: 221 представлена нуклеотидна послідовність передбаченої кДНК rf4-bHLH з сортів кукурудзи B73 і B4207. У SEQ ID NO: 222 представлена нуклеотидна послідовність передбаченої кДНК bHLH з сорту кукурудзи B104. У SEQ ID NO: 223 представлена нуклеотидна послідовність передбаченої кДНК Rf4-bHLH з сортів кукурудзи XJH58, BE9515 і MLW03. У SEQ ID NO: 224 представлена амінокислотна послідовність передбаченого поліпептиду rf4-bHLH кукурудзи. У SEQ ID NO: 225 представлена амінокислотна послідовність передбаченого поліпептиду Rf4-bHLH. У SEQ ID NO: 226 представлена амінокислотна послідовність передбаченого поліпептиду rf4-bHLH Brachypodium distachyon. У SEQ ID NO: 227 представлена амінокислотна послідовність передбаченого поліпептиду rf4-bHLH Sorghum bicolor. У SEQ ID NO: 228 представлена амінокислотна послідовність передбаченого поліпептиду rf4-bHLH Oryza sativa. У SEQ ID NO: 229 і 230 представлені сигнали ядерної локалізації (NLS) в Rf4-bHLH. Спосіб(и) здійснення винаходу I. Огляд декількох варіантів здійснення У даному описі описані конкретні варіанти здійснення генів, що впливають на чоловічу фертильність в рослинах: Rf4 кукурудзи і міцно зчеплені з ними генетичні маркери, які можуть бути придатні в різних системах контролю чоловічої фертильності. Більш того поліморфізм, властивий описаним міцно зчепленим генетичним маркерам, дозволяє рослиннику відстежувати конкретний алель гена, Rf4 або rf4, в сегрегуючій популяції. Ген Rf4 був спочатку картований на 8 хромосомі в трьох популяціях, отриманих схрещуванням чотирьох культиварів кукурудзи: BE4207×BE9515; BE4207×LW03F; і BE4207×XJH58. Точніше картовані і клоновані на основі картування були продемонстровані як приклад в популяції BE4207×XJH58, в кінцевому результаті локалізувавши ген Rf4 в межах приблизно 12 т.п.н. 5 UA 114886 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Відновлення цитоплазматичної чоловічої стерильності (CMS) є стандартною сільськогосподарською практикою при отриманні гібридного насіння протягом багатьох років. Використання гена-відновника фертильності (Rf) при цитоплазматичній чоловічій стерильності спрощує програми продукування і знижує загальні витрати шляхом повного усунення ручного або машинного видалення волотей. Однак повна перевага застосувань генетики відновлення фертильності для цитоплазматичної чоловічої стерильності С-типу в кукурудзі для отримання гібридного насіння не була здійснена, оскільки попередні дослідження генетики відновлення фертильності для цитоплазматичної чоловічої стерильності С-типу в кукурудзі привели до суперечливих результатів. У зв'язку з практичною важливістю цитоплазматичної чоловічої стерильності і відновленням фертильності пилку при отриманні гібридного насіння кукурудзи і необхідності диверсифікації джерела цитоплазми, описане точне картування гена-відновника Rf4 кукурудзи для CMS-C до дуже невеликої області з використанням молекулярних маркерів за допомогою способу генотипування KASPar™ і ідентифікація гена Rf4 кукурудзи з допомогою клонування на основі картування. Було відкрито, що Rf4 є єдиним домінантним геном-відновником для CMS-C в трьох інбредних рослинах кукурудзи: BE9515, MLW03 і XJH58. Rf4 спочатку був картований з використанням маркерів SSR і SNP до області приблизно 5,0 млн.п.н., починаючи з маркера SSR umc-1075 до верхньої частини короткого плеча хромосоми 8. Була створена популяція для підтвердження F2 BE4207×XJH58 з 500 особинами, і вона була оцінена у відношенні фертильності в польових умовах. Був проведений скринінг всього 197 маркерів SNP в популяції для підтвердження і було ідентифіковано 104 рекомбінанти в межах області розміром 5,0 млн.п.н. Шляхом порівняння фенотипових показників і генотипових даних для інформативних рекомбінантних ліній, ген Rf4 кукурудзи був позитивно ідентифікований в межах області приблизно 0,56 млн. (6 генів). Таким чином, використання варіантів здійснення способів, описаних в даному описі, продемонструвало, що ген Rf4 вибраний з групи, що складається з GRMZM2G 122853 (SEQ ID NO: 198); AC187051.4JFG005 (SEQ ID NO: 199); GRMZM2G122851 (SEQ ID NO: 200); GRMZM2G122850 (SEQ ID NO: 201); GRMZM2G582028 (SEQ ID NO: 202); GRMZM2G021276 (SEQ ID NO: 203); GRMZM2G381376 (SEQ ID NO: 204); GRMZM2G081127 (SEQ ID NO: 205); GRMZM2G085111 (SEQ ID NO: 206); GRMZM2G085038 (SEQ ID NO: 207); GRMZM2G317468 (SEQ ID NO: 208); GRMZM2G328030 (SEQ ID NO: 209); GRMZM2G029450 (SEQ ID NO: 210) і GRMZM2G077212 (SEQ ID NO: 211). З використанням великої популяції для точного картування розміром приблизно 5000 особин, локус Rf4 був картований до невеликої області розміром приблизно 12 т.п.н., розташованої у верхній частині 8 хромосоми. Тим самим, було продемонстровано, що ген Rf4 вибраний з групи, що складається з генетичного елемента рослин, що переміщується [GRMZM2G582028 (SEQ ID NO: 202)] і фактору транскрипції основна спіраль-петля-спіраль (bHLH) (GRMZM2G021276 (SEQ ID NO: 203)). Серед цих двох генів єдиним вірогідним кандидатом для Rf4 є фактор транскрипції основна спіраль-петля-спіраль (bHLH), геном Rf4 є GRMZM2G021276 (SEQ ID NO: 203). Таким чином, в конкретних варіантах здійснення ген Rf4 являє собою GRMZM2G021276 (SEQ ID NO: 203), який іноді називають в даному описі як Rf4bHLH. Зрозуміло, що ген Rf4 також може являти собою послідовність ДНК, яка кодує той же поліпептид, що і ген Rf4-bHLH кукурудзи, наприклад, кодуючу послідовність SEQ ID NO: 203. Локус bHLH був клонований з лінії CMS BE4207 кукурудзи; лінії B104 кукурудзи; і трьох ліній відновників кукурудзи: XJH58, BE9515 і MLW03. Був ідентифікований ряд змін послідовностей між різними інбредними рослинами. Потрібно зазначити, що три лінії-відновники мають ідентичні послідовності ДНК Rf4-bHLH, в той час як B73 і BE4207 (які не містять функціональний відновник Rf4) є ідентичними. Послідовність B104 є більш схожою з алелем BE4207/B73, чим з алелем-відновником. На білковому рівні всі із BE4207, B73 і B104 мають однакову послідовність і відрізняються від генного продукту алеля-відновника на 4 амінокислотних заміни, включаючи заміну гідрофобним фенілаланіном консервативного гідрофільного тирозину в домені bHLH. Відповідно до функції Rf4 у відновленні фертильності пилку, алель-відновник Rf4-bHLH експресується специфічно у волотях (з пиляками і пилком) рослин, що розвиваються, які відновлюють CMS-C. У лінії CMS кукурудзи BE4207 не відбувається ні появи пиляків, ні розвиток функціонального пилку. У результаті в листях і чоловічих репродуктивних тканинах з рослин BE4207 була виявлена дуже низька експресія rf4-bHLH або відсутність його експресії. Оскільки B73 (інбредна рослина, яка не містить цитоплазми CMS-C, не відновлює CMS-C) має значну експресію rf4-bHLH, малоймовірно, що відновлення фертильності є наслідком відмінностей в рівні експресії між алелем-відновником (Rf4-bHLH) і алелем-невідновником (rf4bHLH). 6 UA 114886 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Вважають, що відновлення чоловічої фертильності є наслідком відмінностей в амінокислотній послідовності між продуктами генів алеля-відновника і алеля-невідновника. Зокрема, Y186 rf4-bHLH кукурудзи розташований в першій спіралі (Carretero-Paulet et al. (2010) Plant Physiol. 153: 1398-412; і Pires and Dolan (2010) Mol. Biol. Evol. 27:862-74) в зв'язуючому домені ДНК bHLH, і цей залишок є абсолютно консервативним в B73 (не CMS, не відновник), BE4207 (CMS, не відновник) і в ортологах сорго, рису і Brachypodium. У трьох лініях відновників кукурудзи цей гідрофільний залишок замінений гідрофобним фенілаланіном (F187). Така неконсервативна заміна може значно змінити структуру спіралі в домені bHLH і вплинути на зв'язування ДНК і подальшу транскрипцію гена. У зв'язку з вищесказаним, автори винаходу передбачили, що алель rf4 із B104 не відновлює фертильність CMS-C, оскільки bHLH B104 має ідентичну білкову послідовність з rf4-bHLH B73 і BE4207, включаючи консервативний тирозин в положенні 186. У деяких варіантах здійснення молекулярні маркери на основі Rf4-bHLH або міцно зчеплені високопродуктивні молекулярні маркери, описані в даному описі, можна використати для ідентифікації генотипів відновника Rf4, інтрогресії Rf4 в нові генотипи в кукурудзі і інших рослинах для чоловічої конверсії, і видалення Rf4 з жіночих рослин CMS. Маючи маркери і ген Rf4, в даний час можливо надійно перенести Rf4 в елітну зародкову плазму і збільшити масштаб використання системи CMS-C/Rf4 для отримання гібридного насіння. Повна реалізація цієї системи може забезпечити значні фінансові переваги для сільськогосподарської промисловості і споживачів її продукції. II. Терміни Зворотне схрещування: способи зворотного схрещування можна використати для введення послідовності нуклеїнової кислоти в рослини. Спосіб зворотного схрещування широко використовують протягом десятиріч для введення нових ознак в рослини. Jensen, N., Ed. Plant Breeding Способology, John Wiley & Sons, Inc., 1988. У типовому протоколі зворотного схрещування початковий сорт, що представляє інтерес (рекурентна батьківська рослина), схрещують з другим сортом (нерекурентна батьківська рослина), який має ген, що представляє інтерес, що підлягає перенесенню. Потім отримане потомство цього схрещування знову схрещують з рекурентною батьківською рослиною, і цей процес повторюють доти, поки не отримають рослину, де по суті всі з бажаних морфологічних і фізіологічних характеристик рекурентної рослини не з'являться в перетвореній рослині, в доповнення до перенесеного гена з нерекурентної батьківської рослини. Зчеплені, міцно зчеплені і надзвичайно міцно зчеплені: як використовують в рамках винаходи, зчеплення між генами або маркерами належать до явища, коли гени або маркери на хромосомі демонструють імовірність спільної передачі, що піддається вимірюванню особами наступного покоління. Чим ближче два гени або маркери один до одного, тим ближче до (1) ця імовірність. Таким чином, термін "зчеплений" може стосуватися одного або декількох генів або маркерів, які передаються спільно з геном з імовірністю більше за 0,5 (яка очікується, виходячи з незалежного розподілу, де маркери/гени розташовані на різних хромосомах). Оскільки близьке розташування двох генів або маркерів на хромосомі прямо пов'язане з імовірністю того, що гени або маркери будуть передаватися спільно особинам в наступному поколінні, термін "зчеплений" також може стосуватися в даному описі одного або декількох генів або маркерів, які розташовані в межах приблизно 2,0 млн.п.н. один від одного на одній і тій же хромосомі кукурудзи. Таким чином, два "зчеплених" гени або маркери можуть бути розділені приблизно 2,1 млн.п.н.; 2,00 млн.п.н.; приблизно 1,95 млн.п.н.; приблизно 1,90 млн.п.н.; приблизно 1,85 млн.п.н.; приблизно 1,80 млн.п.н.; приблизно 1,75 млн.п.н.; приблизно 1,70 млн.п.н.; приблизно 1,65 млн.п.н.; приблизно 1,60 млн.п.н.; приблизно 1,55 млн.п.н.; приблизно 1,50 млн.п.н.; приблизно 1,45 млн.п.н.; приблизно 1,40 млн.п.н.; приблизно 1,35 млн.п.н.; приблизно 1,30 млн.п.н.; приблизно 1,25 млн.п.н.; приблизно 1,20 млн.п.н.; приблизно 1,15 млн.п.н.; приблизно 1,10 млн.п.н.; приблизно 1,05 млн.п.н.; приблизно 1,00 млн.п.н.; приблизно 0,95 млн.п.н.; приблизно 0,90 млн.п.н.; приблизно 0,85 млн.п.н.; приблизно 0,80 млн.п.н.; приблизно 0,75 млн.п.н.; приблизно 0,70 млн.п.н.; приблизно 0,65 млн.п.н.; приблизно 0,60 млн.п.н.; приблизно 0,55 млн.п.н.; приблизно 0,50 млн.п.н.; приблизно 0,45 млн.п.н.; приблизно 0,40 млн.п.н.; приблизно 0,35 млн.п.н.; приблизно 0,30 млн.п.н.; приблизно 0,25 млн.п.н.; приблизно 0,20 млн.п.н.; приблизно 0,15 млн.п.н.; приблизно 0,10 млн.п.н.; приблизно 0,05 млн.п.н.; приблизно 0,025 млн.п.н.; приблизно 0,012 млн.п.н.; і приблизно 0,01 млн.п.н. Конкретні приклади маркерів, які "зчеплені" з Rf4, включають нуклеотидні послідовності у верхній частині 8 хромосоми геному кукурудзи, наприклад, SEQ ID NO: 1-197; і маркери, що згадуються в даному описі як поліморфізми ID №№ 1-106 (таблиця 3). 7 UA 114886 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Як використовують в рамках винаходу, термін "міцно зчеплений" може стосуватися одного або декількох генів або маркерів, які розташовані в межах приблизно 0,5 млн.п.н. один від одного на одній і тій же хромосомі кукурудзи. Таким чином, два "міцно зчеплених" гени або маркери можуть бути розділені приблизно 0,6 млн.п.н.; приблизно 0,55 млн.п.н.; 0,5 млн.п.н.; приблизно 0,45 млн.п.н.; приблизно 0,4 млн.п.н.; приблизно 0,35 млн.п.н.; приблизно 0,3 млн.п.н.; приблизно 0,25 млн.п.н.; приблизно 0,2 млн.п.н.; приблизно 0,15 млн.п.н.; приблизно 0,12 млн.п.н.; приблизно 0,1 млн.п.н.; і приблизно 0,05 млн.п.н. Конкретні приклади маркерів, які "міцно зчеплені" з Rf4, включають SEQ ID NO: 6-9; SEQ ID NO: 105; SEQ ID NO: 109; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 118-120; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 49; SEQ ID NO: 51; SEQ ID NO: 60; SEQ ID NO: 63; SEQ ID NO: 64; SEQ ID NO: 67; SEQ ID NO: 73; SEQ ID NO: 77; SEQ ID NO: 78; SEQ ID NO: 83; SEQ ID NO: 189-191; і SEQ ID NO: 97; і маркери, що згадуються в даному описі як поліморфізми ID №№ 1-106 (таблиця 3). Як використовують в рамках винаходу, термін "надзвичайно міцно зчеплений" може стосуватися одного або декількох генів або маркерів, які розташовані в межах приблизно 100 т.п.н. один від одного на одній і тій же хромосомі кукурудзи. Таким чином, два "надзвичайно міцно пов'язаних" гени або маркери можуть бути розділені приблизно 125 т.п.н.; приблизно 120 т.п.н.; приблизно 115 т.п.н.; приблизно 110 т.п.н.; приблизно 105 т.п.н.; 100 т.п.н.; приблизно 95 т.п.н.; приблизно 90 т.п.н.; приблизно 85 т.п.н.; приблизно 80 т.п.н.; приблизно 75 т.п.н.; приблизно 70 т.п.н.; приблизно 65 т.п.н.; приблизно 60 т.п.н.; приблизно 55 т.п.н.; приблизно 50 т.п.н.; приблизно 45 т.п.н.; приблизно 40 т.п.н.; приблизно 35 т.п.н.; приблизно 30 т.п.н.; приблизно 25 т.п.н.; приблизно 20 т.п.н.; приблизно 15 т.п.н.; приблизно 12 т.п.н.; приблизно 10 т.п.н.; приблизно 5 т.п.н.; і приблизно 1 т.п.н. Конкретні приклади маркерів, які "надзвичайно міцно зчеплені" з Rf4, включають SEQ ID NO: 105; SEQ ID NO: 109; SEQ ID NO: 111; SEQ ID NO: 115; SEQ ID NO: 118-120; SEQ ID NO: 123; SEQ ID NO: 126; і SEQ ID NO: 134; і маркери, що згадуються в даному описі як поліморфізми ID №№ 1-106 (таблиця 3). Зчеплені, міцно зчеплені і надзвичайно міцно зчеплені генетичні маркери Rf4 можуть бути придатними в здійснюваних за допомогою маркерів програмах виведення для ідентифікації відновників для типів генів цитоплазматичної чоловічої стерильності С-типу, і для виведення цієї ознаки в сортах кукурудзи. Локус: як використовують в рамках винаходу, термін "локус" стосується положення на геномі, який відповідає вимірюванню, що піддається характеристиці (наприклад, ознаці). Локус SNP визначають за допомогою зонда, який гібридизується з ДНК, що знаходиться в локусі. Маркер: як використовують в рамках винаходу, маркер стосується гена або нуклеотидної послідовності, які можна використовувати для ідентифікації рослин, що мають конкретний алель, наприклад, Rf4. Маркер може бути описаний як зміна в даному геномному локусі. Генетичний маркер може являти собою коротку послідовність ДНК, таку як послідовність, що оточує зміну однієї пари основ (однонуклеотидний поліморфізм або "SNP"), або довгу послідовність, наприклад, мінісателітний/простий повтор послідовності ("SSR"). "Маркерний алель" стосується варіанта маркера, який присутній в конкретній рослині. Термін "маркер", як використовують в рамках винаходу, може стосуватися клонованого сегмента хромосомної ДНК кукурудзи (наприклад, як визначають за допомогою однією з SEQ ID NO: 1-197 або поліморфізмів ID №№ 1-106 (таблиця 3)), і також може стосуватися або альтернативно стосуватися молекули ДНК, яка комплементарна клонованому сегменту хромосомної ДНК кукурудзи (наприклад, ДНК, комплементарна одній з SEQ ID NO: 1-197 або поліморфізмам ID №№ 1-106 (таблиця 3)). У деяких варіантах здійснення присутність маркера в рослині можна виявляти з використанням зонда нуклеїнової кислоти. Зонд може являти собою молекулу ДНК або молекулу РНК. РНК-зонди можна синтезувати за допомогою засобів, відомих в даній галузі, наприклад, з використанням молекули ДНК-матриці. Зонд може містити всю або частину нуклеотидної послідовності маркера і додаткову безперервну нуклеотидну послідовність з геному кукурудзи. Його називають в даному описі "неперервним зондом". Додаткову неперервну нуклеотидну послідовність називають "вищележачою" або "нижчележачою" відносно початкового маркера, в залежності від того, чи розташована неперервна нуклеотидна послідовність із хромосоми кукурудзи на 5'- або 3'-стороні початкового маркера, як, загалом, зрозуміло. Додаткова неперервна нуклеотидна послідовність може бути розташована між початковим маркером і областю розміром 100 т.п.н. на 8 хромосомі геному кукурудзи, яка розташована між положеннями на карті 564922 і 601460. Таким чином, неперервна нуклеотидна послідовність може бути розташована між початковим маркером і областю розміром 12 т.п.н. на 8 хромосомі геному кукурудзи, яка розташована між положеннями на карті 86247 і 98188. Як 8 UA 114886 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 загальновизнане фахівцями в даній галузі, спосіб отримання додаткової неперервної нуклеотидної послідовності для включення в маркер, можна повторювати практично без обмежень (він обмежений тільки довжиною хромосоми), тим самим, ідентифікуючи додаткові маркери вздовж хромосоми кукурудзи. Всі із описаних вище маркерів можна використовувати в деяких варіантах здійснення даного винаходу. Послідовність олігонуклеотидного зонда можна отримувати синтетично або шляхом клонування. Придатні клонуючі вектори добре відомі фахівцям в даній галузі. Олігонуклеотид може бути міченим або неміченим. Існує широка множина способів мічення молекул нуклеїнових кислот, включаючи, наприклад і не обмежуючись ними: мічення радіоактивною міткою шляхом нік-трансляції; використання випадкових праймерів; подовження кінців з допомогою кінцевої дезокситрансферази; або схожі з ними, де використовувані нуклеотиди є 32 міченими, наприклад, радіоактивним P. Інші мітки, які можна використати, включають, наприклад і не обмежуючись ними: флуорофори; ферменти; субстрат ферментів; кофактори ферментів; інгібітори ферментів і т. п. Альтернативно використання мітки, яка забезпечує сигнал, що піддається детекції, сама по собі або спільно з іншими реакційноздатними речовинами, можна замінювати лігандами, з якими зв'язуються рецептори, де рецептори є міченими (наприклад, описаними вище мітками) для забезпечення сигналів, що піддаються детекції, або самостійно, або спільно з іншими реагентами. Див., наприклад, Leary et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4045-9. Зонд може містити нуклеотидну послідовність, яка не є неперервною, для послідовності початкового маркера; цей зонд називають в даному описі "не є неперервним зондом". Послідовність, що не є неперервним зондом, розташована досить близько до послідовності початкового маркера на геномі кукурудзи, так, що не є неперервним зондом є генетично зчепленим з тим же геном (наприклад, Rf4). Наприклад, в деяких варіантах здійснення, що не є неперервним зондом, може бути розташований в межах 500 т.п.н.; 450 т.п.н.; 400 т.п.н.; 350 т.п.н.; 300 т.п.н.; 250 т.п.н.; 200 т.п.н.; 150 т.п.н.; 125 т.п.н.; 120 т.п.н.; 100 т.п.н.; 0,9 т.п.н.; 0,8 т.п.н.; 0,7 т.п.н.; 0,6 т.п.н.; 0,5 т.п.н.; 0,4 т.п.н.; 0,3 т.п.н.; 0,2 т.п.н. або 0,1 т.п.н. від початкового маркера в геномі кукурудзи. Зонд може бути точною копією маркера, що підлягає виявленню. Зонд також може являти собою молекулу нуклеїнової кислоти, що містить, або, що складається, з нуклеотидної послідовності, яка по суті ідентична клонованому сегменту хромосомної ДНК кукурудзи (наприклад, як визначено в SEQ ID NO: 1-197 і поліморфізмах ID №№ 1-106 (таблиця 3)). Як використовують в рамках винаходу, термін "по суті ідентичний" може стосуватися нуклеотидних послідовностей, які є більш ніж на 85 % ідентичними. Наприклад, по суті ідентична нуклеотидна послідовність може бути на 85,5 %; 86 %; 87 %; 88 %; 89 %; 90 %; 91 %; 92 %; 93 %; 94 %; 95 %; 96 %; 97 %; 98 %; 99 % або 99,5 % ідентична еталонній послідовності. Зонд також може являти собою молекулу нуклеїнової кислоти, яка є "специфічно гібридизуючуюся" або "специфічно комплементарною" точній копії маркера, що підлягає виявленню ("ДНК-мішень"). "Специфічно гібридизуючийся" і "специфічно комплементарний" є термінами, які вказують на достатній ступінь комплементарності, щоб відбувалося стабільне і специфічне зв'язування між молекулою нуклеїнової кислоти і ДНК-мішенню. Молекула нуклеїнової кислоти не повинна бути на 100 % комплементарна її послідовності-мішені, щоб бути специфічно гібридизуючуюся. Молекула нуклеїнової кислоти є специфічно гібридизуючуюся, коли існує достатній ступінь комплементарності, щоб уникнути неспецифічного зв'язування нуклеїнової кислоти з послідовностями, що не є мішенями в умовах, де специфічне зв'язування є бажаним, наприклад, в жорстких умовах гібридизації. Умови гібридизації, що забезпечують конкретний ступінь жорсткості, варіюють, в залежності від вибраного способу гібридизації і композиції, і довжини гібридизуючих послідовностей нуклеїнових кислот. Як правило, температура гібридизації і іонна сила (особливо концентрація + 2+ Na і/або Mg ) буфера для гібридизації визначають жорсткість гібридизації, хоч час промивання також впливає на жорсткість. Обчислення, що стосуються умов гібридизації, необхідних для досягнення конкретного ступеня жорсткості, відомі середнім фахівцям в даній галузі, і nd розглянуті, наприклад, в Sambrook et al. (ed.) Molecular Cloning: А Laboratory Manual, 2 ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, chapters 9 і 11; і Hames and Higgins (eds.) Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, 1985. Подальша детальна інструкція і керівництво, що стосуються гібридизації нуклеїнових кислот, можуть бути знайдені, наприклад, в Tijssen, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2, Elsevier, NY, 1993; і Ausubel et ah, Eds., Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Greene Publishing and Wiley-Interscience, NY, 1995. 9 UA 114886 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Як використовують в рамках винаходу, "жорсткі умови" охоплюють умови, в яких гібридизація відбувається, тільки якщо існує менше ніж 25 % невідповідності основ між гібридизуючуюся молекулою ДНК-мішенню. "Умови жорсткості" включають інші конкретні рівні жорсткості. Таким чином, як використовують в рамках винаходу, умови "помірної жорсткості" являють собою умови, в яких молекули з більш ніж 25 % невідповідності послідовностей не будуть гібридизуватися; умови "середньої жорсткості" являють собою умови, в яких молекули з більше ніж 15 % невідповідності не будуть гібридизуватися; і умови "високої жорсткості" являють собою умови, в яких послідовності з більше ніж 10 % невідповідності основ не будуть гібридизуватися. Умови "дуже високої жорсткості" являють собою умови, в яких послідовності з більше ніж 6 % невідповідності не будуть гібридизуватися. У конкретних варіантах здійснення жорсткі умови являють собою гібридизацію при 65 °C в 6× сольовому натрій-цитратному буфері (SSC), 5× розчині Денхардта, 0,5 % SDS і 100 г розщепленої ДНК сім'яників лосося, з подальшими послідовними промиваннями протягом 15-30 хвилин при 65 °C в 2× буфері SSC і 0,5 % SDS, а потім 1× буфері SSC і 0,5 % SDS, і, нарешті, в 0,2× буфері SSC і 0,5 % SDS. Що стосується всіх розглянутих вище зондів, зонд може містити додаткові послідовності нуклеїнових кислот, наприклад, промотори; сигнали транскрипції і/або послідовності векторів. Будь-який із розглянутих вище зондів можна використати для визначення додаткових маркерів, які міцно зчеплені з геном, залученим до відновлення фертильності кукурудзи з цитоплазматичною стерильністю С-типу (наприклад, Rf4). Маркери, ідентифіковані таким чином, можуть бути еквівалентними ілюстративним маркерам, вказаним в даному описі і, таким чином, вони знаходяться в об'ємі винаходу. Виведення за допомогою маркера: як використовують в рамках винаходу, термін "виведення за допомогою маркера" може стосуватися підходу для виведення безпосередньо одного або декількох комплексних ознак (наприклад, відновник фертильності CMS-C). У існуючій практиці, рослинники роблять спроби до ідентифікації ознак, що легко виявляються, таких як колір квітки, вигляд оболонки насіння, або варіанти ізоферментів, які зчеплені з бажаною з сільськогосподарської точки зору ознакою. Потім рослинники спостерігають сільськогосподарську ознаку в сегрегуючих популяціях, що виводяться шляхом спостереження за сегрегацією ознаки, що легко виявляється. Однак при виведенні рослин доступно дуже мало з цих взаємозв'язків зчеплення. Виведення за допомогою маркерів забезпечує економічний за часом і затратами спосіб поліпшення сортів рослин. Декілька прикладів застосування виведення за допомогою маркерів залучають використання маркерів ізоферментів. Див., наприклад, Tanksley and Orton, eds. (1983) Isozymes in Plant Breeding and Genetics, Amsterdam: Elsevier. Одним прикладом є маркер ізоферменту, асоційований з геном стійкості до нематодних паразитів в томаті. Ознака стійкості, що контролюється геном, що позначається Mi, локалізована на 6 хромосомі томата і дуже міцно зчеплена з Aps1, ізоферментом кислої фосфатази. Використання маркера ізоферменту Aps1 для непрямої селекції по гену Mi забезпечило ту перевагу, що сегрегацію в популяції стало можливо однозначно визначати за допомогою електрофоретичних способів; маркер ізоферменту можна оцінювати в тканині розсади, усуваючи необхідність в підтримці рослин до дорослого стану; і кодомінантність алелів маркера ізоферменту дозволяє розрізнення між гомозиготами і гетерозиготами. Див. Rick (1983) в Tanksley and Orton, вище. Функціонально зв'язаний: перша нуклеотидна послідовність функціонально зв'язана з другою послідовністю нуклеїнової кислоти, коли перша послідовність нуклеїнової кислоти знаходиться в функціональному взаємозв'язку з другою послідовністю нуклеїнової кислоти. Наприклад, промотор функціонально зв'язаний з кодуючою послідовністю, якщо промотор впливає на транскрипцію або експресію кодуючої послідовності. При рекомбінантній продукції, функціонально зв'язані послідовності нуклеїнових кислот, як правило, є неперервними, і, коли це необхідно, об'єднують дві, кодуючих білок, області в одній рамці зчитування (наприклад, в поліцистронній ORF). Однак нуклеїнові кислоти не повинні бути сусідніми, щоб бути функціонально зв'язаними. Промотор: як використовують в рамках винаходу, термін "промотор" стосується області ДНК, яка може лежати вище за точку початку транскрипції, і яка може бути залучена до розпізнавання і зв'язування РНК-полімерази і інших білків для ініціації транскрипції. Промотор може бути функціонально зв'язаний з геном для експресії в клітині, або промотор може бути функціонально зв'язаний з нуклеотидною послідовністю, що кодує сигнальну послідовність, яка може бути функціонально зв'язана з геном, для експресії в клітині. "Промотор рослин" може являти собою промотор, здатний ініціювати транскрипцію в клітинах рослин. Приклади промоторів, що знаходяться під контролем стадії розвитку, включають промотори, які 10 UA 114886 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 переважно ініціюють транскрипцію в певних тканинах, таких як листя, коріння, насіння, волокна, судинах ксилеми, трахеїдах або склеренхимі. Такі промотори позначають як "переважні для тканин". Промотори, які ініціюють транскрипцію тільки в певних тканинах, називають "тканиноспецифічними". "Специфічний до типу клітин" промотор, головним чином, запускає експресію в певних типах клітин в одному або декількох органах, наприклад, судинних клітинах в корінні або листі. Промотор, що "індукується" може являти собою промотор, який може знаходитися під контролем умов навколишнього середовища. Приклади умов навколишнього середовища, які можуть ініціювати транскрипцію за допомогою індуцибельних промоторів, включають анаеробні умови або присутність світла. Тканиноспецифічні, переважні для тканин, специфічні до типу клітин і індуцибельні промотори складають клас "неконститутивних" промоторів. "Конститутивний" промотор являє собою промотор, який може бути активним в більшості умов навколишнього середовища. У деяких варіантах здійснення даного винаходу можна використати будь-який індуцибельний промотор. Див. Ward et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22:361-366. В випадку індуцибельного промотора швидкість транскрипції зростає у відповідь на індукуючий агент. Ілюстративні індуцибельні промотори включають, але не обмежуються ними: промотори системи ACEI, які відповідають на мідь; ген In2 із кукурудзи, який відповідає на антидоти для бензолсульфонамідних гербіцидів; репресор Tet із Tn10; і індуцибельний промотор із гена стероїдного гормону, транскрипційна активність якого може індукувати глюкокортикостероїдний гормон (Schena et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:0421). Ілюстративні конститутивні промотори включають, але не обмежуються ними: промотори з вірусів рослин, такі як промотор 35S з CaMV; промотори з генів актину рису; промотори убіквітину; pEMU; MAS; промотор гістону H3 кукурудзи; і промотор ALS, фрагмент XbaI/NcoI, що знаходиться з 5'-сторони від структурного гена ALS3 Brassica napus (або нуклеотидна послідовність, схожа з вказаним фрагментом XbaI/NcoI) (міжнародна заявка PCT WO 96/30530). Будь-який тканиноспецифічний або переважний для тканини промотор також можна використовувати в деяких варіантах здійснення даного винаходу. Рослини, трансформовані геном, функціонально зв'язаним з тканиноспецифічним промотором, можуть продукувати білковий продукт трансгена виключно, або переважно, в конкретній тканині. Ілюстративні тканиноспецифічні або переважні для тканин промотори включають, але не обмежуються ними: переважний для коріння промотор, такий як промотор із гена фазеоліну; специфічний для листя і промотор, що індукується світлом, такий як промотор із cab або rubisco; специфічний для пиляка промотор, такий як промотор із LAT52; специфічний для пилку промотор, такий як промотор із Zm13; і переважний для мікроспор промотор, такий як промотор із apg. Ідентичність послідовностей: термін "ідентичність послідовностей" або "ідентичність", як використовують в рамках винаходу в контексті двох послідовностей нуклеїнових кислот або поліпептидів, може стосуватися залишків в двох послідовностях, які є однаковими при вирівнюванні на максимальну відповідність протягом певного вікна порівняння. Коли процент ідентичності послідовностей використовують відносно білків, є загальновизнаним, що залишки, які не є ідентичними, часто відрізняються за допомогою консервативних амінокислотних замін, де амінокислотні залишки заміняють інші амінокислотні залишки зі схожими хімічними властивостями (наприклад, заряд, гідрофобність або просторові ефекти), і, таким чином, не змінюють функціональних властивостей молекули. Таким чином, коли послідовності відрізняються консервативними замінами, процентна ідентичність послідовностей може бути скорегована в напрямку збільшення для поправки на консервативну природу заміни в області неідентичного залишку. Послідовності, які відрізняються такими консервативними замінами, називають послідовностями, що мають "схожість послідовностей" або "схожість". Способи здійснення цієї корекції добре відомі середнім фахівцям в даній галузі. Як правило, такі способи залучають оцінку консервативної заміни як часткову, а не повну, невідповідність, тим самим збільшуючи процентну ідентичність послідовностей. Наприклад, коли ідентичній амінокислоті привласнюється показник від 0 до 1, і неконсервативній заміні привласнюється показник 0, консервативній заміні привласнюється показник від 0 до 1. Оцінку консервативних замін можна проводити, наприклад, як здійснено в програмі PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, CA). Як використовують в рамках винаходу, термін "процент ідентичності послідовностей" може стосуватися величини, що визначається шляхом порівняння двох оптимально вирівняних послідовностей протягом вікна порівняння, де частина послідовності у вікні порівняння може містити вставки або делеції (тобто пропуски) в порівнянні з еталонною послідовністю (яка не містить вставки або делеції) для оптимального вирівнювання двох послідовностей. Процент вираховують шляхом визначення кількості положень, в яких ідентичний нуклеотидний або 11 UA 114886 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 амінокислотний залишок зустрічається в обох послідовностях, з отриманням відповідних один одному положень, розподілу кількості відповідних один одному положень на загальне число положень у вікні порівняння, і множення результату на 100 з отриманням процента ідентичності послідовностей. Однонуклеотидний поліморфізм (SNP): як використовують в рамках винаходу, термін "однонуклеотидний поліморфізм" може стосуватися варіювання послідовності ДНК, виникаючого, коли окремий нуклеотид в геномі (або іншої загальної послідовності) відрізняється між представниками виду або парними хромосомами індивідуума. У популяції SNP може бути приписана частота рідкого алеля - найбільш низька алельна частота в локусі, яку спостерігають в конкретній популяції. Вона являє собою просто найменшу з двох алельних частот однонуклеотидних поліморфізмів. Існує варіювання між популяціями людини, так що алель SNP, який є поширеним в одній географічній або етнічній групі, може бути значно більш рідшим в іншій. Однонуклеотидні поліморфізми можуть знаходитися в кодуючих послідовностях генів, некодуючих областях генів, або в міжгенних областях між генами. SNP в послідовності, що кодує, необов'язково змінює амінокислотну послідовність білка, який продукується, внаслідок вироджуваності генетичного коду. SNP, в якому обидві форми приводять до однієї і тієї ж поліпептидної послідовності, називають "синонімічними" (іноді званою мутацією, що мовчить). Якщо продукується відмінна поліпептидна послідовність, її називають "несинонімічною". Несинонімічна заміна може являти собою або міссенс-заміну, або нонсенс-заміну, де міссенсзаміна приводить до відмінної амінокислоти, а нонсенс-заміна приводить до передчасного стопкодону. SNP, які не є кодуючими білок областями, проте, можуть мати наслідки для сплайсингу генів, зв'язування факторів транскрипції або послідовності некодуючої РНК. SNP звичайно є біалельними і, таким чином, їх легко аналізувати в рослинах і тваринах. Sachidanandam (2001) Nature 409:928-33. InDel: як використовують в рамках винаходу, термін "InDel" використовують, головним чином, для опису інсерції або делеції в гені. Таким чином, "InDel" просто стосується конкретної мутації, яка може являти собою або інсерцію, або делецію, або їх комбінацію. Ознака або фенотип: терміни "ознака" і "фенотип" використовують в даному описі взаємозамінно. Для цілей даного винаходу особливим інтересом є ознака відновлення фертильності CMS С-типу. III. Ген-відновник CMS-C кукурудзи Rf4 і його молекулярні маркери Передбачаються молекулярні маркери, які зчеплені (наприклад, міцно зчеплені) з геномвідновником CMS-C кукурудзи Rf4. Ідентифіковані сегменти ДНК, що містять послідовності, залучені до відновлення фертильності рослин CMS-C. Ці сегменти розташовані між маркерами, які зчеплені (наприклад, міцно зчеплені) з геном Rf4. Таким чином, також передбачені молекули нуклеїнових кислот, що містять ген Rf4. Ідентифіковані сегменти і їх маркери описані в даному описі, частково по їх положенню в конкретній області у верхній частині хромосоми 8 кукурудзи. Положення ідентифікованих сегментів і їх маркерів, коли його виражають як частоти рекомбінації або одиниці картування, передбачене в даному описі як загальна інформація. Варіанти здійснення, описані в даному описі, здійснювали в популяції кукурудзи BE4207×XJH58. Однак положення конкретних сегментів і маркерів як одиниці маркерів виражені відносно загальнодоступної геномної послідовності інбредної рослини кукурудзи B73 (B73 RefGen v1 або v2), яка може бути знайдена у всесвітній мережі на www2.genome.arizona.edu/genomes/maize, або ftp.maizesequence.org/current/assembly/. Послідовності генів сортів кукурудзи BE4207 і XJH58 ще недоступні. Очікується, що числа, наведені для конкретних сегментів і маркерів як одиниці картування, можуть варіювати від культивару до культивару і не є частиною основного визначення сегментів і маркерів ДНК, і ці сегменти і маркери ДНК іншим способом описують, наприклад, за нуклеотидною послідовністю. Домінантний алель гена Rf4 контролює відновлення фертильності в системі CMS-C/Rf4. У варіантах здійснення ген Rf4 визначають як ген, вибраний з групи, що складається з GRMZM2G122853 (SEQ ID NO: 198); AC187051.4_FG005 (SEQ ID NO: 199); GRMZM2G122851 (SEQ ID NO: 200); GRMZM2G122850 (SEQ ID NO: 201); GRMZM2G582028 (SEQ ID NO: 202); GRMZM2G021276 (SEQ ID NO: 203); GRMZM2G381376 (SEQ ID NO: 204); GRMZM2G081127 (SEQ ID NO: 205); GRMZM2G085111 (SEQ ID NO: 206); GRMZM2G085038 (SEQ ID NO: 207); GRMZM2G317468 (SEQ ID NO: 208); GRMZM2G328030 (SEQ ID NO: 209); GRMZM2G029450 (SEQ ID NO: 210) і GRMZM2G077212 (SEQ ID NO: 211). У конкретних варіантах здійснення ген Rf4 являє собою Rf4-bHLH (SEQ ID NO: 203). Наприклад, ген Rf4-bHLH представлений в SEQ ID NO: 220. 12 UA 114886 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У деяких варіантах здійснення винахід також включає нуклеотидні послідовності, які по суті ідентичні Rf4-bHLH. Наприклад, в деяких варіантах здійснення молекула нуклеїнової кислоти являє собою гомолог Rf4, який щонайменше приблизно на 85 % ідентичний Rf4-bHLH. Гомолог Rf4 може бути на 86 %; 87 %; 88 %; 89 %; 90 %; 91 %; 92 %; 93 %; 94 %; 95 %; 96 %; 97 %; 98 %; 99 % або 99,5 % ідентичний Rf4-bHLH. Такий гомолог Rf4 можна легко ідентифікувати і виділяти з повних або часткових генів, легкодоступних фахівцям в даній галузі для множини організмів. Деякі варіанти здійснення також включають функціональні варіанти гена Rf4. Функціональні варіанти Rf4 включають, наприклад, послідовність Rf4-bHLH, що містить одну або декілька нуклеотидних замін, делецій або вставок, де функціональний варіант відновлює чоловічу фертильність в кукурудзі CMS-C, як можна визначати загальноприйнятими способами, добре відомими фахівцям в даній галузі. Наприклад, здатність конкретного варіанта гена Rf4 відновлювати чоловічу фертильність кукурудзи CMS-C можна визначати шляхом загальноприйнятого внесення мутації або фрагмента в рослини, гомозиготні по стерильному алелю rf4, з подальшим стандартним спостереженням рослин відносно чоловічої стерильності. Функціональні варіанти гена Rf4 можна створювати за допомогою сайт-направленого мутагенезу, мутації, що індукується, або вони можуть зустрічатися як алельні варіанти (поліморфізми, наприклад, SNP). У конкретних прикладах функціональний варіант Rf4 являє собою послідовність Rf4-bHLH, що містить одну або декілька нуклеотидних замін, делецій або вставок, так що варіант кодує поліпептид Rf4-bHLH, що містить гідрофобну амінокислотну заміну (наприклад, Phe) для Y186 в домені bHLH. Таким чином, в деяких варіантах здійснення функціональні варіанти гена Rf4 можуть являти собою мутації Rf4, або фрагменти, менші ніж повна послідовність Rf4, які зберігають властивості контролю чоловічої стерильності гена Rf4. Такі мутації і фрагменти, таким чином, вважаються такими, що знаходяться в об'ємі винаходу. У зв'язку з даним описом, фахівець в даній галузі може легко визначити, чи зберігає мутація або фрагмент послідовності Rf4, вказаної в даному описі, властивості гена Rf4. У деяких варіантах здійснення винахід також включає поліпептиди Rf4-bHLH (наприклад, SEQ ID NO: 225) і поліпептиди, які по суті ідентичні Rf4-bHLH. Наприклад, в деяких варіантах здійснення поліпептид, який по суті ідентичний Rf4-bHLH, може бути щонайменше приблизно на 25 % ідентичний Rf4-bHLH і має гідрофобний амінокислотний залишок (наприклад, Phe) в положенні, відповідному F187 SEQ ID NO: 225, при визначенні за допомогою вирівнювання послідовностей. У деяких варіантах здійснення поліпептид, який по суті ідентичний Rf4-bHLH, може бути на 86 %; 87 %; 88 %; 89 %; 90 %; 91 %; 92 %; 93 %; 94 %; 95 %; 96 %; 97 %; 98 %; 99 % або 99,5 % ідентичний Rf4-bHLH. Такі поліпептиди, які по суті ідентичні Rf4-bHLH, можна легко ідентифікувати і встановити з повних або часткових геномів або бібліотек кДНК, вільно доступних фахівцям в даній галузі для множини організмів. IV. Способи використання гена Rf4 Ген Rf4, описаний в даному описі, можна використати в будь-кому з множини способів, відомих фахівцеві в даній галузі, для маніпуляції геном, щоб забезпечити бажаний ефект. Наприклад і не обмежуючись цим, ген Rf4 можна використати для: внесення мутантної послідовності Rf4 в рослину для забезпечення стерильності; внесення мутації в нативну послідовність Rf4; внесення антисмислової молекули нуклеїнової кислоти, націленої на ДНК або РНК Rf4, в рослину для впливу на фертильність; використання утворення шпильок; або зв'язування послідовності(ей) Rf4 з іншими послідовностями нуклеїнової кислоти для контролю експресії продукту гена Rf4. Наприклад, в деяких варіантах здійснення ген Rf4, визначений як вибраний з групи, що складається з GRMZM2G122853 (SEQ ID NO: 198); AC187051.4_FG005 (SEQ ID NO: 199); GRMZM2G122851 (SEQ ID NO: 200); GRMZM2G122850 (SEQ ID NO: 201); GRMZM2G582028 (SEQ ID NO: 202); GRMZM2G021276 (SEQ ID NO: 203); GRMZM2G381376 (SEQ ID NO: 204); GRMZM2G081127 (SEQ ID NO: 205); GRZM2G085111 (SEQ ID NO: 206); GRMZM2G085038 (SEQ ID NO: 207); GRMZM2G317468 (SEQ ID NO: 208); GRMZM2G328030 (SEQ ID NO: 209); GRMZM2G029450 (SEQ ID NO: 210) і GRMZM2G077212 (SEQ ID NO: 211) можна використати для полегшення використання системи чоловічої фертильності CMS-C/Rf4 спільно з іншими генами або мутантами, що впливають на чоловічу фертильність в кукурудзі. Наприклад, в конкретних варіантах здійснення ген Rf4-bHLH можна використовувати для полегшення використання системи чоловічої фертильності CMS-C/Rf4 спільно з іншими генами або мутантами, що впливають на чоловічу фертильність в кукурудзі. У деяких варіантах здійснення ген Rf4 можна вносити в рослину кукурудзи, яка є придатною для застосування в системі чоловічої фертильності, відмінної від системи чоловічої фертильності CMS-C/Rf4. Альтернативно ген або мутантний ген, відмінний від Rf4, можна 13 UA 114886 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 вносити в рослину кукурудзи, яка придатна для застосування в системі чоловічої фертильності CMS-C/Rf4, так щоб внесений ген або мутантний ген можна було використати для забезпечення додаткового або доповнюючого контролю фертильності. Конкретні приклади інших генів чоловічої фертильності і мутацій в кукурудзі включають: CMS-T/Rf1; CMS-T/Rf2; CMS-S/Rf2; ms1 (Singleton and Jones (1930) J. Hered. 21: 266-8); ms2 і ms3 (Eyster (1931) J. Hered. 22:99-102); ms5, ms7, ms8, ms9, ms10, ms11, ms12, ms13 і ms14 (Beadle (1932) Genetics 17:413-31); ms17 (Emerson (1932) Science 75:566); ms20 (Eyster (1934) Bibliographia Genetica 11:187-392); ms23 і ms24 (West and Albertsen (1985) MNL 59:87); ms25 і ms26 (Loukides et al. (1995) Am. J. Bot. 82:1017-23); ms27 і ms38 (Albertsen et al. (1996) MNL 70:30-1); ms28 (Golubovskaya (1979) MNL 53:66-70); ms29 і ms31 (Trimnell et al. (1998) MNL 72:37-38); ms30 (Albertsen et al. (1999) MNL 73:48); ms32, ms36 і ms37 (Trimnell et al. (1999) MNL 73:48-50); ms33 і ms34 (Patterson (1995) MNL 69:126-8); ms43 (Golubovskaya (1979) Int. Rev. Cytol. 58:247-90); ms45 (Albertsen et al. (1993) Proc. Annu. Corn Sorghum Ind. Res. Conf. 48:224-33) і ms48, ms49 і ms50 (Trimnell et al. (2002) MNL 76:38-9). Коли послідовність нуклеїнової кислоти (наприклад, Rf4) "вводять" в організм, такий як рослина, спосіб або методологія, що використовуються для введення молекули нуклеїнової кислоти, що містить конкретну послідовність, не є істотними для винаходу, і його можна проводити за допомогою будь-якого способу або методології, відомих фахівцям в даній галузі. Наприклад, молекулу нуклеїнової кислоти можна вводити способами прямої трансформації, такими як опосередкована Agrobacterium трансформація тканини рослин; бомбардування мікроснарядами; електропорація і т. д. Альтернативно молекулу нуклеїнової кислоти можна вводити шляхом схрещування рослини, що має конкретну нуклеотидну послідовність, з іншою рослиною, так щоб потомство мало нуклеотидну послідовність, включену в їх геном. Такі способи виведення добре відомі фахівцеві в даній галузі. Способи виведення з допомогою маркера, як описано в даному описі, можуть значно полегшувати включення Rf4 шляхом таких схрещувань. У варіантах здійснення, де ген Rf4 вводять в організм, може бути бажаним введення гена Rf4 таким чином, щоб ген Rf4 був функціонально зв'язаний з однією або декількома регуляторними послідовностями, наприклад, введення з використанням плазміди, що містить ген Rf4, функціонально зв'язаний з бажаними регуляторними послідовностями. Регуляторні послідовності, придатні для експресії гетерологічних послідовностей нуклеїнових кислот, добре відомі в даній галузі, і включають, наприклад і не обмежуючись ними: промотори (наприклад, конститутивні промотори; тканиноспецифічні промотори і специфічні для стадії розвитку промотори); послідовності термінації; енхансерні послідовності; послідовності субклітинного націлювання; стабілізуючі або лідерні послідовності; і інтрони. У деяких варіантах здійснення ген Rf4 можна вводити в організм з однією або декількома додатковими бажаними послідовностями нуклеїнових кислот (наприклад, генами). Додаткові бажані послідовності нуклеїнових кислот можуть включати, наприклад: гени, що кодують чужорідні білки; агрономічні гени; гени стійкості до захворювань рослин; гени, що додають стійкість до паразитів рослин; гени, що додають стійкість до гербіцидів; і гени, які додають або вносять внесок в ознаку, що є позитивним доповненням (наприклад, модифікований метаболізм жирних кислот; знижений вміст фітатів; і модифікований вуглеводний склад). Приклади всіх із вищезазначених послідовностей нуклеїнових кислот відомі фахівцям в даній галузі. Ген Rf4 також можна вводити в організм з одним або декількома маркерними генами, функціонально зв'язаними з регуляторним елементом (наприклад, промотором), який дозволяє виділення трансформованих клітин, що містять маркер, або за допомогою негативної селекції (тобто інгібування росту клітин, які не містять генів селективного маркера), або з допомогою позитивної селекції (тобто скринінгу на продукт, що кодується генетичним маркером). Багато які гени селективних маркерів для трансформації добре відомі в даній галузі і включають, наприклад, гени, які кодують ферменти, які здійснюють метаболічну детоксикацію селективного хімічного агента, який може являти собою антибіотик або гербіцид, або гени, які кодують змінену мішень, яка може бути нечутливою до інгібітору. У даній галузі також відомо декілька способів позитивної селекції. Приклади маркерних генів, придатних для застосування в клітинах рослин, можуть включати, наприклад і не обмежуючись ними: ген неоміцинфосфотрансферази II (nptII) (Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803); ген гігроміцинфосфотрансферази (Vanden Elzen et al. (1985) Plant Mol. Biol. 5:299); ген гентаміцинацетилтрансферази, ген стрептоміцинфосфотрансферази, аміноглікозид-3'-аденілтрансферази, і ген, що визначає стійкість до блеоміцину (див., наприклад, Hayford et al. (1988) Plant Physiol. 86:1216; Jones et al. (1987) Mol. Gen. Genet. 210:86); Svab et al. (1990) Plant Mol. Biol. 14:197; і Hille et al. (1986) Plant Mol. Biol. 7:171); гени селективних маркерів, які додають стійкість до гербіцидів, таких як 14 UA 114886 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 гліфосат, глюфосинат або бромксиніл (див., наприклад, Comai et al. (1985) Nature 317:741-744; Gordon-Kamm et al. (1990) Plant Cell 2:603-618; і Stalker et al. (1988) Science 242:419-423); ген дигідрофолатредуктази миші (Eichholtz et al. (1987) Somatic Cell Mol. Genet. 13:67); ген 5енолпірувілшикимат-3-фосфатсинтетази рослин (Shah et al. (1986) Science 233:478); ген ацетолактатсинтетази рослин (Charest et al. (1990) Plant Cell Rep. 8:643). Для іншого класу маркерних генів, придатних для трансформації рослин, використовується скринінг переважно трансформованих клітин-рослин, а не пряма генетична селекція трансформованих клітин у відношенні стійкості до токсичної речовини, такої як антибіотик. Ці гени особливо придатні для кількісного визначення або візуалізації просторового характеру експресії гена в конкретних тканинах, і їх часто називають "репортерними генами", оскільки вони можуть бути злиті з геном або регуляторною послідовністю гена для дослідження експресії гена. Гени, що широко використовуються для скринінгу трансформованих клітин включають ген βглюкуронідази (GUS), β-галактозидази, люциферази і хлорамфеніколацетилтрансферази. Див., наприклад, Jefferson (1987) Plant Mol. Biol. Rep. 5:387; Teeri et al. (1989) EMBO J. 8:343; Koncz et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 84:131; і DeBlock et al (1984) EMBO J. 3: 1681. Недавно стали більш доступними способи для візуалізації активності GUS in vivo, які не вимагають руйнування тканини рослин. Molecular Probes publication 2908, Imagene Green.TM., р. 1-4, 1993; і Naleway et al. (1991) J. Cell Biol. 115: 151a. Крім того, гени, що кодують флуоресцентні білки (наприклад, GFP, EGFP, EBFP, ECFP і YFP) використовують як маркери для експресії генів в прокаріотичних і еукаріотичних клітинах. Див. Chalfie et al. (1994) Science 263:802. Як маркери для скринингу можна використати флуоресцентні білки і мутації флуоресцентних білків. У деяких варіантах здійснення ген Rf4 кукурудзи і фрагменти або сегменти гена Rf4 кукурудзи, описані в даному описі, можна використовувати для ідентифікації гомологічних послідовностей Rf4 з організмів, відмінних від кукурудзи (наприклад, шляхом порівняння послідовностей). Послідовності з організмів, відмінних від кукурудзи, які є гомологічними гену Rf4 кукурудзи, можна ідентифікувати і виділяти добре відомими способами, наприклад, на основі їх гомології послідовності з Rf4-bHLH. Наприклад, всю кодуючу послідовність Rf4-bHLH або її частину можна використати як зонд, який специфічно гібридизується з іншими послідовностями, присутніми в сукупності клонованих фрагментів геномної ДНК (тобто геномної бібліотеки) з організму у відповідності зі стандартними способами. Таким чином, в деяких варіантах здійснення винахід включає нуклеотидні послідовності, які специфічно гібридизуються з послідовністю Rf4-bHLH (наприклад, SEQ ID NO: 220). Альтернативно послідовності з організмів, відмінні від кукурудзи, які гомологічні гену Rf4 кукурудзи, можна ідентифікувати і виділяти шляхом порівняння послідовностей. Наприклад, можна проводити пошук в повністю або частково відсеквенованому геномі організму у відповідності зі стандартними способами за допомогою послідовності Rf4-bHLH кукурудзи (наприклад, SEQ ID NO: 220) для ідентифікації генів в геномі організму, які мають високий ступінь ідентичності послідовності з Rf4 кукурудзи, і, таким чином, ймовірно є гомологами Rf4. Наприклад, всю послідовність Rf4 кукурудзи або її частину (наприклад, SEQ ID NO: 220) можна використати як "еталонну послідовність". Як правило, послідовності нуклеїнових кислот (наприклад, клоновані або геномні фрагменти ДНК геномної бібліотеки), які порівнюють з еталонною послідовністю, включають "вікно порівняння", яке являє собою певний неперервний сегмент послідовності нуклеїнової кислоти. Вікно порівняння може включати вставки або делеції (тобто пропуски) в порівнянні з еталонною послідовністю (яка не містить вставок або делецій) для оптимального вирівнювання двох послідовностей. Вікно порівняння, як правило, має довжину щонайменше 20 послідовно розташованих нуклеотидів, однак воно може мати довжину 30, 40, 50, 100 або 200 нуклеотидів або більше. Для уникнення високої схожості з еталонною послідовністю внаслідок включення делецій у вікно порівняння полінуклеотидних послідовностей, може бути внесений "штраф за делецію", щоб його вирахувати з кількості відповідних один одному нуклеотидів. Способи вирівнювання послідовностей для порівняння добре відомі в даній галузі. Визначення процентної ідентичності послідовностей між будь-якими двома послідовностями можна проводити з використанням доступних математичних алгоритмів. Необмежуючими прикладами таких математичних алгоритмів є алгоритм Myers and Miller (1988), CABIOS 4:11-7; алгоритм локального вирівнювання Smith et al. (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; алгоритм загального вирівнювання Needleman and Wunsch (1970), J. Mol. Biol. 48:443-53; спосіб пошуку для локального вирівнювання Pearson and Lipman (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-8; алгоритм Karlin and Altschul (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264, і Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-7. 15 UA 114886 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Фахівець в даній галузі може здійснювати ці математичні алгоритми на комп'ютері для порівняння послідовностей з метою визначення ідентичності послідовностей, або з метою пошуку в базі даних, що містить множину послідовностей (наприклад, база даних геномів організмів) в залежності від ідентичності послідовності з еталонною послідовністю. Такі здійснення включають, але не обмежуються ними, CLUSTAL в програмі PC/Gene (Intelligenetics, Mountain View, CA); і програму ALIGN і GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA і TFASTA в GCG Wisconsin Genetics Software Package, v.10 (Accelrys Inc., San Diego, CA). Вирівнювання послідовностей з використанням цих програм можна проводити, використовуючи їх параметри за умовчанням. Альтернативно може бути бажаною модифікація параметрів за умовчанням при деяких пошуках (наприклад, зміна величини штрафу за делецію). Вибір конкретного комп'ютерного здійснення математичних алгоритмів для обчислення ідентичності послідовностей і вибір величин параметрів для застосування у вибраному алгоритмі знаходяться на розсуд фахівця в даній галузі. У деяких варіантах здійснення систему CMS-C/Rf4 для отримання гібридного насіння можна включати способами інженерії в сорт кукурудзи, позбавлений функціонального гена-відновника Rf4, або вид рослин, відмінний від кукурудзи, наприклад, шляхом введення гена Rf4 в такий сорт кукурудзи або вид рослин. Таким чином, відповідно до деяких варіантів здійснення, ген Rf4, описаний в даному описі, можна використовувати в способі отримання гібридного насіння. Спосіб отримання гібридного насіння може включати отримання молекули нуклеїнової кислоти, що містить послідовність Rf4bHLH кукурудзи (наприклад, SEQ ID NO: 220), або нуклеотидну послідовність, яка специфічно гібридизується з послідовністю Rf4-bHLH кукурудзи. Потім цю молекулу нуклеїнової кислоти можна вводити в рослинну клітину або рослинну тканину, де рослина, з якої отримана рослинна клітина або тканина рослин, може являти собою Zea mays, або інший вид рослин. Потім з рослинної клітини або тканини рослин можна отримувати трансформовану цілу рослину, в яку введена молекула нуклеїнової кислоти. Потім рослину з цитоплазматичною чоловічою стерильністю можна запилювати за допомогою трансформованої суцільної рослини. Потім з рослини з цитоплазматичною чоловічою стерильністю можна отримувати насіння, яке було запилене трансформованою суцільною рослиною. У конкретних варіантах здійснення функціональні варіанти або гомологи гена Rf4-bHLH кукурудзи можна використовувати замість послідовності Rf4-bHLH кукурудзи (наприклад, SEQ ID NO: 220), або нуклеотидної послідовності, яка специфічно гібридизується з послідовністю Rf4-bHLH кукурудзи, в способі отримання гібридного насіння. Трансформована суцільна рослина, яку отримують, наприклад, описаними вище способами, може бути здатна продукувати насіння. Однак таке насіння може бути нездатне виростати в фертильні рослини. Таким чином, деякі варіанти здійснення способів отримання гібридного насіння залучають способи культивування тканин рослин. Такі способи є стандартними і широко відомі фахівцям в даній галузі. У варіантах здійснення, де систему CMS-C/Rf4 для отримання гібридного насіння вводять способами інженерії у види рослин, відмінні від кукурудзи, може бути необхідно також вводити молекули нуклеїнових кислот, що містять одну або декілька послідовність(ей) нуклеїнових кислот, залучених в систему чоловічої стерильності CMS-C, у види рослин. Наприклад, рецесивний алель rf4-bHLH можна вводити для заміни ортолога Rf4-bHLH у виді рослин для отримання рослини з чоловічою стерильністю rf4/rf4, в яку можна вводити ген Rf4-bHLH для створення у виді способами інженерії системи CMS-C/Rf4 для отримання гібридного насіння. У деяких варіантах здійснення ген Rf4, описаний в даному описі, можна використовувати в способі отримання гібридного насіння, що включає запліднення жіночої рослини, що має ознаку чоловічої стерильності CMS С-типу пилком з чоловічої рослини, що містить ген Rf4. У цих і інших варіантах здійснення можна використовувати послідовність Rf4-bHLH кукурудзи (наприклад, SEQ ID NO: 220), нуклеотидну послідовність, яка специфічно гібридизується з послідовністю Rf4-bHLH кукурудзи, або функціональні варіанти або гомологи послідовності Rf4bHH. У деяких варіантах здійснення спосіб отримання гібридного насіння включає отримання першої рослини, що містить Rf4, наприклад, шляхом зворотного схрещування; мутагенезу; трансформації або гомологічної рекомбінації. Потім можна отримувати другу рослину, що має ознаку чоловічої стерильності CMS С-типу, або створювати, наприклад, шляхом зворотного схрещування; мутагенезу; або гомологічної рекомбінації. Потім другу рослину можна схрещувати з першою рослиною з отриманням фертильного гібридного насіння з другої рослини. У варіантах здійснення перша рослина може являти собою чоловічу рослину, а друга рослина може являти собою жіночу рослину. 16 UA 114886 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У конкретних прикладах способів отримання гібридного насіння рослина може являти собою рослину кукурудзи. У наступних прикладах можна використовувати рослини, відмінні від кукурудзи. Варіанти здійснення способів отримання гібридного насіння відповідно до винаходу застосовні до будь-якої рослини, такої як рослини, що розмножуються статевим шляхом, включаючи рослини, що мають агрономічну цінність, наприклад і не обмежуючись ними: кукурудзу; сою; люцерну; пшеницю; рапс; рис; сорго; цукровий буряк; брахіподію; однодольні рослини; дводольні рослини; різні овочі, включаючи огірок, помідор, перець і т. д.; різні дерева, включаючи яблуко, грушу, персик, вишню, червоне дерево, сосну, дуб і т. д.; і різні декоративні рослини. V. Способи застосування молекулярних маркерів Rf4 Способи застосування молекулярних маркерів нуклеїнових кислот, які зчеплені з геном Rf4 або розташовані в ньому, для ідентифікації рослин з функціональним геном-відновником для CMS С-типу можуть приводити до економії затрат для рослинників, оскільки такі способи можуть усунути потребу в схрещуванні рослин, що містять функціональний ген-відновник, з лініями рослин CMS, а потім фенотипуванні нащадків схрещування. Додаткові маркери можна ідентифікувати як еквівалент будь-якому з ілюстративних маркерів, названих в даному описі (наприклад, SEQ ID NO: 1-197 і поліморфізми ID №№ 1-106 (таблиця 3)), наприклад, шляхом визначення частоти рекомбінації між додатковим маркером і ілюстративним названим маркером. При такому визначенні можна використовувати вдосконалений спосіб ортогональних контрастів на основі способу Mather (1931), The Measurement of Linkage in Heredity, Methuen & Co., London, з подальшим тестом на максимальну імовірність для визначення частоти рекомбінації. Allard (1956) Hilgardia 24:235-78. Якщо величина частоти рекомбінації менше або дорівнює 0,10 (тобто 10 %) в будь-якому культиварі кукурудзи, то додатковий маркер вважається еквівалентом конкретному еталонному маркеру для цілей використання в даних описаних способах. Засоби для відновлення фертильності кукурудзи CMS-C можуть включати послідовність нуклеїнової кислоти з рослини, виявлення якої забезпечує щонайменше переконливу вказівку на те, що рослина, що містить послідовність нуклеїнової кислоти, містить функціональний відновник гена CMS-C. У деяких прикладах засіб для відновлення фертильності кукурудзи CMSC являє собою маркер, який зчеплений (наприклад, зчеплений; міцно зчеплений або надзвичайно міцно зчеплений) з геном Rf4-bHLH або який розташований в ньому. Засоби для ідентифікації рослин кукурудзи, що мають ген для відновлення фертильності кукурудзи CMS-C, може являти собою молекулу, яка забезпечує сигнал, що піддається детекції, при додаванні до зразка, отриманого з рослини, що має ген для відновлення фертильності кукурудзи CMS-C. Специфічна гібридизація нуклеїнових кислот являє собою сигнал, що піддається детекції, і, таким чином, зонд нуклеїнової кислоти, який специфічно гібридизується з репортерним геном CMS-C, або відмінною геномною послідовністю нуклеїнової кислоти, яка є індикатором присутності функціонального гена-відновника CMS-C, може бути засобом для ідентифікації рослин кукурудзи, що мають ген для відновлення фертильності кукурудзи CMS-C. У деяких прикладах засоби для ідентифікації рослин, що мають ген для відновлення фертильності кукурудзи CMS-C, являють собою зонд, який специфічно гібридизується з маркером, який зчеплений (наприклад, зчеплений; міцно зчеплений або надзвичайно міцно зчеплений) з геном Rf4-bHLH кукурудзи або який розташований в ньому. У деяких варіантах здійснення маркери, фланкуючі ген Rf4, можна використовувати для перенесення сегмента(ів) донорної батьківської ДНК, яка однозначно містить ген Rf4. У конкретних варіантах здійснення маркери вибирають з групи маркерів, що містить SEQ ID NO: 1-197 і поліморфізми ID №№ 1-106 (таблиця 3), або з маркерів, еквівалентних маркерам, вибраним з групи маркерів, що містить SEQ ID NO: 1-197 і поліморфізми ID №№ 1-106 (таблиця 3). У деяких варіантах здійснення спосіб використання маркерів, фланкуючих ген Rf4, для перенесення сегмента(ів) донорної батьківської ДНК, яка однозначно містить ген Rf4, може включати аналіз геномної ДНК двох батьківських рослин за допомогою зондів, які специфічно гібридизуються з маркерами, зчепленими (наприклад, зчепленими; міцно зчепленими або надзвичайно міцно зчепленими) з геном Rf4; статеве схрещування двох генотипів батьківських рослин з отриманням популяції нащадків, і аналіз цих нащадків на присутність маркерів, зчеплених (наприклад, зчеплених; міцно зчеплених або надзвичайно міцно зчеплених) з геном Rf4; зворотне схрещування нащадків, які містять маркери, зчеплені (наприклад, зчеплені; міцно зчеплені або надзвичайно міцно зчеплені) з геном Rf4, з реципієнтним генотипом для отримання популяції першого зворотного схрещування, а потім продовження програми зворотного схрещування до отримання кінцевих нащадків, яке містить будь-яку бажану ознаку(и), що виявляється батьківським генотипом і геном Rf4. У конкретних варіантах 17 UA 114886 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 здійснення селекцію індивідуальних нащадків, отриманого на кожній стадії схрещування і зворотного схрещування, проводять за допомогою аналізу маркера Rf4 в кожному поколінні. У деяких варіантах здійснення аналіз геномної ДНК двох батьківських рослин за допомогою зондів, які специфічно гібридизуються з маркерами, зчепленими (наприклад, зчепленими; міцно зчепленими або надзвичайно міцно зчепленими) з геном Rf4 показує, що одна з батьківських рослин містить менше зчеплених маркерів, з якими зонди специфічно гібридизуються, або жоден із зчеплених маркерів, з якими зонди специфічно гібридизуються. У деяких варіантах здійснення маркери, які зчеплені (наприклад, зчеплені; міцно зчеплені або надзвичайно міцно зчеплені) з геном Rf4-bHLH кукурудзи або які розташовані в ньому, або саму послідовність гена Rf4-bHLH кукурудзи можна використовувати для введення гена Rf4 кукурудзи в рослину шляхом генетичної трансформації. У конкретних варіантах здійснення маркери вибрані з групи маркерів, що містять SEQ ID NO: 1-197 і поліморфізми ID №№ 1-106 (таблиця 3), або з маркерів, еквівалентних маркерам, обраним з групи маркерів, що містить SEQ ID NO: 1-197 і поліморфізми ID №№ 1-106 (таблиця 3). У деяких варіантах здійснення спосіб введення гена Rf4 кукурудзи в рослину кукурудзи шляхом генетичної рекомбінації може включати аналіз геномної ДНК рослини (наприклад, рослини кукурудзи) за допомогою зондів, які специфічно гібридизуються з маркерами, зчепленими (наприклад, зчепленими; міцно зчепленими або надзвичайно міцно зчепленими) з геном Rf4, або з самим геном Rf4 для ідентифікації гена Rf4 в рослині; виділення сегмента геномної ДНК рослини, що містить ген Rf4, наприклад, шляхом екстракції геномної ДНК і розщеплення геномної ДНК одним або декількома ферментами - ендонуклеазами рестрикції; необов'язково ампліфікацію виділеного сегмента ДНК; введення виділеного сегмента ДНК в клітину або тканину рослини-хазяїна кукурудзи; і аналіз ДНК рослини-хазяїна кукурудзи за допомогою зондів, які специфічно гібридизуються з маркерами, зчепленими (наприклад, зчепленими; міцно зчепленими або надзвичайно міцно зчепленими) з геном Rf4, або з самим геном Rf4, для ідентифікації гена Rf4 в рослині-хазяїні кукурудзи. У конкретних варіантах здійснення виділений сегмент ДНК можна вводити в рослинухазяїн кукурудзи, так щоб він стабільно вбудовувався в геном рослини-хазяїна кукурудзи. У деяких варіантах здійснення маркери, які зчеплені (наприклад, зчеплені; міцно зчеплені або надзвичайно міцно зчеплені) або з геном Rf4-bHLH кукурудзи або розташовані в ньому, або саму послідовність гена Rf4-bHLH кукурудзи можна використовувати для введення гена Rf4 кукурудзи в інші організми, наприклад, рослини. У конкретних варіантах здійснення маркери вибирають з групи маркерів, що включає SEQ ID NO: 1-197 і поліморфізми ID №№ 1-106 (таблиця 3), або з маркерів, еквівалентних маркерам, обраним з групи маркерів, що містить SEQ ID NO: 1-197 і поліморфізми ID №№ 1-106 (таблиця 3). У деяких варіантах здійснення спосіб введення гена Rf4 кукурудзи в організм, відмінний від кукурудзи, може включати аналіз геномної ДНК рослини (наприклад, рослини кукурудзи) за допомогою зондів, які специфічно гібридизуються з маркерами, зчепленими (наприклад, зчепленими; міцно зчепленими або надзвичайно міцно зчепленими) з геном Rf4 або з самим геном Rf4, для ідентифікації гена Rf4 в рослині; виділення сегмента геномної ДНК рослини, що містить ген Rf4, наприклад, шляхом екстракції геномної ДНК і розщеплення геномної ДНК одним або декількома ферментами ендонуклеазами рестрикції; необов'язково ампліфікацію виділеного сегмента ДНК; введення виділеного сегмента ДНК в організм, відмінний від кукурудзи; і аналіз ДНК організму, відмінного від кукурудзи, за допомогою зондів, які специфічно гібридизуються з маркерами, зчепленими (наприклад, зчеплені; міцно зчеплені або надзвичайно міцно зчеплені) з геном Rf4, або з самим геном Rf4 для ідентифікації гена Rf4 в організмі. У конкретних варіантах здійснення виділений сегмент ДНК можна вводити в організм, так щоб він стабільно вбудовувався в геном організму. У деяких варіантах здійснення маркери, які зчеплені (наприклад, зчеплені; міцно зчеплені або надзвичайно міцно зчеплені) або які розташовані в гені Rf4, або саму послідовність гена Rf4 можна використовувати для ідентифікації рослини з функціональним геном-відновником чоловічої стерильності CMS-C. У конкретних варіантах здійснення рослина являє собою рослину кукурудзи. У деяких варіантах здійснення молекули нуклеїнових кислот (наприклад, геномну ДНК або мРНК) можна екстрагувати з рослини. Потім екстраговані молекули нуклеїнових кислот можна контактувати з одним або декількома зондами, які специфічно гібридизуються з маркерами, зчепленими (наприклад, зчепленими; міцно зчепленими або надзвичайно міцно зчепленими) з геном Rf4, або з самим геном Rf4. Специфічна гібридизація одного або декількох зондів з екстрагованими молекулами нуклеїнових кислот вказує на присутність функціонального гена-відновника для чоловічої стерильності CMS-C в рослині. У деяких варіантах здійснення маркери, які зчеплені (наприклад, зчеплені; міцно зчеплені або надзвичайно міцно зчеплені) з геном Rf4 або які розташовані в ньому, або саму послідовність гена Rf4 можна використовувати для отримання гібридного насіння. Отримання 18 UA 114886 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 гібридного насіння відповідно до таких способів може приводити до економії витрат завдяки усуненню ручного або механічного видалення волотей, і, крім того, може збільшити вихід насіння. У конкретних варіантах здійснення спосіб може включати схрещування чоловічої рослини, що містить молекулярні маркери нуклеїнових кислот, які зчеплені (наприклад, зчеплені; міцно зчеплені або надзвичайно міцно зчеплені) або з геном Rf4 або розташовані в ньому, і жіночої рослини, що має фенотип чоловічої стерильності CMS С-типу. VI. Організми, що містять ген Rf4 Деякі варіанти здійснення даного винаходу також належать до організму, що включає молекулу нуклеїнової кислоти, утримуючу послідовність Rf4-bHLH (наприклад, SEQ ID NO: 220), послідовність нуклеїнової кислоти, яка специфічно гібридизується з послідовністю Rf4-bHLH, або функціональний варіант послідовності Rf4-bHLH. Придатний організм може являти собою будь-яку придатну рослину, дріжджі або бактерію. Як необмежувальний приклад, рослина, що містить згадані вище послідовності, може являти собою рослину, що являє агрономічну цінність, наприклад і не обмежуючись ними: кукурудзу; сою; люцерну; пшеницю; рапс; рис; сорго; буряк; брахіподію; однодольні рослини; дводольні рослини; різні овочі, включаючи огірок, помідор, перець і т. д.; різні дерева, що включають яблуко, грушу, персик, вишню, червоне дерево, сосну, дуб і т. д.; і різні декоративні рослини. У конкретних варіантах здійснення організм може являти собою рослину, що розмножується статевим шляхом. Рослина, яка несе насіння, містить конкретну послідовність нуклеїнової кислоти, може продукувати насіння, яке містить цю послідовність нуклеїнової кислоти. Клітини рослин, що містять послідовність Rf4-bHLH (наприклад, SEQ ID NO: 220), послідовність нуклеїнової кислоти, яка специфічно гібридизується з послідовністю Rf4-bHLH, або функціональним варіантом послідовності Rf4-bHLH, можна культивувати і підтримувати як клітини культури тканини рослин, або в культуральне середовище можна додавати певні рослинні гормони, відомі в даній галузі, тим самим забезпечуючи диференціювання клітин культури тканини рослин і формування нового сорту рослин, який може бути фертильним або стерильним. Такі способи культивування рослин, придатні в цих і інших варіантах здійснення, є стандартними і добре відомі в даній галузі. Деякі варіанти здійснення винаходу стосуються вірусу (наприклад, бактеріофагу або вірусу рослин), що містить послідовність Rf4-bHLH (наприклад, SEQ ID NO: 220), послідовність нуклеїнової кислоти, яка специфічно гібридизується з послідовністю Rf4-bHLH, або функціональний варіант послідовності Rf4-bHLH. Наступні приклади надані для ілюстрації певних конкретних ознак і/або варіантів здійснення. Приклади не треба тлумачити, як ті, що обмежують винахід до конкретних проілюстрованих ознак або варіантів здійснення. Приклади Приклад 1: Матеріали і способи Популяція для підтвердження Лінію чоловічої стерильності CMS С-типу, BE4207, і лінію-відновник чоловічої стерильності, відповідної CMS С-типу, XJH58, використовують як батьківські рослини для отримання нащадків F1. Потім нащадки F1 піддають самозапиленню для отримання популяції F2. Популяцію F2, що складається з 500 особин, використовують для ідентифікації гена Rf4 і маркерів, зчеплених (наприклад, зчеплених; міцно зчеплених або надзвичайно міцно зчеплених) з геном Rf4. Точне картування популяції F3 BE4207/XJH58 Всього 5465 насінин, відібраних з 15 гетерозиготних сімейств F 2 з популяції для підтвердження F2, сегрегуючої по різних фрагментах в області розміром 4,2 млн.п.н. у верхній частині 8 хромосоми, висівали в розсаднику літом 2010 року в Arlington, Wisconsin. Зразки листя збирали від 5104 пророслих сіянців для генотипування. Класифікація по фертильності 500 рослин в цій популяції F2 фенотипово класифікували в залежності від пилку, що скидається з волотей. Рослини, які скидали пилок, класифікували як фертильні. Рослини, які не скидали пилок, класифікували як стерильні. Відновлення Rf4 в цій популяції було повним; не спостерігали частково фертильних рослин. Екстракція і кількісне визначення ДНК 8 отриманих проколюванням діркопробивачем фрагментів тканини листя отримували від TM кожної рослини популяції F2, і ДНК екстрагували з використанням Biocel 1800 (Agilent Inc., Santa Clara, CA). Використаний спосіб екстракції ДНК був наступним: (1) додати одну гранулу з сплаву вольфраму діаметром ~0,32 см в кожну пробірку; (2) додати 300 мкл лізуючого буфера RLT (Qiagen Inc., Germantown, MD) в кожну пробірку; (3) закрити і розмелювати протягом 6 ® хвилин при 1500 ударів/хвилини в SPEX 2000 Geno/Grinder (OPS Diagnostics, LLC, Lebanon, 19 UA 114886 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 NJ); (4) центрифугувати зразки при 6000 об./хв. протягом 5 хвилин; (5) відкрити пробірки; TM наступні стадії проводять на Biocel 1800: (6) перенести 200 мкл супернатанту в 1,1-мл ® планшет для аналізу з квадратними ямками з круглим дном, утримуючий 10 мкл MagAttract Suspension G Beads (Qiagen Inc.); (7) інкубувати протягом 2 хвилин; (8) струшувати при 1200 об./хв. протягом 40 секунд; (9) інкубувати протягом 2 хвилин; (10) помістити планшет для аналізу на магнітну полицю і дозволити гранулам розділитися протягом 40 секунд; (11) TM видалити супернатант; (12) перше промивання - додати промивальний буфер 190 RPW заздалегідь змішаний з РНКазою і ізопропанолом, і струшувати при 1200 об./хв. протягом 40 секунд; (13) помістити планшет для аналізу на магнітну полицю і дозволити гранулам розділитися протягом 20 секунд; (14) видалити супернатант; (15) друге промивання - додати 190 мкл, промивального буфера, що являє собою 100 % етанол, і струшувати при 1200 об./хв. протягом 40 секунд; (16) помістити планшет для аналізу на магнітну полицю і дозволити гранулам розділятися протягом 20 секунд; (17) третє промивання - додати 190 мкл промивального буфера, що являє собою 100 % етанол; (18) струшувати при 1200 об./хв. протягом 40 секунд; (19) помістити планшет для аналізу на магнітну полицю і дозволити гранулам розділитися протягом 20 секунд; (20) видалити супернатант; (21) інкубувати планшет TM протягом 5 хвилин при кімнатній температурі; (22) додати 100 мкл буфера для елюювання AE (Qiagen Inc.); (23) струшувати протягом 2 хвилин; (24) вмістити планшет для аналізу на магнітну полицю і дозволити гранулам розділитися протягом 30 секунд; і (25) перенести супернатант в чистий позначений планшет і закрити. ДНК зберігали при 4ºС. ДНК кількісно визначали з ® використанням PicoGreen (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA), і концентрацію доводили до 5-6 нг/мкл TM для застосування в системі генотипування KASPar (KBioscience Inc., Hoddesdon, Великобританія). TM Система генотипування SNP KASPar TM Система конкурентного алелеспецифічного генотипування з використанням ПЛР (KASPar ) являє собою систему для виявлення SNP, в якій використовується технологія, заснована на алелеспецифічному подовженні олігонуклеотидів і резонансному перенесенні енергії TM флуоресценції (FRET) для генерування сигналу. Для кожного SNP-маркера в аналізі KASPar потрібно тільки два компоненти: суміш для аналізу (суміш трьох немічених праймерів: двох алелеспецифічних олігонуклеотидів і одного загального зворотного локусспецифічного олігонуклеотиду); і реакційна суміш (інші компоненти, необхідні для ПЛР, включаючи універсальну флуоресцентну репортерну систему і Taq-полімеразу). Для моделювання праймерів використовують систему KBioscience Laboratory Information TM Management System (KLIMS ) (KBioscience Inc.), і олігонуклеотиди синтезують за допомогою TM технології Integrated DNA Technology (Coralville, IA). Реакції KASPar проводять відповідно до рекомендації виробника. ПЛР починають з денатурації при 94ºС протягом 15 хвилин, потім проводять 20 циклів по 10 секунд денатурації при 94ºС, 5 секунд відпалу при 57ºС, а потім 10 секунд подовження при 72ºС, а за цими 20 циклами слідують 22 цикли з денатурацією протягом 10 секунд при 94ºС, відпалом протягом 20 секунд при 57ºС, а потім подовженням протягом 40 TM секунд при 72ºС. Флуоресцентні сигнали після завершення реакцій KASPar зчитують в TM спектрофотометрі (Tecan GENios , Mannedorf, Швейцарія) з довжиною хвилі збудження при 485 нм, і довжиною хвилі випущення при 535 нм для флуорофора FAM; і довжиною хвилі збудження 525 нм, і довжиною хвилі випущення 560 нм для флуорофора VIC. Дані аналізують з TM використанням програмного забезпечення Klustercaller (KBiosciences Inc.) для визначення генотипів кожного SNP-маркера в популяції. Екстракція РНК і ПЛР в реальному часі (RT-ПЛР) Батьківські рослини і рослини F3, сегрегуючі по області Rf4, вирощують в теплиці. Тканини листя збирають з рослин, що вирощують протягом 5 тижнів, 7 тижнів і 9 тижнів. Також збирають тканини волотей з пиляками/пилком, що розвиваються і пилок, що скидається (в фертильних TM рослинах). Тотальну РНК екстрагують з використанням набору RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen TM Inc.). кДНК синтезують з використанням набору QuantiTec Reverse Transcription Kit (Qiagen Inc.). Для RT-ПЛР, специфічні до гена Rf4 праймери, контрольні праймери для інвертази кукурудзи, і зонди з подвійним міченням барвниками FAM або VIC і Minor Groove Binding Non TM Fluorescence Quencher I (MGBNFQ) синтезують в Applied Biosystems (Foster City, CA). Для TM проведення 10-мкл реакцій ПЛР використовують основну суміш для генотипування TaqMan TM (Applied Biosystems), і ПЛР проводять на LightCycler 480 (Roche). Програма ПЛР включає: активацію протягом 10 хвилин при 95ºС, потім 50 циклів при 95ºС протягом 10 секунд і 58ºС протягом 38 секунд. Флуоресцентні сигнали реєструють в кінці кожного циклу. Відносний рівень експресії обчислюють з використанням способу Delta CT з використанням інвертази як контролю. 20 UA 114886 C2 5 Приклад 2: Картування гена Rf4 Аналіз сегрегації фертильності Співвідношення сегрегації фертильності в популяції F 2 становило 3:1. Таблиця 1. Результати показали, що відновлення фертильності в системі CMS-C/Rf4 контролюється одним домінантним геном-відновником, Rf4. Таблиця 1 Дані про фенотип популяції для підтвердження Фертильні 373 10 15 20 25 30 35 40 45 Стерильні 126 Без волотей 1 Усього 500 Попереднє генетичне картування Rf4 в популяції F2 з використанням SNP-маркерів. 101 SNP-маркер, розташований поблизу верхньої частини 8 хромосоми кукурудзи, використали в скринінгу батьківських організмів з 5 різними популяціями для картування Rf4, і було визначено, що він знаходиться в межах області Rf4 розміром 5,0 млн.п.н. Набір з 12 маркерів був поліморфним у всіх п'яти популяціях, в той час як 27, в тому числі 12 загальних поліморфних маркерів, продемонстрували поліморфізм між батьківськими організмами популяції F2 BE4207×XJH58. 12 загальних маркерів спочатку використали для генотипування всіх 500 індивідуумів в популяції F2 для ідентифікації рекомбінантних ліній в межах області 5,0 млн.п.н. Потім інші 15 поліморфних маркерів використали для генотипування всіх 104 рекомбінантних ліній. Тридцять чотири випадковим чином відібраних рекомбінанти подані на Фіг. 2 з їх фенотипічними даними і відповідними генотипічними даними для 27 маркерів як прикладів. Більш детальний аналіз 42 найбільш інформативних рекомбінантних ліній показав, що ген Rf4 розташований в області приблизно 1,505 млн.п.н. у верхній частині 8 хромосоми, що визначається SNP-маркером DAS-PZ-40624 (SEQ ID NO: 8). У цій області знаходиться приблизно 30 генів (дані не представлені). Цікаво і несподівано, що, в зв'язку з тим фактом, що всі раніше ідентифіковані генивідновники, за винятком Rf2-кукурудзи і Rf17-рису, кодують білки з пентатрикопептидними повторами (PPR), відсутній передбачений ген PPR в межах області розміром 1,505 млн.п.н., що містить Rf4, хоч існують три гени PPR, розташованих на відстані 1,509, 4,288 і 4,748 млн.п.н., відповідно, Фіг. 3. Генетичне точне картування Rf4 з інформативними рекомбінантами і додатковими SNPмаркерами Для подальшого точного картування розташування на хромосомі гена-відновника Rf4, 96 SNP-маркерів, розташованих в положенні нуклеотидів від 12507 до 1504526 на 8 хромосомі, були відібрані для дослідження батьківських поліморфізмів. 28 SNP-маркерів були поліморфними серед двох картованих батьківських рослин. 93 рекомбінанти, включаючи деякі потенційно інформативні рекомбінанти, не включені в попередній раунд скринінгу, були відібрані для генотипування з 28 маркерами. З використанням того ж порівняння фенотип/генотип, яке описано вище, ген Rf4 був позитивно картований до області 0,56 млн.п.н. з використанням 19 найбільш інформативних рекомбінантів, що визначаються рослинами S-301 і S-115 і SNP-маркером PZE-108000459 (SEQ ID NO: 134) як права межа, як показано на Фіг. 4. Виходячи з генотипових і фенотипових даних рослини S-378 (стерильне), ген Rf4 може бути розташований в області менше за 100 т.п.н., що визначається SNP-маркером PZE-108000086 (SEQ ID NO: 105). Див. Фіг. 4. Таким чином, Rf4 був картований до області 0,56 млн.п.н., яка містить приблизно 14 генів, і далі був картований до області менше за 100 т.п.н., яка містить шість потенційних генів. Див. таблицю 2. Послідовність гена Rf4 вибрана з групи, що складається з GRMZM2G122853 (SEQ ID NO: 198); AC187051.4_FG005 (SEQ ID NO: 199); GRMZM2G122851 (SEQ ID NO: 200); GRMZM2G122850 (SEQ ID NO: 201); GRMZM2G582028 (SEQ ID NO: 202); GRMZM2G021276 (SEQ ID NO: 203); GRMZM2G381376 (SEQ ID NO: 204); GRMZM2G081127 (SEQ ID NO: 205); GRMZM2G085111 (SEQ ID NO: 206); GRMZM2G085038 (SEQ ID NO: 207); GRMZM2G317468 (SEQ ID NO: 208); GRMZM2G328030 (SEQ ID NO: 209); GRMZM2G029450 (SEQ ID NO: 210); і GRMZM2G077212 (SEQ ID NO: 211). 50 21 UA 114886 C2 Таблиця 2 Передбачені гени в області Rf4 Хромосома 8 8 8 8 8 8 8 8 15 20 25 30 35 Назва гена G RMZM2G122853 AC187051.4 FG005 GRMZM2G122851 GRMZM2G122850 GRMZM2G582028 GRMZM2G021276 PZE-108000086 GRMZM2G381376 167824 174330 GRMZM2G081127 8 8 8 8 8 8 8 10 Стоп 19257 50854 53988 69586 93850 98367 98518 166692 8 5 Старт 17505 45481 51763 67385 93160 95823 98418 166253 267226 307170 384128 499230 505089 546182 564822 273756 319669 387634 502184 505924 548235 564922 GRMZM2G085111 GRMZM2G085038 GRMZM2G317468 GRMZM2G328030 GRMZM2G029450 GRMZM2G077212 PZE-108000459 Опис Пероксидаза Гіпотетичний білок Транспозаза MULE (TE) 129 А.К. Білок транспозону Немає істотної відповідності, 68 А.К. HLHTF S-аденозилметіонінсинтетаза SPL1 TF (подібний, що зв'язується з промотором Squamosa) Подібний АВС-транспортеру Білок, взаємодіючий з Pto-кіназою 1 Транспозон, подібний En/Spm (TE) Ліпаза, клас 3 (псевдоген?) GST (псевдоген?) Ізопеніцилін-N-епімераза Ці результати узгоджуються з результатами, викладеними в постері під назвою "Restoration of c-type cytoplasmic male sterility in maize: Fine-mapping of Rf4", недавно представленому Kohls et al. на 2010 Maize Genetics Conference. Kohls et al., згідно з твердженням, картували ген Rf4 до області 0,5 млн.п.н. поблизу верхньої частини 8 хромосоми з використанням обмеженої кількості маркерів. Однак генетичні матеріали, використані Kohls et al., істотно відрізнялися від генетичних матеріалів, використаних в даний роботі, що описується. Важливо, що, Kohls et al. виявили значний процент тільки напівфертильних особин Rf4, в той час як відновлення фертильності в даній популяції F2 було повним (не було виявлено напівфертильних особин). Крім того, Rf4 використали кращий дозвіл карти (