Туберкульозний білок rv3616c та його застосування

Реферат: Винахід стосується застосування ізольованого поліпептиду, який включає: (і) білок Rv3616c послідовності SEQ ID NO: 1 або 3-7; або (іі) варіант білка Rv3616c послідовності, що має принаймні 90 % ідентичності з SEQ ID NO: 1, або (ііі) імуногенний фрагмент, що містить принаймні 10 амінокислотних залишків з білка Rv3616с послідовності SEQ ID NO: 1, а також полінуклеотиду, що включає послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує вказаний поліпептид, у виробництві лікарського засобу для лікування латентного туберкульозу. UA 107330 C2 (12) UA 107330 C2 UA 107330 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 НОВІ КОМПОЗИЦІЇ ТА СПОСОБИ Заявлений винахід стосується поліпептидів та полінуклеотидів для застосування у лікуванні або запобіганні туберкульозу, зокрема для застосування у лікуванні або запобіганні латентного туберкульозу та у запобіганні або затримуванні реактивування туберкульозу (та також пов'язаних процесів). Заявлений винахід крім того стосується фармацевтичних та імуногенних композицій, що містять вказані поліпептиди та полінуклеотиди, та способів діагноз туберкульозу (зокрема латентного туберкульозу). Туберкульоз (ТБ) є хронічною інфекційною хворобою, спричиненою інфекцією із Mycobacterium tuberculosis та іншими видами Mycobacterium. Він є головною хворобою у країнах, що розвиваються, а також зростаючою проблемою у розвинених районах світу. Більше, ніж 2 мільярди людей, можна вважати, є інфікованими бацилами туберкульозу, із приблизно 9,2 мільйонами нових випадків туберкульозу та 1,7 мільйонами смертей кожного року. 10 % інфікованих бацилами туберкульозу матимуть активний ТБ, кожна особа з активним ТБ інфікує в середньому 10 – 15 інших на рік. Тоді як річні норми випадків досягли піку глобально, число смертей та випадків ще зростає внаслідок росту популяції (World Health Organisation Tuberculosis Facts 2008). Mycobacterium tuberculosis інфікує осіб через респіраторний шлях. Альвеолярні макрофаги поглинають бактерію, але вона здатна виживати та проліферувати інгібуванням зрощення фагосом кислотними лізосомами. Складна імунна відповідь, що задіює CD4+ та CD8+T-клітини, виникає, зрештою призводячи до утворення грануломи. Головним для успіху Mycobacterium tuberculosis як патогену є факт, що ізольована, але не знищена бактерія може виживати протягом довгого часу, залишаючи особу уразливою до пізнішого розвитку активного ТБ. Менше, ніж 5 % інфікованих осіб розвивають активний ТБ у перші роки після інфекції. Гранулома може виживати протягом десятків років та, можна вважати, містить живу Mycobacterium tuberculosis у стані бездіяльності, позбавлену кисню та живильних речовин. Однак, останнім часом говорять про те, що більшість бактерій у стані бездіяльності розташовані у типах немакрофагових клітин, поширених скрізь у тілі (Locht et al, Expert Opin. Biol. Ther. 2007 7(11):1665-1677). Розвиток активного ТБ відбувається, коли баланс між природним імунітетом хазяїна та патогеном змінюється, наприклад, як результат імунодепресивних подій (Anderson P Trends іn Microbiology 2007 15(1):7-13; Ehlers S Infection 2009 37(2):87-95). Динамічне припущення. що описує баланс між латентним ТБ та активним ТБ запропоновано також (Cardana P-J Inflammation & Allergy – Drug Targets 2006 6:27-39; Cardana P-J Infection 2009 37(2):80-86). Хоча інфекція може бути безсимптомною протягом чималого часу, активна хвороба найбільш звичайно виявляється, як гостре запалення легень, призводячи до слабкості, втрати маси, лихоманки та стійкого кашлю. Без лікування звичайно відбуваються серйозні ускладнення та смерть. Туберкульоз можна загалом контролювати поширеною терапією антибіотиками, хоча так лікування не є достатнім для запобігання поширенню хвороби. Інфіковані особи можуть бути безсимптомними, але заразними, протягом деякого часу. На додаток, хоча узгодження з режимом лікування є критичним, поведінку пацієнта важко відстежувати. Деякі пацієнти не доводять до кінця курсу лікування, що може призводити до неефективного лікування та розвинення лікарської резистентності. ТБ з множинною лікарською резистентністю (МЛР-ТБ) є формою, що виявляє неспроможність у відповідь на ліки першої черги. 5 % усіх випадків ТБ є МЛР-ТБ, з прогнозованими 490000 новими випадками МЛР-ТБ кожного року. Значною мірою ТБ з лікарською резистентністю (ЛР-ТБ) відбувається, коли стійкість до ліків другої черги розвивається на найвищому ступені МЛР-ТБ. Прогнозовано, що 40000 нових випадків, реально непридатних для лікування ЛР-ТБ, виникають щороку (World Health Organisation Tuberculosis Facts 2008). Навіть якщо повний курс лікування антибіотиками завершують, інфекція M. tuberculosis може не бути знищеною від інфікованої особи та може залишатися як латентна інфекція, що може реактивуватися. Для контролювання поширення туберкульозу, ефективне вакцинування та точний ранній діагноз хвороби є щонайбільш важливими. Діагноз латентної інфекції ТБ звичайно визначають шкірним туберкуліновим тестом, що охоплює інтрадермальне спонукування білково-очищеним похідним туберкуліну (PPD). Антигенспецифічні відповіді T-клітин дають вимірне затвердіння на ділянці ін'єкції через 48-72 годин після ін'єкції, що вказує на піддавання дії мікобактеріальних антигенів. Чутливість та специфічність є, однак, проблематичними за цим тестом, та особи, вакциновані BCG, не можуть 1 UA 107330 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 завжди бути легко розрізненими від інфікованих осіб (це є особливо важливим у світлі факту, що BCG не захищає проти латентної інфекції). Загалом, особи, хто отримав BCG, але не є інфікованими M. tuberculosis показують реакцію PPD менше 10 мм у діаметрі, тоді як люди, хто мають реакцію PPD більше 10 мм у діаметрі, як вважають, інфіковані M. tuberculosis. Однак, це правило не є застосовним до осіб з імунодепресією внаслідок інфекції ВІЛ, що може відбуватися при реакції PPD менше 10 мм у діаметрі); або в ендемічних країнах, де люди, інфіковані нетуберкульозними мікобактеріями, можуть показувати реакцію PPD більше 10 мм у діаметрі. Прогрес протягом останніх років дав іn vitro аналізи на основі T-клітин, на основі вивільнення інтерферону-гамма, та із застосуванням антигенів, є більш специфічними стосовно M. tuberculosis, ніж PPD, а саме ESAT-6 та CFP-10. Ці тести високої специфічності є принаймні, настільки чутливими, як шкірний туберкуліновий тест та також демонструють меншу перехресну реактивність внаслідок вакцинування BCG. Дивись Pai M et al Expert Rev. Mol. Diagn. 2006 6(3):413-422 для недавнього огляду діагнозу латентного ТБ. Однак, оскільки ESAT-6/CFP-10 є антигенами ранньої стадії, аналізи на основі ESAT-6/CFP-10 можна оптимально проводити тільки y останнім часом інфікованих людей. Тому, ідентифікація нових антигенів, специфічно асоційованих з латентним туберкульозом може допомагати розробці більш чутливих аналізів, що могли б визначати довготривалі латентні інфекції. Залишається необхідність в ефективних стратегіях лікування та запобігання туберкульозу, зокрема лікування та запобігання латентного ТБ та запобігання реактивування туберкульозу. Заявлений винахід загалом стосується ідентифікації Rv3616c, як антигену латентного ТБ та пов'язаних процесів та застосувань у запобіганні та лікуванні латентного ТБ та запобіганні або затримуванні реактивування туберкульозу. Заявлений винахід стосується поліпептиду, який містить: (i) послідовність білку Rv3616c; (ii) варіант послідовності білку Rv3616c; або (iii) імуногенний фрагмент послідовності білку Rv3616c; для застосування як медикаменту у лікуванні або запобіганні латентного ТБ. Наступний аспект винаходу стосується способу лікування або запобігання латентного ТБ, який полягає у застосуванні безпечної та ефективної кількості поліпептиду, який містить: (i) послідовність білку Rv3616c; (ii) варіант послідовності білку Rv3616c; або (iii) імуногенний фрагмент послідовності білку Rv3616c; до особи при необхідності цього, де вказаний поліпептид викликає імунну відповідь, зокрема імунну відповідь проти Mycobacterium tuberculosis. Застосування поліпептиду, який містить: (i) послідовність білку Rv3616c; (ii) варіант послідовності білку Rv3616c; або (iii) імуногенний фрагмент послідовності білку Rv3616c; у виробництві медикаменту для лікування або запобігання латентного ТБ, представляє ще один аспект винаходу. Запропоновано також полінуклеотид, який містить послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептид, який містить: (i) послідовність білку Rv3616c; (ii) варіант послідовності білку Rv3616c; або (iii) імуногенний фрагмент послідовності білку Rv3616c; для застосування як медикаменту у лікуванні або запобіганні латентного ТБ. Наступний аспект винаходу стосується способу лікування або запобігання латентного ТБ, який полягає у застосуванні безпечної та ефективної кількості полінуклеотиду, який містить послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептид, який містить: (i) послідовність білку Rv3616c; (ii) варіант послідовності білку Rv3616c; або (iii) імуногенний фрагмент послідовності білку Rv3616c; до особи при необхідності цього, де вказаний полінуклеотид викликає імунну відповідь, зокрема імунну відповідь проти Mycobacterium tuberculosis. Застосування полінуклеотиду, який містить послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептид, який містить: (i) послідовність білку Rv3616c; (ii) варіант послідовності білку Rv3616c; або (iii) імуногенний фрагмент послідовності білку Rv3616c; 2 UA 107330 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 у виробництві медикаменту для лікування або запобігання латентного ТБ, представляє ще один аспект винаходу. На додаток, запропоновано фармацевтичну композицію, що містить: (a) поліпептид, який містить: (i) послідовність білку Rv3616c; (ii) варіант послідовності білку Rv3616c; або (iii) імуногенний фрагмент послідовності білку Rv3616c; або (b) полінуклеотид, який містить послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептид з (a); та (c) фармацевтично прийнятний носій або наповнювач, для застосування як медикаменту у лікуванні або запобіганні латентного ТБ. Крім того, запропоновано імуногенну композицію, що містить: (a) поліпептид, який містить: (i) послідовність білку Rv3616c; (ii) варіант послідовності білку Rv3616c; або (iii) імуногенний фрагмент послідовності білку Rv3616c; або (b) полінуклеотид, який містить послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептид з (a); та (c) посилювач неспецифічної імунної відповіді, для застосування як медикаменту у лікуванні або запобіганні латентного ТБ. На додаток запропоновано антитіло або його фрагмент, що специфічно зв'язує поліпептид, який містить: (i) послідовність білку Rv3616c; (ii) варіант послідовності білку Rv3616c; або (iii) імуногенний фрагмент послідовності білку Rv3616c, для застосування у діагнозі латентного ТБ (як-то способи діагнозу латентного туберкульозу, що полягають у визначенні присутності антитіла або його фрагменту, що специфічно зв'язує поліпептиди винаходу у біологічному зразку від тест-особи). Запропоновано також спосіб лікування латентного ТБ, що має етапи: (i) Ідентифікування особи, яка має латентну інфекцію ТБ (наприклад, на основі аналізів PPD або T-клітин); та (ii) застосування до вказаної особи безпечної та ефективної кількості поліпептиду або полінуклеотиду, як описано тут (як-то у формі фармацевтичної композиції або імуногенної композиції). Запропоновано також застосування поліпептиду заявленого винаходу у виробництві діагностичного комплекту для ідентифікації латентного ТБ у тест-особи. В одному втіленні особа, яка отримувала поліпептид, полінуклеотид або композицію може мати активний туберкульоз (наприклад, активну інфекцію M. tuberculosis). У другому втіленні особа може мати латентний туберкульоз (наприклад, бездіяльну інфекцію M. tuberculosis). У третьому втіленні особа може бути позбавленою туберкульозу (наприклад, позбавленою інфекції M. tuberculosis). Особа, яка отримувала поліпептид, полінуклеотид або композицію, може бути раніше вакцинованою від туберкульозу (наприклад, вакцинованою проти інфекції M. tuberculosis), як-то вакцинованою Bacillus Calmette-Guerin (BCG). Альтернативно, особа, яка отримувала поліпептид, полінуклеотид або композицію винаходу може не бути раніше вакцинованою від туберкульозу (наприклад, не вакцинованою проти інфекції M. tuberculosis), як-то не вакцинованою Bacillus Calmette-Guerin (BCG). опис ФІГ.ФІГ. Фіг. 1: Звіряння пептиду Rv3616c з послідовністю повної довжини. Фіг. 2: PBMC-відповіді на пептиди Rv3616c. Фіг. 3: Процент клітин CD4 та CD8 від імунізованих мишей CB6F1, що експресують цитокіни IFN-γ та/або IL-2 та/або TNF-альфа на добу 21 (тобто 7 діб після другої імунізації). Фіг. 4: Профіль цитокінів на добу 21 (тобто 7 діб після другої імунізації) антиген-специфічної CD4-відповіді у імунізованих мишей CB6F1. Фіг. 5: Профіль цитокінів на добу 21 (тобто 7 діб після другої імунізації) антиген-специфічної CD8-відповіді у імунізованих мишей CB6F1. Фіг. 6: Процент клітин CD4 та CD8 від імунізованих мишей CB6F1, що експресують цитокіни IFN-γ та/або IL-2 та/або TNF-альфа на добу 35 (тобто 7 діб після третьої імунізації). 3 UA 107330 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Фіг. 7: Профіль цитокінів на добу 35 (тобто 7 діб після третьої імунізації) антиген-специфічної CD4-відповіді у імунізованих мишей CB6F1. Фіг. 8: Профіль цитокінів на добу 35 (тобто 7 діб після третьої імунізації) антиген-специфічної CD8-відповіді у імунізованих мишей CB6F1. Фіг. 9: Процент клітин CD4 та CD8 від імунізованих мишей C57BL/6, що експресують цитокіни IFN-γ та/або IL-2 та/або TNF-альфа на добу 21 (тобто 7 діб після другої імунізації). Фіг. 10: Профіль цитокінів на добу 21 (тобто 7 діб після другої імунізації) антиген-специфічної CD4-відповіді у імунізованих мишей C57BL/6. Фіг. 11: Процент клітин CD4 та CD8 від імунізованих мишей C57BL/6, що експресують цитокіни IFN-γ та/або IL-2 та/або TNF-альфа на добу 35 (тобто 7 діб після третьої імунізації). Фіг. 12: Профіль цитокінів на добу 35 (тобто 7 діб після третьої імунізації) антигенспецифічної CD4-відповіді у імунізованих мишей C57BL/6. Фіг. 13: Профіль цитокінів на добу 35 (тобто 7 діб після третьої імунізації) антигенспецифічної CD8-відповіді у імунізованих мишей C57BL/6. Фіг. 14: Антиген-специфічні відповіді CD4 T-клітин у незаражених та латентно інфікованих людей. опис ПОСЛІДОВНОСТей SEQ ID No: 1: поліпептидна послідовність Rv3616c від штаму M. tuberculosis H37Rv. SEQ ID No: 2: полінуклеотидна послідовність Rv3616c від штаму M. tuberculosis H37Rv. SEQ ID No: 3: поліпептидна послідовність Rv3616c штаму M. tuberculosis CDC1551. SEQ ID No: 4: поліпептидна послідовність Rv3616c від штаму M. tuberculosis F11. SEQ ID No: 5: поліпептидна послідовність Rv3616c від штаму M. tuberculosis Haarlem A. SEQ ID No: 6: поліпептидна послідовність Rv3616c від штаму M. tuberculosis C. SEQ ID No: 7: поліпептидна послідовність Rv3616c від BCG. SEQ ID No: 8: поліпептидна послідовність Mtb8,4. SEQ ID No: 9: поліпептидна послідовність Mtb9,8. SEQ ID No: 10: поліпептидна послідовність Mtb9,9. SEQ ID No: 11: поліпептидна послідовність Ra12. SEQ ID No: 12: поліпептидна послідовність Ra35. SEQ ID No: 13: поліпептидна послідовність туберкульозуH9. SEQ ID No: 14: поліпептидна послідовність Mtb41. SEQ ID No: 15: поліпептидна послідовність ESAT-6. SEQ ID No: 16: поліпептидна послідовність Ag85A. SEQ ID No: 17: поліпептидна послідовність Ag85B. SEQ ID No: 18: поліпептидна послідовність альфа-кристалін. SEQ ID No: 19: поліпептидна послідовність MPT64. SEQ ID No: 20: поліпептидна послідовність Mtb32A. SEQ ID No: 21: поліпептидна послідовність Ser/Ala розвиненого мутованого Mtb32A. SEQ ID No: 22: поліпептидна послідовність туберкульозу10,4. SEQ ID No: 23: поліпептидна послідовність Mtb72f. SEQ ID No: 24: поліпептидна послідовність M72. SEQ ID No: 25: поліпептидна послідовність Mtb71f. SEQ ID No: 26: поліпептидна послідовність зрощення M92. SEQ ID No: 27: поліпептидна послідовність зрощення M103. SEQ ID No: 28: поліпептидна послідовність зрощення M114. SEQ ID No: 29: припустимий епітоп CD4-клітин людини 1. SEQ ID No: 30: припустимий епітоп CD4-клітин людини 2. SEQ ID No: 31: припустимий епітоп CD4-клітин людини 3. SEQ ID No: 32: припустимий епітоп CD4-клітин людини 4. SEQ ID No: 33: припустимий епітоп CD4-клітин людини 5. SEQ ID No: 34: припустимий епітоп CD4-клітин людини 6. SEQ ID No: 35: припустимий епітоп CD4-клітин людини 7. SEQ ID No: 36: припустимий епітоп CD4-клітин людини 8. SEQ ID No: 37: припустимий епітоп CD4-клітин людини 9. SEQ ID No: 38: припустимий епітоп CD4-клітин людини 10. SEQ ID No: 39: припустимий епітоп CD4-клітин людини 11. SEQ ID No: 40: припустимий епітоп CD4-клітин людини 12. SEQ ID No: 41: припустимий епітоп CD4-клітин людини 13. SEQ ID No: 42: припустимий епітоп CD4-клітин людини 14. SEQ ID No: 43: припустимий епітоп CD4-клітин людини 15. 4 UA 107330 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 SEQ ID No: 44: припустимий епітоп CD4-клітин людини 16. SEQ ID No: 45: припустимий епітоп CD4-клітин людини 17. SEQ ID No: 46: припустимий епітоп CD4-клітин людини 18. SEQ ID No: 47: припустимий епітоп CD4-клітин людини 19. SEQ ID No: 48: припустимий епітоп CD8-клітин людини 1. SEQ ID No: 49: припустимий епітоп CD8-клітин людини 2. SEQ ID No: 50: припустимий епітоп CD8-клітин людини 3. SEQ ID No: 51: припустимий епітоп CD8-клітин людини 4. SEQ ID No: 52: припустимий епітоп CD8-клітин людини 5. SEQ ID No: 53: припустимий епітоп CD8-клітин людини 6. SEQ ID No: 54: припустимий епітоп CD8-клітин людини 7. SEQ ID No: 55: припустимий епітоп CD8-клітин людини 8. SEQ ID No: 56: припустимий епітоп CD8-клітин людини 9. SEQ ID No: 57: припустимий епітоп CD8-клітин людини 10. SEQ ID No: 58: припустимий епітоп CD8-клітин людини 11. SEQ ID No: 59: припустимий епітоп CD8-клітин людини 12. SEQ ID No: 60: припустимий епітоп CD8-клітин людини 13. SEQ ID No: 61: припустимий епітоп CD8-клітин людини 14. SEQ ID No: 62: припустимий епітоп CD8-клітин людини 15. SEQ ID No: 63: припустимий епітоп CD8-клітин людини 16. SEQ ID No: 64: припустимий епітоп CD8-клітин людини 17. SEQ ID No: 65: припустимий епітоп CD8-клітин людини 18. SEQ ID No: 66: припустимий епітоп CD8-клітин людини 19. SEQ ID No: 67: припустимий епітоп CD8-клітин людини 20. SEQ ID No: 68: припустимий епітоп CD8-клітин людини 21. SEQ ID No: 69: припустимий епітоп CD8-клітин людини 22. SEQ ID No: 70: припустимий епітоп CD8-клітин людини 23. SEQ ID No: 71: припустимий епітоп CD8-клітин людини 24. SEQ ID No: 72: припустимий епітоп CD8-клітин людини 25. SEQ ID No: 73: припустимий епітоп CD8-клітин людини 26. SEQ ID No: 74: припустимий епітоп CD8-клітин людини 27. SEQ ID No: 75: припустимий епітоп CD8-клітин людини 28. SEQ ID No: 76: припустимий епітоп CD8-клітин людини 29. SEQ ID No: 77: припустимий епітоп CD8-клітин людини 30. SEQ ID No: 78: припустимий епітоп CD8-клітин людини 31. SEQ ID No: 79: припустимий епітоп CD8-клітин людини 32. SEQ ID No: 80: припустимий епітоп CD8-клітин людини 33. SEQ ID No: 81: припустимий епітоп CD8-клітин людини 34. SEQ ID No: 82: припустимий епітоп CD8-клітин людини 35. SEQ ID No: 83: припустимий епітоп CD8-клітин людини 36. SEQ ID No: 84: припустимий епітоп CD8-клітин людини 37. SEQ ID No: 85: припустимий епітоп CD8-клітин людини 38. SEQ ID No: 86: припустимий епітоп CD8-клітин людини 39. SEQ ID No: 87: припустимий епітоп CD8-клітин людини 40. SEQ ID No: 88: припустимий епітоп CD8-клітин людини 41. SEQ ID No: 89: припустимий епітоп CD8-клітин людини 42. SEQ ID No: 90: припустимий епітоп CD8-клітин людини 43. SEQ ID No: 91: припустимий епітоп CD8-клітин людини 44. SEQ ID No: 92: припустимий епітоп CD8-клітин людини 45. SEQ ID No: 93: припустимий епітоп CD8-клітин людини 46. SEQ ID No: 94: припустимий епітоп CD8-клітин людини 47. SEQ ID No: 95: припустимий епітоп CD8-клітин людини 48. SEQ ID No: 96: припустимий епітоп CD8-клітин людини 49. SEQ ID No: 97: припустимий епітоп CD8-клітин людини 50. SEQ ID No: 98: припустимий епітоп CD8-клітин людини 51. SEQ ID No: 99: припустимий епітоп CD8-клітин людини 52. SEQ ID No: 100: припустимий епітоп CD8-клітин людини 53. SEQ ID No: 101: припустимий епітоп CD8-клітин людини 54. SEQ ID No: 102: припустимий епітоп CD8-клітин людини 55. SEQ ID No: 103: припустимий епітоп CD8-клітин людини 56. 5 UA 107330 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 SEQ ID No: 104: припустимий епітоп CD8-клітин людини 57. SEQ ID No: 105: припустимий епітоп CD8-клітин людини 58. SEQ ID No: 106: припустимий епітоп CD8-клітин людини 59. SEQ ID No: 107: припустимий епітоп CD8-клітин людини 60. SEQ ID No: 108: припустимий епітоп CD8-клітин людини 61. SEQ ID No: 109: припустимий епітоп CD8-клітин людини 62. SEQ ID No: 110: припустимий епітоп CD8-клітин людини 63. SEQ ID No: 111: припустимий епітоп CD8-клітин людини 64. SEQ ID No: 112: припустимий епітоп CD8-клітин людини 65. SEQ ID No: 113: припустимий епітоп CD8-клітин людини 66. SEQ ID No: 114: припустимий епітоп CD8-клітин людини 67. SEQ ID No: 115: припустимий епітоп CD8-клітин людини 68. SEQ ID No: 116: припустимий епітоп CD8-клітин людини 69. SEQ ID No: 117: припустимий епітоп CD8-клітин людини 70. SEQ ID No: 118: припустимий епітоп CD8-клітин людини 71. SEQ ID No: 119: припустимий епітоп CD8-клітин людини 72. SEQ ID No: 120: припустимий епітоп CD8-клітин людини 73. SEQ ID No: 121: припустимий епітоп CD8-клітин людини 74. SEQ ID No: 122: припустимий епітоп CD8-клітин людини 75. SEQ ID No: 123: припустимий епітоп CD8-клітин людини 76. SEQ ID No: 124: припустимий епітоп CD8-клітин людини 77. SEQ ID No: 125: припустимий епітоп CD8-клітин людини 78. SEQ ID No: 126: припустимий епітоп CD8-клітин людини 79. SEQ ID No: 127: пептид 1. SEQ ID No: 128: пептид 2. SEQ ID No: 129: пептид 3. SEQ ID No: 130: пептид 4. SEQ ID No: 131: пептид 5. SEQ ID No: 132: пептид 6. SEQ ID No: 133: пептид 7. SEQ ID No: 134: пептид 8. SEQ ID No: 135: пептид 9. SEQ ID No: 136: пептид 10. SEQ ID No: 137: пептид 11. SEQ ID No: 138: пептид 12. SEQ ID No: 139: пептид 13. SEQ ID No: 140: пептид 14. SEQ ID No: 141: пептид 15. SEQ ID No: 142: пептид 16. SEQ ID No: 143: пептид 17. SEQ ID No: 144: пептид 18. SEQ ID No: 145: пептид 19. SEQ ID No: 146: пептид 20. SEQ ID No: 147: пептид 21. SEQ ID No: 148: пептид 22. SEQ ID No: 149: пептид 23. SEQ ID No: 150: пептид 24. SEQ ID No: 151: пептид 25. SEQ ID No: 152: пептид 26. SEQ ID No: 153: пептид 27. SEQ ID No: 154: пептид 28. SEQ ID No: 155: пептид 29. SEQ ID No: 156: пептид 30. SEQ ID No: 157: поліпептидна послідовність Rv1753c від штаму M. tuberculosis H37Rv. SEQ ID No: 158: поліпептидна послідовність Rv2386c від штаму M. tuberculosis H37Rv. SEQ ID No: 159: поліпептидна послідовність Rv2707c від штаму M. tuberculosis H37Rv. Зараз, вакцинування живими бактеріями є найбільш ефективним способом індукування захисного імунітету. Найбільш звичайною Mycobacterium, застосовуваною для цього, є Bacillus Calmette-Guerin (BCG), авірулентний штам M. bovis, що розроблено 60 років тому. Однак, безпечність та ефективність BCG є джерелом дебатів – захищаючи проти суворого виявлення 6 UA 107330 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 хвороби у дітей, BCG не запобігає утворенню латентного ТБ або реактивування хвороб легень у житті дорослих. На додаток, деякі країни, як-то США, не вакцинують людей цим агентом. Майже усі нові покоління ТБ-вакцин, що є зараз у клінічній розробці, створені, як попередні вакцини. Вони охоплюють субодиничні вакцини, що є особливо ефективними при повторній імунізації імунітету, індукованого первинним вакцинуванням BCG, та сучасними живими мікобактеріальними вакцинами, що призначені замінити BCG більш ефективними та/або безпечнішими штамами. Хоча ці вакцини призначені для поліпшення стійкості до інфекції, вони, ймовірно, менш ефективні, ніж додаткова експозиція або терапевтичні вакцини у випадках латентного ТБ (Lin MY et al Endocrine, Metabolic & Immune Disorders – Drug Targets 2008 8:1529). Деякі білки, що сильно експресуються на ранніх стадіях інфекції Mycobacterium, як показано, забезпечують сильну захисну ефективність у тваринних моделях вакцинування. Однак, вакцинування антигенами, що є сильно експресованими на ранніх стадіях інфекції, може не забезпечувати оптимальну імунну відповідь для поведінки з пізнішими стадіями інфекції. Адекватний контроль на пізніших стадіях інфекції може потребувати T-клітин, що є специфічними стосовно конкретних антигенів, що є експресованими у цей час. Вторинні вакцини, що безпосередньо націлені на бездіяльні стійкі бактерії, можуть допомагати у захисті проти реактивування ТБ, таким чином посилюючи контролювання ТБ, або навіть даючи змогу очищення від інфекції. Націлювання вакцини на латентний ТБ могло б тому значно та економічно зменшити частоти глобальної інфекції ТБ. Субодиничні вакцини на основі антигенів пізніх стадій можна також було б використовувати у комбінації з антигенами ранніх стадій для забезпечення багатофазних вакцин. Альтернативно, антигени пізніх стадій можна застосовувати для доповнювання та поліпшення вакцинування BCG (повторною імунізацією BCG-відповіді або розробкою сучасних рекомбінантних штамів BCG). Rv3616c, також відомий як Mtb40 або HTCC1, раніше вважали залученим y імунні відповіді, асоційовані з туберкульозом (дивись, наприклад, WO98/53075). Al-Attiyah et al. Clin. Exp. Immunol. 2004 138:139-144 показали, що Rv3616c є добре розпізнаваним (через проліферацією PMBC та продукуванням IFN-γ) пацієнтами з туберкульозом легень. Mustafa et al. Infect. Immun. 2006 74(8):4566-4572 дослідили розпізнавання Rv3616c інфікованою M. bovis та вакцинованою BCG великою рогатою худобою. Останнім часом, ряд вакцин-кандидатів M. tuberculosis запропоновані на основі біоінформатичного аналізу повного генома M. tuberculosis (Zvi et al. BMC Medical Genetics 2008 1:18) та на тестування характерно експресованих білків y активно та латентно інфікованих осіб (Schuck SD et al. PLoS ONE 2009 4(5):e5590). Тоді як макрофаги, як показано, діють, як головні ефектори імунітету від Mycobacterium, Tклітини є домінуючими індукторами такого імунітету. Істотну роль T-клітин стосовно захисту проти туберкульозу ілюстровано збільшеними частотами реактивування туберкульозу y осіб, інфікованих вірусом імунодефіциту людини, внаслідок асоційованого виснаження CD4+T-клітин. До того ж, адоптивне перенесення CD4+T-клітин на найвищому ступені первинної імунної відповіді на M. tuberculosis, як показано, надає захисту проти M. tuberculosis у мишей з дефіцитом T-клітин (Orme et al J. Exp. Med. 1983 158:74-83). Mycobacterium-реактивні CD4+T-клітини, як показано, є потужними виробниками γінтерферону (IFN-γ), що, у свою чергу, як показано, ініціює анті-мікобактеріальну дію макрофагів y мишей (Flynn et al. J. Exp. Med. 1993 178:2249-2254). Тоді як роль IFN-γ y людей є менш ясною, дослідження показали, що 1,25-дигідрокси-вітамін D3, поодинці або у комбінації з IFN-γ або фактором-альфа некрозу пухлин, активує макрофаги людини інгібувати інфекцію M. tuberculosis. До того ж, відомо, що IFN-γ стимулює макрофаги людини до створення 1,25дигідрокси-вітаміну D3. Подібним чином, інтерлейкін-12 (IL-12), як показано, грає роль у стимулюванні стійкості відносно інфекції M. tuberculosisї. Для огляду імунології інфекції M. tuberculosis, дивись Chan & Kaufmann, Tuberculosis: Pathogenesis, Protection та Control (Bloom ed., 1994), Tuberculosis (2nd ed., Rom та Garay, eds., 2003), та Harrison's Principles of Internal Medicine, Chapter 150, pp. 953-966 (16th ed., Braunwald, et al., eds., 2005). Заявлений винахід загалом стосується ідентифікації Rv3616c, як антигену ТБ, що є асоційованим з латентним ТБ, та пов'язаних процесів та застосування у запобіганні та лікуванні латентного ТБ та запобіганні або затримуванні реактивування туберкульозу. Винахід тому стосується білку Rv3616c, його варіанту або імуногенного фрагменту, або полінуклеотиду, що кодує вказаний білок, варіант або фрагмент, для застосування у лікуванні або запобіганні латентного ТБ. Відповідно, застосування може бути специфічним у лікуванні латентного ТБ. Альтернативно, застосування може полягати у запобіганні або затримуванні 7 UA 107330 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 реактивування туберкульозу (особливо затримуванні реактивування туберкульозу, наприклад, на місяці, роки або навіть необмежено). Термін "комплекс видів Mycobacterium tuberculosis" охоплює види, які, як традиційно вважають, спричинюють хворобу туберкульоз, а також екологічні чи умовно-патогенні види Mycobacterium, що спричинюють туберкульоз та хворобу легень у пацієнтів з послабленим імунітетом, як-то пацієнти зі СНІД, наприклад, M. tuberculosis, M. bovis, або M. africanum, BCG, M. avium, M. intracellulare, M. celatum, M. genavense, M. haemophilum, M. kansasii, M. simiae, M. vaccae, M. fortuitum, та M. scrofulaceum (дивись, наприклад, Harrison's Principles of Internal Medicine, Chapter 150, pp. 953-966 (16th ed., Braunwald, et al., eds., 2005). Заявлений винахід особливо стосується інфекції M. tuberculosis. Термін "активна інфекція" стосується інфекції (наприклад, інфекції M. tuberculosis) з виявленими симптомами хвороби та/або ураженнями (відповідно з виявленими симптомами хвороби). Терміни "пасивна інфекція", "бездіяльна інфекція" або "латентна інфекція" стосуються інфекції (наприклад, інфекції M. tuberculosis) без виявлених симптомів хвороби та/або уражень (відповідно без виявлених симптомів хвороби). Термін "первинний туберкульоз" стосується клінічної хвороби (виявлення симптомів хвороби) безпосередньо після інфекції (наприклад, інфекції M. tuberculosis). Дивись, Harrison's Principles of Internal Medicine, Chapter 150, pp. 953-966 (16th ed., Braunwald, et al., eds., 2005). Терміни "вторинний туберкульоз" або "пост-первинний туберкульоз" стосуються реактивування бездіяльної, пасивної або латентної інфекції (наприклад, інфекції M. tuberculosis). Дивись, Harrison's Principles of Internal Medicine, Chapter 150, pp. 953-966 (16th ed., Braunwald, et al., eds., 2005). Термін "реактивування туберкульозу" стосується пізнішого виявлення симптомів хвороби у особи, чиї тести позитивні стосовно інфекції (наприклад, у шкірному туберкуліновому тесті, відповідно в аналізі на основі T-клітин), але яка не має явних симптомів хвороби. Позитивний діагностичний тест вказує, що особа є інфікованою, однак, особа може мати або ні раніше виявлені симптоми активної хвороби, яку лікували достатньою мірою до переходу туберкульозу у пасивний або латентний стан. Треба знати, що способи запобігання, затримування або лікування реактивування туберкульозу можуть бути започатковувані у особи, яка виявляє активні симптоми хвороби. Термін "резистентний до ліків" туберкульоз стосується інфекції (наприклад, інфекції M. tuberculosis), де інфікувальний штам не є утримуваним статичним або вбитим (тобто є резистентним до) одної або більше так званої "фронт-лінії" хіміотерапевтичні агенти, ефективні у лікуванні туберкульозу (як-то, ізоніазид, рифампін, етамбутол, стрептоміцин та піразинамід). Термін "резистентний до багатьох ліків" туберкульоз стосується інфекції (наприклад, інфекції M. tuberculosis), де інфікувальний штам є резистентним до двох або більше хіміотерапевтичних агентів "фронт-лінії", ефективних у лікуванні туберкульозу. "Хіміотерапевтичний агент" стосується фармакологічного агенту, відомого та застосовуваного для лікування туберкульозу (наприклад, інфекції M. tuberculosis). Наведені фармакологічні агенти, застосовувані для лікування, охоплюють, але без обмеження амікацин, аміносаліцилову кислоту, капреoміцин, циклосерин, етамбутол, етіонамід, ізоніазид, канаміцин, піразинамід, рифаміцини (тобто, рифампін, рифапентин та рифабутин), стрептоміцин, oфлоксацин, ципрофлоксацин, кларитрoміцин, азитрoміцин та флуорохінолони. Хіміотерапевтичні агенти "першої-лінії" або "фронт-лінії", застосовувані для лікування туберкульозу, що не є резистентними до ліків, охоплюють ізоніазид, рифампін, етамбутол, стрептоміцин та піразинамід. Хіміотерапевтичні агенти "другої-лінії", застосовувані для лікування туберкульозу, що продемонстрували лікарську резистентність до одних або більше ліків "першої-ліні" охоплюють oфлоксацин, ципрофлоксацин, етіонамід, аміносаліцилову кислоту, циклосерин, амікацин, канаміцин та капреoміцин. Такі фармакологічні агенти розглянуті y Chapter 48 °F Goodman та Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Hardman та Limbird eds., 2001. Терміни "поліпептид", "пептид" та "білок" застосовують взаємозамінно і стосуються полімеру з амінокислотних залишків. Терміни також стосуються амінокислотних полімерів, у котрих один або більше амінокислотних залишків є штучними хімічними міметиками відповідних існуючих у природі амінокислот, а також існуючих у природі амінокислотних полімерів та неіснуючих у природі амінокислотних полімерів. Відповідно поліпептид згідно з заявленим винаходом складається тільки з існуючих у природі амінокислотних залишків, особливо амінокислот, кодованих генетичним кодом. 8 UA 107330 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Термін "амінокислота" стосується існуючих у природі та синтетичних амінокислот, а також амінокислотних аналогів та амінокислотних міметиків, що функціонують подібно існуючим у природі амінокислотам. Існуючі у природі амінокислоти є тими, що кодовані генетичним кодом, а також тими, що є далі модифікованими, наприклад, гідроксипролін, γ-карбоксиглутамат, та Oфосфосерин. Амінокислотні аналоги стосуються сполук, що мають таку ж основну хімічну будову, як існуюча у природі амінокислота, тобто, α карбон, що приєднано до гідрогену, карбоксигрупи, аміногрупи та R-групи, наприклад, гомосерин, норлейцин, метіонін сульфоксид, метіонін метил сульфоній. Такі аналоги мають модифіковані R-групи (наприклад, норлейцин) або модифіковані пептидні ланцюги, але залишають таку ж основну хімічну будову, як існуюча у природі амінокислота. Амінокислотні міметики стосуються хімічних сполук, що мають будову, що є відмінною від загальної хімічної структури амінокислоти, але яка функціонує подібно існуючій у природі амінокислоті. Відповідно амінокислоти є існуючою у природі амінокислотою або амінокислотним аналогом, особливо існуючою у природі амінокислотою, а зокрема амінокислотою кодованою генетичним кодом. "Нуклеїнова кислота" стосується дезоксирибонуклеотидів або рибонуклеотидів та їх полімерів в одно- або подвійно-ланцюговій формі. Термін охоплює нуклеїнові кислоти, що містять відомі нуклеотидні аналоги або модифіковані залишки або зв'язки ланцюга, що є синтетичними, існуючими у природ, та неіснуючими у природі, що мають подібні властивості зв'язування, як базова нуклеїнова кислота, та метаболізуються подібно базовим нуклеотидам. Приклади таких аналогів охоплюють, без обмеження, фосфоротіоати, фосфорамідати, метил фосфонати, хірал-метил фосфонати, 2-O-метил рибонуклеотиди, пептид-нуклеїнові кислоти (PNA). Відповідно термін "нуклеїнова кислота" стосується існуючих у природі дезоксирибонуклеотидів або рибонуклеотидів та їх полімерів. Якщо не вказане інше, певна послідовність нуклеїнової кислоти також безумовно містить її консервативно модифіковані варіанти (наприклад, заміщення виродженими кодонами) та комплементарні послідовності, а також послідовність, детально вказану (відповідно це стосується детально вказаної послідовності). Конкретно, заміщення виродженими кодонами можна досягти створенням послідовності, в якій третя позиція одного або більше вибраних (або усіх) кодонів є заміщеною змішаною з основою та/або залишками дезоксиінозину (Batzer et al., Nuсlеіс Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)). Термін нуклеїнова кислота застосовують взаємозамінно з геном, кДНК, мРНК, олігонуклеотидом та полінуклеотидом. Амінокислоти можна позначати їх звичайно відомими три-літерними символами або однолітерними символами, рекомендованими IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission. Nucleotides, подібно, можна позначати їх звичайними одно-літерними кодами. Термін "послідовність білку Rv3616c", як застосовувано тут, означає поліпептидну послідовність, запропоновану y SEQ ID No: 1 або її гомолог від комплексу видів Mycobacterium tuberculosis, наприклад, видів, як-то M. tuberculosis, M. bovis, або M. africanum, або видів Mycobacterium, що є екологічними чи умовно-патогенними та що спричинює умовно-патогенні інфекції, як-то інфекції легень у хазяїв з послабленим імунітетом (наприклад, пацієнтів зі СНІД), наприклад, BCG, M. avium, M. intracellulare, M. celatum, M. genavense, M. haemophilum, M. kansasii, M. simiae, M. vaccae, M. fortuitum, та M. scrofulaceum (дивись, наприклад, Harrison's Principles of Internal Medicine, Chapter 150, pp. 953-966, 16th ed., Braunwald, et al., eds., 2005). Для гарантування високого ступеню ефективності серед вакцинованих хазяїв, компоненти вакцини повинні бути добре збереженими серед штамів клінічного значення. Відповідно, Rv3616c білок є похідним від M. tuberculosis H37Rv (тобто поліпептидної послідовності запропонованої y SEQ ID No: 1) або його гомологом їх від ще одного штаму M. tuberculosis (якто CDC1551, F11, штами Haarlem A та C). Штами M. tuberculosis, що є асоційованими з лікарською резистентністю (наприклад, МЛР або особливо ЛР) є особливо корисним базисом для послідовностей білку Rv3616c. Корисні штами охоплюють: CDC1551 - заразний та вірулентний штам Родина Haarlem (як-то Haarlem A) - Резистентні до ліків штами, знайдені y людних популяціях. Члени родини штамів Haarlem of M. tuberculosis знайдені y багатьох частинах світу. Перші родини виявлені y Haarlem, Netherlands. KZN4207 - чутливі до ліків виділені з пацієнтів y KwaZulu-Natal, South Africa KZN1435 - мультирезистентні до ліків (МЛР) виділені з пацієнтів y KwaZulu-Natal, South Africa KZN605 - значною мірою резистентні до ліків (ЛР) виділені з пацієнтів y KwaZulu-Natal, South Africa 9 UA 107330 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 C - Високо передавані y New York City. В одному дослідженні цей штам, що знайдено як більш звичайний серед користувачів ін'єкційних ліків та резистентний до реактивних нітрогенпроміжних сполук (Friedman et al. J. Infect. Dis. 1997 176(2):478-84) 94_M4241A - виділено y San Francisco y 1994 з пацієнта народженого у Китаї. Цей штам раніше досліджували аналізом геномних делецій (Gagneux et al., PNAS 2006 103(8):2869-2873). 02_1987 - виділено y San Francisco y 2002 з пацієнта народженого у Південній Кореї. Цей штам раніше досліджували аналізом геномних делецій (Gagneux et al., PNAS 2006 103(8):28692873). T92 - виділено y San Francisco y 1999 з пацієнта народженого у Філіппінах. Цей штам опубліковано Hirsh et al. PNAS 2004 101:4871–4876). T85 - виділено y San Francisco y 1998 з пацієнта народженого у Китаї. Цей штам опубліковано Hirsh et al. PNAS 2004 101:4871–4876). EAS054 - виділено y San Francisco y 1993 з пацієнта народженого в Індії. Цей штам раніше досліджували аналізом геномних делецій (Gagneux et al., PNAS 2006 103(8):2869-2873). Gagneux et al., PNAS 2006 103(8):2869-2873 та Herbert et al. Infect. Immun. 2007 75(12):57985805 пропонують корисне підґрунтя на ряді існуючих штамів M. tuberculosis. Найбільш відповідно, Rv3616c білок є вибраним з поліпептидних послідовностей, запропонованих y SEQ ID Nos: 1 та 3-7, зокрема SEQ ID Nos: 1 та 3-6, як-то SEQ ID No: 1. Особливо корисними полінуклеотидами є ті, що містять послідовність (чи складаються з неї), що кодує: (i) послідовність білку Rv3616c; (ii) варіант послідовності білку Rv3616c; або (iii) імуногенний фрагмент послідовності білку Rv3616c. Полінуклеотиди відповідно містять (чи складаються з них) варіант SEQ ID NO: 2 або фрагмент SEQ ID NO: 2, що кодує імуногенний фрагмент білку Rv3616c. Комбінації Пов'язані з Rv3616c поліпептиди для застосування у заявленому винаході можуть крім того містити інші компоненти для посилення їх імуногенності або для поліпшення цих антигенів. Наприклад, поліпшене виділення антигенів поліпептиду можна полегшувати додаванням ділянки гістидинових залишків (звичайно відомої як гістидинова мітка) на одному кінці антигену. Термін "гістидинова мітка" стосується ланцюжка гістидинових залишків, звичайно 6 залишків, що вставляють у базову послідовність. Для мінімізування руйнування активності, асоційованої з базовою послідовністю, гістидинову мітку звичайно вставляють на N-закінченні, звичайно негайно після початку метіонінового залишку, або ж на C-закінченні. Вони є звичайно гетерологічними до природної послідовності, але їх уводять, оскільки вони полегшують виділення поліпшенням зв'язування білку зі смолою з іммобілізованою афінністю до металу для хроматографії (IMAC). Загалом присутність або відсутність гістидинової мітки не має значення з точки зору отримування бажаної імунної відповіді проти базового білку. Однак, для запобігання ризику шкідливої реакції проти самої гістидинової мітки, вважають найкращим мінімізувати довжину гістидинової мітки, наприклад, до чотирьох або менше залишків, зокрема двох залишків (або вилучити застосування гістидинової мітки цілком). Для поліпшення значення та/або широти отриманої імунної відповіді композиції, поліпептиди та нуклеїнові кислоти можуть містити багато копій винахідницького антигену та/або додаткових гетерологічних поліпептидів (або полінуклеотидів, що їх кодують) з видів Mycobacterium (зокрема M. tuberculosis). Спеціалісту треба знати, що коли ряд компонентів використовують у комбінації, точне представлення може варіювати. Наприклад, компонент Rv3616c та додаткова копія антигену або додатковий компонент гетерологічного антигену могли б бути представленими: (1) як два індивідуальні поліпептидні компоненти; (2) як зрощений білок, який містить обидва поліпептидні компоненти; (3) як один поліпептидний та один полінуклеотидний компонент; (4) як два індивідуальні полінуклеотидні компоненти; (5) як одиничний полінуклеотид, що кодує два індивідуальні поліпептидні компоненти; або (6) як одиничний полінуклеотид, що кодує зрощений білок, який містить обидва поліпептидні компоненти. Цю гнучкість застосовувано рівною мірою до ситуації, де три або більше компоненти застосовують у комбінації. Однак, для зручності, часто бажано, щоб коли був представленим ряд компонентів вони були в одиничному зрощеному білку або полінуклеотиді, що кодує одиничний зрощений білок. В одному втіленні винаходу усі компоненти антигену запропоновані, як поліпептиди (наприклад, в одиничному зрощеному білку). В альтернативному втіленні 10 UA 107330 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 винаходу усі компоненти антигену запропоновані, як полінуклеотиди (як-то, одиничний полінуклеотид, як-то полінуклеотид, що кодує одиничний зрощений білок). Термін "гетерологічний", при застосуванні з посиланням на частини нуклеїнової кислоти вказує, що нуклеїнова кислота містить дві або більше підпослідовності, що не знайдено у такому ж співвідношенні у природі. Наприклад, нуклеїнова кислота є звичайно рекомбінантно отримуваною, маючи дві або більше послідовностей від неспоріднених генів, влаштовуваних для створення нової функціональної нуклеїнової кислоти, наприклад, промотер з одного джерела та кодувальний регіон з ще одного джерела. Подібним чином, гетерологічний білок вказує, що білок містить дві або більше підпослідовності, що не знайдено у такому ж співвідношенні у природі (наприклад, зрощений білок). "Зрощений поліпептид" або "зрощений білок" стосується білку, що має принаймні два гетерологічні поліпептиди (наприклад, принаймні два Mycobacterium sp. поліпептиди) ковалентно зв'язані, безпосередньо або через амінокислотний лінкер. Поліпептиди, що утворюють зрощений білок є звичайно зв'язаними C-закінченням з N-закінченням, хоча вони можуть також бути зв'язаними C-закінченням з C-закінченням, N-закінченням з N-закінченням, або N-закінченням з C-закінченням. Поліпептиди зрощеного білку можуть бути у будь-якому порядку. Цей термін також стосується консервативно модифікованих варіантів, поліморфних варіантів, алелей, мутантів, імуногенних фрагментів та міжвидових гомологів антигенів, що комплектують зрощений білок. Антигени Mycobacterium tuberculosis описані y Cole et al., Nature 393:537 (1998), де розкрито повний геном M. tuberculosis. Антигени від інших видів Mycobacterium, що відповідають антигенам M. tuberculosis, можна ідентифікувати, наприклад, застосовуючи алгоритми порівняння послідовностей, як описано тут, або інші способи, відомі спеціалістам, наприклад, аналізи гібридизації та аналізи зв'язування антитіл. Термін "зрощений" стосується ковалентного зв'язку між двома поліпептидами у зрощеному білку. Поліпептиди є звичайно об'єднаними пептидним зв'язком, або амінокислотним лінкером. Необов'язково, пептиди можуть бути об'єднаними непептидними ковалентними зв'язками, відомими спеціалістам. Зразкові антигени M. tuberculosis, що можна комбінувати з Rv3616c охоплюють одне або більше з (наприклад, 1 – 5, як-то 1 – 3, зокрема 1) нижченаведеного (як-то одне або більше з (i) – (xi)): (i) Mtb8,4 (також відомий як DPV та Rv1174c), поліпептидну послідовність якого описано y SEQ ID No: 102 WO97/09428 (кДНК y SEQ ID No: 101) та y Coler et al Journal of Immunology 1998 161:2356-2364. особливий інтерес має розвинена послідовність Mtb8,4, що не має головного сигнального пептиду (тобто амінокислотних залишків 15-96 від SEQ ID No: 102 WO97/09428). Поліпептидну послідовність повної довжини Mtb8,4 показано y SEQ ID No: 8; (ii) Mtb9,8 (також відомий як MSL та Rv0287), поліпептидну послідовність якого описано y SEQ ID No: 109 WO98/53075 (фрагменти MSL розкриті y SEQ ID Nos: 110-124 WO98/53075, SEQ ID Nos: 119 та 120, що мають особливий інтерес) та також y Coler et al Vaccine 2009 27:223-233 (зокрема реактивні фрагменти, показані y Фіг. 2 там). Поліпептидну послідовність повної довжини для Mtb9,8 показано y SEQ ID No: 9; (iii) Mtb9,9 (також відомий як Mtb9,9A, MTI, MTI-A та Rv1793) поліпептидну послідовність якого описано y SEQ ID No: 19 WO98/53075 та y Alderson et al Journal of Experimental Medicine 2000 7:551-559 (фрагменти MTI розкриті y SEQ ID Nos: 17 та 51-66 WO98/53075, SEQ ID Nos: 17, 51, 52, 53, 56 та 62-65, що мають особливий інтерес). Ряд поліпептидних варіантів MTI описані y SEQ ID Nos: 21, 23, 25, 27, 29 та 31 WO98/53075 та y Alderson et al Journal of Experimental Medicine 2000 7:551-559. Поліпептидну послідовність повної довжини для Mtb9,9 показано y SEQ ID No: 10; (iv) Ra12 (також відомий як Mtb32A C-кінцевий антиген) поліпептидну послідовність якого описано y SEQ ID No: 10 WO01/98460 та y Skeiky et al Journal of Immunology 2004 172:76187682. Поліпептидну послідовність повної довжини для Ra12 показано y SEQ ID No: 11; (v) Ra35 (також відомий як Mtb32A N-кінцевий антиген) поліпептидну послідовність якого описано y SEQ ID No: 8 WO01/98460 та y Skeiky et al Journal of Immunology 2004 172:7618-7682. Поліпептидну послідовність повної довжини для Ra35 показано y SEQ ID No: 12; (vi) TbH9 (також відомий як Mtb39, Mtb39A, TbH9FL та Rv1196) поліпептидну послідовність якого описано y SEQ ID No: 107 WO97/09428, та також y Dillon et al Infection та Immunity 1999 67(6):2941-2950 та Skeiky et al Journal of Immunology 2004 172:7618-7682. Поліпептидну послідовність повної довжини для TbH9 показано y SEQ ID No: 13; (vii) Mtb41 (також відомий як MTCC2 та Rv0915c) поліпептидну послідовність якого описано y SEQ ID No: 142 WO98/53075 (кДНК y SEQ ID No: 140) та y Skeiky et al Journal of Immunology 11 UA 107330 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 2000 165:7140-7149. Поліпептидну послідовність повної довжини для Mtb41 показано y SEQ ID No: 14; (viii) ESAT-6 (також відомий як esxA та Rv3875) поліпептидну послідовність якого описано y SEQ ID No: 103 WO97/09428 (кДНК y SEQ ID No: 104) та y Sorensen et al Infection та Immunity 1995 63(5):1710-1717. Поліпептидну послідовність повної довжини для ESAT-6 показано y SEQ ID No: 15.L. Sorensen, S. Nagai, G. Houen, P. Andersen and A.B. Andersen, Purification and characterization of a low-molecular-mass T-cell antigen secreted by Mycobacterium tuberculosis, Infect Immun 63 (1995) (5), pp. 1710–1717; (ix) Складні антигени Ag85 (наприклад, Ag85A, також відомий як fbpA та Rv3804c; або Ag85B, також відомий як fbpB та Rv1886c), що обговорені, наприклад, y Вміст et al Infection та Immunity 1991 59:3205-3212 та y Huygen et al Nature Medicine 1996 2(8):893-898. Поліпептидну послідовність повної довжини для Ag85A показано y SEQ ID No: 16 (розвинені залишки білку 43338, тобто втрачений сигнальний пептид, що має особливий інтерес). Поліпептидну послідовність повної довжини для Ag85B показано y SEQ ID No: 17 (розвинені залишки білку 41325, тобто втрачений сигнальний пептид, що має особливий інтерес); (x) Альфа-кристалін (також відомий як hspX та Rv2031c), що описано y Verbon et al Journal of Bacteriology 1992 174:1352-1359 та Friscia et al Clinical та Experimental Immunology 1995 102:5357 (особливий інтерес мають фрагменти, що відповідають залишки 71-91, 21-40, 91-110 та 111130)). Поліпептидну послідовність повної довжини для альфа-кристаліну показано y SEQ ID No: 18; (xi) Mpt64 (також відомий як Rv1980c), що описано y Roche et al Scandinavian Journal of Immunology 1996 43:662-670. Поліпептидну послідовність повної довжини для MPT64 показано y SEQ ID No: 19 (розвинені залишки білку 24-228, тобто втрачений сигнальний пептид, що має особливий інтерес): (xii) Mtb32A, поліпептидну послідовність якого описано y SEQ ID No: 2 (повної довжини) та залишки 8-330 SEQ ID No: 4 (розвинений) WO01/98460, особливо варіанти, що мають принаймні одну з каталітичних мутованих тріад (наприклад, каталітичний залишок серину, що може, наприклад, бути мутованим до аланіну). Поліпептидну послідовність повної довжини для Mtb32A показано y SEQ ID No: 20. Розвинену форму Mtb32A, що має мутацію Ser/Ala показано y SEQ ID No: 21; (xiii) TB10,4, поліпептидну послідовність повної довжини для TB10,4 показано y SEQ ID No: 22;.L. Sorensen, S. Nagai, G. Houen, P. Andersen and A.B. Andersen, Purification and characterization of a low-molecular-mass T-cell antigen secreted by Mycobacterium tuberculosis, Infect Immun 63 (1995) (5), pp. 1710–1717; (xiv) Rv1753c, поліпептидну послідовність повної довжини для Rv1753c від Mycobacterium tuberculosis H37Rv показано y SEQ ID No: 157; (xv) Rv2386c, поліпептидну послідовність повної довжини для Rv2386c від Mycobacterium tuberculosis H37Rv показано y SEQ ID No: 158; та/або (xvi) Rv2707c, поліпептидну послідовність повної довжини для Rv2707c від Mycobacterium tuberculosis H37Rv показано y SEQ ID No: 159. або їх комбінації, як-то (наприклад, комбінації, як-то (a) – (g)): (a) комбінація компонентів Ra12, TbH9 та Ra35, наприклад, у формі зрощеного білку, як-то Mtb72f. Поліпептидну послідовність Mtb72f описано y SEQ ID No: 6 WO2006/117240 (кДНК y SEQ ID No: 5) та y Skeiky et al Journal of Immunology 2004 172:7618-7682 (де уведено необов'язкову гістидинову мітку для допомоги очищенню, при використанні у заявленому винаході, відповідно Mtb72f є відсутніми необов'язкові гістидинові залишки). Поліпептидну послідовність для Mtb72f показано y SEQ ID No: 23; (b) комбінація Ra12, TbH9 та Ser/Ala мутованого Ra35 (тобто, де каталітичний залишок серину заміщено аланіном) компоненти, наприклад, у формі зрощеного білку, як-то M72. Поліпептидну послідовність M72 описано y SEQ ID No: 4 WO2006/117240 (кДНК y SEQ ID No: 3), де уведено необов'язковий подвійний гістидин для допомоги виробництву, при використанні у заявленому винаході у M72 можна також уводити подвійний гістидин, хоча відповідно у M72 є відсутнім необов'язковий подвійний гістидин (тобто залишки 4-725 від SEQ ID No: 4 WO2006/117240 мають особливий інтерес). Поліпептидну послідовність для M72 показано y SEQ ID No: 24; (c) компоненти комбінації Mtb8,4, Mtb9,8, Mtb9,9 та Mtb41, наприклад, у формі зрощеного білку, як-то Mtb71f. Поліпептидну послідовність Mtb71f описано y SEQ ID No: 16 WO99/051748 (кДНК y SEQ ID No: 15), де уведено необов'язкову гістидинову мітку для допомоги очищенню, при використанні у заявленому винаході, відповідно Mtb71f відповідає амінокислотним 12 UA 107330 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 залишкам 9-710 SEQ ID NO: 16 від WO99/051748. Поліпептидну послідовність для Mtb71f показано y SEQ ID No: 25; (d) комбінація Mtb72f або M72 (відповідно без необов'язкових гістидинових залишків для допомоги експресії) з Mtb9,8 та Mtb9,9, наприклад, у зрощеному білку. Поліпептидну послідовність для зрощення M72-Mtb9,9-Mtb9,8 показано y SEQ ID No: 26 (M92 зрощення), при застосуванні у заявленому винаході, у зрощення M72-Mtb9,9-Mtb9,8 можна необов'язково уводити подвійний гістидин після початку залишку метіоніну для допомоги виробництву; (e) комбінація Mtb72f або M72 (відповідно без необов'язкових гістидинових залишків для допомоги експресії) з Ag85B, наприклад, у зрощеному білку, Mtb103f. Поліпептидну послідовність Mtb103f описано y SEQ ID No: 18 WO03/070187 (кДНК y SEQ ID No: 10), де уведено необов'язкову гістидинову мітку для допомоги очищенню, при використанні у заявленому винаході, відповідно Mtb103f відповідає амінокислотним залишкам 8-1016 SEQ ID No: 18 від WO03/070187. Також особливий інтерес має M103, тобто Mtb103f, що уводить мутацію Ser/Ala у компонент Ra35, при використанні у заявленому винаході, відповідно M103 відповідає амінокислотним залишкам 8-1016 SEQ ID No: 18 від WO03/070187 де Ser у позиції 710 заміщено Ala. Поліпептидну послідовність для M103 показано y SEQ ID No: 27, при застосуванні у заявленому винаході, у зрощення M72-Mtb9,9-Mtb9,8 можна необов'язково уводити подвійний гістидин після початку залишку метіоніну для допомоги виробництву; (f) комбінація Mtb72f або M72 (відповідно без необов'язкових гістидинових залишків для допомоги експресії) з Mtb41, наприклад, у зрощеному білку, Mtb114f. Поліпептидну послідовність Mtb114f описано y SEQ ID No: 16 WO03/070187 (кДНК y SEQ ID No: 9), де уведено необов'язкову гістидинову мітку для допомоги очищенню, при використанні у заявленому винаході, відповідно Mtb114f відповідає амінокислотним залишкам 8-1154 SEQ ID No: 16 від WO03/070187. Також особливий інтерес має M114, тобто Mtb114f, що уводить мутацію Ser/Ala у компонент Ra35, при використанні у заявленому винаході, відповідно M114 відповідає амінокислотним залишкам 8-1154 SEQ ID No: 16 від WO03/070187 де Ser у позиції 710 заміщено Ala. Поліпептидну послідовність для M114 показано y SEQ ID No: 28, при застосуванні у заявленому винаході, у зрощення M72-Mtb9,9-Mtb9,8 можна необов'язково уводити подвійний гістидин після початку залишку метіоніну для допомоги виробництву; (g) комбінація компонентів Ag85B та ESAT-6, як-то y зрощенні, описаному Doherty et al Journal of Infectious Diseases 2004 190:2146–2153; та/або (год.) комбінація компонентів Ag85B та TB10,4, як-то y зрощенні, описаному Dietrich et al Journal of Immunology 2005 174(10):6332-6339 190:2146–2153. Комбінації компоненту Rv3616c та компоненту Rv1753c мають особливий інтерес. Можна банально пропонувати так комбінації могло б необов'язково містять інші додаткові компоненти антигену (наприклад, M72 компонент). Ще одна корисна комбінація містить компонент Rv3616c та компонент M72. Наступна корисна комбінація містить компонент Rv3616c та компонент Rv2386c. Інші корисні комбінації охоплюють ті, що містять компонент Rv3616c та компонент Rv2707c. Додаткова корисна комбінація містить компонент Rv3616c та компонент альфа-кристаліну. Спеціалісту треба знати, що комбінації не залежать від конкретних послідовностей, описаних вище y (i)-(xvi) та (a)-(год.), та що консервативно модифіковані варіанти (наприклад, що мають принаймні 70 % ідентичності, як-то принаймні 80 % ідентичності, зокрема принаймні 90 % ідентичності та особливо принаймні 95 % ідентичності) або імуногенні фрагменти (наприклад, принаймні 20 % повної довжини антигену, як-то принаймні 50 % антигену, зокрема принаймні 70 % та особливо принаймні 80 %) описаних послідовностей можна застосовувати для досягнення такої ж практичної дії. Кожну з вищенаведених індивідуальних послідовностей антигенів також розкрито y Cole et al Nature 1998 393:537-544 та Camus Microbiology 2002 148:2967-2973. Геном M. tuberculosis H37Rv є загально доступним, наприклад, при Welcome Trust Sanger Institute вебсайт (www.sanger.ac.uk/Projects/M_туберкульоз/). Багато вищенаведених антигенів також розкрито y заявках на патенті США № під номерами 08/523,435, 08/523,436, 08/658,800, 08/659,683, 08/818,111, 08/818,112, 08/942,341, 08/942,578, 08/858,998, 08/859,381, 09/056,556, 09/072,596, 09/072,967, 09/073,009, 09/073,010, 09/223,040, 09/287,849 та у заявках на патент PCT/US98/10407, PCT/US98/10514, PCT/US99/03265, PCT/US99/03268, PCT/US99/07717, WO97/09428 та WO97/09429, WO98/16645, WO98/16646, що тут уведено як посилання. Композиції, поліпептиди та нуклеїнові кислоти винаходу можуть також містити додаткові поліпептиди з інших джерел. Наприклад, композиції та зрощені білки винаходу можуть охоплювати поліпептиди або нуклеїнові кислоти, що кодують поліпептиди, де поліпептид 13 UA 107330 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 посилює експресію антигену, наприклад, NS1, білку вірусу грипу (дивись, наприклад, WO99/40188 та WO93/04175). Нуклеїнові кислоти винаходу можна створювати на основі віддання переваги кодону у кращих видах, наприклад, людей (у випадку експресії іn vivo) або певних бактерій (у випадку отримання поліпептиду). Компонент Rv3616c можна також застосовувати з одним або більше хіміотерапевтичними агентами, ефективними проти туберкульозу (наприклад, інфекції M. tuberculosis). Приклади таких хіміотерапевтичних агентів охоплюють, але без обмеження, амікацин, аміносаліцилову кислоту, капреoміцин, циклосерин, етамбутол, етіонамід, ізоніазид, канаміцин, піразинамід, рифаміцини (тобто, рифампін, рифапентин та рифабутин), стрептоміцин, oфлоксацин, ципрофлоксацин, кларитрoміцин, азитрoміцин та флуорохінолони. Таку хіміотерапію визначає лікар, застосовуючи кращі комбінації ліків. Хіміотерапевтичні агенти "першої-лінії", застосовувані для лікування туберкульозу (наприклад, інфекції M. tuberculosis), що не є резистентним до ліків, охоплюють ізоніазид, рифампін, етамбутол, стрептоміцин та піразинамід. Хіміотерапевтичні агенти "другої-лінії", застосовувані для лікування туберкульозу (наприклад, інфекції M. tuberculosis), що продемонстрували лікарську резистентність до одних або більше ліків "першої-ліні" охоплюють oфлоксацин, ципрофлоксацин, етіонамід, аміносаліцилову кислоту, циклосерин, амікацин, канаміцин та капреoміцин. Звичайні хіміотерапевтичні агенти загалом застосовують протягом відносно довгого часу (приблизно 9 місяців). Комбінація звичайних хіміотерапевтичних агентів із застосуванням компоненту Rv3616c згідно з заявленим винаходом може давати змогу зменшувати період хіміотерапевтичного лікування (наприклад, до 8 місяців, 7 місяців, 6 місяців, 5 місяців, 4 місяців, 3 місяців або менше) без зменшення ефективності. Особливий інтерес має застосування компоненту Rv3616c разом з Bacillus Calmette-Guerin (BCG). Наприклад, у формі модифікованої BCG, що рекомбінантно експресує Rv3616c (або його варіант або фрагмент, як описано тут). Альтернативно, компонент Rv3616c можна застосовувати для посилення відповіді особи до вакцинування BCG, співзастосуванням або повторною імунізацією раніше вакцинованих BCG. При застосуванні для посилення відповіді особи до вакцинування BCG, компонент Rv3616c можна банально пропонувати у формі поліпептиду або полінуклеотиду (необов'язково разом з додатковими антигенними компонентами, як описано вище). Спеціалісту треба знати, що комбінації компонентів необов'язково застосовувати разом та можна використовувати: окремо або у комбінації; у той же час, послідовно або протягом короткого періоду; одним або відмінними шляхами. Як би там не було, для зручності загалом бажане (де режими застосування є сумісними) застосування комбінації компонентів як одиничної композиції. Поліпептиди, полінуклеотиди та композиції заявленого винаходу звичайно можна також застосовувати і до людей, але вони є ефективними в інших ссавцях, охоплюючи домашніх ссавців (наприклад, собак, котів, кролів, щурів, мишей, морських свинок, хом'яків, шиншил) та сільськогосподарських ссавців (наприклад, корів, свиней, овець, кіз, коней). ІМУНОГЕННІ ФРАГМЕНТИ Епітопи T-клітин є короткими суміжними ділянками амінокислот, що є розпізнаваними Tклітинами (як-то CD4+ або CD8+T-клітини). Ідентифікації епітопів T-клітин можна досягти картуванням епітопів, що є добре відомим спеціалістам (дивись, наприклад, Paul, Fundamental Immunology, 3rd ed., 243-247 (1993); Beiβbarth et al Bioinformatics 2005 21(Suppl. 1):i29-i37). Альтернативно, епітопи можна прогнозувати, застосовуючи підходи, обговорені у прикладах. Як результат ключової участі відповіді T-клітин при туберкульозі, є безсумнівним, що фрагменти повної довжини поліпептиду Rv3616c, які містять принаймні один T-клітинний епітоп, повинні бути імуногенними та можуть сприяти імунозахисту. Такі фрагменти є позначеними тут як імуногенні фрагменти. Імуногенні фрагменти згідно з заявленим винаходом звичайно містять принаймні 9 суміжних амінокислот повної довжини (наприклад, принаймні 10), як-то принаймні 12 суміжних амінокислот (наприклад, принаймні 15 або принаймні 20 суміжних амінокислот), зокрема принаймні 50 суміжних амінокислот, як-то принаймні 100 суміжних амінокислот (наприклад, принаймні 200 суміжних амінокислот). Відповідно імуногенні фрагменти повинні мати принаймні 20 %, як-то принаймні 50 %, принаймні 70 % або принаймні 80 % довжини поліпептидної послідовності повної довжини. Слід розуміти, що у відмінній безпородній популяції, як-то людей, відмінні типи HLA означають, що специфічні епітопи можуть не бути розпізнаваними усіма членами популяції. Тому, для максимізації рівня розпізнавання та градації імунної відповіді на поліпептид, загалом 14 UA 107330 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 бажано, щоб імуногенний фрагмент містив множинність епітопів з послідовності повної довжини (відповідно усі епітопи). Особливі фрагменти білку Rv3616c, що можна застосовувати, охоплюють ті, що містять принаймні один епітоп CD4+, відповідно принаймні два епітопи CD4+ та особливо усі епітопи CD4+ (як-то епітопи, описані у прикладах та y SEQ ID Nos: 29-47, особливо асоційовані з множинністю алелей HLA, наприклад, асоційовані з 2, 3, 4, 5 або більше алелями). Інші фрагменти білку Rv3616c, що можна застосовувати охоплюють ті, що містять принаймні один епітоп CD8, відповідно принаймні два епітопи CD8 та особливо усі епітопи CD8 (як-то епітопи, описані у прикладах та y SEQ ID Nos: 48-126, особливо асоційовані з множинністю алелей HLA, наприклад, асоційовані з 2, 3, 4, 5 або більше алелями). Де застосовують індивідуальний фрагмент поліпептиду повної довжини, такий фрагмент вважають імуногенним, де він отримує відповідь, що має принаймні 20 %, відповідно принаймні 50 % та особливо принаймні 75 % (як-то принаймні 90 %) активності базової послідовності в іn vitro аналізі рестимулювання PBMC або цільної крові специфічними антигенами (наприклад, рестимулювання протягом від кількох годин до двох тижнів, як-то до одної доби, 1 доба – 1 тиждень або 1 – 2 тижні), що вимірює активування клітин лімфопроліферацією, отримання цитокінів у супернатанті культури (виміряно за допомогою ELISA, CBA тощо) або визначення параметрів відповідей T- та B-клітин внутрішньо- та зовнішньоклітинним фарбуванням (наприклад, застосовуючи специфічні стосовно антитіл імунні маркери, як-то CD3, CD4, CD8, IL2, TNFa, IFNg, CD40L, CD69 тощо), а потім цитометрією у потоці. Відповідно, фрагмент вважають імуногенним, де він отримує відповідь, що має принаймні 20 %, відповідно принаймні 50 % та особливо принаймні 75 % (як-то принаймні 90 %) активності базової послідовності у аналізі проліферації T-клітин та/або продукування IFN-γ. У деяких відмінних обставинах множинність фрагментів поліпептиду повної довжини (що можуть перекриватися або ні та можуть покривати суцільність послідовності повної довжини або ні) можна застосовувати для отримання еквівалентної біологічної відповіді на саму послідовність повної довжини. Наприклад, принаймні два імуногенні фрагменти (як-то три, чотири або п'ять), як описано вище, що у комбінації забезпечують принаймні 50 %, відповідно принаймні 75 % та особливо принаймні 90 % активності базової послідовності в іn vitro аналізі рестимулювання PBMC або цільної крові (наприклад, аналізі проліферації T-клітин та/або продукування IFN-γ). Пептиди SEQ ID Nos: 127-156 є особливо корисними фрагментами (особливо SEQ ID Nos: 127-133 та 143-156). ВАРІАНТИ "Варіанти" або "консервативно модифіковані варіанти" застосовувано для послідовностей амінокислот та нуклеїнових кислот. Стосовно послідовностей особливих нуклеїнових кислот, консервативно модифіковані варіанти стосуються нуклеїнових кислот, що кодують ідентичні або по суті ідентичні послідовності амінокислот, або, де нуклеїнова кислота не кодує послідовність амінокислот, до по суті ідентичних послідовностей. Внаслідок виродження генетичного коду, велике число функціонально ідентичних нуклеїнових кислот кодують будь-який певний білок. Наприклад, кодони GCA, GCC, GCG та GCU усі кодують амінокислоту аланін. Таким чином, у кожній позиції, де аланін визначено кодоном, кодон можна замінити на будь-які відповідні описані кодони без зміни кодованого поліпептиду. Такі варіанти нуклеїнових кислот дають "мовчазні" або "вироджені" варіанти, що є одними видами консервативно модифікованих варіантів. Кожна послідовність нуклеїнової кислоти тут, що кодує поліпептид, також описує кожний можливий мовчазний варіант нуклеїнової кислоти. Спеціалісту треба знати, що кожний кодон у нуклеїновій кислоті (за винятком AUG, що є звичайно кодоном тільки для метіоніну, та TGG, що є звичайно кодоном тільки для триптофану) можна модифікувати до функціонально ідентичної молекули. Таким чином, кожний мовчазний варіант нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептид, є прихованим у кожній описаній послідовності. Полінуклеотид винаходу може містити ряд мовчазних варіантів (наприклад, 1-50, як-то 1-25, зокрема 1-5, та особливо 1 кодон(ів) можна замінити), при порівнянні з базовою послідовністю. Полінуклеотид винаходу може містити ряд немовчазних консервативних варіантів (наприклад, 1-50, як-то 1-25, зокрема 1-5, та особливо 1 кодон(ів) можна замінити), при порівнянні з базовою послідовністю. Немовчазними варіантами є ті, що призводять до зміни кодованої послідовності амінокислот (заміщенням, делецією або додаванням амінокислотних залишків). Спеціалістам треба знати, що особлива полінуклеотидна послідовність може містити мовчазні та немовчазні консервативні варіанти. 15 UA 107330 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Стосовно варіантів послідовності білку, спеціалісту треба знати, що індивідуальні заміщення, делеції або добавки до поліпептиду, що змінюють, додають або вилучають одиничну амінокислоту або невеликий процент амінокислот, є "консервативно модифікованим варіантом", де зміна призводить до заміщення амінокислоти функціонально подібною амінокислотою, або заміщення/делеції/додавання залишків, що не впливають по суті на біологічну функцію варіанту. Таблиці консервативного заміщення, що забезпечують функціонально подібні амінокислоти, є добре відомими. Такі консервативно модифіковані варіанти є на додаток та не вилучають поліморфних варіантів, міжвидових гомологів та алелей винаходу. Поліпептид винаходу може містити ряд консервативних заміщень (наприклад, 1-50, як-то 125, зокрема 1-10, та особливо 1 амінокислотних залишків можна замінити), при порівнянні з базовою послідовністю. Загалом, такі консервативні заміщення стосуються одного амінокислотних групувань, визначених нижче, хоча у деяких відмінних обставинах інші заміщення можуть бути можливими без впливу по суті на імуногенні властивості антигену. Нижченаведені 8 груп містять амінокислоти, що є звичайно консервативними заміщеннями для кожної з них: 1) Аланін (A), Гліцин (G); 2) Аспарагінова кислота (D), Глутамінова кислота (E); 3) Аспарагін (N), Глутамін (Q); 4) Аргінін (R), Лізин (K); 5) Ізолейцин (I), Лейцин (L), Метіонін (M), Валін (V); 6) Фенілаланін (F), Тирозин (Y), Триптофан (W); 7) Серин (S), Треонін(T); та 8) Цистеїн (C), Метіонін (M) (дивись, наприклад, Creighton, Proteins 1984). Відповідно такі заміщення не існують у регіоні епітопу, та тому не мають значного впливу на імуногенні властивості антигену. Варіанти білків можуть також охоплювати ті, де вставляють додаткові амінокислоти порівняно з базовою послідовністю, наприклад, такі інсерції можуть існувати у 1-10 позиціях (якто 1-5 позиціях, відповідно 1 або 2 позиціях, зокрема 1 позиції) та можуть, наприклад, бути задіяними при додаванні 50 або менше амінокислот у кожній позиції (як-то 20 або менше, зокрема 10 або менше, особливо 5 або менше). Відповідно такі інсерції не існують у регіоні епітопу, та тому не мають значного впливу на імуногенні властивості антигену. Один приклад інсерції охоплює коротку ділянку гістидинових залишків (наприклад, 2-6 залишків) для допомоги експресії та/або очищенню розглянутого антигену. Варіанти білків охоплюють ті, де амінокислоти мають делеції порівняно з базовою послідовністю, наприклад, такі делеції можуть існувати у 1-10 позиціях (як-то 1-5 позиціях, відповідно 1 або 2 позиціях, зокрема 1 позиції) та можуть, наприклад, бути задіяними делеції 50 або менше амінокислот у кожній позиції (як-то 20 або менше, зокрема 10 або менше, особливо 5 або менше). Відповідно такі делеції не існують у регіоні епітопу, та тому не мають значного впливу на імуногенні властивості антигену. Спеціалісту треба знати, що особливий варіант білку може містити заміщення, делеції та добавки (або будь-яку їх комбінацію). Способи визначення регіонів епітопу антигену описані та наведені у прикладах. Варіанти переважно виявляють принаймні приблизно 70 % ідентичності, більш переважно принаймні приблизно 80 % ідентичності та найбільш переважно принаймні приблизно 90 % ідентичності (як-то принаймні приблизно 95 %, принаймні приблизно 98 % або принаймні приблизно 99 %) порівняно з асоційованою базовою послідовністю. Терміни "ідентичний" або процент "ідентичності, ” у контексті двох або більше послідовностей нуклеїнових кислот або поліпептидів, стосуються двох або більше послідовностей або підпослідовностей, що є такими ж або мають визначений процент амінокислотних залишків або нуклеотидів, що є таким же (тобто, 70 % ідентичності, необов'язково 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % або 99 % ідентичності з визначеним регіоном), при порівнянні та звірянні стосовно максимуму відповідності в межах вікна порівняння, або позначеного регіону, що виміряно, застосовуючи один з нижченаведених алгоритмів порівняння послідовностей або мануальним звірянням та візуальним оглядом. Такі послідовності тоді вказані як "по суті ідентичні.” Це визначення також стосується компліменту тест-послідовності. Необов'язково, ідентичність існує у регіоні, що має принаймні приблизно 25 – 50 амінокислот або нуклеотидів у довжину, або необов'язково у регіоні, що має 75-100 амінокислот або нуклеотидів у довжину. Відповідно, порівняння проводять у вікні, що відповідає суцільній довжині базової послідовності. 16 UA 107330 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Для порівняння послідовностей, звичайно одна послідовність діє, як базова послідовність, з якою є порівнюваними тест-послідовності. При застосуванні алгоритму порівняння тестпослідовностей та базових послідовностей їх уводять у комп'ютер, координати підпослідовностей позначають, якщо необхідно, та позначають параметри програми алгоритмів послідовності. Можна застосовувати параметри програми за умовчанням, або можуть бути позначеними альтернативні параметри. Алгоритм порівняння послідовностей тоді розраховує процент ідентичності послідовностей для тест-послідовності відносно базової послідовності, на основі параметрів програми. "Вікно порівняння", як застосовувано тут, стосується сегменту, в якому послідовність можна порівнювати з базовою послідовністю такого ж номеру суміжних позицій після оптимального звіряння двох послідовностей. Способи звіряння послідовностей для порівняння є добре відомими. Оптимальне звіряння послідовностей для порівняння можна проводити, наприклад, алгоритмом локальної гомології Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), алгоритмом звіряння гомології Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), способом пошуку подібності Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), комп'ютеризованою імплементацією цих алгоритмів (GAP, BESTFIT, FASTA, та TFASTA y Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Grоuр, 575 Science Dr., Madison, WI), або мануальним звірянням та візуальним оглядом (дивись, наприклад, Current Protocols іn Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1995) ). Одним прикладом корисного алгоритму є PILEUP. PILEUP створює багатократне звіряння послідовностей з групи споріднених послідовностей, застосовуючи прогресивні попарні звіряння для виявлення співвідношення та проценту ідентичності послідовності. Він також наносить на графік дерево або деревовидну діаграму, що показує співвідношення кластеризації, застосовувані для створення звіряння. PILEUP використовує спрощення способу прогресивного звіряння Feng & Doolittle, J. Mol. Evol. 35:351-360 (1987). Спосіб є подібним способу, описаному Higgins & Sharp, CABIOS 5:151-153 (1989). Програма може звіряти до 300 послідовностей з максимальною довжиною 5000 нуклеотидів або амінокислот. Багатократне звіряння починають парним звірянням двох найбільш подібних послідовностей, створюючи кластер двох звірених послідовностей. Цей кластер тоді звіряють з наступною найбільш спорідненою послідовністю або кластером звірених послідовностей. Два кластери послідовностей звіряють простим подовженням попарного звіряння двох індивідуальних послідовностей. Кінцевого звіряння досягають серіями прогресивних попарних звірянь. Програму виконують позначенням специфічних послідовностей та координат їх амінокислот або нуклеотидів для регіонів порівняння послідовностей та позначенням параметрів програми. Застосовуючи PILEUP, базову послідовність порівнюють з іншими тест-послідовностями для визначення співвідношення проценту ідентичності послідовності, застосовуючи нижченаведені параметри: вага гепу дефолту (3,00), вага довжини гепу дефолту (0,10), та зважені гепи закінчення. PILEUP можна отримувати за програмою аналізу послідовності GCG, наприклад, version 7,0 (Devereaux et al., Nuc. Acids Res. 12:387-395 (1984). Ще одним прикладом алгоритму, що є придатним для визначення проценту ідентичності послідовності та подібності послідовності є алгоритми BLAST та BLAST 2,0, що описані y Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 (1977) та Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990), відповідно. Програма для проведення BLAST-аналізів є загально доступною через National Center for Biotechnology Information (вебсайт при www.ncbi.nlm.nih.gov/). Цей алгоритм задіює перше ідентифікування високого підраховування пар послідовностей (HSPs) ідентифікуванням коротких довжин груп символів W у запрошеній послідовності, що задовольняють деякій позитивно оціненій сумі балів порогової величини T при звірянні з групою символів такої ж довжини у послідовності бази даних. T позначено як групу близькості порогової величини суми балів символів (Altschul et al., вище). Ці початкові схожості груп близькості символів діють як затравки для започатковування досліджень для знаходження довших HSP, що їх містять. Групи символів схожості поширені в обох напрямах вздовж кожної послідовності, щоб можна було збільшити суму балів сукупного звіряння. Сукупні суми балів розраховують, застосовуючи для нуклеотидних послідовностей параметри M (сума балів нагороди для пар звірених залишків; завжди > 0) та N (сума балів пенальті для невідповідних залишків; завжди < 0). Для послідовностей амінокислот, матрицю підраховування застосовують для розраховування сукупної суми балів. Подовження групи символів схожості у кожному напрямі зупиняють, коли: сукупна сума балів звіряння спадає за кількістю X від її максимально досягнутого значення; сукупна сума балів йде до нуля або нижче, внаслідок накопичення одного або більше негативних підраховувань звірянь залишків; або досягнення кінця послідовності. Параметри алгоритму BLAST W, T, та X визначають чутливість та швидкість звіряння. Програма 17 UA 107330 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 BLAST (для нуклеотидних послідовностей) використовує, як дефолти довжину груп символів (W) 11, очікування (E) або 10, M=5, N=-4 та порівняння обох ланцюгів. Для послідовностей амінокислот, програма BLASTP використовує, як дефолти довжину груп символів 3, та очікування (E) 10, та матриця підраховування BLOSUM62 (дивись Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)) звіряння (B) 50, очікування (E) 10, M=5, N=-4, та порівняння обох ланцюгів. Алгоритм BLAST також проводить статистичний аналіз подібності між двома послідовностями (дивись, наприклад, Karlin & Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)). Один вимір подібності, запропонований алгоритмом BLAST є ймовірністю найменшої суми (P(N)), що забезпечує показання ймовірності, за якою можливе порівнювання між двома нуклеотидними послідовностями або послідовностями амінокислот. Наприклад, нуклеїнову кислоту вважають подібною базовій послідовності якщо ймовірність найменшої суми при порівнянні тест-нуклеїнової кислоти з базовою нуклеїновою кислотою є менше, ніж приблизно 0,2, більш переважно менше, ніж приблизно 0,01, та найбільш переважно менше, ніж приблизно 0,001. Заявлений винахід також стосується полінуклеотидів, що містять першу нуклеотидну послідовність, яка селективно гібридизує у помірно суворих умовах, (як-то у дуже суворих умовах) для доповнювання другої нуклеотидної послідовності, яка кодує поліпептид, який містить: (i) послідовність білку Rv3616c; (ii) варіант послідовності білку Rv3616c; або (iii) імуногенний фрагмент послідовності білку Rv3616c, для лікування або запобігання латентного ТБ. Вираз "дуже суворі умови гібридизації" стосується умов, при яких зонд гібридизуватиметься з його цільовою підпослідовністю, звичайно у складній суміші нуклеїнової кислоти, але не до інших послідовностей. Дуже суворі умови є залежними з послідовності та повинні бути відмінними у відмінних обставинах. Довші послідовності гібридизують специфічно при вищій температурі. Довідку щодо гібридизації нуклеїнових кислот знайдено y Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridisation and the strategy of nucleic acid assays" (1993). Загалом, дуже суворі умови є вибраними приблизно на 5-10ºC меншими, ніж точка плавлення (Tm) для конкретної послідовності при визначеній іонній силі pH. Tm – температура (при визначеній іонній силі, pH, та нуклеїновій концентрації), при якій 50 % зондів комплементарні для цільової гібридизації до цільової послідовності при рівновазі (оскільки цільові послідовності є представленими у надлишку, при Tm, 50 % зондів є захопленими при рівновазі). Дуже суворі умови повинні бути такими, при яких концентрація солі є менше, ніж приблизно 1,0 M іонів натрію, звичайно приблизно 0,01 – 1,0 M іонів натрію (або інші солі) при pH 7,0 до 8,3 та температура є принаймні приблизно 30ºC для коротких зондів (наприклад, 10 до 50 нуклеотидів) та принаймні приблизно 60ºC для довгих зондів (наприклад, більше, ніж 50 нуклеотидів). Дуже суворих умов можна також досягти додаванням дестабілізаторів, як-то формамід. Для селективної або специфічної гібридизації, позитивний сигнал є принаймні дворазово більше фону, необов'язково 10-разово більше фону гібридизації. Зразкові дуже суворі умови гібридизації можуть бути такими: 50 % формаміду, 5x SSC, та 1 % SDS, інкубування при 42ºC, або, 5x SSC, 1 % SDS, інкубування при 65ºC, з промиванням y 0,2x SSC, та 0,1 % SDS при 65ºC. Нуклеїнові кислоти, що не гібридизують з кожною іншою у дуже суворих умовах, є ще функціонально еквівалентними, якщо поліпептиди, які вони кодують, є по суті ідентичними. Це відбувається, наприклад, коли створюють копію нуклеїнової кислоти, застосовуючи максимальне виродження кодону, дозволене генетичним кодом. У таких випадках, нуклеїнові кислоти звичайно гібридизують у помірно суворих умовах гібридизації. Зразкові "помірно суворі умови гібридизації" охоплюють гібридизацію у буфері з 40 % формаміду, 1 M NaCl, 1 % SDS при 37ºC, та промивання y 1X SSC при 45ºC. Позитивна гібридизація є принаймні двічі фоновою. Спеціалістам треба знати, що альтернативну гібридизацію та умови промивання можна використовувати для забезпечення умов подібної суворості. Вираз "селективно (або специфічно) гібридизує з" стосується зв'язування, дуплексування або гібридизування молекули тільки з конкретною нуклеотидною послідовністю у суворих умовах гібридизації, коли ця послідовність є у складній суміші (наприклад, сукупній клітинній або бібліотеці ДНК або РНК). 18 UA 107330 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У будь-якому випадку, варіанти послідовності поліпептиду повинні мати по суті таку ж активність, як базова послідовність (у випадку полінуклеотидів, варіант полінуклеотидної послідовності кодуватиме поліпептид, який має по суті таку ж активність, як базова послідовність). По суті така ж активність означає принаймні 50 %, відповідно принаймні 75 % та особливо принаймні 90 % активності базової послідовності в іn vitro аналізі рестимулювання PBMC або цільної крові специфічними антигенами (наприклад, рестимулювання протягом від кількох годин до двох тижнів, як-то до одної доби, 1 доба – 1 тиждень або 1 – 2 тижні), що вимірює активування клітин лімфопроліферацією, отримання цитокінів у супернатанті культури (виміряно за допомогою ELISA, CBA тощо) або визначення параметрів відповідей T- та B-клітин внутрішньо- та зовнішньоклітинним фарбуванням (наприклад, застосовуючи специфічні стосовно антитіл імунні маркери, як-то CD3, CD4, CD8, IL2, TNFa, IFNg, CD40L, CD69 тощо), а потім цитометрією у потоці. Відповідно, по суті така ж активність означає принаймні 50 %, відповідно принаймні 75 % та особливо принаймні 90 % активності базової послідовності у аналізі проліферації T-клітин та/або продукування IFN-γ. КОМПОЗИЦІЇ ПОЛІНУКЛЕОТИДІВ Як застосовувано тут, термін "полінуклеотид" стосується молекул, що виділено позбавленими загальної геномної ДНК конкретних видів. Тому, полінуклеотид, що кодує поліпептид стосується сегменту полінуклеотиду, який містить одну або більше кодувальних послідовностей по суті виділених або позбавлених від загальної геномної ДНК видів, з яких полінуклеотид отримано. Спеціалістам слід розуміти, що полінуклеотиди для застосування у заявленому винаході можуть охоплювати геномні послідовності, зовнішньо-геномні та кодовані плазмідами послідовності та менші створювані сегменти генів, що експресують, або можуть бути адаптованими для експресування білків, поліпептидів, пептидів тощо. Такі сегменти можуть бути природно виділеними, або модифікованими синтетично. "Виділений", як застосовувано тут, означає, що полінуклеотид є по суті вільним від інших кодувальних послідовностей, та що полінуклеотид не містить великих частин неспорідненої кодувальної ДНК, як-то великі хромoсомні фрагменти або інші функціональні гени або регіони кодування поліпептидів. Виділену нуклеїнову кислоту відділяють від інших відкритих рамок зчитування, що фланкують ген та кодують білки, інші, ніж ген. Безумовно, це стосується сегменту ДНК, що виділено спочатку, та не вилучає гени або кодувальні регіони, пізніше додані до сегменту. Як треба знати спеціалісту, полінуклеотиди можуть бути одно-ланцюговими (кодувальними або антизначеннєвими) або подвійно-ланцюговими, та можуть бути молекулами ДНК (геномної, кДНК або синтетичної) або РНК.Молекули РНК охоплюють молекули гяРНК, що містять інтрони та відповідають молекулі ДНК один-до-одного, та молекули мРНК, що не містять інтрони. Додаткові кодувальні або некодувальні послідовності можуть, але необов'язково, бути у полінуклеотиді заявленого винаходу, та полінуклеотид може, але необов'язково, бути зв'язаним з іншими молекулами та/або підкладками. Полінуклеотиди можуть містити природну послідовність (тобто, ендогенну послідовність, що кодує антиген Mycobacterium або його частину) або можуть містити варіант, або біологічний або функціональний еквівалент такої послідовності. Полінуклеотидні варіанти можуть містити одне або більше заміщень, добавок, делецій та/або інсерцій, як описано нижче, переважно так, щоб імуногенність кодованого поліпептиду не була зменшеною відносно базового білку. Дію на імуногенність кодованого поліпептиду можна загалом оцінювати, як описано тут. У додаткових втіленнях заявлений винахід стосується виділених полінуклеотидів та поліпептидів, що мають різну довжину суміжних ділянок послідовностей ідентичних або комплементарних одній або більше з послідовностей, розкритих тут. Наприклад, полінуклеотиди, запропоновані заявленим винаходом, що містять принаймні приблизно 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500 або 1000 або більше суміжних нуклеотидів базової послідовності, розкритої тут, а також усі проміжні довжини між. Легко зрозуміти, що "проміжні довжини", y цьому контексті, означають будь-яку довжину між значеннями, як-то 30, 31, 32, тощо; 50, 51, 52, 53, тощо; 100, 101, 102, 103, тощо; 150, 151, 152, 153, тощо; охоплюючи усі цілі через 200-500; 500-1000, тощо. Більш того, спеціалістам ясно, що як результат виродження генетичного коду, є багато нуклеотидних послідовностей, що кодують поліпептид, як описано тут. Деякі з цих полінуклеотидів мають відносно низьку ідентичність з нуклеотидною послідовністю будь-якого природного гена. Однак, полінуклеотиди, що варіюють внаслідок відмінностей y кодоні, конкретно розглінуті у заявленому винаході, наприклад, полінуклеотиди, що є оптимізованими для вибору кодону людини та/або примата. Крім того, алелі генів, що містять полінуклеотидні 19 UA 107330 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 послідовності, запропоновані тут, є у рамках заявленого винаходу. Алелі є ендогенними генами, що є зміненими в результаті одної або більше мутації, як-то делецій, інсерцій та/або заміщень нуклеотидів. Утворені мРНК та білок можуть, але необов'язково, мати змінену структуру або функцію. Алелі можна ідентифікувати, стандартними способами (як-то гібридизація, ампліфікація та/або база даних порівняння послідовностей). ІДЕНТИФІКАЦІЯ ТА ВИЗНАЧЕННЯ ПАРАМЕТРІВ ПОЛІНУКЛЕОТИДУ Полінуклеотиди можна ідентифікувати, отримувати та/або поводитися, застосовуючи будьякі добре відомі способи. Наприклад, полінуклеотид можна ідентифікувати, як описано більш детально нижче, скринуванням мікрокомплекту кДНК. Такі скринування можна проводити, наприклад, застосовуючи мікрокомплект Synteni (Palo Alto, CA) за інструкціями виробника (та по суті, як описано Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10614-10619 (1996) та Heller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:2150-2155 (1997)). Альтернативно, полінуклеотиди можна ампліфікувати з кДНК, отримуваною з клітин, що експресують білки, описані тут, як-то клітини M. tuberculosis. Такі полінуклеотиди можна ампліфікувати полімеразною ланцюговою реакцією (PCR). Для цього підходу послідовність-специфічні праймери можна створювати на основі послідовності, запропонованої тут, та можна купувати або синтезувати. Ампліфіковану частин полінуклеотиду можна застосовувати для виділення гена повної довжини з придатної бібліотеки (наприклад, бібліотеки кДНК M. tuberculosis), застосовуючи добре відомі способи. Такими способами бібліотеку (кДНК або геномну) скринують, застосовуючи один або більше полінуклеотидних зондів або праймерів, придатних для ампліфікації. Переважно, бібліотека є вибраною за розміром для охоплення більших молекул. Бібліотеки розсіяної затравки можуть також бути кращими для ідентифікування 5" та вищерозташованих регіонів генів. Геномні бібліотеки є кращими для отримання інтронів та розширення 5" послідовності. Для гібридизації, часткову послідовність можна мітити (наприклад, нік-трансляцією або міченням кінця 32P), застосовуючи добре відомі способи. Бактеріальну або бактеріoфагову бібліотеку тоді загалом скринують фільтрами гібридизування, що містять денатуровані бактеріальні колонії (або газони, що містять бляшки фагу) з міченим зондом (дивись Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2000)). колонії або бляшки гібридизування вибирають та збільшують в об'ємі, та ДНК виділяють для наступного аналізу. кДНК клони можна досліджувати для визначення кількості додаткової послідовності, наприклад, PCR, застосовуючи праймер від часткової послідовності та праймер від вектору. Рестрикційні карти та часткові послідовності можна створювати для ідентифікації одного або більше перекривних клонів. Повну послідовність можна тоді визначати, стандартними способами, що можуть задіювати створення серій делеційних клонів. Утворені перекривні послідовності можна тоді збирати в одиничну суміжну послідовність. Молекула кДНК повної довжини можна створювати лігуванням придатних фрагментів, застосовуючи добре відомі способи. Альтернативно, є ряд способів ампліфікації для отримання кодувальної послідовності повної довжини з часткової послідовності кДНК. Такими способами ампліфікацію загалом проводять за допомогою PCR. Будь-який з комерційно доступних комплектів можна застосовувати для проведення ампліфікації. Праймери можна створювати, застосовуючи, наприклад, добре відому програму. Праймерами є переважно 22-30 нуклеотидів у довжину, вони мають вміст GC принаймні 50 % та гібридизують до цільової послідовності при температурі приблизно 68ºC – 72ºC. Ампліфікований регіон можна секвенсувати, як описано вище, та перекривні послідовності збирати у суміжну послідовність. Одним таким способом ампліфікації є зворотна PCR (дивись Triglia et al., Nucl. Acids Res. 16:8186 (1988)), що використовує рестрикційні ферменти для створення фрагменту у відомому регіоні гена. Фрагмент тоді циркуляризують внутрішньомолекулярним лігуванням та застосовують як темплат для PCR з дивергентними праймерами, похідними з відомого регіону. В альтернативному підході, послідовності, суміжні з частковою послідовністю, можуть бути виправленими ампліфікацією з праймером до лінкерної послідовність та праймер-специфічними стосовно відомого регіону. Ампліфіковані послідовності звичайно піддають другому етапу ампліфікації з таким же лінкерним праймером та другим праймером, специфічним стосовно відомого регіону. Варіант цього, що застосовує два праймери, що започатковують подовження у протилежних напрямах від відомої послідовності, описано y WO 96/38591. Ще одним таким способом, відомим як "швидка ампліфікація кінців кДНК" або RACE. Цей спосіб задіює застосування внутрішнього праймеру та зовнішнього праймеру, що гібридизує з регіоном поліA або послідовністю вектору, для ідентифікації послідовностей, що є 5" та 3" відомої послідовності. Додаткові способи охоплюють захоплювану PCR (Lagerstrom et al., PCR Methods Applic. 1:111-19 (1991)) та прогулянкову PCR (Parker et al., Nucl. Acids. Res. 19:3055-60 (1991)). 20 UA 107330 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Інші способи, що застосовують ампліфікацію, можна також застосовувати для отримання послідовності кДНК повної довжини. У деяких випадках можливе отримання послідовності кДНК повної довжини аналізом послідовностей, запропонованих y базі даних міток експресованих послідовностей (EST), доступній з GenBank. Дослідження для перекривних EST можна загалом проводити, застосовуючи добре відомі програми (наприклад, дослідження NCBI BLAST), і такі EST можна застосовувати для створення суміжної послідовності повної довжини. Послідовності ДНК повної довжини можна також отримувати аналізом геномних фрагментів. ЕКСПРЕСІЯ ПОЛІНУКЛЕОТИДІВ У КЛІТИНАХ ХАЗЯЇНА Полінуклеотидні послідовності або їх фрагменти, що кодують поліпептиди, або зрощені білки або їх функціональні еквіваленти, можна застосовувати y рекомбінантних молекулах ДНК для спрямування експресії поліпептиду у прийнятних клітинах хазяїна. Внаслідок природного виродження генетичного коду, інші послідовності ДНК, що кодують по суті таку ж або функціонально еквівалентну послідовність амінокислот, можна створювати та ці послідовності можна застосовувати для клонування та експресування певного поліпептиду. Спеціалістам слід розуміти, що у деяких випадках може бути кращим створення кодуючих поліпептид нуклеотидних послідовностей, що мають неіснуючі у природі кодони. Наприклад, кодони, кращі за винятковим прокаріотним або евкаріотним хазяїном, можна вибирати для збільшення ступеню експресії білку або для створення рекомбінантного транскрипту РНК, що має бажані властивості, як-то період напівперетворення, що є довшим, ніж транскрипт, створений з існуючої у природі послідовності. Більш того, полінуклеотидні послідовності можна створювати, застосовуючи загалом відомі способи зміни поліпептиду, що кодує послідовності, охоплюючи, але без обмеження, зміни, що модифікують клонування, обробляння та/або експресію продукту гена. Наприклад, тасування ДНК випадковим фрагментуванням та PCR-переборкою фрагментів гена та синтетичних олігонуклеотидів можна застосовувати для створювання нуклеотидних послідовностей. На додаток, сайт-спрямований мутагенез можна застосовувати для інсерції нових рестрикційних сайтів, зміни характеру глікозилування, зміни віддання переваги кодону, створення сплайсових варіантів, або уведення мутації, тощо. Природні, модифіковані або рекомбінантні послідовності нуклеїнових кислот можна лігувати у гетерологічну послідовність для кодування зрощеного білку. Наприклад, для скринування пептидної бібліотеки на інгібітори активності поліпептиду, може бути корисним кодування химерного білку, що може бути розпізнаваними комерційно доступним антитілом. Зрощений білок можна також створювати з вмістом сайту розщеплення, розташованим між кодуючою поліпептид послідовністю та гетерологічною послідовністю білку, так що поліпептид можна розщеплювати та очищати від гетерологічних груп. Послідовності, яка кодує бажаний поліпептид, можна синтезувати, застосовуючи добре відомі способи (дивись Caruthers, M. H. et al., Nucl. Acids Res. Symp. Ser. pp. 215-223 (1980), Horn et al., Nucl. Acids Res. Symp. Ser. pp. 225-232 (1980)). Альтернативно, білок можна створювати, застосовуючи хімічні способи синтезу послідовності амінокислот поліпептиду або його частини. Наприклад, синтез пептиду можна проводити, застосовуючи різні твердо-фазні способи (Roberge et al., Science 269:202-204 (1995)) та автоматизований синтез, наприклад, застосовуючи синтезатор пептидів ABI 431A (Perkin Elmer, Palo Alto, CA). Синтезований пептид можна по суті очищати препаративною високоефективною рідинною хроматографією (наприклад, Creighton, Proteins, Structures та Molecular Principles (1983)) або іншими доступними способами порівняння. Склад синтетичних пептидів можна підтвердити амінокислотним аналізом або секвенсуванням. На додаток, послідовність амінокислот поліпептиду, або будь-яку їх частину, можна замінити при безпосередньому синтезі та/або комбінувати, застосовуючи хімічні способи, з послідовностями інших білків, або будь-якими їх частинами, для створення варіанту поліпептиду. Для експресії бажаного поліпептиду, нуклеотидні послідовності, яка кодує поліпептид, або функціональні еквіваленти, можна вставляти у прийнятний вектор експресії, тобто, вектор, який містить необхідні елементи для транскрипції та трансляції вставленої кодувальної послідовності. Способи, що є добре відомими спеціалістам можна застосовувати до констракту векторів експресії, що містять послідовності, яка кодує корисний поліпептид та прийнятні транскрипційні та трансляційні контрольні елементи. Ці способи охоплюють іn vitro способи рекомбінантної ДНК, синтетичні способи, та іn vivo генетичну рeкомбінацію. Такі способи описані Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2000), та Ausubel et al., Current Protocols іn Molecular Biology (оновлено щороку). 21 UA 107330 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Багато систем експресія/хазяї вектору можна використовувати для вміщення та експресування полінуклеотидних послідовностей, що охоплюють, але без обмеження, мікроорганізми, як-то бактерії, трансформовані рекомбінантним бактеріoфагом, плазмідою, або векторами експресії космідної ДНК; дріжджі, трансформовані векторами експресії дріжджів; системи клітин комах, інфікованих векторами експресії вірусу (наприклад, бакуловірус); системи клітин рослин, трансформованих векторами експресії вірусу (як-то, вірус мозаїки кольорової капусти, CaMV; вірус мозаїки тютюну, TMV) або бактеріальними векторами експресії (як-то, плазміди Ti або pBR322); або системи клітин тварин. "Контрольні елементи" або "регуляторні послідовності" у векторі експресії є нетрансльованими регіонами – посилювачами, промотерами, 5" та 3" нетрансльованими регіонами – взаємодіючими з клітинними білками хазяїна для перебігу транскрипції та трансляції. Такі елементи можуть варіювати за силою та специфічністю. Залежно від використовуваних векторної системи та хазяїна будь-яке число придатних елементів транскрипції та трансляції, охоплюючи конструктивні та індуковувані промотери, можна застосовувати. Наприклад, при клонуванні у бактеріальних системах можна застосовувати індуковувані промотери, як-то гібридний промотер lacZ фагеміду PBLUESCRIPT (Stratagene, La Jolla, Calif.) або плазміди PSPORT1 (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) тощо. У системах клітин ссавців промотери від ссавців гени або від ссавців віруси є загалом кращими. Якщо це необхідно для створення лінії клітин, який містить багато копій послідовності, яка кодує поліпептид, вектори на основі SV40 або EBV можна краще застосовувати зприйнятним селектовуваним маркером. У бактеріальних системах число векторів експресії можна вибирати залежно від застосування, призначеного для експресованого поліпептиду. Наприклад, коли великі кількості є необхідними, наприклад, для індукування антитіла, можна застосовувати вектори, що скеровують високий рівень експресії зрощених білків, що легко очищати. Такі вектори охоплюють, але без обмеження, багатофункціональні вектори клонування та експресії E. coli, як-то BLUESCRIPT (Stratagene), в яких послідовність, що кодує корисний поліпептид, можна лігувати у вектор у рамці з послідовностями для аміно-кінцевого Met та наступними 7 залишками β-галактозидази, так що створюється гібридний білок; вектори pIN (Van Heeke &Schuster, J. Biol. Chem. 264:5503-5509 (1989)); тощо. вектори pGEX (Promega, Madison, Wis.) можна також застосовувати для експресування чужинних поліпептидів, як зрощених білків з глутатіон S-трансферазою (GST). Загалом, такі зрощені білки є розчинними та їх можна легко очищати від лізованих клітин абсорбцією на кульках з глутатіон-арагозою, а потім елюванням без глутатіону. Білки, що можна створювати y таких системах, охоплюють гепарин, тромбін або сайти фактору XA розщеплення протеазою, так що клонований корисний поліпептид можна звільняти від групи GST. У дріжджах Saccharomyces cerevisiae можна застосовувати ряд векторів, що містять конструктивні та індуковувані промотери, як-то альфа фактор, алкоголь-оксидазу та PGH. Інші вектори, що містять конструктивні та індуковувані промотери, охоплюють GAP, PGK, GAL та ADH. Для огляду, дивись Ausubel et al. (вище) та Grant et al., Methods Enzymol. 153:516-544 (1987) та Romas et al. Yeast 8 423-88 (1992). У випадках, де застосовують вектори експресії рослин, експресію послідовностей, що кодують поліпептиди, можна проводити з будь-яким числом промотерів. Наприклад, вірусні промотери, як-то промотери 35S та 19S CaMV, можна застосовувати поодинці або у комбінації з лідерною послідовністю omega від TMV (Takamatsu, EMBO J. 6:307-311 (1987)). Альтернативно, можна застосовувати промотери рослин, як-то невелику субодиницю RUBISCO або промотери теплового шоку (Coruzzi et al., EMBO J. 3:1671-1680 (1984); Broglie et al., Science 224:838-843 (1984); та Winter et al., Результати Probl. Cell Differ. 17:85-105 (1991)). Ці констракти можна уводити у клітини рослин безпосередньою трансформацією ДНК або опосередкованою патогенами трансфекцією. Такі способи описані рядом загалом доступних оглядів (дивись, наприклад, Hobbs y McGraw Hill Yearbook of Science та Technology pp. 191-196 (1992)). Систему комах можна також застосовувати для експресування корисного поліпептиду. Наприклад, в одній такій системі, Autographa californica, ядерний багатогранний вірус (AcNPV) застосовують як вектор для експресування чужинних генів y Spodoptera frugiperda або y Trichoplusia larvae. Послідовності, яка кодує поліпептид, можна клонувати у невід'ємний регіон вірусу, як-то поліедральний ген, та розміщати під контролем поліедрального промотеру. Успішна інсерція послідовності, що кодує поліпептид, робить поліедральний ген пасивним та створює рекомбінантний вірус без покривального білку. Рекомбінантні віруси можна тоді застосовувати для інфікування, наприклад, S. frugiperda або Trichoplusia larvae, в яких може 22 UA 107330 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 бути експресованим корисний поліпептид (Engelhard et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:32243227 (1994)). У клітинах хазяїна-ссавця, ряд систем експресії на вірусній основі є загалом доступним. Наприклад, у випадках, де аденовірус застосовують як вектор експресії, послідовності, яка кодує корисний поліпептид можна лігувати в аденовірусний транскрипційно/трансляційний комплекс, який складається з пізнього промотеру та троїстої лідерної послідовності. Інсерцію y невід'ємний регіон E1 або E3 вірусного генома можна застосовувати для отримання життєздатного вірусу, що є здатним експресувати поліпептид в інфікованих клітинах-хазяї (Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:3655-3659 (1984)). На додаток, посилювачі транскрипції, як-то вірус саркоми Роуза (RSV), можна застосовувати для збільшення експресії у клітинах хазяїна-ссавця. Способи обробки аденовірусними векторами розглянуті y Wold, Adenovirus Methods та Protocols, 1998. Додаткові посилання стосовно застосування аденовірусних векторів можна знайти y Adenovirus: A Medical Dictionary, Bibliography, and Annotated Research Guide to Internet References, 2004. Специфічні сигнали початку можна також застосовувати для досягнення більш ефективної трансляції послідовностей, що кодують корисний поліпептид. Такі сигнали охоплюють кодон початку ATG та суміжні послідовності. У випадках, де послідовності, яка кодує поліпептид, його кодон початку та вищерозташовані послідовності, вставляють у прийнятний вектор експресії, без необхідності у додаткових транскрипційних або трансляційних контрольних сигналах. Однак, у випадках, де вставляють тільки кодувальну послідовність або її частину, повинні бути запропонованими екзогенні трансляційні контрольні сигнали, охоплюючи кодон початку ATG. До того ж, кодон початку повинен бути у коректній рамці зчитування для гарантування трансляції цілої вставки. Екзогенні трансляційні елементи та кодони початку можуть бути різного походження, природні та синтетичні. Ефективність експресії можна посилювати приєднанням посилювачів, що є прийнятними для конкретної системи клітин, що застосовують, як-то описані у літературі (Scharf. et al., Results Probl. Cell Differ. 20:125-162 (1994)). На додаток, штам клітин-хазяїна можна вибирати за його здатністю модулювати експресію вставленої послідовності або для обробляння експресованого білку бажаним чином. Такі модифікації поліпептиду охоплюють, але без обмеження, ацетилування, карбоксилування, глікозилування, фосфорилування, ліпідування, та ацилування. Посттрансляційне обробляння, що розщеплює "препро" форму білку можна також застосовувати для полегшення коректної інсерції, згортання та/або функції. Відмінні клітини-хазяї, як-то CHO, HeLa, MDCK, HEK293, та WI38, що мають характерні механізми такої посттрансляційної активності, можна вибирати для гарантування коректної модифікації та обробляння чужинного білку. Для довготермінового високопродуктивного отримання рекомбінантних білків стабільна експресія є загалом кращою. Наприклад, лінії клітин, що стабільно експресують корисний полінуклеотид, можна трансформувати, застосовуючи вектори експресії, що можуть містити вірусні початки реплікації та/або елементи ендогенної експресії та селектовуваний маркерний ген на тому ж або окремому векторі. Після уведення вектора клітини можна вирощувати протягом 1-2 діб у збагачених середовищах та переводити у селективні середовища. Призначенням селектовуваного маркеру є стійкість до вибору, та його присутність робить можливим ріст та виділення клітин, які успішно експресують уведені послідовності. Резистентні клони стабільно трансформованих клітин можуть проліферувати при застосуванні способів культури тканин прийнятних для типів клітин. Будь-яке число систем вибору можна застосовувати для виділення трансформованих ліній клітин. Вони охоплюють, але без обмеження, тимідин-кіназу вірусу простого герпесу (Wigler et al., Cell 11:223-32 (1977)) та аденін-фосфорибозилтрансферазу (Lowy et al., Cell 22:817-23 (1990)) гени, що можна застосовувати y клітинах tk.sup.- або aprt.sup.-, відповідно. Також, як базис для вибору можна застосовувати антиметаболіт, антибіотик або стійкість до гербіцидів; наприклад, dhfr, що надає стійкості до метотрексату (Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77:3567-70 (1980)); npt, що надає стійкості до аміноглікозидів, неoміцину та G-418 (ColbereGarapin et al., J. Mol. Biol. 150:1-14 (1981)); та als або pat, що надають стійкості до хлорсульфурону та фосфінотрицин ацетилтрансферази, відповідно (Murry, вище). Описані додаткові селектовувані гени, наприклад, trpB, що дозволяє клітинам використання індолу замість триптофану, або hisD, що дозволяє клітинам використання гістинолу замість гістидину (Hartman & Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:8047-51 (1988)). Останнім часом, застосування видимих маркерів має зрослу популярність з такими маркерами, як антоціаніни, βглюкуронідаза та її субстрат GUS, та люцифераза та її субстрат люциферин, широко застосовувані не тільки для ідентифікації трансформантів, але також для вимірювання кількості 23 UA 107330 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 тимчасової або стабільної експресії білку, віднесеної до конкретної векторної системи (Rhodes et al., Methods Mol. Biol. 55:121-131 (1995)). Хоча присутність/відсутність експресії маркерного гена говорить про те, що корисний ген є також, його присутність та експресія можуть потребувати підтвердження. Наприклад, якщо послідовність, що кодує поліпептид вставляють у послідовність маркерного гена, рекомбінантні клітини, що містять послідовності, можна ідентифікувати за відсутністю функції маркерного гена. Альтернативно, маркерний ген може бути у тандемі з кодуючою поліпептидною послідовністю під контролем одиничного промотеру. Експресія маркерного гена y відповідь на індукування або селекцію звичайно вказує на експресію тандемного гена також. Альтернативно, клітини-хазяї, що містять та експресують бажану полінуклеотидну послідовність, можна ідентифікувати відомими способами. Ці способи охоплюють, але без обмеження, способи гібридизації ДНК-ДНК або ДНК-РНК та біоаналізу або імуноаналізу, що охоплюють мембрану, розчин, або способи на основі чипів для визначення та/або вимірювання нуклеїнової кислоти або білку. Більшість способів визначення та вимірювання експресії кодованих полінуклеотидами продуктів, застосовуючи поліклональне або моноклональне антитіло, специфічне для відомого продукту. Приклади охоплюють імуноферментний твердофазний аналіз (ELISA), радіоімуноаналіз (RIA), та аналіз активованої флуоресценції сортованих клітин (FACS). Двостадійний, моноклонально-базований імуноаналіз з використанням моноклонального антитіла реактивного стосовно двох невзаємодіючих епітопів на певному поліпептиді може бути кращим для застосування, але аналіз конкурентного зв'язування можна застосовувати також. Ці та інші аналізи описані Hampton et al., Serological Methods, Laboratory Manual (1990) та Maddox et al., J. Exp. Med. 158:1211-1216 (1983). Багато міток та способів кон'югації відомі спеціалістам та їх можна застосовувати y різних аналізах нуклеїнових кислот та амінокислот. Засоби для створення мічених гібридизаційних або PCR-зондів для визначення послідовностей, пов'язаних з полінуклеотидомами, охоплюють олігомічення, нік-трансляцію, мічення кінців або PCR-ампліфікацію, застосовуючи мічений нуклеотид. Альтернативно, послідовності, або будь-які їх частини можна клонувати у вектор для отримання мРНК-зонду. Такі вектори відомі, є комерційно доступними, та їх можна застосовувати для синтезу РНК-зондів іn vitro додаванням прийнятної РНК-полімерази, як-то T7, T3, або SP6 та мічених нуклеотидів. Ці способи можна проводити, застосовуючи багато комерційно доступних комплектів. Придатні репортерні молекули або мітки, що можна застосовувати, охоплюють радіонукліди, ферменти, флуорeсцентні, хемілюмінісцентні або хромoгенні агенти, а також субстрати, кофактори, інгібітори, магнітні частинки, тощо. Клітини-хазяї, трансформовані корисною полінуклеотидною послідовністю, можна культивувати в умовах, придатних для експресії та виділення білку з культур клітин. Білок, створений рекомбінантною клітиною може бути секретованим або вмісним у клітині залежно від застосовуваних послідовності та/або вектору. Спеціалістам слід розуміти, що вектори експресії, що містять полінуклеотиди можна створювати для вміщення сигнальної послідовності з безпосереднім секретуванням кодованого поліпептиду через мембрану клітини прокаріоту або евкаріоту. Інші рекомбінантні структури можна застосовувати для об'єднання послідовностей, що кодують корисний поліпептид до нуклеотидної послідовності, що кодує домен поліпептиду, що полегшуватиме очищення розчинних білків. Такі домени полегшування очищення охоплюють, але без обмеження, метал-хелатні пептиди, як-то гістидин-триптофанові модулі, що дозволяють очищення на іммобілізованих металах, домени білку A, що дозволяють очищення на іммобілізованому імуноглобуліні, та домен, використовуваний y системі очищення FLAGSподовження/афінність (Immunex Corp., Seattle, Промивання.). Приєднання розщеплюваних послідовностей лінкеру, як-то специфічних для фактору XA або ентерокінази (Invitrogen. San Diego, Calif.) між доменом очищення та кодованим поліпептидом можна застосовувати для полегшення очищення. Один такий вектор експресії забезпечує експресію зрощеного білку, який містить корисний поліпептид, та нуклеїнову кислоту, що кодує 6 гістидинових залишків перед тіоредоксином або сайтом розщеплення ентерокіназою. Гістидинові залишки полегшують очищення на IMIAC (афінна хроматографія на іммобілізованому металі), як описано y Porath et al., Prot. Exp. Purif. 3:263-281 (1992) тоді як сайт розщеплення ентерокіназою забезпечує засоби для очищення бажаного поліпептиду від зрощеного білку. Обговорення векторів, що містять зрощені білки, запропоновано Kroll et al., DNA Cell Biol. 12:441-453 (1993)). ІN VIVO СПОСОБИ ДОСТАВЛЯННЯ ПОЛІНУКЛЕОТИДУ У додаткових втіленнях генетичні констракти, що містять один або більше полінуклеотидів винаходу, уводять у клітини іn vivo. Цього можна досягти, застосовуючи будь-який з добре відомих підходів, деякі з котрих наведені нижче для ілюстрації. 24 UA 107330 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 1. Аденовірус Один з кращих способів доставляння іn vivo одної або більше послідовностей нуклеїнових кислот задіює застосування аденовірусного вектору експресії. "Аденовірусний вектор експресії" охоплює констракти, що містять послідовності аденовірусу, достатні для (a) підтримування упаковки констракту та (b) для експресування полінуклеотиду, що клоновано там y значеннєвій або антизначеннєвій орієнтації. Безумовно, у контексті антизначеннєвого констракту, експресія не потребує, щоб продукт гена був синтезованим. Вектор експресії містить генетично створювану форму аденовірусу. Знання генетичної організації аденовірусу,36 ко, лінійний, подвійно-ланцюговий ДНК-вірус, дозволяє заміщення великих частин аденовірусної ДНК чужинними послідовностями до 7 ко (Grunhaus & Horwitz, 1992). На відміну від ретровірусу аденовірусна інфекція клітин-хазяїна не призводить до хромoсомної інтеграції, оскільки аденовірусна ДНК може реплікувати епісомним чином без потенційної генотоксичності. Також, аденовіруси є структурно стабільними, та жодного геномного перегрупування не визначено після значної ампліфікації. Аденовірус може інфікувати реально усі епітеліальні клітини незважаючи на стадію їх клітинного циклу. Тому аденовірусні інфекція зв'язана тільки з помірною хворобою, як-то гостра респіраторна хвороба y людей. Аденовірус є особливо придатним для застосування, як вектор переносу гена внаслідок середнього розміру його, легкості поводження, високого титру, широких меж цільових клітин та високої інфективності. Обидва кінці вірусного генома містять 100-200 пар основ інвертованих повторень (ITRs), що є cis елементами, необхідними для реплікації та упаковки вірусної ДНК. Ранні (E) та пізні (L) регіони генома містять відмінні транскрипційні одиниці, що є поділеними початком реплікації вірусної ДНК. Регіон E1 (E1A та E1B) кодує білки, чутливі стосовно регулювання транскрипції вірусного генома та кількох клітинних генів. Експресія регіону E2 (E2A та E2B) призводить до синтезу білків для реплікації вірусної ДНК. Ці білки приймають участь y реплікації ДНК, експресії пізніх генів та відключенні клітин-хазяїна (Renan, 1990). Продукти пізніх генів, охоплюючи більшість вірусних капсидних білків, експресуються тільки після значного обробляння одиничного первинного транскрипту від головного пізнього промотеру (MLP). MLP, (розташований при 16,8 m.u.) є особливо ефективним у пізній фазі інфекції, та усі мРНК від цього промотеру мають троїсту лідерну (TPL) послідовність, що робить їх кращими мРНК для трансляції. У сучасній системі рекомбінантний аденовірус створюють гомологічною рeкомбінацією між човниковим вектором та прoвірусним вектором. Внаслідок можливої рeкомбінації між двома прoвірусними векторами, аденовірус природного типу можна створювати цим способом. Тому, критичним для виділення є одиничний клон вірусу від індивідуальної бляшки та досліджування його геномної структури. Породження та розмноження сучасних аденовірусних векторів, що є реплікаційно дефектними, залежать від унікальної хелперної лінії клітин, позначеної 293, що трансформовано з клітин нирок ембріону людини фрагментами Ad5 ДНК та конститутивно експресують білки E1 (Graham et al., 1977). Оскільки регіон E3 є неістотним у геномі аденовірусу (Jones & Shenk, 1978), сучасні аденовірусіні вектори з допомогою клітин 293 несуть чужинну ДНК y регіонах E1, D3 або обох (Graham & Prevec, 1991). Природно, аденовірус може упаковувати приблизно 105 % геному природного типу (Ghosh-Choudhury et al., 1987), що забезпечує місткість для приблизно 2 екстра ко ДНК. Комбінували з приблизно 5,5 ко ДНК, що є замінною y регіонах E1 та E3, максимальна місткість сучасного аденовірусного вектору є під 7,5 ко, або приблизно 15 % загальної довжини вектора. Більше, ніж 80 % вірусного геному аденовірусу залишається у ланцюгу вектору та є джерелом цитотоксичності вектора. Також, дефіцит реплікації E1-видаленого вірусу є дефектним. Наприклад, втрати експресії вірусного гена спостерігають з зараз доступними векторами при високій різноманітності інфекції (MOI) (Mulligan, 1993). Хелперні лінії клітин можуть бути похідними з клітин людини, як-то клітин нирок ембріону людини, м'язових клітин, гемопоетичих клітин або інших клітин ембріону людини мезенхімних або епітеліальних клітин. Альтернативно, хелперні клітини можуть бути похідними з клітин інших видів ссавців, що є дозвільними для аденовірусу людини. Так клітини охоплюють, наприклад, клітини Vero або інші мезенхімні або епітеліальні клітини ембріону мавпи. Як встановлено вище, зараз кращою хелперною лінією клітин є 293. Racher et al. (1995) розкрили поліпшені способи культивування клітин 293 та розмноження аденовірусу. В одному форматі агрегати природних клітин вирощують засіванням індивідуальних клітин у силіконізовані обертальні колби на 1 л (Techne, Cambridge, UK), що містять 100-200 мл середовища. Після перемішування при 40 об/хвил, життєздатність клітин оцінюють з трипановим блакитним. У ще одному форматі Fibra-Cel-мікроносії (Bibby Sterlin, 25 UA 107330 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Stone, UK) (5 г/л) застосовують, таким чином. Засівний матеріал клітин, ресуспендований y 5 мл середовища, додають до носія (50 мл) y колбу Ерленмейера на 250 мл та залишають з перемішуванням, протягом 1 – 4 год. Середовище тоді заміщають 50 мл свіжого середовища та струшують. Для отримання вірусу клітини вирощують – 80 % конфлюєнтності, після чого середовище заміщають (до 25 % кінцевого об'єму) та аденовірус додають при MOI 0,05. Культури залишають на ніч, після чого об'єм збільшують до 100 % та струшують протягом ще 72 год. За винятком вимоги, що аденовірусний вектор повинен бути реплікаційно дефектним, або принаймні умовно дефектним, природу аденовірусного вектору не вважають ключовою для успішного здійснення винаходу. Аденовірус може бути будь-яким з 42 відмінних відомих серoтипів або підгруп A-F. Аденовірус типу 5 підгрупи C є кращим вихідним матеріалом для отримання умовного реплікаційно дефектного аденовірусного вектору для застосування у заявленому винаході, оскільки аденовірус типу 5 є аденовірусом людини, про який відомо багато біохімічної та генетичної інформації, та його застосовують для більшості структур, що застосовують аденовірус як вектор. Як встановлено вище, типовий вектор згідно з заявленим винаходом є реплікаційно дефектним та не має аденовірусний регіон E1. Таким чином, найбільш зручним повинно бути уведення полінуклеотиду, що кодує корисний ген у позиції, з якої E1-кодувальні послідовності мають бути видаленими. Однак, позиція інсерції констракту у послідовності аденовірусу не є критичною для винаходу. Полінуклеотид, що кодує корисний ген, можна також вставляти замість видаленого регіону E3 y E3-замінних векторах, як описано Karlsson et al. (1986) або y регіоні E4, де хелперна лінія клітин або хелперний вірус доповнює дефект E4. Аденовірус легко вирощувати та поводитися з ним та він має багато хазяїв іn vitro та іn vivo. Цю групу вірусів можна отримувати y високих титрах, наприклад, 109-1011 бляшко-твірних одиниць на мл, та вони є високо інфекційними. Цикл життя аденовірусу не потребує інтеграції у геном клітини-хазяїна. Чужинні гени, доставлені аденовірусними векторами є епісомними та тому мають низьку генотоксичність стосовно клітин-хазяїв. Жодної побічної дії не повідомлено у дослідженнях вакцинування аденовірусом природного типу (Couch et al., 1963; Тор et al., 1971), що демонструє їх безпечність та терапевтичну потенцію, як іn vivo векторів переносу гена. Аденовірусні вектори, застосовувані y експресії евкаріотного гена (Levrero et al., 1991; Gomez-Foix et al., 1992) та розробці вакцини (Grunhaus & Horwitz, 1992; Graham & Prevec, 1992). Останнім часом, дослідження тварин говорять, що рекомбінантний аденовірус можна застосовувати для генної терапії (Stratford-Perricaudet & Perricaudet, 1991; Stratford-Perricaudet et al., 1990; Rich et al., 1993). Дослідження застосування рекомбінантного аденовірусу до відмінних тканин охоплюють інстиляцію у трахеї (Rosenfeld et al., 1991; Rosenfeld et al., 1992), ін'єкцію у м'язи (Ragot et al., 1993), периферійні внутрішньовенні ін'єкції (Herz & Gerard, 1993) та стереотаксичну інокуляцію у мозок (Le Gal La Salle et al., 1993). Аденовірусні вектори можуть походити від аденовірусу людини. Альтернативно вони можуть походити від аденовірусу інших видів, наприклад, шимпанзе, що може мати перевагу в тому, що вірусні вектори не нейтралізуються антитілом проти аденовірусу людини, що циркулює y багатьох людях (дивись, наприклад: Tatsis N et al Gene Therapy 2006 13:421-429). Аденовірус типу 35, що є відносно незвичайним, а тому має низькі рівні вже існуюючого імунітету до самого вектору, і застосовуваний як система y деяких туберкульозних вакцинах, що є розробленими (дивись наприклад, Radosevic et al Infection та Immunity 2007 75(8):4105-4115). Аденовірус типу 35 може також мати особливе значення у заявленому винаході, як вектор доставляння. 2. Ретровіруси Ретровіруси є групою одно-ланцюгових РНК-вірусів, охарактеризованих здатністю перетворення їх РНК у подвійно-ланцюгову ДНК в інфікованих клітинах зворотною транскрипцією (Coffin, 1990). Утворена ДНК тоді стабільно входить у клітинні хромoсоми, як прoвірус та спрямовує синтез вірусних білків. Входження призводить до збереження послідовностей вірусного гена y реципієнтній T-клітині та її нащадків. Ретровірусний геном містить три гени, gag, pol, та env, що є кодом для капсидних білків, полімеразного ферменту, та компонентів оболонки, відповідно. Послідовність, знайдена як вищерозташована від гена gag, містить сигнал для упаковки генома у віріони. Два довгих кінцевих повторень (LTR) послідовності є представленими на 5" та 3" кінцях вірусного генома. Вони містять сильний промотер та посилювач послідовності та є також потрібними для входження у геном клітинихазяїна (Coffin, 1990). Для створення ретровірусного вектору нуклеїнову кислоту, що кодує одну або більше олігонуклеотидних або полінуклеотидних корисних послідовностей, вставляють у вірусний 26 UA 107330 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 геном замість деяких вірусних послідовностей для створення вірусу, що є реплікаційно дефектним. Для створення віріонів створюють пакувальну лінію клітин, що містять гени gag, pol, та env, але без LTR, та пакувальні компоненти (Mann et al., 1983). Коли рекомбінантну плазміду, який містить кДНК, разом з ретровірусним LTR, та пакувальні послідовності уводять у цю лінію клітин (осадженням кальцію фосфату, наприклад), пакувальна послідовність дозволяє РНКтранскрипт рекомбінантної плазміди для упаковування у вірусні частинки, що тоді секретують у середовищах культур (Nicolas & Rubenstein, 1988; Temin, 1986; Mann et al., 1983). Середовища, що містять рекомбінантні ретровіруси, тоді збирають, необов'язково концентрують, та застосовують для переносу гена. Ретровірусні вектори здатні інфікувати багато типів клітин. Однак, входження та стабільна експресія потребують поділу клітини-хазяїна (Paskind et al., 1975). Новий підхід створено для специфічного націлювання ретровірусних векторів. який останнім часом розроблено на основі хімічної модифікації ретровірусу хімічним додаванням залишків лактози до вірусної оболонки. Ця модифікація могла б дозволити специфічну інфекцію гепатoцитів через рецептори сіалoглікопротеїну. Відмінний підхід до націлювання рекомбінантних ретровірусів створено, в ньому були застосовуваними біотиніловане антитіло проти білку ретровірусної оболонки та проти специфічного клітинного рецептору. Антитіло сполучали через біотинові компоненти застосуванням стрептавідину (Roux et al., 1989). Застосовуючи антитіло проти головних складних антигенів гістосумісності класу I та класу II, вони продемонстрували інфекцію багатьох клітин людини, що витягують ті антигени поверхні з екотопічного вірусу іn vitro (Roux et al., 1989). 3. Адено-асоційовані ВІРУСИ AAV (Ridgeway, 1988; Hermonat & Muzycska, 1984) є парoвірусом, відкритим, як забруднення аденовірусних напівпродуктів. Він є повсюдним вірусом (антитіло є представленим y 85 % популяції США), що не зв'язаний з будь-якою хворобою. Він також класифікований, як депендoвірус, оскільки його реплікація є залежною від присутності хелперного вірусу, як-то аденовірус. П'ять серoтипів виділені, з яких AAV-2 є найкраще характеризованим. AAV має одно-ланцюгову лінійну ДНК, що є інкапсидованою у капсидні білки VP1, VP2 та VP3 з утворенням ікосаедрального віріону 20 до 24 нм у діаметрі (Muzyczka & McLaughlin, 1988). Довжина ДНК AAV є приблизно 4,7 кілооснов. Він містить дві відкриті рамки зчитування та є фланкованим двома ITRs. Y геномі AAV є два головних гени: rep та cap. Ген rep кодує білки, чутливі стосовно вірусної реплікації, тоді як cap кодує капсидний білок VP1-3. Кожний ITR утворює шпилькову структуру форми T. Ці кінцеві повторення є тільки невід'ємними cis компонентами AAV для входження у хромoсому. Тому, AAV можна застосовувати як вектор з усіма вірусними кодувальними послідовностями, видаленими та заміщеними касетними генами для доставляння. Три вірусні промотери ідентифіковані та названі p5, p19, та p40, за їх позиціями у карті. Транскрипція p5 та p19 призводить до отримання білків rep, та транскрипція p40 створює капсидні білки (Hermonat & Muzyczka, 1984). Є кілька факторів, що підказують дослідження можливості застосування rAAV як вектору експресії. Один полягає у тому, що вимоги доставляння гена для входження у хромoсому хазяїна є несподівано малими. Це необхідно, щоб мати ITR 145-по, що є тільки 6 % геному AAV. Це залишає місце y векторі для збирання інсерції 4,5-ко ДНК. Тоді як це перенесення місткості може відвертати AAV від доставляння великих генів, це є достатнім для доставляння антизначеннєвих констрактів. AAV є також гарним предметом вибору переносників для доставляння внаслідок його безпечності. Існує відносно ускладнений механізм звільнення: не тільки аденовірус природного типу, але також гени AAV є потрібними для мобілізації rAAV. Подібно, AAV не є патогенним та не асоційований з будь-якою хворобою. Видалення вірусної кодувальної послідовності мінімізує імунні реакції на експресію вірусного гена, а тому, rAAV не викликає запальну відповідь. 4. Інші віруснІ вектори як констракти експресії Інші вірусні вектори можна застосовувати як констракти експресії у заявленому винаході для доставляння олігонуклеотидних або полінуклеотидних послідовностей до клітин-хазяїна. Вектори, похідні від вірусів, як-то вірусу коров'ячої віспи (Ridgeway, 1988; Coupar et al., 1988), лентивіруси, поліовіруси та віруси герпесу можна застосовувати. Інші вектори, похідні від вірусу групи віспи, як-то вектори, похідні від вірусу вітрянки, можна, як очікують, застосовувати також. Вони пропонують кілька притягальних особливостей для різних клітин ссавців (Friedmann, 1989; Ridgeway, 1988; Coupar et al., 1988; Horwich et al., 1990). З недавнім розпізнаванням дефектних вірусів гепатиту B нове розуміння є виграшним стосовно співвідношення структура-функція, відмінних вірусних послідовностей. Іn vitro 27 UA 107330 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 дослідження показало, що вірус міг би залишати здатність стосовно залежної від хелперу упаковки та зворотної транскрипції, незважаючи на делецію до 80 % його генома (Horwich et al., 1990). Це говорить, що великі частини генома можна було б заміщати чужинним генетичним матеріалом. Гепатoтропізм та витривалість (входження) були особливо притягальними властивостями для спрямованого на печінку переносу гена. Chang et al. (1991) уводили ген хлорамфенікол-ацетилтрансферази (CAT) у геном вірусу гепатиту B качки замість полімеразних, поверхневих та передповерхневих кодувальних послідовностей. Він був кoтрансфектованим з вірусом природного типу у лінію клітин гепатoми птиць. Середовища культур, що містять високі титри рекомбінантного вірусу, були застосовуваними для інфікування первинних гепатoцитів каченя. Стабільний ген експресії CAT, що визначали протягом принаймні протягом принаймні (Chang et al., 1991). Додаткові "вірусні" вектори охоплюють вірусо-подібні частинки (VLPs) та фаги. 5. НЕВІРУСНі вектори Для здійснення експресії олігонуклеотидних або полінуклеотидних послідовностей заявленого винаходу, констракт експресії повинен бути доставленим у клітину. Це доставляння може бути іn vitro, як трансформування ліній клітин у лабораторії, або іn vivo або ex vivo, як у лікуванні деяких станів хвороб. Як описано вище, один кращий механізм полягає у доставлянні інфекцією вірусом, де констракт експресії є інкапсульованим y інфекційній вірусній частинці. Як тільки констракт експресії доставлено у клітину, нуклеїнову кислоту, що кодує бажані олігонуклеотидні або полінуклеотидні послідовності, можна розташувати та експресувати на відмінних сайтах. У деяких втіленнях нуклеїнова кислота, що кодує констракт, може стабільно входити у геном клітини. Це входження може полягати y специфічному розташуванні та орієнтації через гомологічну рeкомбінацію (заміщення гена) або він може входити y випадковому, неспецифічному розташуванні (збільшення гена). У подальших втіленнях нуклеїнову кислоту можна стабільно підтримувати y клітині як окремий епісомний сегмент ДНК. Такі сегменти нуклеїнових кислот або "епісоми" кодують послідовності, достатні для підтримування та реплікації незалежно або синхронно з циклом клітини-хазяїна. Як констракт експресії доставляється до клітини та де y клітині залишається нуклеїнова кислота, залежить від типу застосовуваного констракту експресії. У деяких втіленнях винаходу, констракт експресії, який містить одну або більше олігонуклеотидних або полінуклеотидних послідовностей, може просто складатися з оголеної рекомбінантної ДНК або плазміди. Переніс констракту можна проводити, наприклад, будь-яким способом, що фізично або хімічно будь-яким способом, що забезпечує проникність клітин мембран. Це є особливо застосовним для переносу іn vitro, але це можна використовувати для застосування іn vivo також. Dubensky et al. (1984) успішно уводили ДНК вірусу поліoми у формі осадів кальцію фосфату у печінку та селезінку дорослих та новонароджених мишей, що демонструє активну вірусну реплікацію та гостру інфекцію. Benvenisty & Reshef (1986) також продемонстрували, що безпосередня інтраперитонеальна ін'єкція осаджених кальцію фосфатом плазмід призводить до експресії трансфектованх генів. Передбачено, що ДНК, що кодує корисний ген, можна також переносити подібним чином іn vivo та експресувати продукт гена. У ще одному втіленні винаходу для перенесення констракту експресії оголеної ДНК у клітини можна задіювати бомбардування частинками. Цей спосіб залежить від здатності прискорювати ДНК до високої швидкості, що дозволяє пробивати мембрани клітин та входити у клітини без їх вбивання (Klein et al., 1987). Розроблено кілька пристроїв для прискорювання невеликих частинок. Один такий пристрій працює при високій напрузі для створення електроструму, що у свою чергу забезпечує рушійну силу (Yang et al., 1990). Застосовувані мікробомбочки складаються з біологічно інертних речовин, як-то кульки з вольфраму чи золота. Вибрані органи, охоплюючи печінку, шкіру та м'язи тканин щурів та мишей бомбардують іn vivo (Yang et al., 1990; Zelenin et al., 1991). Це може потребувати хірургічного відкриття тканин або клітин. До того ж ДНК, що кодує конкретний ген, можна доставляти та уводити цим способом. Бактерії можна також використовувати для доставляння (наприклад, listeria, дивись WO2004/11048) та зокрема BCG. Композиції поліпептидів Загалом, поліпептид для застосування у винаході повинен бути виділеним поліпептидом (тобто відділеним від компонентів, з яким може звичайно бути знайденим у природі). Наприклад, існуючий у природі білок виділяють, якщо його відділяють від деяких або усіх співіснуюючих матеріалів y природній системі. Переважно, такі поліпептиди є принаймні приблизно на 90 % чистими, більш переважно принаймні приблизно на 95 % чистими та 28