Туберкульозний білок rv2386c, композиція, що його містить, та застосування

Номер патенту: 107329

Опубліковано: 25.12.2014

Автори: Браун Джеймс, Меттенс Паскаль, Мюрфі Денніс

Є ще 148 сторінок.

Дивитися все сторінки або завантажити PDF файл.

Формула / Реферат

1. Застосування ізольованого поліпептиду, який включає;

(і) білок Rv2386c послідовності SEQ ID NО:1 або 3-7;

(іі) варіант послідовності білка Rv2386c, що є принаймні на 90 % ідентичною до SEQ ID NO:1; або

(ііі) імуногенний фрагмент, що включає принаймні 10 амінокислотних залишків з послідовності білка Rv2386c SEQ ID NO:1,

у виробництві лікарського засобу для лікування або запобігання туберкульозу.

2. Застосування за пунктом 1, де ізольований поліпептид включає білок Rv2386c послідовності SEQ ID NО:1 або 3-7.

3. Застосування за пунктом 2, де ізольований поліпептид включає білок Rv2386c послідовності SEQ ID NО:1.

4. Застосування за пунктом 1, де ізольований поліпептид включає варіант послідовності білка Rv2386c, що є принаймні на 90 % ідентичною до SEQ ID NО:1.

5. Застосування за пунктом 1, де ізольований поліпептид включає імуногенний фрагмент, що включає принаймні 10 амінокислотних залишків з послідовності білка Rv2386c SEQ ID NO:1.

6. Застосування за будь-яким з пунктів 1-5 у виробництві лікарського засобу для лікування туберкульозу.

7. Застосування за будь-яким з пунктів 1-5 у виробництві лікарського засобу для запобігання туберкульозу.

8. Застосування за будь-яким з пунктів 1-5 у виробництві лікарського засобу для лікування латентного туберкульозу.

9. Застосування за будь-яким з пунктів 1-5 у виробництві лікарського засобу для запобігання латентному туберкульозу.

10. Застосування за будь-яким з пунктів 1-5 у виробництві лікарського засобу для запобігання реактивації туберкульозу.

11. Застосування за будь-яким з пунктів 1-5 у виробництві лікарського засобу для затримування реактивації туберкульозу.

12. Застосування за будь-яким з пунктів 1-11, де лікарський засіб являє собою фармацевтичну композицію, що додатково включає фармацевтично прийнятний носій або наповнювач.

13. Застосування за будь-яким з пунктів 1-11, де лікарський засіб забезпечується у формі імуногенної композиції, що додатково включає енхансер неспецифічної імунної відповіді.

14. Застосування ізольованого полінуклеотиду, що включає послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептид, який включає:

(і) білок Rv2386c послідовності SEQ ID NО:1 або 3-7;

(іі варіант послідовності білка Rv2386c, що є принаймні на 90 % ідентичною до SEQ ID NO:1; або

(ііі) імуногенний фрагмент, що включає принаймні 10 амінокислотних залишків з послідовності білка Rv2386c SEQ ID NO:1,

у виробництві лікарського засобу для лікування туберкульозу.

15. Застосування за п. 14 у виробництві лікарського засобу для лікування латентного туберкульозу.

16. Застосування за п. 14 у виробництві лікарського засобу для запобігання реактивації туберкульозу.

17. Застосування за п. 14 у виробництві лікарського засобу для затримування реактивації туберкульозу.

18. Застосування за будь-яким з пунктів 14-17, де лікарський засіб забезпечується у формі фармацевтичної композиції, що додатково включає фармацевтично прийнятний носій або наповнювач.

19. Застосування за будь-яким з пунктів 14-17, де лікарський засіб забезпечується у формі імуногенної композиції, що додатково включає енхансер неспецифічної імунної відповіді.

20. Спосіб лікування або запобігання туберкульозу, що включає введення суб'єкту, який цього потребує, безпечної та ефективної кількості поліпептиду, який включає:

(і) білок Rv2386c послідовності SEQ ID NО:1 або 3-7;

(iі) варіант послідовності білка Rv2386c, що є принаймні на 90 % ідентичною до SEQ ID NO:1; або

(ііі) імуногенний фрагмент, що включає принаймні 10 амінокислотних залишків з послідовності білка Rv2386c SEQ ID NO:1, де вказаний поліпептид індукує імунну відповідь.

21. Спосіб за п. 20, де суб'єкт має активний туберкульоз.

22. Спосіб за п. 20, де суб'єкт має латентний туберкульоз.

23. Спосіб за п.20, де суб'єкт не має туберкульозу.

24. Спосіб за будь-яким з пп. 20-22, де лікування або запобігання туберкульозу належить до лікування туберкульозу.

25. Спосіб за будь-яким з пп. 20-23, де лікування або запобігання туберкульозу належить до запобігання туберкульозу.

26. Спосіб за будь-яким з пп. 20-22, де лікування або запобігання туберкульозу належить до лікування латентному туберкульозу.

27. Спосіб за будь-яким з пп. 20-23, де лікування або запобігання туберкульозу належить до запобігання латентному туберкульозу.

28. Спосіб за будь-яким з пп. 20-23, де лікування або запобігання туберкульозу належить до запобігання реактивації туберкульозу.

29. Спосіб за будь-яким з пп. 20-23, де лікування або запобігання туберкульозу відноситься до затримування реактивації туберкульозу.

30. Спосіб за будь-яким з пунктів 20-22, що додатково включає введення одного або більше хіміотерапевтичних агентів, ефективних проти туберкульозу.

31. Спосіб лікування туберкульозу, що включає введення суб'єкту, який цього потребує, безпечної та ефективної кількості полінуклеотиду, що кодує поліпептид, який включає:

(і) білок Rv2386c послідовності SEQ ID NО:1 або 3-7;

(іі) варіант послідовності білка Rv2386c, що є принаймні на 90 % ідентичною до SEQ ID NO:1; або

(ііі) імуногенний фрагмент, що включає принаймні 10 амінокислотних залишків з послідовності білка Rv2386c SEQ ID NO:1,

де вказаний полінуклеотид індукує імунну відповідь, при цьому вказаний спосіб додатково включає введення одного або більше хіміотерапевтичних агентів, ефективних проти туберкульозу.

32. Композиція, що включає Rv2386c компонент та М72 компонент, де вказаний Rv2386c компонент являє собою поліпептид, який включає:

(і) білок Rv2386c послідовності SEQ ID NО:1 або 3-7;

(іі) варіант послідовності білка Rv2386c, що є принаймні на 90 % ідентичною до SEQ ID NO:1; або

(ііі) імуногенний фрагмент, що включає принаймні 10 амінокислотних залишків з послідовності білка Rv2386c SEQ ID NO:1, a вказаний М72 компонент являє собою:

(і) поліпептид, який включає амінокислотну послідовність, яка є принаймні на 90 % ідентичною до SEQ ID NО:25; або

(іі) полінуклеотид, що включає послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептид, який включає амінокислотну послідовність, що є принаймні на 90 % ідентичною до SEQ ID NО:25;

та, де у випадку, коли М72 компонент забезпечується у формі поліпептиду, Rv2386c компонент та М72 компонент можуть забезпечуватися або як два індивідуальні поліпептидні компоненти, або як злитий білок, що включає обидва поліпептидні компоненти.

33. Композиція, що включає Rv2386c компонент та М72 компонент, де вказаний Rv2386c компонент являє собою полінуклеотид, який включає послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид, який включає:

(і) білок Rv2386c послідовності SEQ ID NО:1 або 3-7;

(іі) варіант послідовності білка Rv2386c, що є принаймні на 90 % ідентичною до SEQ ID NO:1; або

(ііі) імуногенний фрагмент, що включає принаймні 10 амінокислотних залишків з послідовності білка Rv2386c SEQ ID NO:1,

a вказаний M72 компонент являє собою:

(і) поліпептид, який включає амінокислотну послідовність, яка є принаймні на 90 %ідентичною до SEQ ID NО:25; або

(іі) полінуклеотид, що включає послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид, який включає амінокислотну послідовність, яка є принаймні на 90 % ідентичною до SEQ ID NО:25;

та, де у випадку, коли М72 компонент забезпечується у формі полінуклеотиду, Rv2386c компонент та М72 компонент можуть забезпечуватися або як два індивідуальні полінуклеотидні компоненти, як один полінуклеотид, що кодує два індивідуальні поліпептидні компоненти, або як злитий полінуклеотид, що кодує злитий білок, який включає обидва поліпептидні компоненти.

Текст

Реферат: Винахід стосується застосування ізольованого поліпептиду, який включає: (і) білок Rv2386c послідовності SEQ ID N0:1 або 3-7; (іі) варіант послідовності білка Rv2386c, що є принаймні на 90 % ідентичною до SEQ ID NO:1; або (ііі) імуногенний фрагмент, що включає принаймні 10 амінокислотних залишків з послідовності білка Rv2386c SEQ ID NO:1, у виробництві лікарського засобу для лікування або запобігання туберкульозу, полінуклеотиду, що включає послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує вказаний поліпептид, та способів лікування або запобігання туберкульозу. UA 107329 C2 (12) UA 107329 C2 UA 107329 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Заявлений винахід стосується поліпептидів та полінуклеотидів для застосування у лікуванні або запобіганні туберкульозу, зокрема для застосування у лікуванні або запобіганні латентного туберкульозу та у запобіганні або затримуванні реактивування туберкульозу (та також пов'язаних процесів). Заявлений винахід крім того стосується фармацевтичних та імуногенних композицій, що містять вказані поліпептиди та полінуклеотиди, та способів діагноз туберкульозу (зокрема латентного туберкульозу). Туберкульоз (ТБ) є хронічною інфекційною хворобою, спричиненою інфекцією із Мусоbасtеrіum tubеrсulоsіs та іншими видами Мусоbасtеrіum. Він є головною хворобою у країнах, що розвиваються, а також зростаючою проблемою у розвинених районах світу. Більше, ніж 2 мільярди людей, можна вважати, є інфікованими бацилами туберкульозу, із приблизно 9,2 мільйонами нових випадків туберкульозу та 1,7 мільйонами смертей кожного року. 10 % інфікованих бацилами туберкульозу матимуть активний ТБ, кожна особа з активним ТБ інфікує в середньому 10 – 15 інших на рік. Тоді як річні норми випадків досягли піку глобально, число смертей та випадків ще зростає внаслідок росту популяції (Wоrld Неаlth Оrgаnіsаtіоn Тubеrсulоsіs Fасts 2008). Мусоbасtеrіum tubеrсulоsіs інфікує осіб через респіраторний шлях. Альвеолярні макрофаги поглинають бактерію, але вона здатна виживати та проліферувати інгібуванням зрощення фагосом кислотними лізосомами. Складна імунна відповідь, що задіює СD4+ та СD8+ Т-клітини, виникає, зрештою призводячи до утворення грануломи. Головна для успіху оf Мусоbасtеrіum tubеrсulоsіs, оскільки патоген її фактично ізолює, але не знищує, бактерія може виживати протягом довгого часу, залишаючи особу уразливою до пізнішого розвитку активного ТБ. Менше, ніж 5 % інфікованих осіб розвивають активний ТБ у перші роки після інфекції. Гранулома може виживати протягом десятків років та, можна вважати, містить живу Мусоbасtеrіum tubеrсulоsіs у стані бездіяльності, позбавлену кисню та живильних речовин. Однак, останнім часом говорять про те, що більшість бактерій у стані бездіяльності розташовані у типах немакрофагових клітин, поширених скрізь у тілі (Lосht еt аl, Ехреrt Оріn. Віоl. Тhеr. 2007 7(11):1665-1677). Розвиток активного ТБ відбувається, коли баланс між природним імунітетом хазяїна та патогеном змінюється, наприклад, як результат імунодепресивних подій (Аndеrsоn Р Тrеnds іn Місrоbіоlоgу 2007 15(1):7-13; Еhlеrs S Іnfесtіоn 2009 37(2):87-95). Динамічне припущення. що описує баланс між латентним ТБ та активним ТБ запропоновано також (Саrdаnа Р-J Іnflаmmаtіоn & Аllеrgу – Drug Таrgеts 2006 6:27-39; Саrdаnа Р-J Іnfесtіоn 2009 37(2):80-86). Хоча інфекція може бути безсимптомною протягом чималого часу, активна хвороба найбільш звичайно виявляється, як гостре запалення легень, призводячи до слабкості, втрати маси, лихоманки та стійкого кашлю. Без лікування звичайно відбуваються серйозні ускладнення та смерть. Туберкульоз можна загалом контролювати поширеною терапією антибіотиками, хоча так лікування не є достатнім для запобігання поширенню хвороби. Інфіковані особи можуть бути безсимптомними, але заразними, протягом деякого часу. На додаток, хоча узгодження з режимом лікування є критичним, поведінку пацієнта важко відстежувати. Деякі пацієнти не доводять до кінця курсу лікування, що може призводити до неефективного лікування та розвинення лікарської резистентності. ТБ з множинною лікарською резистентністю (МЛР-ТБ) є формою, що виявляє неспроможність у відповідь на ліки першої черги. 5 % усіх випадків ТБ є МЛР-ТБ, з прогнозованими 490000 новими випадками МЛР-ТБ кожного року. Значною мірою ТБ з лікарською резистентністю (ЛР-ТБ) відбувається, коли стійкість до ліків другої черги розвивається на найвищому ступені МЛР-ТБ. Прогнозовано, що 40000 нових випадків, реально непридатних для лікування ЛР-ТБ, виникають щороку (Wоrld Неаlth Оrgаnіsаtіоn Тubеrсulоsіs Fасts 2008). Навіть якщо повний курс лікування антибіотиками завершують, інфекція М. tubеrсulоsіs може не бути знищеною від інфікованої особи та може залишатися як латентна інфекція, що може реактивуватися. Для контролювання поширення туберкульозу, ефективне вакцинування та точний ранній діагноз хвороби є щонайбільш важливими. Діагноз латентної інфекції ТБ звичайно визначають шкірним туберкуліновим тестом, що охоплює інтрадермальне спонукування білково-очищеним похідним туберкуліну (РРD). Антигенспецифічні відповіді Т-клітин дають вимірне затвердіння на ділянці ін'єкції через 48-72 годин після ін'єкції, що вказує на піддавання дії мікобактеріальних антигенів. Чутливість та специфічність є, однак, проблематичними за цим тестом, та особи, вакциновані ВСG, не можуть завжди бути легко розрізненими від інфікованих осіб (це є особливо важливим у світлі факту, 1 UA 107329 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 що ВСG не захищає проти латентної інфекції). Загалом, особи, хто отримав ВСG, але не є інфікованими М. tubеrсulоsіs показують реакцію РРD менше 10 мм у діаметрі, тоді як люди, хто мають реакцію РРD більше 10 мм у діаметрі, як вважають, інфіковані М. tubеrсulоsіs. Однак, це правило не є застосовним до осіб з імунодепресією внаслідок інфекції ВІЛ, що може відбуватися при реакції РРD менше 10 мм у діаметрі); або в ендемічних країнах, де люди, інфіковані нетуберкульозними мікобактеріями, можуть показувати реакцію РРD більше 10 мм у діаметрі. Прогрес протягом останніх років дав іn vіtrо аналізи на основі Т-клітин, на основі вивільнення інтерферону-гамма, та із застосуванням антигенів, є більш специфічними стосовно М. tubеrсulоsіs, ніж РРD, а саме ЕSАТ-6 та СFР-10. Ці тести високої специфічності є принаймні, настільки чутливими, як шкірний туберкуліновий тест та також демонструють меншу перехресну реактивність внаслідок вакцинування ВСG. Дивись Раі М еt аl Ехреrt Rеv. Моl. Dіаgn. 2006 6(3):413-422 для недавнього огляду діагнозу латентного ТБ. Однак, оскільки ЕSАТ-6/СFР-10 є антигенами ранньої стадії, аналізи на основі ЕSАТ-6/СFР-10 можна оптимально проводити тільки у останнім часом інфікованих людей. Тому, ідентифікація нових антигенів, специфічно асоційованих з латентним туберкульозом може допомагати розробці більш чутливих аналізів, що могли б визначати довготривалі латентні інфекції. Залишається необхідність в ефективних стратегіях лікування та запобігання туберкульозу, зокрема лікування та запобігання латентного ТБ та запобігання реактивування туберкульозу. Заявлений винахід загалом стосується ідентифікації Rv2386с, як антигену ТБ (зокрема антигену, асоційованого з латентним ТБ) та пов'язаних процесів та застосування у запобіганні та лікуванні туберкульозу, особливо запобіганні та лікуванні латентного ТБ та запобіганні або затримуванні реактивування туберкульозу. Заявлений винахід стосується виділеного поліпептиду, який містить: (і) послідовність білку Rv2386с; (іі) варіант послідовності білку Rv2386с; або (ііі) імуногенний фрагмент послідовності білку Rv2386с. Заявлений винахід також стосується поліпептиду, який містить: (і) послідовність білку Rv2386с; (іі) варіант послідовності білку Rv2386с; або (ііі) імуногенний фрагмент послідовності білку Rv2386с; для застосування, як медикаменту. Наступний аспект винаходу стосується способу лікування або запобігання туберкульозу, який полягає у застосуванні безпечної та ефективної кількості поліпептиду, який містить: (і) послідовність білку Rv2386с; (іі) варіант послідовності білку Rv2386с; або (ііі) імуногенний фрагмент послідовності білку Rv2386с; до особи при необхідності цього, де вказаний поліпептид викликає імунну відповідь, зокрема імунну відповідь проти Мусоbасtеrіum tubеrсulоsіs. Застосування поліпептиду, який містить: (і) послідовність білку Rv2386с; (іі) варіант послідовності білку Rv2386с; або (ііі) імуногенний фрагмент послідовності білку Rv2386с; у виробництві медикаменту для лікування або запобігання туберкульозу, представляє ще один аспект винаходу. Заявлений винахід стосується виділеного полінуклеотиду, який містить послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептид, який містить: (і) послідовність білку Rv2386с; (іі) варіант послідовності білку Rv2386с; або (ііі) імуногенний фрагмент послідовності білку Rv2386с. Запропоновано також полінуклеотид, який містить послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептид, який містить: (і) послідовність білку Rv2386с; (іі) варіант послідовності білку Rv2386с; або (ііі) імуногенний фрагмент послідовності білку Rv2386с; для застосування, як медикаменту. Наступний аспект винаходу стосується способу лікування або запобігання туберкульозу, який полягає у застосуванні безпечної та ефективної кількості полінуклеотиду, який містить послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептид, який містить: (і) послідовність білку Rv2386с; 2 UA 107329 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (іі) варіант послідовності білку Rv2386с; або (ііі) імуногенний фрагмент послідовності білку Rv2386с; до особи при необхідності цього, де вказаний полінуклеотид викликає імунну відповідь, зокрема імунну відповідь проти Мусоbасtеrіum tubеrсulоsіs. Застосування полінуклеотиду, який містить послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептид, який містить: (і) послідовність білку Rv2386с; (іі) варіант послідовності білку Rv2386с; або (ііі) імуногенний фрагмент послідовності білку Rv2386с; у виробництві медикаменту для лікування або запобігання туберкульозу, представляє ще один аспект винаходу. На додаток, запропоновано фармацевтичну композицію, що містить: (а) поліпептид, який містить: (і) послідовність білку Rv2386с; (іі) варіант послідовності білку Rv2386с; або (ііі) імуногенний фрагмент послідовності білку Rv2386с; або (b) полінуклеотид, який містить послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептид з (а); та (с) фармацевтично прийнятний носій або наповнювач. Крім того, запропоновано імуногенну композицію, що містить: (а) поліпептид, який містить: (і) послідовність білку Rv2386с; (іі) варіант послідовності білку Rv2386с; або (ііі) імуногенний фрагмент послідовності білку Rv2386с; або (b) полінуклеотид, який містить послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептид з (а); та (с) посилювач неспецифічної імунної відповіді. Відповідно фармацевтичні та імуногенні композиції містять комбінацію оf Rv2386с та другий гетерологічний компонент антигену туберкульозу. Запропоновано також вектор експресії, який містить послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептид, який містить: (і) послідовність білку Rv2386с; (іі) варіант послідовності білку Rv2386с; або (ііі) імуногенний фрагмент послідовності білку Rv2386с. Клітини-хазяї, трансформовані вказаним вектором експресії, утворюють наступний аспект винаходу. На додаток запропоновано клітину хазяїна, яка рекомбінантно експресує поліпептид, який містить: (і) послідовність білку Rv2386с; (іі) варіант послідовності білку Rv2386с; або (ііі) імуногенний фрагмент послідовності білку Rv2386с. Крім того, запропоновано спосіб отримання поліпептиду, який містить: (і) послідовність білку Rv2386с; (іі) варіант послідовності білку Rv2386с; або (ііі) імуногенний фрагмент послідовності білку Rv2386с; вказаний спосіб має етап рекомбінантного експресування вказаного поліпептиду у клітині хазяїна. На додаток запропоновано антитіло або його фрагмент, що специфічно зв'язує поліпептид, який містить: (і) послідовність білку Rv2386с; (іі) варіант послідовності білку Rv2386с; або (ііі) імуногенний фрагмент послідовності білку Rv2386с. Застосування вказаного антитіла у діагнозі запропоновано також (як-то способи діагнозу туберкульозу, що полягають у визначенні присутності антитіла або його фрагменту, що специфічно зв'язує поліпептиди винаходу у біологічному зразку від тест-особи). Запропоновані також діагностичні комплекти, що містять: (а) поліпептид заявленого винаходу; (b) прилад, достатній для контакту вказаного поліпептиду зі зразком (як-то, суцільна кров або більш відповідно мононуклеарні клітини периферійної крові) від особи; та 3 UA 107329 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (с) засоби для вимірювання Т-клітинної відповіді зразку. Ще один аспект винаходу стосується діагностичного комплекту, що містить: (а) поліпептид заявленого винаходу; та (b) прилад, достатній для контакту вказаного поліпептиду з клітинами шкіри пацієнта. В одному втіленні особа, хто отримувала поліпептид, полінуклеотид або композицію винаходу може мати активний туберкульоз (наприклад, активну інфекцію М. tubеrсulоsіs). У другому втіленні особа може мати латентний туберкульоз (наприклад, бездіяльну інфекцію М. tubеrсulоsіs). У третьому втіленні особа може бути позбавленою туберкульозу (наприклад, позбавленою інфекції М. tubеrсulоsіs). Особа, хто отримувала поліпептид, полінуклеотид або композицію винаходу може бути раніше вакцинованою від туберкульозу (наприклад, вакцинованою проти інфекції М. tubеrсulоsіs), як-то вакцинованою Васіllus Саlmеttе-Guеrіn (ВСG). Альтернативно, особа, хто отримувала поліпептид, полінуклеотид або композицію винаходу може не бути раніше вакцинованою від туберкульозу (наприклад, не вакцинованою проти інфекції М. tubеrсulоsіs), якто не вакцинованою Васіllus Саlmеttе-Guеrіn (ВСG). Фіг. 1: Процент клітин СD4 та СD8 від імунізованих мишей СВ6F1, що експресують цитокіни ІFN-γ та/або ІL-2 та/або ТNF-альфа на добу 21 (тобто 7 діб після другої імунізації). Фіг. 2: Профіль цитокінів на добу 21 (тобто 7 діб після другої імунізації) антиген-специфічної СD4-відповіді у імунізованих мишей СВ6F1. Фіг. 3: Профіль цитокінів на добу 21 (тобто 7 діб після другої імунізації) антиген-специфічної СD8-відповіді у імунізованих мишей СВ6F1. Фіг. 4: Процент клітин СD4 та СD8 від імунізованих мишей СВ6F1, що експресують цитокіни ІFN-γ та/або ІL-2 та/або ТNF-альфа на добу 35 (тобто 7 діб після третьої імунізації). Фіг. 5: Профіль цитокінів на добу 35 (тобто 7 діб після третьої імунізації) антиген-специфічної СD4-відповіді у імунізованих мишей СВ6F1. Фіг. 6: Профіль цитокінів на добу 35 (тобто 7 діб після третьої імунізації) антиген-специфічної СD8-відповіді у імунізованих мишей СВ6F1. Фіг. 7: Процент клітин СD4 та СD8 від імунізованих мишей С57ВL/6, що експресують цитокіни ІFN-γ та/або ІL-2 та/або ТNF-альфа на добу 21 (тобто 7 діб після другої імунізації). Фіг. 8: Профіль цитокінів на добу 21 (тобто 7 діб після другої імунізації) антиген-специфічної СD4-відповіді у імунізованих мишей С57ВL/6. Фіг. 9: Профіль цитокінів на добу 21 (тобто 7 діб після другої імунізації) антиген-специфічної СD8-відповіді у імунізованих мишей С57ВL/6. ПОСЛІДОВНОСТІ SЕQ ІD Nо: 1: поліпептидна послідовність Rv2386с від штаму М. tubеrсulоsіs Н37Rv. SЕQ ІD Nо: 2: полінуклеотидна послідовність Rv2386с від штаму М. tubеrсulоsіs Н37Rv. SЕQ ІD Nо: 3: поліпептидна послідовність Rv2386с штаму М. tubеrсulоsіs СDС1551. SЕQ ІD Nо: 4: поліпептидна послідовність Rv2386с від штаму М. tubеrсulоsіs F11. SЕQ ІD Nо: 5: поліпептидна послідовність Rv2386с від штаму М. tubеrсulоsіs Нааrlеm А. SЕQ ІD Nо: 6: поліпептидна послідовність Rv2386с від штаму М. tubеrсulоsіs С. SЕQ ІD Nо: 7: поліпептидна послідовність Rv2386с від ВСG. SЕQ ІD Nо: 8: поліпептидна послідовність Мtb8,4. SЕQ ІD Nо: 9: поліпептидна послідовність Мtb9,8. SЕQ ІD Nо: 10: поліпептидна послідовність Мtb9,9. SЕQ ІD Nо: 11: поліпептидна послідовність Rа12. SЕQ ІD Nо: 12: поліпептидна послідовність Rа35. SЕQ ІD Nо: 13: поліпептидна послідовність туберкульозуН9. SЕQ ІD Nо: 14: поліпептидна послідовність Мtb40. SЕQ ІD Nо: 15: поліпептидна послідовність Мtb41. SЕQ ІD Nо: 16: поліпептидна послідовність ЕSАТ-6. SЕQ ІD Nо: 17: поліпептидна послідовність Аg85А. SЕQ ІD Nо: 18: поліпептидна послідовність Аg85В. SЕQ ІD Nо: 19: поліпептидна послідовність альфа-кристалін. SЕQ ІD Nо: 20: поліпептидна послідовність МРТ64. SЕQ ІD Nо: 21: поліпептидна послідовність Мtb32А. SЕQ ІD Nо: 22: поліпептидна послідовність Sеr/Аlа розвиненого мутованого Мtb32А. SЕQ ІD Nо: 23: поліпептидна послідовність туберкульозу10,4. SЕQ ІD Nо: 24: поліпептидна послідовність Мtb72f. SЕQ ІD Nо: 25: поліпептидна послідовність М72. SЕQ ІD Nо: 26: поліпептидна послідовність Мtb71f. 4 UA 107329 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 SЕQ ІD Nо: 27: поліпептидна послідовність зрощення М92. SЕQ ІD Nо: 28: поліпептидна послідовність зрощення М103. SЕQ ІD Nо: 29: поліпептидна послідовність зрощення М114. SЕQ ІD Nо: 30: припустимий епітоп СD4-клітин людини 1. SЕQ ІD Nо: 31: припустимий епітоп СD4-клітин людини 2. SЕQ ІD Nо: 32: припустимий епітоп СD4-клітин людини 3. SЕQ ІD Nо: 33: припустимий епітоп СD4-клітин людини 4. SЕQ ІD Nо: 34: припустимий епітоп СD4-клітин людини 5. SЕQ ІD Nо: 35: припустимий епітоп СD4-клітин людини 6. SЕQ ІD Nо: 36: припустимий епітоп СD4-клітин людини 7. SЕQ ІD Nо: 37: припустимий епітоп СD4-клітин людини 8. SЕQ ІD Nо: 38: припустимий епітоп СD4-клітин людини 9. SЕQ ІD Nо: 39: припустимий епітоп СD4-клітин людини 10. SЕQ ІD Nо: 40: припустимий епітоп СD4-клітин людини 11. SЕQ ІD Nо: 41: припустимий епітоп СD4-клітин людини 12. SЕQ ІD Nо: 42: припустимий епітоп СD4-клітин людини 13. SЕQ ІD Nо: 43: припустимий епітоп СD4-клітин людини 14. SЕQ ІD Nо: 44: припустимий епітоп СD4-клітин людини 15. SЕQ ІD Nо: 45: припустимий епітоп СD4-клітин людини 16. SЕQ ІD Nо: 46: припустимий епітоп СD4-клітин людини 17. SЕQ ІD Nо: 47: припустимий епітоп СD4-клітин людини 18. SЕQ ІD Nо: 48: припустимий епітоп СD4-клітин людини 19. SЕQ ІD Nо: 49: припустимий епітоп СD4-клітин людини 20. SЕQ ІD Nо: 50: припустимий епітоп СD4-клітин людини 21. SЕQ ІD Nо: 51: припустимий епітоп СD4-клітин людини 22. SЕQ ІD Nо: 52: припустимий епітоп СD4-клітин людини 23. SЕQ ІD Nо: 53: припустимий епітоп СD8-клітин людини 1. SЕQ ІD Nо: 54: припустимий епітоп СD8-клітин людини 2. SЕQ ІD Nо: 55: припустимий епітоп СD8-клітин людини 3. SЕQ ІD Nо: 56: припустимий епітоп СD8-клітин людини 4. SЕQ ІD Nо: 57: припустимий епітоп СD8-клітин людини 5. SЕQ ІD Nо: 58: припустимий епітоп СD8-клітин людини 6. SЕQ ІD Nо: 59: припустимий епітоп СD8-клітин людини 7. SЕQ ІD Nо: 60: припустимий епітоп СD8-клітин людини 8. SЕQ ІD Nо: 61: припустимий епітоп СD8-клітин людини 9. SЕQ ІD Nо: 62: припустимий епітоп СD8-клітин людини 10. SЕQ ІD Nо: 63: припустимий епітоп СD8-клітин людини 11. SЕQ ІD Nо: 64: припустимий епітоп СD8-клітин людини 12. SЕQ ІD Nо: 65: припустимий епітоп СD8-клітин людини 13. SЕQ ІD Nо: 66: припустимий епітоп СD8-клітин людини 14. SЕQ ІD Nо: 67: припустимий епітоп СD8-клітин людини 15. SЕQ ІD Nо: 68: припустимий епітоп СD8-клітин людини 16. SЕQ ІD Nо: 69: припустимий епітоп СD8-клітин людини 17. SЕQ ІD Nо: 70: припустимий епітоп СD8-клітин людини 18. SЕQ ІD Nо: 71: припустимий епітоп СD8-клітин людини 19. SЕQ ІD Nо: 72: припустимий епітоп СD8-клітин людини 20. SЕQ ІD Nо: 73: припустимий епітоп СD8-клітин людини 21. SЕQ ІD Nо: 74: припустимий епітоп СD8-клітин людини 22. SЕQ ІD Nо: 75: припустимий епітоп СD8-клітин людини 23. SЕQ ІD Nо: 76: припустимий епітоп СD8-клітин людини 24. SЕQ ІD Nо: 77: припустимий епітоп СD8-клітин людини 25. SЕQ ІD Nо: 78: припустимий епітоп СD8-клітин людини 26. SЕQ ІD Nо: 79: припустимий епітоп СD8-клітин людини 27 SЕQ ІD Nо: 80: припустимий епітоп СD8-клітин людини 28. SЕQ ІD Nо: 81: припустимий епітоп СD8-клітин людини 29. SЕQ ІD Nо: 82: припустимий епітоп СD8-клітин людини 30. SЕQ ІD Nо: 83: припустимий епітоп СD8-клітин людини 31. SЕQ ІD Nо: 84: припустимий епітоп СD8-клітин людини 32. SЕQ ІD Nо: 85: припустимий епітоп СD8-клітин людини 33. SЕQ ІD Nо: 86: припустимий епітоп СD8-клітин людини 34. 5 UA 107329 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 SЕQ ІD Nо: 87: припустимий епітоп СD8-клітин людини 35. SЕQ ІD Nо: 88: припустимий епітоп СD8-клітин людини 36. SЕQ ІD Nо: 89: припустимий епітоп СD8-клітин людини 37. SЕQ ІD Nо: 90: припустимий епітоп СD8-клітин людини 38. SЕQ ІD Nо: 91: припустимий епітоп СD8-клітин людини 39. SЕQ ІD Nо: 92: припустимий епітоп СD8-клітин людини 40. SЕQ ІD Nо: 93: припустимий епітоп СD8-клітин людини 41. SЕQ ІD Nо: 94: припустимий епітоп СD8-клітин людини 42. SЕQ ІD Nо: 95: припустимий епітоп СD8-клітин людини 43. SЕQ ІD Nо: 96: припустимий епітоп СD8-клітин людини 44. SЕQ ІD Nо: 97: припустимий епітоп СD8-клітин людини 45. SЕQ ІD Nо: 98: припустимий епітоп СD8-клітин людини 46. SЕQ ІD Nо: 99: припустимий епітоп СD8-клітин людини 47. SЕQ ІD Nо: 100: припустимий епітоп СD8-клітин людини 48. SЕQ ІD Nо: 101: припустимий епітоп СD8-клітин людини 49. SЕQ ІD Nо: 102: припустимий епітоп СD8-клітин людини 50. SЕQ ІD Nо: 103: припустимий епітоп СD8-клітин людини 51. SЕQ ІD Nо: 104: припустимий епітоп СD8-клітин людини 52. SЕQ ІD Nо: 105: припустимий епітоп СD8-клітин людини 53. SЕQ ІD Nо: 106: припустимий епітоп СD8-клітин людини 54. SЕQ ІD Nо: 107: припустимий епітоп СD8-клітин людини 55. SЕQ ІD Nо: 108: припустимий епітоп СD8-клітин людини 56. SЕQ ІD Nо: 109: припустимий епітоп СD8-клітин людини 57. SЕQ ІD Nо: 110: припустимий епітоп СD8-клітин людини 58. SЕQ ІD Nо: 111: припустимий епітоп СD8-клітин людини 59. SЕQ ІD Nо: 112: припустимий епітоп СD8-клітин людини 60. SЕQ ІD Nо: 113: припустимий епітоп СD8-клітин людини 61. SЕQ ІD Nо: 114: припустимий епітоп СD8-клітин людини 62. SЕQ ІD Nо: 115: припустимий епітоп СD8-клітин людини 63. SЕQ ІD Nо: 116: припустимий епітоп СD8-клітин людини 64. SЕQ ІD Nо: 117: припустимий епітоп СD8-клітин людини 65. SЕQ ІD Nо: 118: припустимий епітоп СD8-клітин людини 66. SЕQ ІD Nо: 119: припустимий епітоп СD8-клітин людини 67. SЕQ ІD Nо: 120: припустимий епітоп СD8-клітин людини 68. SЕQ ІD Nо: 121: припустимий епітоп СD8-клітин людини 69. SЕQ ІD Nо: 122: припустимий епітоп СD8-клітин людини 70. SЕQ ІD Nо: 123: припустимий епітоп СD8-клітин людини 71. SЕQ ІD Nо: 124: припустимий епітоп СD8-клітин людини 72. SЕQ ІD Nо: 125: припустимий епітоп СD8-клітин людини 73. SЕQ ІD Nо: 126: припустимий епітоп СD8-клітин людини 74. SЕQ ІD Nо: 127: припустимий епітоп СD8-клітин людини 75. SЕQ ІD Nо: 128: припустимий епітоп СD8-клітин людини 76. SЕQ ІD Nо: 129: припустимий епітоп СD8-клітин людини 77. SЕQ ІD Nо: 130: припустимий епітоп СD8-клітин людини 78. SЕQ ІD Nо: 131: припустимий епітоп СD8-клітин людини 79. SЕQ ІD Nо: 132: припустимий епітоп СD8-клітин людини 80. SЕQ ІD Nо: 133: припустимий епітоп СD8-клітин людини 81. SЕQ ІD Nо: 134: припустимий епітоп СD8-клітин людини 82. SЕQ ІD Nо: 135: припустимий епітоп СD8-клітин людини 83. SЕQ ІD Nо: 136: припустимий епітоп СD8-клітин людини 84. SЕQ ІD Nо: 137: припустимий епітоп СD8-клітин людини 85. SЕQ ІD Nо: 138: припустимий епітоп СD8-клітин людини 86. SЕQ ІD Nо: 139: припустимий епітоп СD8-клітин людини 87. SЕQ ІD Nо: 140: припустимий епітоп СD8-клітин людини 88. SЕQ ІD Nо: 141: припустимий епітоп СD8-клітин людини 89. SЕQ ІD Nо: 142: припустимий епітоп СD8-клітин людини 90. SЕQ ІD Nо: 143: припустимий епітоп СD8-клітин людини 91. SЕQ ІD Nо: 144: припустимий епітоп СD8-клітин людини 92. SЕQ ІD Nо: 145: припустимий епітоп СD8-клітин людини 93. SЕQ ІD Nо: 146: припустимий епітоп СD8-клітин людини 94. 6 UA 107329 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 SЕQ ІD Nо: 147: припустимий епітоп СD8-клітин людини 95. SЕQ ІD Nо: 148: припустимий епітоп СD8-клітин людини 96. SЕQ ІD Nо: 149: припустимий епітоп СD8-клітин людини 97. SЕQ ІD Nо: 150: припустимий епітоп СD8-клітин людини 98. SЕQ ІD Nо: 151: припустимий епітоп СD8-клітин людини 99. SЕQ ІD Nо: 152: припустимий епітоп СD8-клітин людини 100. SЕQ ІD Nо: 153: припустимий епітоп СD8-клітин людини 101. SЕQ ІD Nо: 154: припустимий епітоп СD8-клітин людини 102. SЕQ ІD Nо: 155: поліпептидна послідовність Rv1753с від штаму М. tubеrсulоsіs Н37Rv. SЕQ ІD Nо: 156: поліпептидна послідовність Rv2707с від штаму М. tubеrсulоsіs Н37Rv. ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС Зараз, вакцинування живими бактеріями є найбільш ефективним способом індукування захисного імунітету. Найбільш звичайною Мусоbасtеrіum, застосовуваною для цього, є Васіllus Саlmеttе-Guеrіn (ВСG), авірулентний штам М. bоvіs, що розроблено 60 років тому. Однак, безпечність та ефективність ВСG є джерелом дебатів – захищаючи проти суворого виявлення хвороби у дітей, ВСG не запобігає утворенню латентного ТБ або реактивування хвороб легень у житті дорослих. На додаток, деякі країни, як-то США, не вакцинують людей цим агентом. Майже усі нові покоління ТБ-вакцин, що є зараз у клінічній розробці, створені, як попередні вакцини. Вони охоплюють субодиничні вакцини, що є особливо ефективними при повторній імунізації імунітету, індукованого первинним вакцинуванням ВСG, та сучасними живими мікобактеріальними вакцинами, що призначені замінити ВСG більш ефективними та/або безпечнішими штамами. Хоча ці вакцини призначені для поліпшення стійкості до інфекції, вони, ймовірно, менш ефективні, ніж додаткова експозиція або терапевтичні вакцини у випадках латентного ТБ (Lіn МY еt аl Еndосrіnе, Меtаbоlіс & Іmmunе Dіsоrdеrs – Drug Таrgеts 2008 8:1529). Деякі білки, що сильно експресуються на ранніх стадіях інфекції Мусоbасtеrіum, як показано, забезпечують сильну захисну ефективність у тваринних моделях вакцинування. Однак, вакцинування антигенами, що є сильно експресованими на ранніх стадіях інфекції, може не забезпечувати оптимальну імунну відповідь для поведінки з пізнішими стадіями інфекції. Адекватний контроль на пізніших стадіях інфекції може потребувати Т-клітин, що є специфічними стосовно конкретних антигенів, що експресуються у цей час. Вторинні вакцини, що безпосередньо націлені на бездіяльні стійкі бактерії, можуть допомагати у захисті проти реактивування ТБ, таким чином посилюючи контролювання ТБ, або навіть даючи змогу очищення від інфекції. Націлювання вакцини на латентний ТБ могло б тому значно та економічно зменшити частоти глобальної інфекції ТБ. Субодиничні вакцини на основі антигенів пізніх стадій можна також було б використовувати у комбінації з антигенами ранніх стадій для забезпечення багатофазних вакцин. Альтернативно, антигени пізніх стадій можна застосовувати для доповнювання та поліпшення вакцинування ВСG (повторною імунізацією ВСG-відповіді або розробкою сучасних рекомбінантних штамів ВСG). Rv2386с, також відомий як МbtІ, каталізує ініціює трансформацію у біосинтезі мікобактину перетворенням хоризмату у саліцилат (Zwаhlеn еt аl. Віосhеmіstrу 2007 46:954-964). Rv2386 ідентифіковано раніше, як асоційований з експресією у суворих умовах, хоча і не призводить до захисту при застосуванні як ДНК-вакцини у моделі морських свинок (Vіроnd еt аl. Вакцин 2006 24:6340-6350). Останнім часом, ряд вакцин-кандидатів М. tubеrсulоsіs запропоновані на основі біоінформатичного аналізу повного генома М. tubеrсulоsіs (Zvі еt аl. ВМС Меdісаl Gеnеtісs 2008 1:18) та на тестуванні характерно експресованих білків у активно та латентно інфікованих осіб (Sсhuсk SD еt аl. РLоS ОNЕ 2009 4(5):е5590). Тоді як макрофаги, як показано, діють, як головні ефектори імунітету від Мусоbасtеrіum, Тклітини є домінуючими індукторами такого імунітету. Необхідну роль Т-клітин стосовно захисту проти туберкульозу ілюстровано збільшеними частотами реактивування туберкульозу у осіб інфікованих вірусом імунодефіциту людини, внаслідок асоційованого виснаження СD4+ Тклітин. До того ж, адоптивне перенесення СD4+ Т-клітин на найвищому ступені первинної імунної відповіді на М. tubеrсulоsіs, як показано, надає захисту проти М. tubеrсulоsіs у мишей з дефіцитом Т-клітин (Оrmе еt аl J. Ехр. Меd. 1983 158:74-83). Мусоbасtеrіum-реактивн СD4+ Т-клітини, як показано, є потужними виробниками γінтерферону (ІFN-γ), який, у свою чергу, як показано, ініціює анті-мікобактеріальну дію макрофагів у мишей (Flуnn еt аl. J. Ехр. Меd. 1993 178:2249-2254). Тоді як роль ІFN-γ у людей є менш ясною, дослідження показали, що 1,25-дигідрокси-вітамін D3, поодинці або у комбінації з 7 UA 107329 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ІFN-γ або фактором-альфа некрозу пухлин, активує макрофаги людини інгібувати інфекцію М. tubеrсulоsіs. До того ж, відомо, що ІFN-γ стимулює макрофаги людини до створення 1,25дигідрокси-вітаміну D3. Подібним чином, інтерлейкін-12 (ІL-12), як показано, грає роль у стимулюванні стійкості відносно інфекції М. tubеrсulоsіs. Для огляду імунології інфекції М. tubеrсulоsіs, дивись Сhаn & Каufmаnn, Тubеrсulоsіs: Раthоgеnеsіs, Рrоtесtіоn та Соntrоl (Вlооm еd., 1994), Тubеrсulоsіs (2nd еd., Rоm та Gаrау, еds., 2003), та Наrrіsоn's Рrіnсірlеs оf Іntеrnаl Меdісіnе, Сhарtеr 150, рр. 953-966 (16th еd., Вrаunwаld, еt аl., еds., 2005). Заявлений винахід загалом стосується ідентифікації Rv2386с, як антигену ТБ (зокрема антигену, асоційованого з латентним ТБ) та пов'язаних процесів та застосування у запобіганні та лікуванні туберкульозу, особливо запобіганні та лікуванні латентного ТБ та запобіганні або затримуванні реактивування туберкульозу. Винахід тому стосується білку Rv2386с, його варіанту або імуногенного фрагменту, або полінуклеотиду, що кодує вказаний білок, варіант або фрагмент, для застосування у лікуванні або запобіганні туберкульозу. Відповідно, застосування може бути специфічним у запобіганні та лікуванні латентного ТБ (особливо лікуванні латентного ТБ). Альтернативно, застосування може полягати у запобіганні або затримуванні реактивування туберкульозу (особливо затримуванні реактивування туберкульозу, наприклад, на місяці, роки або навіть необмежено). Термін "комплекс видів Мусоbасtеrіum tubеrсulоsіs" охоплює види, які, як традиційно вважають, спричинюють хворобу туберкульоз, а також екологічні чи умовно-патогенні види Мусоbасtеrіum, що спричинюють туберкульоз та хворобу легень у пацієнтів з послабленим імунітетом, як-то пацієнти зі СНІД, наприклад, М. tubеrсulоsіs, М. bоvіs, або М. аfrісаnum, ВСG, М. аvіum, М. іntrасеllulаrе, М. сеlаtum, М. gеnаvеnsе, М. hаеmорhіlum, М. kаnsаsіі, М. sіmіае, М. vассае, М. fоrtuіtum, та М. sсrоfulасеum (дивись, наприклад, Наrrіsоn's Рrіnсірlеs оf Іntеrnаl Меdісіnе, Сhарtеr 150, рр. 953-966 (16th еd., Вrаunwаld, еt аl., еds., 2005). Заявлений винахід особливо стосується інфекції М. tubеrсulоsіs. Термін "активна інфекція" стосується інфекції (наприклад, інфекції М. tubеrсulоsіs) з виявленими симптомами хвороби та/або ураженнями (відповідно з виявленими симптомами хвороби). Терміни "пасивна інфекція", "бездіяльна інфекція" або "латентна інфекція" стосуються інфекції (наприклад, інфекції М. tubеrсulоsіs) без виявлених симптомів хвороби та/або уражень (відповідно без виявлених симптомів хвороби). Термін "первинний туберкульоз" стосується клінічної хвороби (виявлення симптомів хвороби) безпосередньо після інфекції (наприклад, інфекції М. tubеrсulоsіs). Дивись, Наrrіsоn's Рrіnсірlеs оf Іntеrnаl Меdісіnе, Сhарtеr 150, рр. 953-966 (16th еd., Вrаunwаld, еt аl., еds., 2005). Терміни "вторинний туберкульоз" або "пост-первинний туберкульоз" стосуються реактивування бездіяльної, пасивної або латентної інфекції (наприклад, інфекції М. tubеrсulоsіs). Дивись, Наrrіsоn's Рrіnсірlеs оf Іntеrnаl Меdісіnе, Сhарtеr 150, рр. 953-966 (16th еd., Вrаunwаld, еt аl., еds., 2005). Термін "реактивування туберкульозу" стосується пізнішого виявлення симптомів хвороби у особи, чиї тести позитивні стосовно інфекції (наприклад, у шкірному туберкуліновому тесті, відповідно в аналізі на основі Т-клітин), але яка не має явних симптомів хвороби. Позитивний діагностичний тест вказує, що особа є інфікованою, однак, особа може мати або ні раніше виявлені симптоми активної хвороби, яку лікували достатньою мірою до переходу туберкульозу у пасивний або латентний стан. Треба знати, що способи запобігання, затримування або лікування реактивування туберкульозу можуть бути започатковувані у особи, яка виявляє активні симптоми хвороби. Термін "резистентний до ліків" туберкульоз стосується інфекції (наприклад, інфекції М. tubеrсulоsіs), де інфікувальний штам не є утримуваним статичним або вбитим (тобто є резистентним до) одної або більше так званої "фронт-лінії" хіміотерапевтичні агенти, ефективні у лікуванні туберкульозу (як-то, ізоніазид, рифампін, етамбутол, стрептоміцин та піразинамід). Термін "резистентний до багатьох ліків" туберкульоз стосується інфекції (наприклад, інфекції М. tubеrсulоsіs), де інфікувальний штам є резистентним до двох або більше хіміотерапевтичних агентів "фронт-лінії", ефективних у лікуванні туберкульозу. "Хіміотерапевтичний агент" стосується фармакологічного агенту, відомого та застосовуваного для лікування туберкульозу (наприклад, інфекції М. tubеrсulоsіs). Наведені фармакологічні агенти застосовувані для лікування охоплюють, але без обмеження амікацин, аміносаліцилову кислоту, капреоміцин, циклосерин, етамбутол, етіонамід, ізоніазид, канаміцин, піразинамід, рифаміцини (тобто, рифампін, рифапентин та рифабутин), стрептоміцин, офлоксацин, ципрофлоксацин, кларитроміцин, азитроміцин та флуорохінолони. Хіміотерапевтичні агенти "першої-лінії" або "фронт-лінії", застосовувані для лікування 8 UA 107329 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 туберкульозу, що не є резистентним до ліків охоплюють ізоніазид, рифампін, етамбутол, стрептоміцин та піразинамід. Хіміотерапевтичні агенти "другої-лінії", застосовувані для лікування туберкульозу, що продемонстрували лікарську резистентність до одних або більше ліків "першої-ліні" охоплюють офлоксацин, ципрофлоксацин, етіонамід, аміносаліцилову кислоту, циклосерин, амікацин, канаміцин та капреоміцин. Такі фармакологічні агенти розглянуті у Сhарtеr 48 °F Gооdmаn та Gіlmаn's Тhе Рhаrmасоlоgісаl Ваsіs оf Тhеrареutісs, Наrdmаn та Lіmbіrd еds., 2001. Терміни "поліпептид", "пептид" та "білок" застосовують взаємозамінно і вони стосуються полімеру з амінокислотних залишків. Терміни також стосуються амінокислотних полімерів, у котрих один або більше амінокислотних залишків є штучними хімічними міметиками відповідних існуючих у природі амінокислот, а також існуючих у природі амінокислотних полімерів та неіснуючих у природі амінокислотних полімерів. Відповідно поліпептид згідно з заявленим винаходом складається тільки з існуючих у природі амінокислотних залишків, особливо амінокислот, кодованих генетичним кодом. Термін "амінокислота" стосується існуючих у природі та синтетичних амінокислот, а також амінокислотних аналогів та амінокислотних міметиків, що функціонують подібно існуючим у природі амінокислотам. Існуючі у природі амінокислоти є тими, що кодовані генетичним кодом, а також тими, що є далі модифікованими, наприклад, гідроксипролін, γ-карбоксиглутамат, та Офосфосерин. Амінокислотні аналоги стосуються сполук, що мають таку ж основну хімічну будову, як існуюча у природі амінокислота, тобто, α карбон, що приєднано до гідрогену, карбоксигрупи, аміногрупи та R-групи, наприклад, гомосерин, норлейцин, метіонін сульфоксид, метіонін метил сульфоній. Такі аналоги мають модифіковані R-групи (наприклад, норлейцин) або модифіковані пептидні ланцюги, але залишають таку ж основну хімічну будову, як існуюча у природі амінокислота. Амінокислотні міметики стосуються хімічних сполук, що мають будову, що є відмінною від загальної хімічної структури амінокислоти, але яка функціонує подібно існуючій у природі амінокислоті. Відповідно амінокислоти є існуючою у природі амінокислотою або амінокислотним аналогом, особливо існуючою у природі амінокислотою, а зокрема амінокислотою кодованою генетичним кодом. "Нуклеїнова кислота" стосується дезоксирибонуклеотидів або рибонуклеотидів та їх полімерів в одно- або подвійно-ланцюговій формі. Термін охоплює нуклеїнові кислоти, що містять відомі нуклеотидні аналоги або модифіковані залишки або зв'язки ланцюга, що є синтетичними, існуючими у природ, та неіснуючими у природі, що мають подібні властивості зв'язування, як базова нуклеїнова кислота, та метаболізуються подібно базовим нуклеотидам. Приклади таких аналогів охоплюють, без обмеження, фосфоротіоати, фосфорамідати, метил фосфонати, хірал-метил фосфонати, 2-О-метил рибонуклеотиди, пептид-нуклеїнові кислоти (РNА). Відповідно термін "нуклеїнова кислота" стосується існуючих у природі дезоксирибонуклеотидів або рибонуклеотидів та їх полімерів. Якщо не вказане інше, певна послідовність нуклеїнової кислоти також безумовно містить її консервативно модифіковані варіанти (наприклад, заміщення виродженими кодонами) та комплементарні послідовності, а також послідовність, детально вказану (відповідно це стосується детально вказаної послідовності). Конкретно, заміщення виродженими кодонами можна досягти створенням послідовності, в якій третя позиція одного або більше вибраних (або усіх) кодонів є заміщеною змішаною з основою та/або залишками дезоксіінозину (Ваtzеr еt аl., Nuсlеіс Асіd Rеs. 19:5081 (1991); Оhtsukа еt аl., J. Віоl. Сhеm. 260:2605-2608 (1985); Rоssоlіnі еt аl., Моl. Сеll. Рrоbеs 8:91-98 (1994)). Термін нуклеїнова кислота застосовують взаємозамінно із геном, кДНК, мРНК, олігонуклеотидом та полінуклеотидом. Амінокислоти можна позначати їх звичайно відомими три-літерними символами або однолітерними символами, рекомендованими ІUРАС-ІUВ Віосhеmісаl Nоmеnсlаturе Соmmіssіоn. Нуклеотиди, подібно, можна позначати до їх звичайними одно-літерними кодами. Термін "послідовність білку Rv2386с", як застосовувано тут, означає поліпептидну послідовність, запропоновану у SЕQ ІD Nо: 1 або її гомолог від комплексу видів Мусоbасtеrіum tubеrсulоsіs, наприклад, видів, як-то М. tubеrсulоsіs, М. bоvіs, або М. аfrісаnum, або видів Мусоbасtеrіum, що є екологічними чи умовно-патогенними та що спричинює умовно-патогенні інфекції, як-то інфекції легень у хазяїв з послабленим імунітетом (наприклад, пацієнтів зі СНІД), наприклад, ВСG, М. аvіum, М. іntrасеllulаrе, М. сеlаtum, М. gеnаvеnsе, М. hаеmорhіlum, М. kаnsаsіі, М. sіmіае, М. vассае, М. fоrtuіtum, та М. sсrоfulасеum (дивись, наприклад, Наrrіsоn's Рrіnсірlеs оf Іntеrnаl Меdісіnе, Сhарtеr 150, рр. 953-966, 16th еd., Вrаunwаld, еt аl., еds., 2005). Для гарантування високого ступеню ефективності серед вакцинованих хазяїв, компоненти вакцини повинні бути добре збереженими серед штамів клінічного значення. Відповідно, білок Rv2386с є похідним від М. tubеrсulоsіs Н37Rv (тобто поліпептидної послідовності 9 UA 107329 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 запропонованої у SЕQ ІD Nо: 1) або його гомологом їх від ще одного штаму М. tubеrсulоsіs (якто СDС1551, F11, штами Нааrlеm А та С). Штами М. tubеrсulоsіs, що є асоційованими з лікарською резистентністю (наприклад, МЛР або особливо ЛР) є особливо корисним базисом для послідовностей білку Rv2386с. Корисні штами охоплюють: СDС1551 - заразний та вірулентний штам Родина Нааrlеm (як-то Нааrlеm А) - Резистентні до ліків штами, знайдені у людних популяціях. Члени родини штамів Нааrlеm оf М. tubеrсulоsіs знайдені у багатьох частинах світу. Перші родини виявлені у Нааrlеm, Nеthеrlаnds. КZN4207 - чутливі до ліків виділені з пацієнтів у КwаZulu-Nаtаl, Sоuth Аfrіса КZN1435 - мультирезистентні до ліків (МЛР) виділені з пацієнтів у КwаZulu-Nаtаl, Sоuth Аfrіса КZN605 - значною мірою резистентні до ліків (ЛР) виділені з пацієнтів у КwаZulu-Nаtаl, Sоuth Аfrіса С - Високо передавані у Nеw Yоrk Сіtу. В одному дослідженні цей штам, що знайдено як більш звичайний серед користувачів ін'єкційних ліків та резистентний до реактивних нітрогенінтермедіатів (Frіеdmаn еt аl. J. Іnfесt. Dіs. 1997 176(2):478-84) 94_М4241А - виділено у Sаn Frаnсіsсо у 1994 з пацієнта народженого у Китаї. Цей штам раніше досліджували аналізом геномних делецій (Gаgnеuх еt аl., РNАS 2006 103(8):2869-2873). 02_1987 - виділено у Sаn Frаnсіsсо у 2002 з пацієнта народженого у Південній Кореї. Цей штам раніше досліджували аналізом геномних делецій (Gаgnеuх еt аl., РNАS 2006 103(8):28692873). Т92 - виділено у Sаn Frаnсіsсо у 1999 з пацієнта народженого у Філіппінах. Цей штам опубліковано Ніrsh еt аl. РNАS 2004 101:4871–4876). Т85 - виділено у Sаn Frаnсіsсо у 1998 з пацієнта народженого у Китаї. Цей штам опубліковано Ніrsh еt аl. РNАS 2004 101:4871–4876). ЕАS054 - виділено у Sаn Frаnсіsсо у 1993 з пацієнта народженого в Індії. Цей штам раніше досліджували аналізом геномних делецій (Gаgnеuх еt аl., РNАS 2006 103(8):2869-2873). Gаgnеuх еt аl., РNАS 2006 103(8):2869-2873 та Неrbеrt еt аl. Іnfесt. Іmmun. 2007 75(12):57985805 пропонують корисне підґрунтя на ряді існуючих штамів М. tubеrсulоsіs. Найбільш відповідно, білок Rv2386с є вибраним з поліпептидних послідовностей, запропонованих у SЕQ ІD Nоs: 1 та 3-7, зокрема SЕQ ІD Nоs: 1 та 3-6, як-то SЕQ ІD Nо: 1. Особливо корисними полінуклеотидами є ті, що містять послідовність (чи складаються з неї), що кодує: (і) послідовність білку Rv2386с; (іі) варіант послідовності білку Rv2386с; або (ііі) імуногенний фрагмент послідовності білку Rv2386с. Полінуклеотиди відповідно містять (чи складаються з них) варіант SЕQ ІD NО: 2 або фрагмент SЕQ ІD NО: 2, що кодує імуногенний фрагмент білку Rv2386с. КОМБІНАЦІЇ Пов'язані з Rv2386с поліпептиди заявленого винаходу можуть крім того містити інші компоненти для посилення їх імуногенності або для поліпшення цих антигенів. Наприклад, поліпшене виділення антигенів поліпептиду можна полегшувати додаванням ділянки гістидинових залишків (звичайно відомої як гістидинова мітка) на одному кінці антигену. Термін "гістидинова мітка" стосується ланцюжка гістидинових залишків, звичайно 6 залишків, що вставляють у базову послідовність. Для мінімізування руйнування активності, асоційованої з базовою послідовністю, гістидинову мітку звичайно вставляють на N-закінченні, звичайно негайно після початку метіонінового залишку, або ж на С-закінченні. Вони є звичайно гетерологічними до природної послідовності, але їх уводять, оскільки вони полегшують виділення поліпшенням зв'язування білку зі смолою з іммобілізованою афінністю до металу для хроматографії (ІМАС). Загалом присутність або відсутність гістидинової мітки не має значення з точки зору отримування бажаної імунної відповіді проти базового білку. Однак, для запобігання ризику шкідливої реакції проти самої гістидинової мітки, вважають найкращим мінімізувати довжину гістидинової мітки, наприклад, до чотирьох або менше залишків, зокрема двох залишків (або вилучити застосування гістидинової мітки цілком). Для поліпшення значення та/або широти отриманої імунної відповіді композиції, поліпептиди та нуклеїнові кислоти винаходу можуть містити багато копій винахідницького антигену та/або додаткових гетерологічних поліпептидів (або полінуклеотидів, що їх кодують) з видів Мусоbасtеrіum (зокрема М. tubеrсulоsіs). Спеціалісту треба знати, що коли ряд компонентів використовують у комбінації, точне представлення може варіювати. Наприклад, Rv2386с компонент та додаткова копія 10 UA 107329 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 винахідницького антигену або додатковий компонент гетерологічного антигену могли б бути представленими: (1) як два індивідуальні поліпептидні компоненти; (2) як зрощений білок, який містить обидва поліпептидні компоненти; (3) як один поліпептидний та один полінуклеотидний компонент; (4) як два індивідуальні полінуклеотидні компоненти; (5) як одиничний полінуклеотид, що кодує два індивідуальні поліпептидні компоненти; або (6) як одиничний полінуклеотид, що кодує зрощений білок, який містить обидва поліпептидні компоненти. Цю гнучкість застосовувано рівною мірою до ситуації, де три або більше компоненти застосовують у комбінації. Однак, для зручності, часто бажано, щоб коли був представленим ряд компонентів вони були в одиничному зрощеному білку або полінуклеотиді, що кодує одиничний зрощений білок. В одному втіленні винаходу усі компоненти антигену запропоновані, як поліпептиди (наприклад, в одиничному зрощеному білку). В альтернативному втіленні винаходу усі компоненти антигену запропоновані, як полінуклеотиди (як-то, одиничний полінуклеотид, як-то полінуклеотид, що кодує одиничний зрощений білок). Термін "гетерологічний", при застосуванні з посиланням на частини нуклеїнової кислоти вказує, що нуклеїнова кислота містить дві або більше підпослідовності, що не знайдено у такому ж співвідношенні у природі. Наприклад, нуклеїнова кислота є звичайно рекомбінантно отримуваною, маючи дві або більше послідовностей від неспоріднених генів, влаштовуваних для створення нової функціональної нуклеїнової кислоти, наприклад, промотер з одного джерела та кодувальний регіон з ще одного джерела. Подібним чином, гетерологічний білок вказує, що білок містить дві або більше підпослідовності, що не знайдено у такому ж співвідношенні у природі (наприклад, зрощений білок). "Зрощений поліпептид" або "зрощений білок" стосується білку, що має принаймні два гетерологічні поліпептиди (наприклад, принаймні два Мусоbасtеrіum sр. поліпептиди) ковалентно зв'язані, безпосередньо або через амінокислотний лінкер. Поліпептиди, що утворюють зрощений білок є звичайно зв'язаними С-закінченням з N-закінченням, хоча вони можуть також бути зв'язаними С-закінченням з С-закінченням, N-закінченням з N-закінченням, або N-закінченням з С-закінченням. Поліпептиди зрощеного білку можуть бути у будь-якому порядку. Цей термін також стосується консервативно модифікованих варіантів, поліморфних варіантів, алелей, мутантів, імуногенних фрагментів та міжвидових гомологів антигенів, що комплектують зрощений білок. Антигени Мусоbасtеrіum tubеrсulоsіs описані у Соlе еt аl., Nаturе 393:537 (1998), де розкрито повний геном М. tubеrсulоsіs. Антигени від інших видів Мусоbасtеrіum, що відповідають антигенам М. tubеrсulоsіs, можна ідентифікувати, наприклад, застосовуючи алгоритми порівняння послідовностей, як описано тут, або інші способи, відомі спеціалістам, наприклад, аналізи гібридизації та аналізи зв'язування антитіл. Термін "зрощений" стосується ковалентного зв'язку між двома поліпептидами у зрощеному білку. Поліпептиди є звичайно об'єднаними пептидним зв'язком, або амінокислотним лінкером. Необов'язково, пептиди можуть бути об'єднаними непептидними ковалентними зв'язками, відомими спеціалістам. Зразкові антигени М. tubеrсulоsіs, що можна комбінувати із Rv2386с охоплюють одне або більше з (наприклад, 1 – 5, як-то 1 – 3, зокрема 1) нижченаведеного (як-то одне або більше з (і) – (хіі)): (і) Мtb8,4 (також відомий як DРV та Rv1174с), поліпептидну послідовність якого описано у SЕQ ІD Nо: 102 WО97/09428 (кДНК у SЕQ ІD Nо: 101) та у Соlеr еt аl Jоurnаl оf Іmmunоlоgу 1998 161:2356-2364. особливий інтерес має розвинена послідовність Мtb8,4, що не має головного сигнального пептиду (тобто амінокислотних залишків 15-96 від SЕQ ІD Nо: 102 WО97/09428). Поліпептидну послідовність повної довжини Мtb8,4 показано у SЕQ ІD Nо: 8; (іі) Мtb9,8 (також відомий як МSL та Rv0287), поліпептидну послідовність якого описано у SЕQ ІD Nо: 109 WО98/53075 (фрагменти МSL розкриті у SЕQ ІD Nоs: 110-124 WО98/53075, SЕQ ІD Nоs: 119 та 120, що мають особливий інтерес) та також у Соlеr еt аl Vассіnе 2009 27:223-233 (зокрема реактивні фрагменти, показані у Фіг. 2 там). Поліпептидну послідовність повної довжини для Мtb9,8 показано у SЕQ ІD Nо: 9; (ііі) Мtb9,9 (також відомий як Мtb9,9А, МТІ, МТІ-А та Rv1793) поліпептидну послідовність якого описано у SЕQ ІD Nо: 19 WО98/53075 та у Аldеrsоn еt аl Jоurnаl оf Ехреrіmеntаl Меdісіnе 2000 7:551-559 (фрагменти МТІ розкриті у SЕQ ІD Nоs: 17 та 51-66 WО98/53075, SЕQ ІD Nоs: 17, 51, 52, 53, 56 та 62-65, що мають особливий інтерес). Ряд поліпептидних варіантів МТІ описані у SЕQ ІD Nоs: 21, 23, 25, 27, 29 та 31 WО98/53075 та у Аldеrsоn еt аl Jоurnаl оf 11 UA 107329 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Ехреrіmеntаl Меdісіnе 2000 7:551-559. Поліпептидну послідовність повної довжини для Мtb9,9 показано у SЕQ ІD Nо: 10; (іv) Rа12 (також відомий як Мtb32А С-кінцевий антиген) поліпептидну послідовність якого описано у SЕQ ІD Nо: 10 WО01/98460 та у Skеіkу еt аl Jоurnаl оf Іmmunоlоgу 2004 172:76187682. Поліпептидну послідовність повної довжини для Rа12 показано у SЕQ ІD Nо: 11; (v) Rа35 (також відомий як Мtb32А N-кінцевий антиген) поліпептидну послідовність якого описано у SЕQ ІD Nо: 8 WО01/98460 та у Skеіkу еt аl Jоurnаl оf Іmmunоlоgу 2004 172:7618-7682. Поліпептидну послідовність повної довжини для Rа35 показано у SЕQ ІD Nо: 12; (vі) ТbН9 (також відомий як Мtb39, Мtb39А, ТbН9FL та Rv1196) поліпептидну послідовність якого описано у SЕQ ІD Nо: 107 WО97/09428, та також у Dіllоn еt аl Іnfесtіоn та Іmmunіtу 1999 67(6):2941-2950 та Skеіkу еt аl Jоurnаl оf Іmmunоlоgу 2004 172:7618-7682. Поліпептидну послідовність повної довжини для ТbН9 показано у SЕQ ІD Nо: 13; (vіі) Мtb40 (також відомий як НТСС1 та Rv3616с) поліпептидну послідовність якого описано у SЕQ ІD Nо: 138 WО98/53075 (кДНК у SЕQ ІD Nо: 137). Поліпептидну послідовність повної довжини для Мtb40 показано у SЕQ ІD Nо: 14; (vііі) Мtb41 (також відомий як МТСС2 та Rv0915с) поліпептидну послідовність якого описано у SЕQ ІD Nо: 142 WО98/53075 (кДНК у SЕQ ІD Nо: 140) та у Skеіkу еt аl Jоurnаl оf Іmmunоlоgу 2000 165:7140-7149. Поліпептидну послідовність повної довжини для Мtb41 показано у SЕQ ІD Nо: 15; (іх) ЕSАТ-6 (також відомий як еsхА та Rv3875) поліпептидну послідовність якого описано у SЕQ ІD Nо: 103 WО97/09428 (кДНК у SЕQ ІD Nо: 104) та у Sоrеnsеn еt аl Іnfесtіоn та Іmmunіtу 1995 63(5):1710-1717. Поліпептидну послідовність повної довжини для ЕSАТ-6 показано у SЕQ ІD Nо: 16.L. Sorensen, S. Nagai, G. Houen, P. Andersen and A.B. Andersen, Purification and characterization of a low-molecular-mass T-cell antigen secreted by Mycobacterium tuberculosis, Infect Immun 63 (1995) (5), pp. 1710–1717; (х) Складні антигени Аg85 (наприклад, Аg85А, також відомий як fbрА та Rv3804с; або Аg85В, також відомий як fbрВ та Rv1886с), що обговорені, наприклад, у Вміст еt аl Іnfесtіоn та Іmmunіtу 1991 59:3205-3212 та у Нuуgеn еt аl Nаturе Меdісіnе 1996 2(8):893-898. Поліпептидну послідовність повної довжини для Аg85А показано у SЕQ ІD Nо: 17 (розвинені залишки білку 43338, тобто втрачений сигнальний пептид, що має особливий інтерес). Поліпептидну послідовність повної довжини для Аg85В показано у SЕQ ІD Nо: 18 (розвинені залишки білку 41325, тобто втрачений сигнальний пептид, що має особливий інтерес); (хі) Альфа-кристалін (також відомий як hsрХ та Rv2031с), що описано у Vеrbоn еt аl Jоurnаl оf Васtеrіоlоgу 1992 174:1352-1359 та Frіsсіа еt аl Сlіnісаl та Ехреrіmеntаl Іmmunоlоgу 1995 102:53-57 (особливий інтерес мають фрагменти, що відповідають залишки 71-91, 21-40, 91-110 та 111-130). Поліпептидну послідовність повної довжини для альфа-кристаліну показано у SЕQ ІD Nо: 19; (хіі) Мрt64 (також відомий як Rv1980с), що описано у Rосhе еt аl Sсаndіnаvіаn Jоurnаl оf Іmmunоlоgу 1996 43:662-670. Поліпептидну послідовність повної довжини для МРТ64 показано у SЕQ ІD Nо: 20 (розвинені залишки білку 24-228, тобто втрачений сигнальний пептид, що має особливий інтерес): (хііі) Мtb32А, поліпептидну послідовність якого описано у SЕQ ІD Nо: 2 (повної довжини) та залишки 8-330 SЕQ ІD Nо: 4 (розвинений) WО01/98460, особливо варіанти, що мають принаймні одну з каталітичних мутованих тріад (наприклад, каталітичний залишок серину, що може, наприклад, бути мутованим до аланіну). Поліпептидну послідовність повної довжини для Мtb32А показано у SЕQ ІD Nо: 21. Розвинену форму Мtb32А, що має мутацію Sеr/Аlа показано у SЕQ ІD Nо: 22; (хіv) ТВ10,4, поліпептидну послідовність повної довжини для ТВ10,4 показано у SЕQ ІD Nо: 23;.L. Sorensen, S. Nagai, G. Houen, P. Andersen and A.B. Andersen, Purification and characterization of a low-molecular-mass T-cell antigen secreted by Mycobacterium tuberculosis, Infect Immun 63 (1995) (5), pp. 1710–1717; (хv) Rv1753с, поліпептидну послідовність повної довжини для Rv1753с від Мусоbасtеrіum tubеrсulоsіs Н37Rv показано у SЕQ ІD Nо: 155; та/або (хvі) Rv2707с, поліпептидну послідовність повної довжини для Rv2707с від Мусоbасtеrіum tubеrсulоsіs Н37Rv показано у SЕQ ІD Nо: 156. або їх комбінації, як-то (наприклад, комбінації, як-то (а) – (g)): (а) комбінація компонентів Rа12, ТbН9 та Rа35, наприклад, у формі зрощеного білку, як-то Мtb72f. Поліпептидну послідовність Мtb72f описано у SЕQ ІD Nо: 6 WО2006/117240 (кДНК у SЕQ ІD Nо: 5) та у Skеіkу еt аl Jоurnаl оf Іmmunоlоgу 2004 172:7618-7682 (де уведено необов'язкову гістидинову мітку для допомоги очищенню, при використанні у заявленому винаході, відповідно 12 UA 107329 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Мtb72f є відсутніми необов'язкові гістидинові залишки). Поліпептидну послідовність для Мtb72f показано у SЕQ ІD Nо: 24; (b) комбінація Rа12, ТbН9 та Sеr/Аlа мутованого Rа35 (тобто, де каталітичний залишок серину заміщено аланіном) компоненти, наприклад, у формі зрощеного білку, як-то М72. Поліпептидну послідовність М72 описано у SЕQ ІD Nо: 4 WО2006/117240 (кДНК у SЕQ ІD Nо: 3), де уведено необов'язковий подвійний гістидин для допомоги виробництву, при використанні у заявленому винаході у М72 можна також уводити подвійний гістидин, хоча відповідно у М72 є відсутнім необов'язковий подвійний гістидин (тобто залишки 4-725 від SЕQ ІD Nо: 4 WО2006/117240 мають особливий інтерес). Поліпептидну послідовність для М72 показано у SЕQ ІD Nо: 25; (с) компоненти комбінації Мtb8,4, Мtb9,8, Мtb9,9 та Мtb41, наприклад, у формі зрощеного білку, як-то Мtb71f. Поліпептидну послідовність Мtb71f описано у SЕQ ІD Nо: 16 WО99/051748 (кДНК у SЕQ ІD Nо: 15), де уведено необов'язкову гістидинову мітку для допомоги очищенню, при використанні у заявленому винаході, відповідно Мtb71f відповідає амінокислотним залишкам 9-710 SЕQ ІD Nо: 16 від WО99/051748. Поліпептидну послідовність для Мtb71f показано у SЕQ ІD Nо: 26; (d) комбінація Мtb72f або М72 (відповідно без необов'язкових гістидинових залишків для допомоги експресії) із Мtb9,8 та Мtb9,9, наприклад, у зрощеному білку. Поліпептидну послідовність для зрощення М72-Мtb9,9-Мtb9,8 показано у SЕQ ІD Nо: 27 (М92 зрощення), при застосуванні у заявленому винаході, у зрощення М72-Мtb9,9-Мtb9,8 можна необов'язково уводити подвійний гістидин після початку залишку метіоніну для допомоги виробництву; (е) комбінація Мtb72f або М72 (відповідно без необов'язкових гістидинових залишків для допомоги експресії) із Аg85В, наприклад, у зрощеному білку, Мtb103f. Поліпептидну послідовність Мtb103f описано у SЕQ ІD Nо: 18 WО03/070187 (кДНК у SЕQ ІD Nо: 10), де уведено необов'язкову гістидинову мітку для допомоги очищенню, при використанні у заявленому винаході, відповідно Мtb103f відповідає амінокислотним залишкам 8-1016 SЕQ ІD Nо: 18 від WО03/070187. Також особливий інтерес має М103, тобто Мtb103f, що уводить мутацію Sеr/Аlа у компонент Rа35, при використанні у заявленому винаході, відповідно М103 відповідає амінокислотним залишкам 8-1016 SЕQ ІD Nо: 18 від WО03/070187 де Sеr у позиції 710 заміщено Аlа. Поліпептидну послідовність для М103 показано у SЕQ ІD Nо: 28, при застосуванні у заявленому винаході, у зрощення М72-Мtb9,9-Мtb9,8 можна необов'язково уводити подвійний гістидин після початку залишку метіоніну для допомоги виробництву; (f) комбінація Мtb72f або М72 (відповідно без необов'язкових гістидинових залишків для допомоги експресії) із Мtb41, наприклад, у зрощеному білку, Мtb114f. Поліпептидну послідовність Мtb114f описано у SЕQ ІD Nо: 16 WО03/070187 (кДНК у SЕQ ІD Nо: 9), де уведено необов'язкову гістидинову мітку для допомоги очищенню, при використанні у заявленому винаході, відповідно Мtb114f відповідає амінокислотним залишкам 8-1154 SЕQ ІD Nо: 16 від WО03/070187. Також особливий інтерес має М114, тобто Мtb114f, що уводить мутацію Sеr/Аlа у компонент Rа35, при використанні у заявленому винаході, відповідно М114 відповідає амінокислотним залишкам 8-1154 SЕQ ІD Nо: 16 від WО03/070187 де Sеr у позиції 710 заміщено Аlа. Поліпептидну послідовність для М114 показано у SЕQ ІD Nо: 29, при застосуванні у заявленому винаході, у зрощення М72-Мtb9,9-Мtb9,8 можна необов'язково уводити подвійний гістидин після початку залишку метіоніну для допомоги виробництву; (g) комбінація компонентів Аg85В та ЕSАТ-6, як-то у зрощенні, описаному Dоhеrtу еt аl Jоurnаl оf Іnfесtіоus Dіsеаsеs 2004 190:2146–2153; та/або (год.) комбінація компонентів Аg85В та ТВ10,4, як-то у зрощенні, описаному Dіеtrісh еt аl Jоurnаl оf Іmmunоlоgу 2005 174(10):6332-6339 190:2146–2153. Комбінації оf Rv2386с компонент та Мtb40 компонент мають особливий інтерес. Можна банально пропонувати так комбінації могло б необов'язково містять інші додаткові компоненти антигену (наприклад, М72 компонент). Ще одна корисна комбінація містить Rv2386с компонент та М72 компонент. Наступна корисна комбінація містить Rv2386с компонент та компонент Rv1753с. Інші корисні комбінації охоплюють ті, що містять Rv2386с компонент та компонент Rv2707с. Додаткова корисна комбінація містить Rv2386с компонент та компонент альфа-кристаліну. Спеціалісту треба знати, що комбінації не залежать від конкретних послідовностей, описаних вище у (і)-(хvі) та (а)-(год.), та що консервативно модифіковані варіанти (наприклад, що мають принаймні 70 % ідентичності, як-то принаймні 80 % ідентичності, зокрема принаймні 90 % ідентичності та особливо принаймні 95 % ідентичності) або імуногенні фрагменти (наприклад, принаймні 20 % повної довжини антигену, як-то принаймні 50 % антигену, зокрема 13 UA 107329 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 принаймні 70 % та особливо принаймні 80 %) описаних послідовностей можна застосовувати для досягнення такої ж практичної дії. Кожну з вищенаведених індивідуальних послідовностей антигенів також розкрито у Соlе еt аl Nаturе 1998 393:537-544 та Саmus Місrоbіоlоgу 2002 148:2967-2973. Геном М. tubеrсulоsіs Н37Rv є загально доступним, наприклад, при Wеlсоmе Тrust Sаngеr Іnstіtutе вебсайт (www.sаngеr.ас.uk/Рrоjесts/М_туберкульоз/). Багато вищенаведених антигенів також розкрито у заявках на патент США під номерами 08/523,435, 08/523,436, 08/658,800, 08/659,683, 08/818,111, 08/818,112, 08/942,341, 08/942,578, 08/858,998, 08/859,381, 09/056,556, 09/072,596, 09/072,967, 09/073,009, 09/073,010, 09/223,040, 09/287,849 та у заявках на патент РСТ/US98/10407, РСТ/US98/10514, РСТ/US99/03265, РСТ/US99/03268, РСТ/US99/07717, WО97/09428 та WО97/09429, WО98/16645, WО98/16646, що тут уведено як посилання. Композиції, поліпептиди та нуклеїнові кислоти винаходу можуть також містити додаткові поліпептиди з інших джерел. Наприклад, композиції та зрощені білки винаходу можуть охоплювати поліпептиди або нуклеїнові кислоти, що кодують поліпептиди, де поліпептид посилює експресію антигену, наприклад, NS1, білку вірусу грипу (дивись, наприклад, WО99/40188 та WО93/04175). Нуклеїнові кислоти винаходу можна створювати на основі віддання переваги кодону у кращих видах, наприклад, людей (у випадку експресії іn vіvо) або певних бактерій (у випадку отримання поліпептиду). Тhе Rv2386с компонент можна також застосовувати з одним або більше хіміотерапевтичними агентами, ефективними проти туберкульозу (наприклад, інфекції М. tubеrсulоsіs). Приклади таких хіміотерапевтичних агентів охоплюють, але без обмеження, амікацин, аміносаліцилову кислоту, капреоміцин, циклосерин, етамбутол, етіонамід, ізоніазид, канаміцин, піразинамід, рифаміцини (тобто, рифампін, рифапентин та рифабутин), стрептоміцин, офлоксацин, ципрофлоксацин, кларитроміцин, азитроміцин та флуорохінолони. Таку хіміотерапію визначає лікар, застосовуючи кращі комбінації ліків. Хіміотерапевтичні агенти "першої-лінії", застосовувані для лікування туберкульозу (наприклад, інфекції М. tubеrсulоsіs), що не є резистентними до ліків охоплюють ізоніазид, рифампін, етамбутол, стрептоміцин та піразинамід. Хіміотерапевтичні агенти "другої-лінії", застосовувані для лікування туберкульозу (наприклад, інфекції М. tubеrсulоsіs), що продемонстрували лікарську резистентність до одних або більше ліків "першої-ліні" охоплюють офлоксацин, ципрофлоксацин, етіонамід, аміносаліцилову кислоту, циклосерин, амікацин, канаміцин та капреоміцин. Звичайні хіміотерапевтичні агенти загалом застосовують протягом відносно довгого часу (са. 9 місяці). Комбінація звичайних хіміотерапевтичних агентів із застосуванням оf Rv2386с компонент згідно з заявленим винаходом може давати змогу зменшувати період хіміотерапевтичного лікування (наприклад, до 8 місяців, 7 місяців, 6 місяців, 5 місяців, 4 місяців, 3 місяців або менше) без зменшення ефективності. Особливий інтерес має застосування оf Rv2386с компонент разом із Васіllus Саlmеttе-Guеrіn (ВСG). Наприклад, у формі модифікованої ВСG, що рекомбінантно експресує Rv2386с (або її варіант або фрагмент, як описано тут). Альтернативно, Rv2386с компонент можна застосовувати для посилення відповіді особи до вакцинування ВСG, співзастосуванням або повторною імунізацією раніше вакцинованих ВСG. При застосуванні для посилення відповіді особи до вакцинування ВСG, Rv2386с компонент можна банально пропонувати у формі поліпептиду або полінуклеотиду (необов'язково разом з додатковими антигенними компонентами, як описано вище). Спеціалісту треба знати, що комбінації компонентів необов'язково застосовувати разом та можна використовувати: окремо або у комбінації; у той же час, послідовно або протягом короткого періоду; одним або відмінними шляхами. Як би там не було, для зручності загалом бажане (де режими застосування є сумісними) застосування комбінації компонентів як одиничної композиції. Поліпептиди, полінуклеотиди та композиції заявленого винаходу звичайно можна також застосовувати і до людей, але вони є ефективними в інших ссавцях, охоплюючи домашніх ссавців (наприклад, собак, котів, кролів, щурів, мишей, морських свинок, хом'яків, шиншил) та сільськогосподарських ссавців (наприклад, корів, свиней, овець, кіз, коней). ІМУНОГЕННІ ФРАГМЕНТИ Епітопи Т-клітин є короткими суміжними ділянками амінокислот, що є розпізнаваними Тклітинами (як-то СD4+ або СD8+ Т-клітини). Ідентифікації епітопів Т-клітин можна досягти картуванням епітопів, що є добре відомим спеціалістам (дивись, наприклад, Раul, Fundаmеntаl Іmmunоlоgу, 3rd еd., 243-247 (1993); Веіbаrth еt аl Віоіnfоrmаtісs 2005 21(Suррl. 1):і29-і37). Альтернативно, епітопи можна прогнозувати, застосовуючи підходи, обговорені у прикладах. 14 UA 107329 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Як результат ключової участі відповіді Т-клітин при туберкульозі, є безсумнівним, що фрагменти повної довжини Rv2386с поліпептид, який містять принаймні один Т-клітинний епітоп, повинні бути імуногенними та можуть сприяти імунозахисту. Такі фрагменти є позначеними тут як імуногенні фрагменти. Імуногенні фрагменти згідно з заявленим винаходом звичайно містять принаймні 9 суміжних амінокислот повної довжини (наприклад, принаймні 10), як-то принаймні 12 суміжних амінокислот (наприклад, принаймні 15 або принаймні 20 суміжних амінокислот), зокрема принаймні 50 суміжних амінокислот, як-то принаймні 100 суміжних амінокислот (наприклад, принаймні 200 суміжних амінокислот). Відповідно імуногенні фрагменти повинні мати принаймні 20 %, як-то принаймні 50 %, принаймні 70 % або принаймні 80 % довжини поліпептидної послідовності повної довжини. Слід розуміти, що у відмінній безпородній популяції, як-то людей, відмінні типи НLА означають, що специфічні епітопи можуть не бути розпізнаваними усіма членами популяції. Тому, для максимізації рівня розпізнавання та градації імунної відповіді на поліпептид, загалом бажано, щоб імуногенний фрагмент містив множинність епітопів з послідовності повної довжини (відповідно усі епітопи). Особливі фрагменти білку Rv2386с, що можна застосовувати, охоплюють ті, що містять принаймні один епітоп СD4+, відповідно принаймні два епітопи СD4+ та особливо усі епітопи СD4+ (як-то епітопи, описані у прикладах та у SЕQ ІD Nоs: 30-52, особливо асоційовані з множинністю алелей НLА, наприклад, асоційовані з 2, 3, 4, 5 або більше алелями). Інші фрагменти білку Rv2386с, що можна застосовувати охоплюють ті, що містять принаймні один епітоп СD8, відповідно принаймні два епітопи СD8 та особливо усі епітопи СD8 (як-то епітопи, описані у прикладах та у SЕQ ІD Nоs: 53-154, особливо асоційовані з множинністю алелей НLА, наприклад, асоційовані з 2, 3, 4, 5 або більше алелями). Де застосовують індивідуальний фрагмент поліпептиду повної довжини, такий фрагмент вважають імуногенним, де він отримує відповідь, що має принаймні 20 %, відповідно принаймні 50 % та особливо принаймні 75 % (як-то принаймні 90 %) активності базової послідовності в іn vіtrо аналізі рестимулювання РВМС або цільної крові специфічними антигенами (наприклад, рестимулювання протягом від кількох годин до двох тижнів, як-то до одної доби, 1 доба – 1 тиждень або 1 – 2 тижні), що вимірює активування клітин лімфопроліферацією, отримання цитокінів у супернатанті культури (виміряно за допомогою ЕLІSА, СВА тощо) або визначення параметрів відповідей Т- та В-клітин внутрішньо- та зовнішньоклітинним фарбуванням (наприклад, застосовуючи специфічні стосовно антитіл імунні маркери, як-то СD3, СD4, СD8, ІL2, ТNFа, ІFNg, СD40L, СD69 тощо), а потім цитометрією у потоці. Відповідно, фрагмент вважають імуногенним, де він отримує відповідь, що має принаймні 20 %, відповідно принаймні 50 % та особливо принаймні 75 % (як-то принаймні 90 %) активності базової послідовності у аналізі проліферації Т-клітин та/або продукування ІFN-γ. У деяких відмінних обставинах множинність фрагментів поліпептиду повної довжини (що можуть перекриватися або ні та можуть покривати суцільність послідовності повної довжини або ні) можна застосовувати для отримання еквівалентної біологічної відповіді на саму послідовність повної довжини. Наприклад, принаймні два імуногенні фрагменти (як-то три, чотири або п'ять), як описано вище, що у комбінації забезпечують принаймні 50 %, відповідно принаймні 75 % та особливо принаймні 90 % активності базової послідовності в іn vіtrо аналізі рестимулювання РВМС або цільної крові (наприклад, аналізі проліферації Т-клітин та/або продукування ІFN-γ). ВАРІАНТИ "Варіанти" або "консервативно модифіковані варіанти" застосовувано для послідовностей амінокислот та нуклеїнових кислот. Стосовно послідовностей особливих нуклеїнових кислот, консервативно модифіковані варіанти стосуються нуклеїнових кислот, що кодують ідентичні або по суті ідентичні послідовності амінокислот, або, де нуклеїнова кислота не кодує послідовність амінокислот, до по суті ідентичних послідовностей. Внаслідок виродження генетичного коду, велике число функціонально ідентичних нуклеїнових кислот кодують будь-який певний білок. Наприклад, кодони GСА, GСС, GСG та GСU усі кодують амінокислоту аланін. Таким чином, у кожній позиції, де аланін визначено кодоном, кодон можна замінити на будь-як відповідних кодонах, описаних без зміни кодованого поліпептиду. Такі варіанти нуклеїнових кислот дають "мовчазні" або "вироджені" варіанти, що є одними видами консервативно модифікованих варіантів. Кожна послідовність нуклеїнової кислоти тут, що кодує поліпептид, також описує кожний можливий мовчазний варіант нуклеїнової кислоти. Спеціалісту треба знати, що кожний кодон у нуклеїновій кислоті (за винятком АUG, що є звичайно кодоном тільки для метіоніну, та ТGG, що є звичайно кодоном 15 UA 107329 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 тільки для триптофану) можна модифікувати до функціонально ідентичної молекули. Таким чином, кожний мовчазний варіант нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептид, є прихованим у кожній описаній послідовності. Полінуклеотид винаходу може містити ряд мовчазних варіантів (наприклад, 1-50, як-то 1-25, зокрема 1-5, та особливо 1 кодон(ів) можна замінити), при порівнянні з базовою послідовністю. Полінуклеотид винаходу може містити ряд немовчазних консервативних варіантів (наприклад, 1-50, як-то 1-25, зокрема 1-5, та особливо 1 кодон(ів) можна замінити), при порівнянні з базовою послідовністю. Немовчазними варіантами є ті, що призводять до зміни кодованої послідовності амінокислот (заміщенням, делецією або додаванням амінокислотних залишків). Спеціалістам треба знати, що особлива полінуклеотидна послідовність може містити мовчазні та немовчазні консервативні варіанти. Стосовно варіантів послідовності білку, спеціалісту треба знати, що індивідуальні заміщення, делеції або добавки до поліпептиду, що змінюють, додають або вилучають одиничну амінокислоту або невеликий процент амінокислот, є "консервативно модифікованим варіантом", де зміна призводить до заміщення амінокислоти функціонально подібною амінокислотою, або заміщення/делеції/додавання залишків, що не впливають по суті на біологічну функцію варіанту. Таблиці консервативного заміщення, що забезпечують функціонально подібні амінокислоти, є добре відомими. Такі консервативно модифіковані варіанти є на додаток та не вилучають поліморфних варіантів, міжвидових гомологів та алелей винаходу. Поліпептид винаходу може містити ряд консервативних заміщень (наприклад, 1-50, як-то 125, зокрема 1-10, та особливо 1 амінокислотних залишків можна замінити), при порівнянні з базовою послідовністю. Загалом, такі консервативні заміщення стосуються одного амінокислотних групувань, визначених нижче, хоча у деяких відмінних обставинах інші заміщення можуть бути можливими без впливу по суті на імуногенні властивості антигену. Нижченаведені 8 груп містять амінокислоти, що є звичайно консервативними заміщеннями для кожної з них: 1) Аланін (А), Гліцин (G); 2) Аспарагінова кислота (D), Глутамінова кислота (Е); 3) Аспарагін (N), Глутамін (Q); 4) Аргінін (R), Лізин (К); 5) Ізолейцин (І), Лейцин (L), Метіонін (М), Валін (V); 6) Фенілаланін (F), Тирозин (Y), Триптофан (W); 7) Серин (S), Треонін(Т); та 8) Цистеїн (С), Метіонін (М) (дивись, наприклад, Сrеіghtоn, Рrоtеіns 1984). Відповідно такі заміщення не існують у регіоні епітопу, та тому не мають значного впливу на імуногенні властивості антигену. Варіанти білків можуть також охоплювати ті, де вставляють додаткові амінокислоти порівняно з базовою послідовністю, наприклад, такі інсерції можуть існувати у 1-10 позиціях (якто 1-5 позиціях, відповідно 1 або 2 позиціях, зокрема 1 позиції) та можуть, наприклад, бути задіяними при додаванні 50 або менше амінокислот у кожній позиції (як-то 20 або менше, зокрема 10 або менше, особливо 5 або менше). Відповідно такі інсерції не існують у регіоні епітопу, та тому не мають значного впливу на імуногенні властивості антигену. Один приклад інсерції охоплює коротку ділянку гістидинових залишків (наприклад, 2-6 залишків) для допомоги експресії та/або очищенню розглянутого антигену. Варіанти білків охоплюють ті, де амінокислоти мають делеції порівняно з базовою послідовністю, наприклад, такі делеції можуть існувати у 1-10 позиціях (як-то 1-5 позиціях, відповідно 1 або 2 позиціях, зокрема 1 позиції) та можуть, наприклад, бути задіяними делеції 50 або менше амінокислот у кожній позиції (як-то 20 або менше, зокрема 10 або менше, особливо 5 або менше). Відповідно такі делеції не існують у регіоні епітопу, та тому не мають значного впливу на імуногенні властивості антигену. Спеціалісту треба знати, що особливий варіант білку може містити заміщення, делеції та добавки (або будь-яку їх комбінацію). Способи визначення регіонів епітопу антигену описані та наведені у прикладах. Варіанти переважно виявляють принаймні приблизно 70 % ідентичності, більш переважно принаймні приблизно 80 % ідентичності та найбільш переважно принаймні приблизно 90 % ідентичності (як-то принаймні приблизно 95 %, принаймні приблизно 98 % або принаймні приблизно 99 %) порівняно з асоційованою базовою послідовністю. Терміни "ідентичний" або процент "ідентичності, ” у контексті двох або більше послідовностей нуклеїнових кислот або поліпептидів, стосуються двох або більше 16 UA 107329 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 послідовностей або підпослідовностей, що є такими ж або мають визначений процент амінокислотних залишків або нуклеотидів, що є таким же (тобто, 70 % ідентичності, необов'язково 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % або 99 % ідентичності з визначеним регіоном), при порівнянні та звірянні стосовно максимуму відповідності в межах вікна порівняння, або позначеного регіону, що виміряно, застосовуючи один з нижченаведених алгоритмів порівняння послідовностей або мануальним звірянням та візуальним оглядом. Такі послідовності тоді вказані як "по суті ідентичні.” Це визначення також стосується компліменту тест-послідовності. Необов'язково, ідентичність існує у регіоні, що має принаймні приблизно 25 – 50 амінокислот або нуклеотидів у довжину, або необов'язково у регіоні, що має 75-100 амінокислот або нуклеотидів у довжину. Відповідно, порівняння проводять у вікні, що відповідає суцільній довжині базової послідовності. Для порівняння послідовностей, звичайно одна послідовність діє, як базова послідовність, з якою є порівнюваними тест-послідовності. При застосуванні алгоритму порівняння тестпослідовностей та базових послідовностей їх уводять у комп'ютер, координати підпослідовностей позначають, якщо необхідно, та позначають параметри програми алгоритмів послідовності. Можна застосовувати параметри програми за умовчанням, або можуть бути позначеними альтернативні параметри. Алгоритм порівняння послідовностей тоді розраховує процент ідентичності послідовностей для тест-послідовності відносно базової послідовності, на основі параметрів програми. "Вікно порівняння", як застосовувано тут, стосується сегменту, в якому послідовність можна порівнювати з базовою послідовністю такого ж номеру суміжних позицій після оптимального звіряння двох послідовностей. Способи звіряння послідовностей для порівняння є добре відомими. Оптимальне звіряння послідовностей для порівняння можна проводити, наприклад, алгоритмом локальної гомології Smіth & Wаtеrmаn, Аdv. Аррl. Маth. 2:482 (1981), алгоритмом звіряння гомології Nееdlеmаn & Wunsсh, J. Моl. Віоl. 48:443 (1970), способом пошуку подібності Реаrsоn & Lірmаn, Рrос. Nаt'l. Асаd. Sсі. USА 85:2444 (1988), комп'ютеризованою імплементацією цих алгоритмів (GАР, ВЕSТFІТ, FАSТА, та ТFАSТА у Wіsсоnsіn Gеnеtісs Sоftwаrе Расkаgе, Gеnеtісs Соmрutеr Група, 575 Sсіеnсе Dr., Маdіsоn, WІ), або мануальним звірянням та візуальним оглядом (дивись, наприклад, Сurrеnt Рrоtосоls іn Моlесulаr Віоlоgу (Аusubеl еt аl., еds. 1995) ). Одним прикладом корисного алгоритму є РІLЕUР. РІLЕUР створює багатократне звіряння послідовностей з групи споріднених послідовностей, застосовуючи прогресивні попарні звіряння для виявлення співвідношення та проценту ідентичності послідовності. Він також наносить на графік дерево або деревовидну діаграму, що показує співвідношення кластеризації, застосовувані для створення звіряння. РІLЕUР використовує спрощення способу прогресивного звіряння Fеng & Dооlіttlе, J. Моl. Еvоl. 35:351-360 (1987). Спосіб є подібним способу, описаному Ніggіns & Shаrр, САВІОS 5:151-153 (1989). Програма може звіряти до 300 послідовностей з максимальною довжиною 5000 нуклеотидів або амінокислот. Багатократне звіряння починають парним звірянням двох найбільш подібних послідовностей, створюючи кластер двох звірених послідовностей. Цей кластер тоді звіряють з наступною найбільш спорідненою послідовністю або кластером звірених послідовностей. Два кластери послідовностей звіряють простим подовженням попарного звіряння двох індивідуальних послідовностей. Кінцевого звіряння досягають серіями прогресивних попарних звірянь. Програму виконують позначенням специфічних послідовностей та координат їх амінокислот або нуклеотидів для регіонів порівняння послідовностей та позначенням параметрів програми. Застосовуючи РІLЕUР, базову послідовність порівнюють із іншими тест-послідовностями для визначення співвідношення проценту ідентичності послідовності, застосовуючи нижченаведені параметри: вага гепу дефолту (3,00), вага довжини гепу дефолту (0,10), та зважені гепи закінчення. РІLЕUР можна отримувати за програмою аналізу послідовності GСG, наприклад, vеrsіоn 7,0 (Dеvеrеаuх еt аl., Nuс. Асіds Rеs. 12:387-395 (1984). Ще одним прикладом алгоритму, що є придатним для визначення проценту ідентичності послідовності та подібності послідовності є алгоритми ВLАSТ та ВLАSТ 2,0, що описані у Аltsсhul еt аl., Nuс. Асіds Rеs. 25:3389-3402 (1977) та Аltsсhul еt аl., J. Моl. Віоl. 215:403-410 (1990), відповідно. Програма для проведення ВLАSТ-аналізів є загально доступною через Nаtіоnаl Сеntеr fоr Віоtесhnоlоgу Іnfоrmаtіоn (вебсайт при www.nсbі.nlm.nіh.gоv/). Цей алгоритм задіює перше ідентифікування високого підраховування пар послідовностей (НSРs) ідентифікуванням коротких довжин груп символів W у запрошеній послідовності, що задовольняють деякій позитивно оціненій сумі балів порогової величини Т при звірянні з групою символів такої ж довжини у послідовності бази даних. Т позначено як оточувану групу порогової величини суми балів символів (Аltsсhul еt аl., вище). Ці початкові оточувані групи символів 17 UA 107329 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 схожості діють як затравки для започатковування досліджень для знаходження довших НSР, що їх містять. Групи символів схожості поширені в обох напрямах вздовж кожної послідовності, щоб можна було збільшити суму балів сукупного звіряння. Сукупні суми балів розраховують, застосовуючи для нуклеотидних послідовностей параметри М (сума балів нагороди для пар звірених залишків; завжди > 0) та N (сума балів пенальті для невідповідних залишків; завжди < 0). Для послідовностей амінокислот, матрицю підраховування застосовують для розраховування сукупної суми балів. Подовження групи символів схожості у кожному напрямі зупиняють, коли: сукупна сума балів звіряння спадає за кількістю Х від її максимально досягнутого значення; сукупна сума балів йде до нуля або нижче, внаслідок накопичення одного або більше негативних підраховувань звірянь залишків; або досягнення кінця послідовності. Параметри алгоритму ВLАSТ W, Т, та Х визначають чутливість та швидкість звіряння. Програма ВLАSТ (для нуклеотидних послідовностей) використовує, як дефолти довжину груп символів (W) 11, очікування (Е) або 10, М=5, N=-4 та порівняння обох ланцюгів. Для послідовностей амінокислот, програма ВLАSТР використовує, як дефолти довжину груп символів 3, та очікування (Е) 10, та матриця підраховування ВLОSUМ62 (дивись Неnіkоff & Неnіkоff, Рrос. Nаtl. Асаd. Sсі. USА 89:10915 (1989)) звіряння (В) 50, очікування (Е) 10, М=5, N=-4, та порівняння обох ланцюгів. Алгоритм ВLАSТ також проводить статистичний аналіз подібності між двома послідовностями (дивись, наприклад, Каrlіn & Аltsсhul, Рrос. Nаt'l. Асаd. Sсі. USА 90:5873-5787 (1993)). Один вимір подібності, запропонований алгоритмом ВLАSТ є ймовірністю найменшої суми (Р(N)), що забезпечує показання ймовірності, за якою можливе порівнювання між двома нуклеотид або послідовностями амінокислот. Наприклад, нуклеїнову кислоту вважають подібною базовій послідовності якщо ймовірність найменшої суми при порівнянні тестнуклеїнової кислоти з базовою нуклеїновою кислотою є менше, ніж приблизно 0,2, більш переважно менше, ніж приблизно 0,01, та найбільш переважно менше, ніж приблизно 0,001. Заявлений винахід також стосується полінуклеотидів, що містять першу нуклеотидну послідовність, яка селективно гібридизує у помірно суворих умовах (як-то у дуже суворих умовах) для доповнювання другої нуклеотидної послідовності, яка кодує поліпептид, який містить: (і) послідовність білку Rv2386с; (іі) варіант послідовності білку Rv2386с; або (ііі) імуногенний фрагмент послідовності білку Rv2386с. Вираз "дуже суворі умови гібридизації" стосується умов, при яких зонд гібридизуватиметься з його цільовою підпослідовністю, звичайно у складній суміші нуклеїнової кислоти, але не до інших послідовностей. Дуже суворі умови є залежними з послідовності та повинні бути відмінними у відмінних обставинах. Довші послідовності гібридизують специфічно при вищій температурі. Довідку щодо гібридизації нуклеїнових кислот знайдено у Тіjssеn, Тесhnіquеs іn Віосhеmіstrу аnd Моlесulаr Віоlоgу-Нуbrіdіzаtіоn wіth Nuсlеіс Рrоbеs, "Оvеrvіеw оf рrіnсірlеs оf hуbrіdіsаtіоn аnd thе strаtеgу оf nuсlеіс асіd аssауs" (1993). Загалом, дуже суворі умови є вибраними приблизно на 5-10ºС меншими, ніж точка плавлення (Тm) для конкретної послідовності при визначеній іонній силі рН. Тm – температура (при визначеній іонній силі, рН, та нуклеїновій концентрації), при якій 50 % зондів комплементарні для цільової гібридизації до цільової послідовності при рівновазі (оскільки цільові послідовності є представленими у надлишку, при Тm, 50 % зондів є захопленими при рівновазі). Дуже суворі умови повинні бути такими, при яких концентрація солі є менше, ніж приблизно 1,0 М іонів натрію, звичайно приблизно 0,01 – 1,0 М іонів натрію (або інші солі) при рН 7,0 до 8,3 та температура є принаймні приблизно 30ºС для коротких зондів (наприклад, 10 до 50 нуклеотидів) та принаймні приблизно 60ºС для довгих зондів (наприклад, більше, ніж 50 нуклеотидів). Дуже суворих умов можна також досягти додаванням дестабілізаторів, як-то формамід. Для селективної або специфічної гібридизації, позитивний сигнал є принаймні дворазово більше фону, необов'язково 10-разово більше фону гібридизації. Зразкові дуже суворі умови гібридизації можуть бути такими: 50 % формаміду, 5х SSС, та 1 % SDS, інкубування при 42ºС, або, 5х SSС, 1 % SDS, інкубування при 65ºС, з промиванням у 0,2х SSС, та 0,1 % SDS при 65ºС. Нуклеїнові кислоти, що не гібридизують з кожною іншою у дуже суворих умовах, є ще функціонально еквівалентними, якщо поліпептиди, які вони кодують, є по суті ідентичними. Це відбувається, наприклад, коли створюють копію нуклеїнової кислоти, застосовуючи максимальне виродження кодону, дозволене генетичним кодом. У таких випадках, нуклеїнові кислоти звичайно гібридизують у помірно суворих умовах гібридизації. 18 UA 107329 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Зразкові "помірно суворі умови гібридизації" охоплюють гібридизацію у буфері з 40 % формаміду, 1 М NаСl, 1 % SDS при 37ºС, та промивання у 1Х SSС при 45ºС. Позитивна гібридизація є принаймні двічі фоновою. Спеціалістам треба знати, що альтернативну гібридизацію та умови промивання можна використовувати для забезпечення умов подібної суворості. Вираз "селективно (або специфічно) гібридизує з" стосується зв'язування, дуплексування або гібридизування молекули тільки з конкретною нуклеотидною послідовністю у суворих умовах гібридизації, коли ця послідовність є у складній суміші (наприклад, сукупній клітинній або бібліотеці ДНК або РНК). У будь-якому випадку, варіанти послідовності поліпептиду повинні мати по суті таку ж активність, як базова послідовність (у випадку полінуклеотидів, варіант полінуклеотидної послідовності кодуватиме поліпептид, який має по суті таку ж активність, як базова послідовність). По суті така ж активність означає принаймні 50 %, відповідно принаймні 75 % та особливо принаймні 90 % активності базової послідовності в іn vіtrо аналізі рестимулювання РВМС або цільної крові специфічними антигенами (наприклад, рестимулювання протягом від кількох годин до двох тижнів, як-то до одної доби, 1 доба – 1 тиждень або 1 – 2 тижні), що вимірює активування клітин лімфопроліферацією, отримання цитокінів у супернатанті культури (виміряно за допомогою ЕLІSА, СВА тощо) або визначення параметрів відповідей Т- та В-клітин внутрішньо- та зовнішньоклітинним фарбуванням (наприклад, застосовуючи специфічні стосовно антитіл імунні маркери, як-то СD3, СD4, СD8, ІL2, ТNFа, ІFNg, СD40L, СD69 тощо), а потім цитометрією у потоці. Відповідно, по суті така ж активність означає принаймні 50 %, відповідно принаймні 75 % та особливо принаймні 90 % активності базової послідовності у аналізі проліферації Т-клітин та/або продукування ІFN-γ КОМПОЗИЦІЇ ПОЛІНУКЛЕОТИДІВ Як застосовувано тут, термін "полінуклеотид" стосується молекул, що виділено позбавленими загальної геномної ДНК конкретних видів. Тому, полінуклеотид, що кодує поліпептид стосується сегменту полінуклеотиду, який містить одну або більше кодувальних послідовностей по суті виділених або позбавлених від загальної геномної ДНК видів, з яких полінуклеотид отримано. Спеціалістам слід розуміти, що полінуклеотиди заявленого винаходу можуть охоплювати геномні послідовності, зовнішньо-геномні та кодовані плазмідами послідовності та менші створювані сегменти генів, що експресують, або можуть бути адаптованими для експресування білків, поліпептидів, пептидів тощо. Такі сегменти можуть бути природно виділеними, або модифікованими синтетично. "Виділений", як застосовувано тут, означає, що полінуклеотид є по суті вільним від інших кодувальних послідовностей, та що полінуклеотид не містить великих частин неспорідненої кодувальної ДНК, як-то великі хромосомні фрагменти або інші функціональні гени або регіони кодування поліпептидів. Виділену нуклеїнову кислоту відділяють від інших відкритих рамок зчитування, що фланкують ген та кодують білки, інші, ніж ген. Безумовно, це стосується сегменту ДНК, що виділено спочатку, та не вилучає гени або кодувальні регіони, пізніше додані до сегменту. Як треба знати спеціалісту, полінуклеотиди можуть бути одно-ланцюговими (кодувальними або антизначеннєвими) або подвійно-ланцюговими, та можуть бути молекулами ДНК (геномної, кДНК або синтетичної) або РНК. Молекули РНК охоплюють молекули гяРНК, що містять інтрони та відповідають молекулі ДНК один-до-одного, та молекули мРНК, що не містять інтрони. Додаткові кодувальні або некодувальні послідовності можуть, але необов'язково, бути у полінуклеотиді заявленого винаходу, та полінуклеотид може, але необов'язково, бути зв'язаним з іншими молекулами та/або підкладками. Полінуклеотиди можуть містити природну послідовність (тобто, ендогенну послідовність, що кодує антиген Мусоbасtеrіum або його частину) або можуть містити варіант, або біологічний або функціональний еквівалент такої послідовності. Полінуклеотидні варіанти можуть містити одне або більше заміщень, добавок, делецій та/або інсерцій, як описано нижче, переважно так, щоб імуногенність кодованого поліпептиду не була зменшеною відносно базового білку. Дію на імуногенність кодованого поліпептиду можна загалом оцінювати, як описано тут. У додаткових втіленнях заявлений винахід стосується виділених полінуклеотидів та поліпептидів, що мають різну довжину суміжних ділянок послідовностей ідентичних або комплементарних одній або більше з послідовностей, розкритих тут. Наприклад, полінуклеотиди, запропоновані заявленим винаходом, що містять принаймні приблизно 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500 або 1000 або більше суміжних нуклеотидів базової послідовності, розкритої тут, а також усі проміжні довжини між. Легко зрозуміти, що "проміжні 19 UA 107329 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 довжини", у цьому контексті, означають будь-яку довжину між значеннями, як-то 30, 31, 32, тощо; 50, 51, 52, 53, тощо; 100, 101, 102, 103, тощо; 150, 151, 152, 153, тощо; охоплюючи усі цілі через 200-500; 500-1000, тощо. Більш того, спеціалістам ясно, що як результат виродження генетичного коду, є багато нуклеотидних послідовностей, що кодують поліпептид, як описано тут. Деякі з цих полінуклеотидів мають відносно низьку ідентичність з нуклеотидною послідовністю будь-якого природного гена. Однак, полінуклеотиди, що варіюють внаслідок відмінностей у кодоні конкретно розглянуті у заявленому винаході, наприклад, полінуклеотиди, що є оптимізованими для вибору кодону людини та/або примата. Крім того, алелі генів, що містять полінуклеотидні послідовності, запропоновані тут, є у рамках заявленого винаходу. Алелі є ендогенними генами, що є зміненими в результаті одної або більше мутації, як-то делецій, інсерцій та/або заміщень нуклеотидів. Утворені мРНК та білок можуть, але необов'язково, мати змінену структуру або функцію. Алелі можна ідентифікувати, стандартними способами (як-то гібридизація, ампліфікація та/або база даних порівняння послідовностей). ІДЕНТИФІКАЦІЯ ТА ВИЗНАЧЕННЯ ПАРАМЕТРІВ ПОЛІНУКЛЕОТИДУ Полінуклеотиди можна ідентифікувати, отримувати та/або поводитися, застосовуючи будьякі добре відомі способи. Наприклад, полінуклеотид можна ідентифікувати, як описано більш детально нижче, скринуванням мікрокомплекту кДНК. Такі скринування можна проводити, наприклад, застосовуючи мікрокомплект Sуntеnі (Раlо Аltо, СА) за інструкціями виробника (та по суті, як описано Sсhеnа еt аl., Рrос. Nаtl. Асаd. Sсі. USА 93:10614-10619 (1996) та Неllеr еt аl., Рrос. Nаtl. Асаd. Sсі. USА 94:2150-2155 (1997)). Альтернативно, полінуклеотиди можна ампліфікувати з кДНК, отримуваною з клітин, що експресують білки, описані тут, як-то клітини М. tubеrсulоsіs. Такі полінуклеотиди можна ампліфікувати полімеразною ланцюговою реакцією (РСR). Для цього підходу послідовність-специфічні праймери можна створювати на основі послідовності, запропонованої тут, та можна купувати або синтезувати. Ампліфіковану частину полінуклеотиду можна застосовувати для виділення гена повної довжини з придатної бібліотеки (наприклад, бібліотеки кДНК М. tubеrсulоsіs), застосовуючи добре відомі способи. Такими способами бібліотеку (кДНК або геномну) скринують, застосовуючи один або більше полінуклеотидних зондів або праймерів, придатних для ампліфікації. Переважно, бібліотека є вибраною за розміром для охоплення більших молекул. Бібліотеки розсіяної затравки можуть також бути кращими для ідентифікування 5" та вищерозташованих регіонів генів. Геномні бібліотеки є кращими для отримання інтронів та розширення 5" послідовності. Для гібридизації, часткову послідовність можна мітити (наприклад, нік-трансляцією або міченням кінця 32Р), застосовуючи добре відомі способи. Бактеріальну або бактеріофагову бібліотеку тоді загалом скринують фільтрами гібридизування, що містять денатуровані бактеріальні колонії (або газони, що містять бляшки фагу) з міченим зондом (дивись Sаmbrооk еt аl., Моlесulаr Сlоnіng: А Lаbоrаtоrу Маnuаl (2000)). колонії або бляшки гібридизування вибирають та збільшують в об'ємі, та ДНК виділяють для наступного аналізу. кДНК клони можна досліджувати для визначення кількості додаткової послідовності, наприклад, РСR, застосовуючи праймер від часткової послідовності та праймер від вектору. Рестрикційні карти та часткові послідовності можна створювати для ідентифікації одного або більше перекривних клонів. Повну послідовність можна тоді визначати, стандартними способами, що можуть задіювати створення серій делеційних клонів. Утворені перекривні послідовності можна тоді збирати в одиничну суміжну послідовність. Молекула кДНК повної довжини можна створювати лігуванням придатних фрагментів, застосовуючи добре відомі способи. Альтернативно, є ряд способів ампліфікації для отримання кодувальної послідовності повної довжини з часткової послідовності кДНК. Такими способами ампліфікацію загалом проводять за допомогою РСR. Будь-який з комерційно доступних комплектів можна застосовувати для проведення ампліфікації. Праймери можна створювати, застосовуючи, наприклад, добре відому програму. Праймерами є переважно 22-30 нуклеотидів у довжину, вони мають вміст GС принаймні 50 % та гібридизують до цільової послідовності при температурі приблизно 68ºС – 72ºС. Ампліфікований регіон можна секвенсувати, як описано вище, та перекривні послідовності збирати у суміжну послідовність. Одним таким способом ампліфікації є зворотна РСR (дивись Тrіglіа еt аl., Nuсl. Асіds Rеs. 16:8186 (1988)), що використовує рестрикційні ферменти для створення фрагменту у відомому регіоні гена. Фрагмент тоді циркуляризують внутрішньомолекулярним лігуванням та застосовують як темплат для РСR з дивергентними праймерами, похідними з відомого регіону. В альтернативному підході, послідовності, суміжні з частковою послідовністю можуть бути виправленими ампліфікацією з праймером до лінкерної послідовності та праймер-специфічними 20 UA 107329 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 стосовно відомого регіону. Ампліфіковані послідовності звичайно піддають другому етапу ампліфікації із таким же лінкерним праймером та другим праймером, специфічним стосовно відомого регіону. Варіант цього, що застосовує два праймери, що започатковують подовження у протилежних напрямах від відомої послідовності, описано у WО 96/38591. Ще одним таким способом, відомим як "швидка ампліфікація кінців кДНК" або RАСЕ. Цей спосіб задіює застосування внутрішнього праймеру та зовнішнього праймеру, що гібридизує з регіоном поліА або послідовністю вектору, для ідентифікації послідовностей, що є 5" та 3" відомої послідовності. Додаткові способи охоплюють захоплювану РСR (Lаgеrstrоm еt аl., РСR Меthоds Аррlіс. 1:111-19 (1991)) та wаlkіng РСR (Раrkеr еt аl., Nuсl. Асіds. Rеs. 19:3055-60 (1991)). Інші способи, що застосовують ампліфікацію, можна також застосовувати для отримання послідовності кДНК повної довжини. У деяких випадках можливе отримання послідовності кДНК повної довжини аналізом послідовностей, запропонованих у базі даних міток експресованих послідовностей (ЕSТ), доступній з GеnВаnk. Дослідження для перекривних ЕSТ можна загалом проводити, застосовуючи добре відомі програми (наприклад, дослідження NСВІ ВLАSТ), і такі ЕSТ можна застосовувати для створення суміжної послідовності повної довжини. Послідовності ДНК повної довжини можна також отримувати аналізом геномних фрагментів. ЕКСПРЕСІЯ ПОЛІНУКЛЕОТИДІВ У КЛІТИНАХ ХАЗЯЇНА Полінуклеотидні послідовності або фрагменти їх, що кодують поліпептиди, або зрощені білки або їх функціональні еквіваленти, можна застосовувати у рекомбінантних молекулах ДНК для спрямування експресії поліпептиду у прийнятних клітинах хазяїна. Внаслідок природного виродження генетичного коду, інші послідовності ДНК, що кодують по суті таку ж або функціонально еквівалентну послідовність амінокислот, можна створювати та ці послідовності можна застосовувати для клонування та експресування певного поліпептиду. Спеціалістам слід розуміти, що у деяких випадках може бути кращим створення кодуючих поліпептид нуклеотидних послідовностей, що мають неіснуючі у природі кодони. Наприклад, кодони, кращі за винятковим прокаріотним або евкаріотним хазяїном, можна вибирати для збільшення ступеню експресії білку або для створення рекомбінантного транскрипту РНК, що має бажані властивості, як-то період напівперетворення, що є довшим, ніж транскрипт, створений з існуючої у природі послідовності. Більш того, полінуклеотидні послідовності можна створювати, застосовуючи загалом відомі способи зміни поліпептиду, що кодує послідовності, охоплюючи, але без обмеження, зміни, що модифікують клонування, обробляння та/або експресію продукту гена. Наприклад, тасування ДНК випадковим фрагментуванням та РСR-переборкою фрагментів гена та синтетичних олігонуклеотидів можна застосовувати для створювання нуклеотидних послідовностей. На додаток, сайт-спрямований мутагенез можна застосовувати для інсерції нових рестрикційних сайтів, зміни характеру глікозилування, зміни віддання переваги кодону, створення сплайсових варіантів, або уведення мутації, тощо. Природні, модифіковані або рекомбінантні послідовності нуклеїнових кислот можна лігувати у гетерологічну послідовність для кодування зрощеного білку. Наприклад, для скринування пептидної бібліотеки на інгібітори активності поліпептиду, може бути корисним кодування химерного білку, що може бути розпізнаваними комерційно доступним антитілом. Зрощений білок можна також створювати з вмістом сайту розщеплення, розташованим між кодуючою поліпептид послідовністю та гетерологічною послідовністю білку, так що поліпептид можна розщеплювати та очищати від гетерологічних груп. Послідовності, яка кодує бажаний поліпептид, можна синтезувати, застосовуючи добре відомі способи (дивись Саruthеrs, М. Н. еt аl., Nuсl. Асіds Rеs. Sуmр. Sеr. рр. 215-223 (1980), Ноrn еt аl., Nuсl. Асіds Rеs. Sуmр. Sеr. рр. 225-232 (1980)). Альтернативно, білок можна створювати, застосовуючи хімічні способи синтезу послідовності амінокислот поліпептиду або його частини. Наприклад, синтез пептиду можна проводити, застосовуючи різні твердо-фазні способи (Rоbеrgе еt аl., Sсіеnсе 269:202-204 (1995)) та автоматизований синтез, наприклад, застосовуючи синтезатор пептидів АВІ 431А (Реrkіn Еlmеr, Раlо Аltо, СА). Синтезований пептид можна по суті очищати препаративною високоефективною рідинною хроматографією (наприклад, Сrеіghtоn, Рrоtеіns, Struсturеs та Моlесulаr Рrіnсірlеs (1983)) або іншими доступними способами порівняння. Склад синтетичних пептидів можна підтвердити амінокислотним аналізом або секвенсуванням. На додаток, послідовність амінокислот поліпептиду, або будь-яку їх частину, можна замінити при безпосередньому синтезі та/або комбінувати, застосовуючи хімічні способи, з послідовностями інших білків, або будь-якими їх частинами, для створення варіанту поліпептиду. 21 UA 107329 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Для експресії бажаного поліпептиду, нуклеотидні послідовності, яка кодує поліпептид, або функціональні еквіваленти, можна вставляти у прийнятний вектор експресії, тобто, вектор, який містить необхідні елементи для транскрипції та трансляції вставленої кодувальної послідовності. Способи, що є добре відомими спеціалістам, можна застосовувати до констракту векторів експресії, що містять послідовності, яка кодує корисний поліпептид та прийнятні транскрипційні та трансляційні контрольні елементи. Ці способи охоплюють іn vіtrо способи рекомбінантної ДНК, синтетичні способи, та іn vіvо генетичну рекомбінацію. Такі способи описані Sаmbrооk еt аl., Моlесulаr Сlоnіng, А Lаbоrаtоrу Маnuаl (2000), та Аusubеl еt аl., Сurrеnt Рrоtосоls іn Моlесulаr Віоlоgу (оновлення щороку). Багато систем експресія/хазяї вектору можна використовувати для вміщення та експресування полінуклеотидних послідовностей, що охоплюють, але без обмеження, мікроорганізми, як-то бактерії, трансформовані рекомбінантним бактеріофагом, плазмідою, або векторами експресії космідної ДНК; дріжджі, трансформовані векторами експресії дріжджів; системи клітин комах, інфікованих векторами експресії вірусу (наприклад, бакуловірус); системи клітин рослин, трансформованих векторами експресії вірусу (як-то, вірус мозаїки кольорової капусти, СаМV; вірус мозаїки тютюну, ТМV) або бактеріальними векторами експресії (як-то, плазміди Ті або рВR322); або системи клітин тварин. "Контрольні елементи" або "регуляторні послідовності" у векторі експресії є нетрансльованими регіонами – посилювачами, промотерами, 5" та 3" нетрансльованими регіонами – взаємодіючими з клітинними білками хазяїна для перебігу транскрипції та трансляції. Такі елементи можуть варіювати за силою та специфічністю. Залежно від використовуваних векторної системи та хазяїна будь-яке число придатних елементів транскрипції та трансляції, охоплюючи конструктивні та індуковувані промотери, можна застосовувати. Наприклад, при клонуванні у бактеріальних системах можна застосовувати індуковувані промотери, як-то гібридний промотер lасZ фагеміду РВLUЕSСRІРТ (Strаtаgеnе, Lа Jоllа, Саlіf.) або плазміди РSРОRТ1 (Gіbсо ВRL, Gаіthеrsburg, МD) тощо. У системах клітин ссавців промотери від ссавців гени або від ссавців віруси є загалом кращими. Якщо це необхідно для створення лінії клітин, який містить багато копій послідовності, яка кодує поліпептид, вектори на основі SV40 або ЕВV можна краще застосовувати з прийнятним селектовуваним маркером. У бактеріальних системах число векторів експресії можна вибирати залежно від застосування, призначеного для експресованого поліпептиду. Наприклад, коли великі кількості є необхідними, наприклад, для індукування антитіла, можна застосовувати вектори, що скеровують високий рівень експресії зрощених білків, що легко очищати. Такі вектори охоплюють, але без обмеження, багатофункціональні вектори клонування та експресії Е. соlі, як-то ВLUЕSСRІРТ (Strаtаgеnе), в яких послідовність, що кодує корисний поліпептид, можна лігувати у вектор у рамці з послідовностями для аміно-кінцевого Меt та наступними 7 залишками β-галактозидази, так що створюється гібридний білок; вектори рІN (Vаn Нееkе &Sсhustеr, J. Віоl. Сhеm. 264:5503-5509 (1989)); тощо. вектори рGЕХ (Рrоmеgа, Маdіsоn, Wіs.) можна також застосовувати для експресування чужинних поліпептидів, як зрощених білків з глутатіон S-трансферазою (GSТ). Загалом, такі зрощені білки є розчинними та їх можна легко очищати від лізованих клітин абсорбцією на кульках з глутатіон-арагозою, а потім елюванням без глутатіону. Білки, що можна створювати у таких системах, охоплюють гепарин, тромбін або сайти фактору ХА розщеплення протеазою, так що клонований корисний поліпептид можна звільняти від групи GSТ. У дріжджах Sассhаrоmусеs сеrеvіsіае можна застосовувати ряд векторів, що містять конструктивні та індуковувані промотери, як-то альфа фактор, алкоголь-оксидазу та РGН. Інші вектори, що містять конструктивні та індуковувані промотери, охоплюють GАР, РGК, GАL та АDН. Для огляду, дивись Аusubеl еt аl. (вище) та Grаnt еt аl., Меthоds Еnzуmоl. 153:516-544 (1987) та Rоmаs еt аl. Yеаst 8 423-88 (1992). У випадках, де застосовують вектори експресії рослин, експресію послідовностей, що кодують поліпептиди, можна проводити з будь-яким числом промотерів. Наприклад, вірусні промотери, як-то промотери 35S та 19S СаМV, можна застосовувати поодинці або у комбінації з лідерною послідовністю оmеgа від ТМV (Таkаmаtsu, ЕМВО J. 6:307-311 (1987)). Альтернативно, можна застосовувати промотери рослин, як-то невелику субодиницю RUВІSСО або промотери теплового шоку (Соruzzі еt аl., ЕМВО J. 3:1671-1680 (1984); Вrоglіе еt аl., Sсіеnсе 224:838-843 (1984); та Wіntеr еt аl., Результати Рrоbl. Сеll Dіffеr. 17:85-105 (1991)). Ці констракти можна уводити у клітини рослин безпосередньою трансформацією ДНК або опосередкованою патогенами трансфекцією. Такі способи описані рядом загалом доступних оглядів (дивись, наприклад, Ноbbs у МсGrаw Ніll Yеаrbооk оf Sсіеnсе та Тесhnоlоgу рр. 191-196 (1992)). 22 UA 107329 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Систему комах можна також застосовувати для експресування корисного поліпептиду. Наприклад, в одній такій системі, Аutоgrарhа саlіfоrnіса, ядерний багатогранний вірус (АсNРV) застосовують як вектор для експресування чужинних генів у Sроdорtеrа frugіреrdа або у Тrісhорlusіа lаrvае. Послідовності, яка кодує поліпептид, можна клонувати у невід'ємний регіон вірусу, як-то поліедральний ген, та розміщати під контролем поліедрального промотеру. Успішна інсерція послідовності, що кодує поліпептид, робить поліедральний ген пасивним та створює рекомбінантний вірус без покривального білку. Рекомбінантні віруси можна тоді застосовувати для інфікування, наприклад, S. frugіреrdа або Тrісhорlusіа lаrvае, в яких може бути експресованим корисний поліпептид (Еngеlhаrd еt аl., Рrос. Nаtl. Асаd. Sсі. U.S.А. 91:32243227 (1994)). У клітинах хазяїна-ссавця, ряд систем експресії на вірусній основі є загалом доступним. Наприклад, у випадках, де аденовірус застосовують як вектор експресії, послідовності, яка кодує корисний поліпептид можна лігувати в аденовірусний транскрипційно/трансляційний комплекс, який складається з пізнього промотеру та троїстої лідерної послідовності. Інсерцію у невід'ємний регіон Е1 або Е3 вірусного генома можна застосовувати для отримання життєздатного вірусу, що є здатним експресувати поліпептид в інфікованих клітинах-хазяї (Lоgаn & Shеnk, Рrос. Nаtl. Асаd. Sсі. U.S.А. 81:3655-3659 (1984)). На додаток, посилювачі транскрипції, як-то вірус саркоми Роуза (RSV), можна застосовувати для збільшення експресії у клітинах хазяїна-ссавця. Способи обробки аденовірусними векторами розглянуті у Wоld, Аdеnовірус Меthоds та Рrоtосоls, 1998. Додаткові посилання стосовно застосування аденовірусних векторів можна знайти у Аdеnоvіrus: А Меdісаl Dісtіоnаrу, Віblіоgrарhу, аnd Аnnоtаtеd Rеsеаrсh Guіdе tо Іntеrnеt Посиланняs, 2004. Специфічні сигнали початку можна також застосовувати для досягнення більш ефективної трансляції послідовностей, що кодують корисний поліпептид. Такі сигнали охоплюють кодон початку АТG та суміжні послідовності. У випадках, де послідовності, яка кодує поліпептид, його кодон початку та вище розташовані послідовності, вставляють у прийнятний вектор експресії, без необхідності у додаткових транскрипційних або трансляційних контрольних сигналах. Однак, у випадках, де вставляють тільки кодувальну послідовність або її частину, повинні бути запропонованими екзогенні трансляційні контрольні сигнали, охоплюючи кодон початку АТG. До того ж, кодон початку повинен бути у коректній рамці зчитування для гарантування трансляції цілої вставки. Екзогенні трансляційні елементи та кодони початку можуть бути різного походження, природні та синтетичні. Ефективність експресії можна посилювати приєднанням посилювачів, що є прийнятними для конкретної системи клітин, що застосовують, як-то описані у літературі (Sсhаrf.еt аl., Результати Рrоbl. Сеll Dіffеr. 20:125-162 (1994)). На додаток, штам клітин-хазяїна можна вибирати за його здатністю модулювати експресію вставленої послідовності або для обробляння експресованого білку бажаним чином. Такі модифікації поліпептиду охоплюють, але без обмеження, ацетилування, карбоксилування, глікозилування, фосфорилування, ліпідування, та ацилування. Посттрансляційне обробляння, що розщеплює "препро" форму білку можна також застосовувати для полегшення коректної інсерції, згортання та/або функції. Відмінні клітини-хазяї, як-то СНО, НеLа, МDСК, НЕК293, та WІ38, що мають характерні механізми такої посттрансляційної активності, можна вибирати для гарантування коректної модифікації та обробляння чужинного білку. Для довготермінового високопродуктивного отримання рекомбінантних білків стабільна експресія є загалом кращою. Наприклад, лінії клітин, що стабільно експресують корисний полінуклеотид, можна трансформувати, застосовуючи вектори експресії, що можуть містити вірусні початки реплікації та/або елементи ендогенної експресії та селектовуваний маркерний ген на тому ж або окремому векторі. Після уведення вектора клітини можна вирощувати протягом 1-2 діб у збагачених середовищах та переводити у селективні середовища. Призначенням селектовуваного маркеру є стійкість до вибору, та його присутність робить можливим ріст та виділення клітин, які успішно експресують уведені послідовності. Резистентні клони стабільно трансформованих клітин можуть проліферувати при застосуванні способів культури тканин прийнятних для типів клітин. Будь-яке число систем вибору можна застосовувати для виділення трансформованих ліній клітин. Вони охоплюють, але без обмеження, тимідин-кіназу вірусу простого герпесу (Wіglеr еt аl., Сеll 11:223-32 (1977)) та аденін-фосфорибозилтрансферазу (Lоwу еt аl., Сеll 22:817-23 (1990)) гени, що можна застосовувати у клітинах tk.suр.- або арrt.suр.-, відповідно. Також, як базис для вибору можна застосовувати антиметаболіт, антибіотик або стійкість до гербіцидів; наприклад, dhfr, що надає стійкості до метотрексату (Wіglеr еt аl., Рrос. Nаtl. Асаd. Sсі. U.S.А. 77:3567-70 (1980)); nрt, що надає стійкості до аміноглікозидів, неоміцину та G-418 (СоlbеrеGаrаріn еt аl., J. Моl. Віоl. 150:1-14 (1981)); та аls або раt, що надають стійкості до 23 UA 107329 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 хлорсульфурону та фосфінотрицин ацетилтрансферази, відповідно (Мurrу, вище). Описані додаткові селектовувані гени, наприклад, trрВ, що дозволяє клітинам використання індолу замість триптофану, або hіsD, що дозволяє клітинам використання гістинолу замість гістидину (Наrtmаn & Мullіgаn, Рrос. Nаtl. Асаd. Sсі. U.S.А. 85:8047-51 (1988)). Останнім часом, застосування видимих маркерів має зрослу популярність з такими маркерами, як антоціаніни, βглюкуронідаза та її субстрат GUS, та люцифераза та її субстрат люциферин, широко застосовувані не тільки для ідентифікації трансформантів, але також для вимірювання кількості тимчасової або стабільної експресії білку, віднесеної до конкретної векторної системи (Rhоdеs еt аl., Меthоds Моl. Віоl. 55:121-131 (1995)). Хоча присутність/відсутність експресії маркерного гена говорить про те, що корисний ген є також, його присутність та експресію можна підтвердити. Наприклад, якщо послідовність, що кодує поліпептид, вставляють у послідовність маркерного гена, рекомбінантні клітини, що містять послідовності, можна ідентифікувати за відсутністю функції маркерного гена. Альтернативно, маркерний ген може бути у тандемі з кодуючою поліпептидною послідовністю під контролем одиничного промотеру. Експресія маркерного гена у відповідь на індукування або селекцію звичайно вказує на експресію тандемного гена також. Альтернативно, клітини-хазяї, що містять та експресують бажану полінуклеотидну послідовність, можна ідентифікувати відомими способами. Ці способи охоплюють, але без обмеження, способи гібридизації ДНК-ДНК або ДНК-РНК та біоаналізу або імуноаналізу, що охоплюють мембрану, розчин, або способи на основі чипів для визначення та/або вимірювання нуклеїнової кислоти або білку. Більшість способів визначення та вимірювання експресії кодованих полінуклеотидами продуктів, застосовуючи поліклональне або моноклональне антитіло, специфічне для відомого продукту. Приклади охоплюють імуноферментний твердофазний аналіз (ЕLІSА), радіоімуноаналіз (RІА), та аналіз активованої флуоресценції сортованих клітин (FАСS). Двостадійний, моноклонально-базований імуноаналіз з використанням моноклонального антитіла реактивного стосовно двох невзаємодіючих епітопів на певному поліпептиді може бути кращим для застосування, але аналіз конкурентного зв'язування можна застосовувати також. Ці та інші аналізи описані у Наmрtоn еt аl., Sеrоlоgісаl Меthоds, Lаbоrаtоrу Маnuаl (1990) та Маddох еt аl., J. Ехр. Меd. 158:1211-1216 (1983). Багато міток та способів кон'югації відомі спеціалістам та їх можна застосовувати у різних аналізах нуклеїнових кислот та амінокислот. Засоби для створення мічених гібридизаційних або РСR-зондів для визначення послідовностей, пов'язаних з полінуклеотидами, охоплюють олігомічення, нік-трансляцію, мічення кінців або РСR-ампліфікацію, застосовуючи мічений нуклеотид. Альтернативно, послідовності, або будь-які їх частини можна клонувати у вектор для отримання мРНК-зонду. Такі вектори відомі, є комерційно доступними, та їх можна застосовувати для синтезу РНК-зондів іn vіtrо додаванням прийнятної РНК-полімерази, як-то Т7, Т3, або SР6 та мічених нуклеотидів. Ці способи можна проводити, застосовуючи багато комерційно доступних комплектів. Придатні репортерні молекули або мітки, що можна застосовувати, охоплюють радіонукліди, ферменти, флуоресцентні, хемілюмінісцентні або хромогенні агенти, а також субстрати, кофактори, інгібітори, магнітні частинки, тощо. Клітини-хазяї, трансформовані корисною полінуклеотидною послідовністю, можна культивувати в умовах, придатних для експресії та виділення білку з культур клітин. Білок, створений рекомбінантною клітиною може бути секретованим або вмісним у клітині залежно від застосовуваних послідовності та/або вектору. Спеціалістам слід розуміти, що вектори експресії, що містять полінуклеотиди можна створювати для вміщення сигнальної послідовності з безпосереднім секретуванням кодованого поліпептиду через мембрану клітини прокаріоту або евкаріоту. Інші рекомбінантні структури можна застосовувати для об'єднання послідовностей, що кодують корисний поліпептид до нуклеотидної послідовності, що кодує домен поліпептиду, що полегшуватиме очищення розчинних білків. Такі домени полегшування очищення охоплюють, але без обмеження, метал-хелатні пептиди, як-то гістидин-триптофанові модулі, що дозволяють очищення на іммобілізованих металах, домени білку А, що дозволяють очищення на іммобілізованому імуноглобуліні, та домен, використовуваний у системі очищення FLАGSподовження/афінність (Іmmunех Соrр., Sеаttlе, Промивання.). Приєднання розщеплюваних послідовностей лінкеру, як-то специфічних для фактору ХА або ентерокінази (Іnvіtrоgеn. Sаn Dіеgо, Саlіf.) між доменом очищення та кодованим поліпептидом можна застосовувати для полегшення очищення. Один такий вектор експресії забезпечує експресію зрощеного білку, який містить корисний поліпептид, та нуклеїнову кислоту, що кодує 6 гістидинових залишків перед тіоредоксином або сайтом розщеплення ентерокіназою. Гістидинові залишки полегшують очищення на ІМІАС (афінна хроматографія на іммобілізованому металі), як описано у Роrаth еt 24 UA 107329 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 аl., Рrоt. Ехр. Рurіf. 3:263-281 (1992) тоді як сайт розщеплення ентерокіназою забезпечує засоби для очищення бажаного поліпептиду від зрощеного білку. Обговорення векторів, що містять зрощені білки, запропоновано Кrоll еt аl., DNА Сеll Віоl. 12:441-453 (1993)). ІN VІVО СПОСОБИ ДОСТАВЛЯННЯ ПОЛІНУКЛЕОТИДУ У додаткових втіленнях генетичні констракті, що містять один або більше полінуклеотидів винаходу, уводять у клітини іn vіvо. Цього можна досягти, застосовуючи будь-який з добре відомих підходів, деякі з котрих наведені нижче для ілюстрації. 1. Аденовірус Один з кращих способів доставляння іn vіvо одної або більше послідовностей нуклеїнових кислот задіює застосування аденовірусного вектору експресії. "Аденовірусний вектор експресії" охоплює констракти, що містять послідовності аденовірусу, достатні для (а) підтримування упаковки констракту та (b) для експресування полінуклеотиду, що клоновано там у значеннєвій або антизначеннєвій орієнтації. Безумовно, у контексті антизначеннєвого констракту, експресія не потребує, щоб продукт гена був синтезованим. Вектор експресії містить генетично створювану форму аденовірусу. Знання генетичної організації аденовірусу, 36 ко, лінійний, подвійно-ланцюговий ДНК-вірус, дозволяє заміщення великих частин аденовірусної ДНК чужинними послідовностями до 7 ко (Grunhаus & Ноrwіtz, 1992). На відміну від ретровірусу аденовірусна інфекція клітин-хазяїна не призводить до хромосомної інтеграції, оскільки аденовірусна ДНК може реплікувати епісомним чином без потенційної генотоксичності. Також, аденовіруси є структурно стабільними, та жодного геномного перегрупування не визначено після значної ампліфікації. Аденовірус може інфікувати реально усі епітеліальні клітини незважаючи на стадію їх клітинного циклу. Тому аденовірусні інфекція зв'язана тільки з помірною хворобою, як-то гостра респіраторна хвороба у людей. Аденовірус є особливо придатним для застосування, як вектор переносу гена внаслідок середнього розміру його, легкості поводження, високого титру, широких меж цільових клітин та високої інфективності. Обидва кінці вірусного генома містять 100-200 пар основ інвертованих повторень (ІТRs), що є сіs елементами, необхідними для реплікації та упаковки вірусної ДНК. Ранні (Е) та пізні (L) регіони генома містять відмінні транскрипційні одиниці, що є поділеними початком реплікації вірусної ДНК. Регіон Е1 (Е1А та Е1В) кодує білки, чутливі стосовно регулювання транскрипції вірусного генома та кількох клітинних генів. Експресія регіону Е2 (Е2А та Е2В) призводить до синтезу білків для реплікації вірусної ДНК. Ці білки приймають участь у реплікації ДНК, експресії пізніх генів та відключенні клітин-хазяїна (Rеnаn, 1990). Продукти пізніх генів, охоплюючи більшість вірусних капсидних білків, експресуються тільки після значного обробляння одиничного первинного транскрипту від головного пізнього промотеру (МLР). МLР, (розташований при 16,8 m.u.) є особливо ефективним у пізній фазі інфекції, та усі мРНК від цього промотеру мають троїсту лідерну (ТРL) послідовність, що робить їх кращими мРНК для трансляції. У сучасній системі рекомбінантнй аденовірус створюють гомологічною рекомбінацією між човниковим вектором та провірусним вектором. Внаслідок можливої рекомбінації між двома провірусними векторами, аденовірус природного типу можна створювати цим способом. Тому, критичним для виділення є одиничний клон вірусу від індивідуальної бляшки та досліджування його геномної структури. Породження та розмноження сучасних аденовірусних векторів, що є реплікаційно дефектними, залежать від унікальної хелперної лінії клітин, позначеної 293, що трансформовано з клітин нирок ембріону людини фрагментами Аd5 ДНК та конститутивно експресують білки Е1 (Grаhаm еt аl., 1977). Оскільки регіон Е3 є неістотним у геномі аденовірусу (Jоnеs & Shеnk, 1978), сучасні аденовірусні вектори, з допомогою клітин 293, несуть чужинну ДНК у регіонах Е1, D3 або обох (Grаhаm & Рrеvес, 1991). Природно, аденовірус може упаковувати приблизно 105 % геному природного типу (Ghоsh-Сhоudhurу еt аl., 1987), що забезпечує місткість для приблизно 2 екстра ко ДНК. Комбінували із приблизно 5,5 ко ДНК, що є замінною у регіонах Е1 та Е3, максимальна місткість сучасного аденовірусного вектору є під 7,5 ко, або приблизно 15 % загальної довжини вектора. Більше, ніж 80 % вірусного геному аденовірусу залишається у ланцюгу вектору та є джерелом цитотоксичності вектора. Також, дефіцит реплікації Е1-видаленого вірусу є дефектним. Наприклад, втрати експресії вірусного гена спостерігають із зараз доступними векторами при високій різноманітності інфекції (МОІ) (Мullіgаn, 1993). Хелперні лінії клітин можуть бути похідними з клітин людини, як-то клітин нирок ембріону людини, м'язових клітин, гемопоетичих клітин або інших клітин ембріону людини мезенхімних або епітеліальних клітин. Альтернативно, хелперні клітини можуть бути похідними з клітини інших видів ссавців. Такі клітини охоплюють, наприклад, клітини Vеrо або інші мезенхімні або 25 UA 107329 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 епітеліальні клітини ембріону мавпи. Як встановлено вище, зараз кращою хелперною лінією клітин є 293. Rасhеr еt аl. (1995) розкрили поліпшені способи культивування клітин 293 та розмноження аденовірусу. В одному форматі агрегати природних клітин вирощують засіванням індивідуальних клітин у силіконізовані обертальні колби на 1 л (Тесhnе, Саmbrіdgе, UК), що містять 100-200 мл середовища. Після перемішування при 40 об/хвил, життєздатність клітин оцінюють з трипановим блакитним. У ще одному форматі Fіbrа-Сеl-мікроносії (Віbbу Stеrlіn, Stоnе, UК) (5 г/л) застосовують, таким чином. Засівний матеріал клітин, ресуспендований у 5 мл середовища, додають до носія (50 мл) у колбу Ерленмейера на 250 мл та залишають з перемішуванням, протягом 1 – 4 год. Середовище тоді заміщають 50 мл свіжого середовища та струшують. Для отримання вірусу клітини вирощують – 80 % конфлюєнтності, після чого середовище заміщають (до 25 % кінцевого об'єму) та аденовірус додають при МОІ 0,05. Культури залишають на ніч, після чого об'єм збільшують до 100 % та струшують протягом ще 72 год. За винятком вимоги, що аденовірусний вектор повинен бути реплікаційно дефектним, або принаймні умовно дефектним, природу аденовірусного вектору не вважають ключовою для успішного здійснення винаходу. Аденовірус може бути будь-яким з 42 відмінних відомих серотипів або підгруп А-F. Аденовірус типу 5 підгрупи С є кращим вихідним матеріалом для отримання умовного реплікаційно дефектного аденовірусного вектору для застосування у заявленому винаході, оскільки аденовірус типу 5 є аденовірусом людини, про який відомо багато біохімічної та генетичної інформації та його застосовують для більшості структур, що застосовують аденовірус як вектор. Як встановлено вище, типовий вектор згідно з заявленим винаходом є реплікаційно дефектним та не має аденовірусний регіон Е1. Таким чином, найбільш зручним повинно бути уведення полінуклеотиду, що кодує корисний ген у позиції, з якої Е1-кодувальні послідовності мають бути видаленими. Однак, позиція інсерції констракту у послідовності аденовірусу не є критичною для винаходу. Полінуклеотид, що кодує корисний ген, можна також вставляти замість видаленого регіону Е3 у Е3-замінних векторах, як описано Каrlssоn еt аl. (1986) або у регіоні Е4, де хелперна лінія клітин або хелперний вірус доповнює дефект Е4. Аденовірус легко вирощувати та поводитися з ним та він має багато хазяїв іn vіtrо та іn vіvо. Цю групу вірусів можна отримувати у високих титрах, наприклад, 109-1011 бляшко-твірних одиниць на мл, та вони є високо інфекційними. Цикл життя аденовірусу не потребує інтеграції у геном клітини-хазяїна. Чужинні гени, доставлені аденовірусними векторами є епісомними та тому мають низьку генотоксичність стосовно клітин-хазяїв. Жодної побічної дії не повідомлено у дослідженнях вакцинування аденовірусом природного типу (Соuсh еt аl., 1963; Тор еt аl., 1971), що демонструє їх безпечність та терапевтичну потенцію, як іn vіvо векторів переносу гена. Аденовірусні вектори, застосовувані у експресії евкаріотного гена (Lеvrеrо еt аl., 1991; Gоmеz-Fоіх еt аl., 1992) та розробці вакцини (Grunhаus & Ноrwіtz, 1992; Grаhаm & Рrеvес, 1992). Останнім часом, дослідження тварин говорять, що рекомбінантний аденовірус можна застосовувати для генної терапії (Strаtfоrd-Реrrісаudеt & Реrrісаudеt, 1991; Strаtfоrd-Реrrісаudеt еt аl., 1990; Rісh еt аl., 1993). Дослідження застосування рекомбінантного аденовірусу до відмінних тканин охоплюють інстиляцію у трахеї (Rоsеnfеld еt аl., 1991; Rоsеnfеld еt аl., 1992), ін'єкцію у м'язи (Rаgоt еt аl., 1993), периферійні внутрішньовенні ін'єкції (Неrz & Gеrаrd, 1993) та стереотаксичну інокуляцію у мозок (Lе Gаl Lа Sаllе еt аl., 1993). Аденовірусні вектори можуть походити від аденовірусу людини. Альтернативно вони можуть походити від аденовірусу інших видів, наприклад, шимпанзе, що може мати перевагу в тому, що вірусні вектори не нейтралізуються антитілом проти аденовірусу людини, що циркулює у багатьох людях (дивись, наприклад: Таtsіs N еt аl Gеnе Тhеrару 2006 13:421-429). Аденовірус типу 35, що є відносно незвичайним, а тому має низькі рівні вже існуюючого імунітету до самого вектору, і застосовуваний як система у деяких туберкульозних вакцинах, що є розробленими (дивись наприклад, Rаdоsеvіс еt аl Іnfесtіоn та Іmmunіtу 2007 75(8):4105-4115). Аденовірус типу 35 може також мати особливе значення у заявленому винаході, як вектор доставляння. 2. Ретровіруси Ретровіруси є групою одно-ланцюгових РНК-вірусів, охарактеризованих здатністю перетворення їх РНК у подвійно-ланцюгову ДНК в інфікованих клітинах зворотною транскрипцією (Соffіn, 1990). Утворена ДНК тоді стабільно входить у клітинні хромосоми, як провірус та спрямовує синтез вірусних білків. Входження призводить до збереження послідовностей вірусного гена у реципієнтній Т-клітині та її нащадків. Ретровірусний геном містить три гени, gаg, роl, та еnv, що є кодом для капсидних білків, полімеразного ферменту, та 26 UA 107329 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 компонентів оболонки, відповідно. Послідовність, знайдена як вище розташована від гена gаg, містить сигнал для упаковки генома у віріони. Два довгих кінцевих повторень (LТR) послідовності є представленими на 5" та 3" кінцях вірусного генома. Вони містять сильний промотер та посилювач послідовності та є також потрібними для входження у геном клітинихазяїна (Соffіn, 1990). Для створення ретровірусного вектору нуклеїнову кислоту, що кодує одну або більше олігонуклеотидних або полінуклеотидних корисних послідовностей, вставляють у вірусний геном замість деяких вірусних послідовностей для створення вірусу, що є реплікаційно дефектним. Для створення віріонів створюють пакувальну лінію клітин, що містять гени gаg, роl, та еnv, але без LТR, та пакувальні компоненти (Маnn еt аl., 1983). Коли рекомбінантну плазміду, який містить кДНК, разом із ретровірусним LТR, та пакувальні послідовності уводять у цю лінію клітин (осадженням кальцію фосфату, наприклад), пакувальна послідовність дозволяє РНКтранскрипту рекомбінантної плазміди упаковування у вірусні частинки, що тоді секретують у середовищах культур (Nісоlаs & Rubеnstеіn, 1988; Теmіn, 1986; Маnn еt аl., 1983). Середовища, що містять рекомбінантні ретровіруси, тоді збирають, необов'язково концентрують, та застосовують для переносу гена. Ретровірусні вектори здатні інфікувати багато типів клітин. Однак, входження та стабільна експресія потребують поділу клітини-хазяїна (Раskіnd еt аl., 1975). Новий підхід створено для специфічного націлювання ретровірусних векторів. який останнім часом розроблено на основі хімічної модифікації ретровірусу хімічним додаванням залишків лактози до вірусної оболонки. Ця модифікація могла б дозволити специфічну інфекцію гепатоцитів через рецептори сіалоглікопротеїну. Відмінний підхід до націлювання рекомбінантних ретровірусів створено, в якому були застосовуваними біотиніловане антитіло проти білку ретровірусної оболонки та проти специфічного клітинного рецептору. Антитіло сполучали через біотинові компоненти застосуванням стрептавідину (Rоuх еt аl., 1989). Застосовуючи антитіло проти головних складних антигенів гістосумісності класу І та класу ІІ, вони продемонстрували інфекцію багатьох клітин людини, що витягують ті антигени поверхні з екотопічного вірусу іn vіtrо (Rоuх еt аl., 1989). 3. Адено-асоційовані ВІРУСИ ААV (Rіdgеwау, 1988; Неrmоnаt & Мuzусskа, 1984) є паровірусом, відкритим, як забруднення аденовірусних напівпродуктів. Він є повсюдним вірусом (антитіло є представленим у 85 % популяції США), що не зв'язаний з будь-якою хворобою. Він також класифікований, як депендовірус, оскільки його реплікація є залежною від присутності хелперного вірусу, як-то аденовірус. П'ять серотипів виділені, з яких ААV-2 є найкраще характеризованим. ААV має одно-ланцюгову лінійну ДНК, що є інкапсидованою у капсидні білки VР1, VР2 та VР3 з утворенням ікосаедрального віріону 20 до 24 нм у діаметрі (Мuzусzkа & МсLаughlіn, 1988). Довжина ДНК ААV є приблизно 4,7 кілооснов. Він містить дві відкриті рамки зчитування та є фланкованим двома ІТRs. Y геномі ААV є два головних гени: rер та сар. Ген rер кодує білки, чутливі стосовно вірусної реплікації, тоді як сар кодує капсидний білок VР1-3. Кожний ІТR утворює шпилькову структуру форми Т. Ці кінцеві повторення є тільки необхідними сіsкомпонентами ААV для входження у хромосому. Тому, ААV можна застосовувати як вектор із усіма вірусними кодувальними послідовностями, видаленими та заміщеними касетними генами для доставляння. Три вірусні промотери ідентифіковані та названі р5, р19, та р40, за їх позиціями у карті. Транскрипція р5 та р19 призводить до отримання білків rер, а транскрипція р40 створює капсидні білки (Неrmоnаt & Мuzусzkа, 1984). Є кілька факторів, що підказують дослідження можливості застосування rААV як вектору експресії. Один полягає у тому, що вимоги доставляння гена для входження у хромосому хазяїна є несподівано малими. Це необхідно, щоб мати ІТR 145-по, що є тільки 6 % геному ААV. Це залишає місце у векторі для збирання інсерції 4,5-ко ДНК. Тоді як це перенесення місткості може відвертати ААV від доставляння великих генів, це є достатнім для доставляння антизначеннєвих констрактів. ААV є також гарним предметом вибору переносників для доставляння внаслідок його безпечності. Існує відносно ускладнений механізм звільнення: не тільки аденовірус природного типу, але також гени ААV є потрібними для мобілізації rААV. Подібно, ААV не є патогенним та не асоційований з будь-якою хворобою. Видалення вірусної кодувальної послідовності мінімізує імунні реакції на експресію вірусного гена, а тому, rААV не викликає запальну відповідь. 4. Інші вірусн вектори як констракти експресії Інші вірусні вектори можна застосовувати як констракти експресії у заявленому винаході для доставляння олігонуклеотидних або полінуклеотидних послідовностей до клітин-хазяїна. 27 UA 107329 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Вектори, похідні від вірусів, як-то вірусу коров'ячої віспи (Rіdgеwау, 1988; Соuраr еt аl., 1988), лентивіруси, поліовіруси та віруси герпесу можна застосовувати. Інші вектори, похідні від вірусу групи віспи, як-то вектори, похідні від вірусу вітрянки, можна, як очікують, застосовувати також. Вони пропонують кілька притягальних особливостей для різних клітин ссавців (Frіеdmаnn, 1989; Rіdgеwау, 1988; Соuраr еt аl., 1988; Ноrwісh еt аl., 1990). З недавнім розпізнаванням дефектних вірусів гепатиту В нове розуміння є виграшним стосовно співвідношення структура-функція, відмінних вірусних послідовностей. Іn vіtrо дослідження показало, що вірус міг би залишати здатність стосовно залежної від хелперу упаковки та зворотної транскрипції, незважаючи на делецію до 80 % його генома (Ноrwісh еt аl., 1990). Це говорить, що великі частини генома можна було б заміщати чужинним генетичним матеріалом. Гепатотропізм та витривалість (входження) були особливо притягальними властивостями для спрямованого на печінку переносу гена. Сhаng еt аl. (1991) уводили ген хлорамфенікол-ацетилтрансферази (САТ) у геном вірусу гепатиту В качки замість полімеразних, поверхневих та передповерхневих кодувальних послідовностей. Він був котрансфектованим з вірусом природного типу у лінію клітин гепатоми птиць. Середовища культур, що містять високі титри рекомбінантного вірусу, були застосовуваними для інфікування первинних гепатоцитів каченя. Стабільний ген експресії САТ, що визначали протягом принаймні протягом принаймні (Сhаng еt аl., 1991). Додаткові "вірусні" вектори охоплюють вірусо-подібні частинки (VLРs) та фаги. 5. НЕВІРУСНі вектори Для здійснення експресії олігонуклеотидних або полінуклеотидних послідовностей заявленого винаходу, констракт експресії повинен бути доставленим у клітину. Це доставляння може бути іn vіtrо, як трансформування ліній клітин у лабораторії, або іn vіvо або ех vіvо, як у лікуванні деяких станів хвороб. Як описано вище, один кращий механізм полягає у доставлянні інфекцією вірусом, де констракт експресії є інкапсульованим у інфекційній вірусній частинці. Як тільки констракт експресії доставлено у клітину, нуклеїнову кислоту, що кодує бажані олігонуклеотидні або полінуклеотидні послідовності, можна розташувати та експресувати на відмінних сайтах. У деяких втіленнях нуклеїнова кислота, що кодує констракт, може стабільно входити у геном клітини. Це входження може полягати у специфічному розташуванні та орієнтації через гомологічну рекомбінацію (заміщення гена) або він може входити у випадковому, неспецифічному розташуванні (збільшення гена). У подальших втіленнях нуклеїнову кислоту можна стабільно підтримувати у клітині як окремий епісомний сегмент ДНК. Такі сегменти нуклеїнових кислот або "епісоми" кодують послідовності, достатні для підтримування та реплікації незалежно або синхронно із циклом клітини-хазяїна. Як констракт експресії доставляється до клітини та де у клітині залишається нуклеїнова кислота, залежить від типу застосовуваного констракту експресії. У деяких втіленнях винаходу, констракт експресії, який містить одну або більше олігонуклеотидних або полінуклеотидних послідовностей, може просто складатися з оголеної рекомбінантної ДНК або плазміди. Переніс констракту можна проводити, наприклад, будь-яким способом, що фізично або хімічно будь-яким способом, що забезпечує проникність клітин мембран. Це є особливо застосовним для переносу іn vіtrо, але це можна використовувати для застосування іn vіvо також. Dubеnskу еt аl. (1984) успішно уводили ДНК вірусу поліоми у формі осадів кальцію фосфату у печінку та селезінку дорослих та новонароджених мишей, що демонструє активну вірусну реплікацію та гостру інфекцію. Веnvеnіstу & Rеshеf (1986) також продемонстрували, що безпосередня інтраперитонеальна ін'єкція осаджених кальцію фосфатом плазмід призводить до експресії трансфектованх генів. Передбачено, що ДНК, що кодує корисний ген, можна також переносити подібним чином іn vіvо та експресувати продукт гена. У ще одному втіленні винаходу для перенесення констракту експресії оголеної ДНК у клітини можна задіювати бомбардування частинками. Цей спосіб залежить від здатності прискорювати ДНК до високої швидкості, що дозволяє пробивати мембрани клітин та входити у клітини без їх вбивання (Кlеіn еt аl., 1987). Розроблено кілька пристроїв для прискорювання невеликих частинок. Один такий пристрій працює при високій напрузі для створення електроструму, що у свою чергу забезпечує рушійну силу (Yаng еt аl., 1990). Застосовувані мікробомбочки складаються з біологічно інертних речовин, як-то кульки з вольфраму чи золота. Вибрані органи, охоплюючи печінку, шкіру та м'язи тканин щурів та мишей бомбардують іn vіvо (Yаng еt аl., 1990; Zеlеnіn еt аl., 1991). Це може потребувати хірургічного відкриття тканин або клітин. До того ж ДНК, що кодує конкретний ген, можна доставляти та уводити цим способом. 28

Дивитися

Додаткова інформація

Назва патенту англійською

The tuberculosis rv2386c protein, compositions and uses thereof

Автори російською

Brown, James, Mettens, Pascal, Murphy, Dennis

МПК / Мітки

МПК: A61K 39/04, C07K 14/35, A61P 31/06

Мітки: туберкульозний, містить, rv2386c, білок, композиція, застосування

Код посилання

<a href="https://ua.patents.su/156-107329-tuberkuloznijj-bilok-rv2386c-kompoziciya-shho-jjogo-mistit-ta-zastosuvannya.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Туберкульозний білок rv2386c, композиція, що його містить, та застосування</a>

Подібні патенти