Спосіб відтворення гетерозиготного генотипу вищих рослин на основі цитоплазматичної чоловічої стерильності (варіант 1)

Реферат: Спосіб відтворення гетерозиготного генотипу вищих рослин на основі цитоплазматичної чоловічої стерильності включає отримання із вихідного гетерозиготного генотипу альтернативно-комплементарних гомозиготних ліній, які відновлюють його при схрещуванні, розмноження і схрещування цих ліній. Як вихідний гетерозиготний генотип беруть рослину на основі цитоплазматичної чоловічої стерильності, гетерозиготну і за генами закріплення/відновлення фертильності, а пари ліній підбирають таким чином, щоб одна з ліній в RfRf парі була чоловічо-фертильною (відновлювач фертильності - S ), а інша -чоловічоrfrf rfrf стерильною (S ), для розмноження якої створюють закріплювач стерильності (N ), поєднуючи її ядерний геном (rfrf) з мітохондріомом дикого типу (N) шляхом злиття протопластів чоловічостерильної форми з протопластами-донорами мітохондріому з інактивованим у них ядром. UA 79624 U (12) UA 79624 U UA 79624 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Спосіб належить до сільського господарства і може бути використаний в селекційнонасінницькій роботі з сільськогосподарськими, лісовими та декоративними рослинами. Аналогом способу відтворення гетерозиготного генотипу є спосіб класичної селекції гібридів (гетерозиготних генотипів) та їх подальшого відтворення, який полягає в тому, що гібриди створюють шляхом емпіричного підбору батьківських ліній, з випробуванням гібридних комбінацій за бажаними ознаками. Кращі гібридні комбінації (гібриди) відбирають для промислового відтворення. Для промислового відтворення гібриду (гетерозиготного генотипу) лінії розмножують в необхідній кількості, висівають на ділянках гібридизації в співвідношенні, що визначається пилкоутворюючою здатністю батьківської лінії. Проводять ряд процедур необхідних для забезпечення повноцінного схрещування, наприклад, видалення волотей на материнській лінії гібриду кукурудзи (Югенхеймер Р.У. Кукуруза: улучшение сортов, производство семян, использование. - М.: Колос, 1979. - 520 с.). Підбір батьківських ліній, схрещування та оцінка гетерозиготних форм, розмноження батьківських ліній та їх схрещування - спільні суттєві ознаки аналога і корисної моделі. Однак, на відміну від корисної моделі, ці суттєві ознаки не забезпечують відтворення будь-якої гетерозиготної форми, так як відповідно до аналогу, передбачається відтворення гетерозиготної форми, створеної лише у результаті схрещування гомозиготних ліній. Відомий спосіб відтворення гетерозиготного генотипу, обраний нами як прототип, в якому передбачається відбір бажаного гетерозиготного генотипу, пригнічення кросинговеру в мейозі відібраної рослини, застосування культури мікроспор для отримання дигаплоїдних ліній, підбір серед ліній альтернативно-комплементарних пар шляхом застосування ДНК маркерів, переведення ліній на основу цитоплазматичної чоловічої стерильності (ЦЧС) шляхом беккросування, розмноження підібраних ліній та їх широкомасштабне схрещування (Пат. 91861, МПК А01Н1/04 (2006.01). опубл. 10.09.2010, Бюл. № 17). Відбір бажаного гетерозиготного генотипу, отримання із вихідного гетерозиготного генотипу альтернативно-комплементарних гомозиготних ліній, які будуть відновлювати вихідний гетерозиготний генотип при схрещуванні, розмноження і схрещування цих ліній - спільні суттєві ознаки прототипу та корисної моделі. Однак, на відміну від пропонованого рішення, ці суттєві ознаки не дозволяють зменшити затрати часу на широкомасштабне відтворення гетерозиготного генотипу, так як відповідно до прототипу, передбачається створення пар альтернативно-комплементарних ліній та їх переведення на ЦЧС основу шляхом беккросування (привнесення мітохондріому та рецесивних алелів генів закріплення-відновлення в одну альтернативно-комплементарну лінію, а домінантних алелів Rf-в іншу), що вимагає додатково 7-10 поколінь схрещувань. В основу корисної моделі поставлено задачу створення ефективного способу відтворення гетерозиготного генотипу на ЦЧС основі, шляхом відбору гетерозиготної за генами відновлення фертильності бажаної рослини, із якої отримують пари альтернативно-комплементарних ліній, при цьому одна з ліній в парі буде чоловічо-фертильною - відновлювач фертильності (SW), а rfrf інша - чоловічо-стерильною (S ). Поставлена задача вирішується тим, що для розмноження чоловічо-стерильної rfrf альтернативно-комплементарної лінії створюють закріплювач стерильності (N ), поєднуючи її ядерний геном (rfrf) з мітохондріомом дикого типу (N) шляхом злиття протопластів чоловічостерильної форми з протопластами-донорами мітохондріому з інактивованим у них ядром. Запропонований спосіб характеризується такими суттєвими ознаками: відбір бажаного генотипу гетерозиготного за генами закріплення/відновлення фертильності, отримання із вихідного гетерозиготного генотипу альтернативно-комплементарних гомозиготних ліній, таким RfRf чином, щоб одна з ліній в парі була чоловічо-фертильною - відновлювач фертильності (S ), a rfrf інша - чоловічо-стерильною (S ), які будуть відновлювати його при схрещуванні, створення rfrf закріплювача стерильності (N ) для розмноження чоловічо-стерильної альтернативнокомплементарної лінії, поєднуючи її ядерний геном (rfrf) з мітохондріомом дикого типу (N) шляхом злиття протопластів чоловічо-стерильної форми з протопластами-донорами мітохондріому з інактивованим у них ядром, розмноження та схрещування цих ліній. Нові, відмінні від прототипу ознаки забезпечують зменшення затрат часу на відтворення гетерозиготного генотипу на ЦЧС основі, оскільки запропонований спосіб виключає етап отримання стерильних аналогів альтернативно-комплементарних ліній та аналогів відновлювачів фертильності. Сучасні дані по успадкуванню та використанню ЦЧС коротко можна підсумувати таким чином: ЦЧС обумовлена взаємодією особливого (стерильного) типу цитоплазми та рецесивних алелів ядерних генів (rf). Стерильна цитоплазма позначається символом "S", фертильна або ж нормальна - "N". Домінантні алелі ядерних генів Rf відновлюють фертильність пилку при 1 UA 79624 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 взаємодії їх із стерильною цитоплазмою. Детермінантом чоловічої стерильності виступає плазма, що стерилізує. її реалізація відбувається при наявності в генотипі рецесивних алелів генів відновлення фертильності, тобто наведений ідіотип формує стерильний фенотип. Явище ядерного контролю стерильності дозволяє сформувати підтримуючий ідіотип, який містить нормальну (фертильну) плазму та рецесивні алелі генів відновлення фертильності. Запилення rfrf rfrf рослин з ідіотипом S підтримуючою формою (закріплювачем стерильності – N ) призводить до формування насіння із стерильною плазмою та рецесивними алелями генів відновлення фертильності (Перетятько Н. А., Перетятько В. Г., 1978). Компонент відновлення фертильності в даній генетичній системі контрольованого розмноження включає домінантні алелі генів закріплення/відновлення із стерильною або фертильною плазмами. Стерильні рослини схрещуються з рослинами, які містять компонент відновлення (домінантні алелі генів відновлення фертильності). Від такого схрещування в наступній генерації отримують ідіотип, який містить стерильну плазму та має гетерозиготність за генами відновлення фертильності. Наявність домінантних алелів забезпечує фертильність рослин з таким ідіотипом. Відомо, що злиття протопластів - соматична або парасексуальна гібридизація - це штучний метод гібридизації, який використовується для багатьох видів рослин і не передбачає статевого схрещування, так як в як батьківські компоненти виступають не гамети (статеві клітини), а соматичні клітини рослин. Соматична гібридизація дає можливість не тільки долати обмеження статевого процесу, а й конструювати нові рослини (Глеба Ю.Ю., Сытник К.М., 1982) Для отримання протопластів (клітин, позбавлених клітинної оболонки) використовують обробку культивованих in vitro клітин і тканин ферментними розчинами, які готують на осмотичних стабілізаторах (Мельничук М.Д. та ін.,2003). Злиття протопластів може бути спонтанним (частіше всього відбувається в молодих клітинах чи суспензійних культурах) або індукованим (фізичним або хімічним). В основу фізичного методу злиття покладено поперемінну дію постійного та змінного струму на плазмалему. В основу хімічного - додавання до суспензії протопластів речовин, стимулюючих злиття. Відомо, що при використанні соматичної гібридизації для рослин А і С, в рівному ступені можна отримати рослини А+А, С+С та А+С. Якщо, в нашому випадку, рослина А- це чоловічоrfrf фертильна (N) лінія, а рослина С -чоловічо-стерильна (S ) лінія, то зрозуміло, що бажаним продуктом злиття для нас буде комбінація А+С. Досягти збільшення частоти злиття саме такого типу і послідуючого вибіркового виділення тільки продуктів злиття А+С можливо, використовуючи такі відомі методи як: тимчасове надання поверхні протопластів однієї форми позитивного заряду (звичайно, поверхня протопласта несе від'ємний заряд) шляхом обробки її фосфоліпідом. Таким чином, при змішуванні, наприклад, протопластів А, що мають позитивний заряд, з необробленими протопластами С, що несуть негативний заряд, за рахунок притягання різнойменних зарядів в більшості випадків будуть отримуватись комбінації А+С; маркування протопластів тої чи іншої рослини за допомогою різних флуоресцентних барвників. Таким чином, обробивши протопласти А одним барвником, а протопласти С - іншим, можливо, не змінюючи активності клітин, відібрати комбінацію А+С, яка буде мати обидва кольори флуоресценції (С.С. Giri, P.S. Abuja, 1995). Відомо, що в процесі культивування життєздатні протопласти швидко відновлюють клітинну стінку і перетворюються на звичайні культивовані in vitro клітини. Однією із важливих і складних проблем сучасної біотехнології є регенерація цілих рослин із ізольованих клітин, яким властива тотипотентність (реалізація нормального морфогенезу). Регенерація рослин може здійснюватись: або шляхом органогенезу; або внаслідок соматичного ембріогенезу. Всі наведені вище відомості свідчать про можливість здійснення корисної моделі. Корисну модель здійснюють таким чином: створюють популяцію рослин Brassica napus L. шляхом гібридизації. За материнську форму обирають гібрид Гідромель F 1, за батьківську - сорт ВНІС 100. Починаючи з F1 рослини висівають на провокаційному фоні. Відібрані рослини F 1 вирощують методом пересівання 3 роки, потім відбирають елітні рослини методом індивідуального добору. Добори проводять за такими ознаками: стерильна цитоплазма (S); гетерозиготність за геном закріплення/відновлення фертильності Rf; безеруковість; низький вміст глікозинолатів; 2 UA 79624 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 висока урожайність; стійкість проти сірої гнилі. Наявність стерильної цитоплазми і гетерозиготність за генами закріплення/відновлення фертильності Rf визначають молекулярно-генетичним аналізом. Для визначення вмісту ерукової кислоти застосовують паперову хроматографію. Для оцінки вмісту глікозинолатів застосовують електроколориметричний метод. Оцінку стійкості проти сірої гнилі проводять візуально. З отриманої популяції відбирають кращу, бажану за перерахованими вище ознаками рослину, гетерозиготний генотип якої необхідно відтворити, і вводять її в культуру in vitro. Точки росту (апікальні та пазушні меристеми) висаджують на середовище МС (Murashige Т., Skoog F., 1962), що містить бензиламінопурин (БАЛ) в концентрації 1 мг/л для регенерації пагонів. Як експланти використовують точки росту довжиною 3-5 мм. Мікроклонально розмножені таким чином рослини-регенеранти пересаджують для укорінення на середовище МС, що містить індолілоцтову кислоту (ЮК) в концентрації 1 мг/л. Рослини-регенеранти, що мають добре сформоване стебло і кореневу систему висаджують в ґрунт. Перед висадкою проводять адаптацію рослин, отриманих в культуру in vitro, до нестерильних умов (Юркова Г.Н. и др., 1999). Укорінені і адаптовані рослини висаджують в теплицю. В період цвітіння відібраних та розмножених рослин суцвіття занурюють у розчин 0,04 % НСl для індукції асинапсису. Проводять цитологічне дослідження в пиляках і маркують ті квітки, де спостерігається асинапсис. Потім, суцвіття з такими квітками збирають на стадії, коли ті досягають довжини 3-4мм та визначають на якій ембріональній стадії знаходяться мікроспори (Shelley Eftoda, 2002). Пошкоджені бутони видаляються, а бажані - переносять в металеве сито для виділення мікроспор. Подальші дії проводять у стерильних умовах. Ламінар-бокс стерилізують 70 % спиртом. Сито з бутонами переносять до стерильного лабораторного стакана, доливають розчин для стерилізації і стерилізують протягом 15 хвилин на шейкері. Після цього сито з бутонами тричі промивають в бідистильованій стерильній воді, по 5 хвилин кожне відмивання. Бутони переносять в стакан використовуючи стерильну техніку роботи в боксі та додають розчин В5 (Gamborg et al. 1968). Дигаплоїдні рослини отримують згідно з методикою, що описана (Guichang Zhang, Connie M. Williams, Mary К. Campenot, Locksley E. McGann and David D. Cass, 1992). Із отриманих дигаплоїдних рослин та вихідної гетерозиготної рослини екстрагують ДНК. Проводять полімеразну ланцюгову реакцію із олігонуклеотидними праймерами до SSR локусів і розподіляють продукти ампліфікації методом гель-електрофорезу. На основі отриманих даних визначають за якими SSR локусами вихідна рослина була гетерозиготною і відбирають пари ліній, які містять різні алелі даного локусу. При цьому SSR локуси повинні бути локалізовані у всіх 19 хромосомах ріпаку не менше, ніж по 2 локуси на кожному плечі хромосоми. На основі отриманих даних визначають групи зчеплення алелів SSR локусів і відбирають дигаплоїдні рослини, хромосоми яких були сформовані без кросинговеру у мейозі вихідної рослини. Підбирають пари ліній так, щоб одна з ліній в парі була чоловічо-фертильною (відновлювач RfRf rfrf фертильності S ), а інша - чоловічо-стерильною (S ) та щоб кожна з ліній в парі несла одну із гомологічних хромосом вихідного гетерозиготного організму. rfrf Для розмноження чоловічо-стерильної альтернативно-комплементарної лінії (S ) rfrf створюють закріплювач стерильності (N ). Насіння сорту ВШС100 (донор мітохондріому дикого типу (N), фертильний) миють в теплій мильній воді, потім відмивають в проточній воді, споліскують дистильованою водою. Далі матеріал переносять в ламінарбокс, де проводять стерилізацію. Насіння переносять в стерильний стакан, заливають 70 % етиловим спиртом, витримують 30 секунд. Зливають спирт і заливають стерилізуючий розчин. В стерильному розчині насіння витримують 20 хвилин, після чого розчин зливають. Простерилізоване насіння промивають тричі по 10 хв у стерильній дистильованій воді. Стерильним пінцетом насіння переносять на безгормональне поживне середовище МС у пробірки для пророщування. Пробірки з насінням культивують у термостаті без освітлення з температурою 25±1 °C. Як експланти для виділення протопластів з чоловічо-стерильної альтернативноrfrf комплементарної лінії (S ) використовують повністю розвернуті листки та черешки, а з сорту ВНІС 100 - гіпокотилі. Всі операції проводять в ламінар-боксі, дотримуючись стерильної техніки роботи. Листки, для кращого проникнення фермента, густо надрізають скальпелем з гострим лезом і поміщають нижньою стороною у пластикові чашки Петрі з ферментним розчином (суміш із 1 % целюлази "Onozuka R-10" і 0,25 % пектинази). Черешки або гіпокотилі дрібно ріжуть на сегменти довжиною по 1-2мм і також поміщають у ферментний розчин. Ферментація триває 18 год. при температурі 25 °C без освітлення. 3 UA 79624 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Суспензію протопластів переносять стерильною піпеткою в стаканчик з нейлоновим фільтром (розмір пор 50 мкм). Піпетки прожарюють в сушильній шафі, а перед роботою проколюють в полум'ї спиртівки. Виймають пінцетом фільтр і піпеткою переносять фільтрат в центрифужну пробірку. Зверху доливають на 2/3 пробірки 0,5 М манітол. Далі пробірку центрифугують протягом 4-5 хв при 300 об/хв. Пастерівською піпеткою відбирають супернатант. В пробірку з осадом доливають 0,8 М сахарозу (майже на 2/3), зверху по стінці доливають розчин W5 (приблизно 2 мл). Центрифугують 12 хв. при 800 об/хв. Піпеткою відбирають протопласти в чисту стерильну пробірку і доливають на 2/3 пробірки W5. Центрифугують 3 хв при 500 об/хв. Відбирають надосад. Після фільтрування і центрифугування протопласти сорту ВНІС 100 опромінюють -променями (200Гр). rfrf Протопласти сорту ВНІС 100 та протопласти чоловічо-стерильної лінії (S ) змішують в одній 56 пробірці у співвідношенні 1:1 і концентрацію їх доводять до 10 10 протопластів в Імл. 450 мкл (4 краплі) суміші протопластів переносять в чашки Петрі (діаметр 35мм) і залишають на 20 хвилин для того, щоб дати протопластам осісти на дно чашки. Після цього 50 мкл 20 % ПЕГ (молекулярна маса 2000), який використовують як фюзоген (індуктор злиття), обережно додають до кожної відстояної краплі і залишають на 10 хвилин. ПЕГ обережно видаляють за допомогою розчину для відмивання (М. Vasylenko et. al., 2006; Beranek M, Bechyne M, Klima M.; Menczel L., Nagy F., Kiss Z. R., and Maliga P., 1981). Останнє п'яте відмивання роблять поживним середовищем В (Beranek М., Bechyne М., Klima М, 2007). Злиті протопласти переносять на 3 дні в термостат з температурою 26,5±1 °C, відносній вологості 70-75 %, без освітлення. Далі культивування проводять за методикою, що описана (Pelletier et al., 1993). Через 14 діб додають середовище С і спостерігають утворення клітинних колоній. Добре розвинені мікрокалюси переносять на агаризоване поживне середовище Е. Через 14 діб культивування калуси переносять на агаризоване середовище F (Beranek M., Bechyne M., Klima M., 2007). Рослини-регенеранти, що утворюються переносять на середовище МС, що містить БАЛ в концентрації 1мг/л для проліферації пагонів. Мікроклонально розмножені таким чином рослини-регенеранти пересаджують для укорінення на середовище МС, що містить ЮК в концентрації 1мг/л. Рослини-регенеранти, що мають добре сформоване стебло і кореневу систему, висаджують в ґрунт. Перед висадкою проводять адаптацію рослин, отриманих в культуру in vitro, до нестерильних умов. Укорінені і адаптовані рослини висаджують в теплицю. rfrf Із отриманих соматичних гібридів (закріплювачів стерильності - N ) і вихідної rfrf альтернативно-комплементарної чоловічо-стерильної лінії (S ) екстрагують ДНК і проводять генетично-молекулярний аналіз відповідно методикам, що описані (А.Е. Солоденько, А.В. Саналатий, Ю.М. Сиволап Идентификация генотипов подсолнечника с помощью микросателитных маркеров // Цитология и генетика № 2.-2004). RfRf rfrf Відновлювач фертильності (S ) самозапилюють. Чоловічо-стерильні лінії (S ) rfrf розмножують за допомогою створених закріплювачів стерильності (N ). В наступному поколінні схрещують альтернативно-комплементарні лінії у межах підібраних пар. Далі проводять вивчення гібридів та ліній і відбирають ті, які найбільш придатні для відтворення вихідного гетерозиготного генотипу в польових умовах. Відібрані лінії розмножують у польових умовах до необхідних об'ємів і схрещують на ділянках гібридизації. Отримують гібридне насіння, генотип Rfrf зародків якого відповідає генотипу вихідної гетерозиготної форми (S ). Заявлена корисна модель дозволяє ефективно відтворити будь-який гетерозиготний генотип створений на основі цитоплазматичної чоловічої стерильності. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 50 55 Спосіб відтворення гетерозиготного генотипу вищих рослин на основі цитоплазматичної чоловічої стерильності, що включає отримання із вихідного гетерозиготного генотипу альтернативно-комплементарних гомозиготних ліній, які відновлюють його при схрещуванні, розмноження і схрещування цих ліній, який відрізняється тим, що як вихідний гетерозиготний генотип беруть рослину на основі цитоплазматичної чоловічої стерильності, гетерозиготну і за генами закріплення/відновлення фертильності, а пари ліній підбирають таким чином, щоб одна RfRf з ліній в парі була чоловічо-фертильною (відновлювач фертильності – S ), а інша - чоловічоrfrf rfrf стерильною (S ), для розмноження якої створюють закріплювач стерильності (N ), поєднуючи її ядерний геном (rfrf) з мітохондріомом дикого типу (N) шляхом злиття протопластів чоловічостерильної форми з протопластами-донорами мітохондріому з інактивованим у них ядром. 4 UA 79624 U Комп’ютерна верстка В. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5