Антитіла проти nrr notch1 і способи їх застосування

Реферат: Винахід належить до анти-NRR Notch1-антитіл, композицій, які містять анти-NRR Notch1антитіла, способу одержання та способу застосування анти-NRR Notch1-антитіл, поліпептиду, який кодує анти-NRR Notch1-антитіло, вектора, який містить нуклеотид та клітини-хазяїна. UA 100984 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ПЕРЕХРЕСНЕ ПОСИЛАННЯ НА СПОРІДНЕНІ ЗАЯВКИ У даній заявці вимагається пріоритет по даті подачі попередньої заявки на видачу патенту США з реєстраційним № 60/933072, поданої 4 червня 2007 р., і попередньої заявки на видачу патенту США з реєстраційним № 60/994646, поданої 20 вересня 2007 р., описи яких включені в даний опис у вигляді посилання. ГАЛУЗЬ ТЕХНІКИ, ДО ЯКОЇ НАЛЕЖИТЬ ВИНАХІД Даний винахід стосується, головним чином, галузі молекулярної біології. Більш конкретно, винахід стосується антитіл проти області негативної регуляції (NRR) Notch1 і застосувань таких антитіл. РІВЕНЬ ТЕХНІКИ Сімейство рецепторів Notch являє собою клас еволюційно консервативних трансмембранних рецепторів, які передають сигнали, що впливають на розвиток різноманітних організмів, від морських їжаків до людини. І рецептори Notch, і сімейство їх лігандів Delta і Serrate (відомі як Jagged у ссавців) є трансмембранними білками з великими позаклітинними доменами, які містять повтори, подібні епідермальному фактору росту (EGF). Кількість паралогів Notch відрізняється у різних видів. Наприклад, існує чотири рецептори Notch у ссавців (Notch1-Notch4), два у Caenorhabditis elegans (LIN-12 і GLP-1) і один у Drosophila melanogaster (Notch). Рецептори Notch протеолітично процесуються під час транспорту до клітинної поверхні фуриноподібною протеазою на ділянці S1, розташованій із зовнішньої сторони від трансмембранного домену, вивільняючи позаклітинну субодиницю Notch (ECN) і трансмембранну субодиницю Notch (NTM). Дві вказаних субодиниці залишаються нековалентно асоційованими і складають зрілий гетеродимерний рецептор клітинної поверхні. Субодиниці ECN Notch1 містять 36 N-кінцевих EGF-подібних повторів, за якими ідуть три тандемно повторюваних модулі Lin 12/Notch-повторів (LNR), які передують ділянці S1. Кожний модуль LNR містить три дисульфідних зв'язки і групу консервативних кислих і полярних залишків, які передбачувано координують іон кальцію. У області EGF-повтору знаходяться ділянки зв’язування активуючих лігандів. Модулі LNR, які містять унікальний домен рецепторів Notch, беруть участь в підтриманні Notch в конформації, відповідній стану спокою, перед індукованою лігандом активацією. NTM Notch1 містить позаклітинну область (яка включає сайт розщеплення S2), трансмембранний фрагмент (який несе сайт розщеплення S3) і велику внутрішньоклітинну частину, яка включає домен RAM, повтори анкірину, домен трансактивації і послідовність PEST на карбоксильному кінці. Стабільна асоціація субодиниць ECN і NTM залежить від домену гетеродимеризації (HD), що містить карбоксильний кінець ECN (називаний HD-C) і позаклітинний амінокінець NTM (називаний HD-N). Зв’язування ліганду Notch з субодиницею ECN ініціює два протеолітичних розщеплення, що ідуть одне за одним, які відбуваються внаслідок регульованого внутрішньомембранного протеолізу. Перше розщеплення металопротеазою в сайті S2 робить трансмембранну субодиницю Notch чутливою до другого розщеплення в сайті S3, розташованому поблизу внутрішнього листка плазматичної мембрани. Розщеплення в сайті S3, яке каталізується мультибілковим комплексом, що містить пресенілін і нікастрин, вивільняє внутрішньоклітинну частину трансмембранної субодиниці Notch, забезпечуючи можливість її транслокації в ядро і активації транскрипції генів-мішеней. У людини ідентифіковано п'ять лігандів Notch класу Jagged і Delta-подібного класу (Jagged 1 (також називаний Serrate 1), Jagged 2 (також називаний Serrate 2), Delta-подібний 1 (також називаний DLL1), Delta-подібний 3 (також називаний DLL3) і Delta-подібний 4 (також називаний DLL4)). Кожний з лігандів є однопрохідним трансмембранним білком з консервативним Nкінцевим мотивом Delta, Serrate, LAG-2 (DSL), необхідним для зв’язування Notch. Серія EGFподібних модулів, С-кінцевих відносно мотиву DSL, передує фрагменту, що пронизує мембрану. На відміну від рецепторів Notch ліганди мають короткі цитоплазматичні хвости з 70-215 амінокислот на С-кінці. Крім того, повідомлялося про інші типи лігандів (наприклад, DNER, NB3 і F3/контактин). Шлях Notch функціонує в ході різних процесів розвитку і фізіологічних процесів, включаючи вплив на нейрогенез у двокрилих і хребетних. Загалом, передача сигналів Notch залучена у латеральне гальмування, прийняття рішень про вибір лінії клітин і створення границь між групами клітин (дивись, наприклад, Bray, Molecular Cell Biology 7: 678-679, 2006). Показано, що множина захворювань людини, включаючи злоякісні пухлини і нейродегенеративні порушення, є результатом мутацій в генах, що кодують рецептори Notch або їх ліганди (дивись, наприклад, Nam et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 6: 501-509, 2002). Зв'язок між необмеженою передачею сигналів Notch і злоякісністю уперше був виявлений, коли ідентифікували рекурентну хромосомну транслокацію t (7; 9) (q34; q34.3), яка створює укорочений, конститутивно активний 1 UA 100984 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 варіант Notch1 людини, в підгрупі пацієнтів з гострим лімфобластним лейкозом (T-ALL). У мишачих моделях показано, що передача сигналів Notch1 необхідна для розвитку Т-клітин і що опосередковані Notch1 сигнали стимулюють розвиток Т-клітин за рахунок розвитку В-клітин. Також в мишачих моделях надмірна передача сигналів Notch під час розвитку приводить до неоплазії Т-клітин. Крім того, рецептори Notch експресуються у великому числі злоякісних пухлин людини і одержаних з пухлин клітинних лініях і стимулюють шлях розвитку клітин нервової системи з ембріональних стовбурових клітин людини. Наприклад, Notch експресується на високому рівні при неопластичних ураженнях шийки матки людини і в клітинах печінковоклітинної карциноми людини. Беручи до уваги участь шляху передачі сигналів Notch в широкій множині захворювань людини, ясно, що зберігається потреба в засобах, які регулюють передачу сигналів Notch, що мають клінічні характеристики, які є оптимальними для розробки терапевтичних засобів. Винахід, описаний в цьому документі, задовольняє таку потребу і забезпечує інші переваги. Всі публікації, згадувані в даному описі, включаючи заявки на видачу патентів і публікації патентів, включені у вигляді посилання в повному об'ємі. СУТЬ ВИНАХОДУ Винахід частково основане на ідентифікації множини агентів, що зв'язують область негативної регуляції (NRR) Notch1 (таких як антитіла і їх фрагменти). NRR Notch1 являє собою важливу і корисну терапевтичну мішень, і винахід стосується композицій і способів, основаних на зв’язуванні NRR Notch1. Засоби, що зв'язують NRR Notch1 згідно з винаходом, які описані в цьому документі, являють собою цінні терапевтичні і діагностичні засоби для застосування у випадку цілеспрямованого впливу на патологічні стани, асоційовані з експресією і/або активністю шляхів передачі сигналів Notch1. Відповідно, винахід стосується способів, композицій, наборів і виробів, які стосуються зв’язування NRR Notch1. Даний винахід стосується антитіл, які зв'язуються з NRR Notch1. У одному аспекті відмітною ознакою винаходу є ізольоване антитіло, яке зв'язує NRR Notch1. У конкретному аспекті у винаході охарактеризоване ізольоване антитіло проти NRR Notch1, яке зв'язує NRR Notch1 з Kd -7 1×10 або сильніше. У переважних варіантах антитіло проти NRR Notch1 зв'язує NRR Notch1 з -8 -9 Kd 1×10 або сильніше або з Kd 1×10 або сильніше. У іншому аспекті винахід стосується ізольованого анти-NRR Notch1-антитіла, де повнорозмірна IgG-форма антитіла зв'язує NRR -7 Notch1 людини і миші з Kd 1×10 або сильніше. Як добре встановлено в даній галузі, афінність зв’язування ліганду з його рецептором може бути визначена з використанням будь-якого з множини аналізів і виражена різними кількісними показниками. Відповідно, в одному варіанті афінність зв’язування виражають у вигляді значень Kd, які відображають дійсну афінність зв’язування (наприклад, з мінімізованими ефектами авідності). Звичайно і переважно афінність зв’язування вимірюють in vitro або в безклітинних системах, або в асоційованих з клітинами системах. Можна використовувати будь-який з множини аналізів, відомих в даній галузі, включаючи аналізи, описані в цьому документі, для проведення вимірювань афінності зв’язування, включаючи, наприклад, Biacore, радіоімуноаналіз (РІА) і ELISA. У одному аспекті відмітною ознакою винаходу є ізольоване анти-NRR Notch1-антитіло, яке містить: (a) щонайменше одну, дві, три, чотири або п'ять послідовностей гіперваріабельних областей (HVR), вибраних з: (i) HVR-L1, що містить послідовність A1-A11, де A1-A11 являє собою RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 7), (ii) HVR-L2, що містить послідовність B1-B7, де B1-B7 являє собою SASFLYS (SEQ ID NO: 8), (iii) HVR-L3, що містить послідовність C1-C9, де C1-C9 являє собою QQSYTTPPT (SEQ ID NO: 9), (iv) HVR-H1, що містить послідовність D1-D10, де D1-D10 являє собою GFTFSSYWIH (SEQ ID NO: 1), (v) HVR-H2, що містить послідовність E1-E18, де E1-E18 являє собою ARINPSNGSTNYADSVKG (SEQ ID NO: 2), і (vi) HVR-H3, що містить послідовність F1-F14, де F1-F14 являє собою ARGSGFRWVMDY (SEQ ID NO: 6); і (b) щонайменше один варіант HVR, де послідовність варіанта HVR містить модифікацію щонайменше одного залишку в послідовності, вказаній в SEQ ID NO: 1-12. Модифікація за потреби являє собою заміну, інсерцію або делецію. У бажаних варіантах здійснення винаходу варіант HVR-L3 містить 1-4 (1, 2, 3 або 4) заміни в будь-якому поєднанні наступних положень: C3 (S або F), C4 (Y або F), C5 (Т або S) і C8 (Р або 2 UA 100984 C2 5 10 15 20 25 30 35 А або S). У іншому бажаному варіанті здійснення винаходу варіант HVR-H2 містить 1-4 (1, 2, 3 або 4) заміни в будь-якому поєднанні наступних положень: E6 (S або Р або А); E8 (G або R); E10 (Т або А або N); і E11 (N або Н або Q або R). У іншому аспекті відмітною ознакою винаходу є ізольоване анти-NRR Notch1-антитіло, яке містить одну, дві, три, чотири, п'ять або шість HVR, де кожна HVR містить, складається або по суті складається з послідовності, вибраної з послідовностей SEQ ID NO: 1-12, і де послідовність SEQ ID NO: 7 відповідає HVR-L1, послідовність SEQ ID NO: 8 відповідає HVR-L2, послідовність SEQ ID NO: 9, 10, 11 або 12 відповідає HVR-L3, послідовність SEQ ID NO: 1 відповідає HVR-H1, послідовність SEQ ID NO: 2, 3, 4 або 5 відповідає HVR-H2 і послідовність SEQ ID NO: 6 відповідає HVR-H3. У одному аспекті винаходу пропонується антитіло, яке містить область HVR-H1, що включає послідовність SEQ ID NO: 1. У одному аспекті у винаході пропонується антитіло, яке містить область HVR-H2, що включає послідовність SEQ ID NO: 2, 3, 4 або 5. В одному аспекті у винаході пропонується антитіло, яке містить область HVR-H3, що включає послідовність SEQ ID NO: 6. У одному аспекті у винаході пропонується антитіло, яке містить HVR-L3, що включає послідовність SEQ ID NO: 10, 11 або 12. У одному аспекті у винаході пропонується антитіло, яке містить щонайменше одну, щонайменше дві, щонайменше три або всі чотири з наступних послідовностей: (i) послідовність HVR-H1, що містить послідовність SEQ ID NO: 1; (ii) послідовність HVR-H2, що містить послідовність SEQ ID NO:2, 3, 4 або 5; послідовність HVR-H3, що містить послідовність SEQ ID NO: 6; послідовність HVR-L3, що містить послідовність SEQ ID NO: 10, 11 або 12. У переважному варіанті антитіло містить області HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 і HVR-H3, де кожна по порядку містить послідовність SEQ ID NO: 7, 8, 9, 1, 2, 6. В іншому переважному варіанті антитіло містить області HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 і HVR-H3, де кожна по порядку містить послідовність SEQ ID NO: 7, 8, 10, 1, 3, 6. В наступному переважному варіанті антитіло містить області HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 і HVR-H3, де кожна по порядку містить послідовність SEQ ID NO: 7, 8, 11, 1, 4, 6. В наступному переважному варіанті антитіло містить області HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 і HVR-H3, де кожна по порядку містить послідовність SEQ ID NO: 7, 8, 12, 1, 5, 6. Амінокислотні послідовності SEQ ID NO: 1-12 пронумеровані згідно з окремими HVR (тобто H1, H2 або H3), які вказані на фігурі 1, при цьому нумерація відповідає системі нумерації Кабата, яка описана нижче. У одному конкретному аспекті у винаході пропонується ізольоване анти-NRR Notch1антитіло, яке інгібує, знижує і/або блокує передачу сигналів Notch1. Деякі варіанти антитіл згідно з винаходом містять варіабельний домен легкого ланцюга гуманізованого антитіла 4D5 (huMAb4D5-8) (HERCEPTIN®, Genentech, Inc., South San Francisco, Calif., USA) (також згадуваного в патенті США № 6407213 і в публікації Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5): 10731093), який зображений у вигляді послідовності SEQ ID NO: 53 нижче. 40 45 У одному варіанті послідовність варіабельного домену легкого ланцюга huMAb4D5-8 модифікована в одному або декількох положеннях 30, 66 і 91 (Asn, Arg і His, які вказані жирним шрифтом/курсивом вище, відповідно). У конкретному варіанті модифікована послідовність huMAb4D5-8 містить Ser в положенні 30, Gly в положенні 66 і/або Ser в положенні 91. Відповідно, в одному варіанті антитіло згідно з винаходом містить варіабельний домен легкого ланцюга, що містить послідовність, зображену в SEQ ID NO: 54 нижче: 3 UA 100984 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Замінені залишки відносно huMAb4D5-8 показані жирним шрифтом/курсивом. Антитіла згідно з винаходом можуть містити будь-яку послідовність варіабельного домену каркаса, за умови, що активність зв’язування з NRR Notch1 по суті зберігається. Наприклад, в деяких варіантах антитіла згідно з винаходом містять консенсусну послідовність каркаса важкого ланцюга підгрупи III людини. У одному варіанті таких антитіл, каркасна консенсусна послідовність містить заміну в положенні 71, 73 і/або 78. У деяких варіантах таких антитіл положення 71 представлене А, 73 представлене Т і/або 78 представлене A. В одному варіанті такі антитіла містять каркасні послідовності варіабельного домену важкого ланцюга huMAb4D58 (HERCEPTIN®, Genentech, Inc., South San Francisco, Calif., USA) (також описано в патентах США №№ 6407213 і 5821337 і в Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5): 1073-1093). В одному варіанті такі антитіла додатково містять консенсусну каркасну послідовність легкого ланцюга κI людини. У конкретному варіанті такі антитіла містять послідовності HVR легкого ланцюга huMAb4D5-8, що описано в патентах США №№ 6407213 і 5821337.) У одному варіанті такі антитіла містять послідовності варіабельного домену легкого ланцюга huMAb4D5-8 (HERCEPTIN®, Genentech, Inc., South San Francisco, Calif., USA) (також описаного в патентах США №№ 6407213 і 5821337 і в Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5): 1073-1093). У одному варіанті антитіло згідно з винаходом містить варіабельний домен важкого ланцюга, в якому каркасна послідовність містить послідовність SEQ ID NO: 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 і/або 37, і послідовності HVR H1, H2 і H3 являють собою послідовності SEQ ID NO: 1, 2 і/або 6, відповідно. У іншому варіанті каркасна послідовність містить послідовність SEQ ID NO: 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 і/або 37, і послідовності HVR H1, H2 і H3 являють собою послідовності SEQ ID NO: 1, 3 і/або 6, відповідно. У ще одному варіанті каркасна послідовність містить послідовність SEQ ID NO: 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 і/або 37, і послідовності HVR H1, H2 і H3 являють собою послідовності SEQ ID NO: 1, 4 і/або 6, відповідно. У наступному варіанті каркасна послідовність містить послідовність SEQ ID NO: 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 і/або 37, і послідовності HVR H1, H2 і H3 являють собою послідовності SEQ ID NO: 1, 5 і/або 6, відповідно. У конкретному варіанті антитіло згідно з винаходом містить варіабельний домен легкого ланцюга, в якому каркасна послідовність містить послідовність SEQ ID NO: 38, 39, 40 і/або 41, і послідовності HVR L1, L2 і L3 являють собою послідовності SEQ ID NO: 7, 8 і/або 9, відповідно. У іншому варіанті антитіло згідно з винаходом містить варіабельний домен легкого ланцюга, в якому каркасна послідовність містить послідовність SEQ ID NO: 38, 39, 40 і/або 41, і послідовності HVR L1, L2 і L3 являють собою послідовності SEQ ID NO: 7, 8 і/або 10, відповідно. У додатковому варіанті антитіло згідно з винаходом містить варіабельний домен легкого ланцюга, в якому каркасна послідовність містить послідовність SEQ ID NO: 38, 39, 40 і/або 41, і послідовності HVR L1, L2 і L3 являють собою послідовності SEQ ID NO: 7, 8 і/або 11, відповідно. У ще одному варіанті антитіло згідно з винаходом містить варіабельний домен легкого ланцюга, в якому каркасна послідовність містить послідовність SEQ ID NO: 38, 39, 40 і/або 41, і послідовності HVR L1, L2 і L3 являють собою послідовності SEQ ID NO: 7, 8 і/або 12, відповідно. У іншому варіанті антитіло згідно з винаходом містить варіабельний домен важкого ланцюга, в якому каркасна послідовність містить послідовність SEQ ID NO: 42, 43, 44 і/або 45, і послідовності HVR H1, H2 і H3 являють собою послідовності SEQ ID NO: 1, 2 і/або 6, відповідно. У додатковому варіанті антитіло згідно з винаходом містить варіабельний домен важкого ланцюга, в якому каркасна послідовність містить послідовність SEQ ID NO: 42, 43, 44 і/або 45, і послідовності HVR H1, H2 і H3 являють собою послідовності SEQ ID NO: 1, 3 і/або 6, відповідно. 4 UA 100984 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У наступному варіанті антитіло згідно з винаходом містить варіабельний домен важкого ланцюга, в якому каркасна послідовність містить послідовність SEQ ID NO: 42, 43, 44 і/або 45, і послідовності HVR H1, H2 і H3 являють собою послідовності SEQ ID NO: 1, 4 і/або 6, відповідно. У ще одному варіанті антитіло згідно з винаходом містить варіабельний домен важкого ланцюга, в якому каркасна послідовність містить послідовність SEQ ID NO: 42, 43, 44 і/або 45, і послідовності HVR H1, H2 і H3 являють собою послідовності SEQ ID NO: 1, 5 і/або 6, відповідно. У одному варіанті антитіло згідно з винаходом містить варіабельний домен легкого ланцюга, в якому каркасна послідовність містить послідовність SEQ ID NO: 15, 16, 17 і/або 18, і послідовності HVR L1, L2 і L3 являють собою послідовності SEQ ID NO: 7, 8 і/або 9, відповідно. У іншому варіанті антитіло згідно з винаходом містить варіабельний домен легкого ланцюга, в якому каркасна послідовність містить послідовність SEQ ID NO: 15, 16, 17 і/або 18, і послідовності HVR L1, L2 і L3 являють собою послідовності SEQ ID NO: 7, 8 і/або 10, відповідно. У ще одному варіанті антитіло згідно з винаходом містить варіабельний домен легкого ланцюга, в якому каркасна послідовність містить послідовність SEQ ID NO: 15, 16, 17 і/або 18, і послідовності HVR L1, L2 і L3 являють собою послідовності SEQ ID NO: 7, 8 і/або 11, відповідно. У наступному варіанті антитіло згідно з винаходом містить варіабельний домен легкого ланцюга, в якому каркасна послідовність містить послідовність SEQ ID NO: 15, 16, 17 і/або 18, і послідовності HVR L1, L2 і L3 являють собою послідовності SEQ ID NO: 7, 8 і/або 12, відповідно. У одному варіанті антитіло згідно з винаходом містить варіабельний домен важкого ланцюга, в якому каркасна послідовність містить послідовності SEQ ID NO: 42, 43, 47 і/або 45, і послідовності HVR H1, H2 і H3 являють собою послідовності SEQ ID NO:1, 2 і/або 6, відповідно. У додатковому варіанті антитіло згідно з винаходом містить варіабельний домен важкого ланцюга, в якому каркасна послідовність містить послідовності SEQ ID NO: 42, 43, 47 і/або 45, і послідовності HVR H1, H2 і H3 являють собою послідовності SEQ ID NO: 1, 3 і/або 6, відповідно. У іншому варіанті антитіло згідно з винаходом містить варіабельний домен важкого ланцюга, в якому каркасна послідовність містить послідовності SEQ ID NO: 42, 43, 47 і/або 45, і послідовності HVR H1, H2 і H3 являють собою послідовності SEQ ID NO: 1, 4 і/або 6, відповідно. У наступному варіанті антитіло згідно з винаходом містить варіабельний домен важкого ланцюга, в якому каркасна послідовність містить послідовності SEQ ID NO: 42, 43, 47 і/або 45, і послідовності HVR H1, H2 і H3 являють собою послідовності SEQ ID NO: 1, 5 і/або 6, відповідно. У одному варіанті антитіло згідно з винаходом містить варіабельний домен легкого ланцюга, в якому каркасна послідовність містить послідовності SEQ ID NO: 15, 16, 47 і/або 18, і послідовності HVR L1, L2 і L3 являють собою послідовності SEQ ID NO: 7, 8 і/або 9, відповідно. У іншому варіанті антитіло згідно з винаходом містить варіабельний домен легкого ланцюга, в якому каркасна послідовність містить послідовності SEQ ID NO: 15, 16, 47 і/або 18, і послідовності HVR L1, L2 і L3 являють собою послідовності SEQ ID NO: 7, 8 і/або 10, відповідно. У ще одному варіанті антитіло згідно з винаходом містить варіабельний домен легкого ланцюга, в якому каркасна послідовність містить послідовності SEQ ID NO: 15, 16, 47 і/або 18, і послідовності HVR L1, L2 і L3 являють собою послідовності SEQ ID NO: 7, 8 і/або 11, відповідно. У наступному варіанті антитіло згідно з винаходом містить варіабельний домен легкого ланцюга, в якому каркасна послідовність містить послідовності SEQ ID NO: 15, 16, 47 і/або 18, і послідовності HVR L1, L2 і L3 являють собою послідовності SEQ ID NO: 7, 8 і/або 12, відповідно. У ще одному варіанті антитіло згідно з винаходом є антитілом з дозрілою афінністю, щоб одержати необхідну афінність зв’язування мішені. У одному прикладі антитіло з дозрілою афінністю згідно з винаходом містить заміну в одному або декількох положеннях амінокислот H53, H55, H57, H58, L91 і L96. У одному прикладі антитіло з дозрілою афінністю згідно з винаходом містить одну або декілька з наступних замін: (a) у важкому ланцюгу S53P, S53A, G55R, T57A, T57N, N58H, N58Q і N58R, або (b) у легкому ланцюгу S91F, P96A і P96S. У іншому аспекті антитіло згідно з винаходом містить варіабельний домен важкого ланцюга, що містить послідовність SEQ ID NO: 58. У одному варіанті антитіло згідно з винаходом містить варіабельний домен легкого ланцюга, що містить послідовність SEQ ID NO: 59. У одному варіанті антитіло згідно з винаходом містить варіабельний домен важкого ланцюга, що містить послідовність SEQ ID NO: 58, і варіабельний домен легкого ланцюга, що містить послідовність SEQ ID NO: 59. У іншому аспекті антитіло згідно з винаходом містить варіабельний домен важкого ланцюга, що містить послідовність SEQ ID NO: 60. У одному варіанті антитіло згідно з винаходом містить варіабельний домен легкого ланцюга, що містить послідовність SEQ ID NO: 61. У одному варіанті антитіло згідно з винаходом містить варіабельний домен важкого ланцюга, що містить послідовність SEQ ID NO: 60, і варіабельний домен легкого ланцюга, що містить послідовність SEQ ID NO: 61. У іншому аспекті антитіло згідно з винаходом містить варіабельний домен важкого ланцюга, що містить послідовність SEQ ID NO: 62. У одному 5 UA 100984 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 варіанті антитіло згідно з винаходом містить варіабельний домен легкого ланцюга, що містить послідовність SEQ ID NO: 63. У одному варіанті антитіло згідно з винаходом містить варіабельний домен важкого ланцюга, що містить послідовність SEQ ID NO: 62, і варіабельний домен легкого ланцюга, що містить послідовність SEQ ID NO: 63. У іншому аспекті антитіло згідно з винаходом містить варіабельний домен важкого ланцюга, що містить послідовність SEQ ID NO: 64. У одному варіанті антитіло згідно з винаходом містить варіабельний домен легкого ланцюга, що містить послідовність SEQ ID NO: 65. У одному варіанті антитіло згідно з винаходом містить варіабельний домен важкого ланцюга, що містить послідовність SEQ ID NO: 64, і варіабельний домен легкого ланцюга, що містить послідовність SEQ ID NO: 65. У одному аспекті у винаході пропонується антитіло, яке конкурує з будь-яким з описаних вище антитіл за зв’язування з NRR Notch1. У одному аспекті у винаході пропонується антитіло, яке зв'язується з тим же самим або подібним епітопом на NRR Notch1, що і будь-яке з описаних вище антитіл. Як відомо в даній галузі і як описано більш детально нижче, положення амінокислот/визначення границь гіперваріабельної області антитіла можуть варіювати залежно від контексту і різних визначень, відомих в даній галузі (які описані нижче). Деякі положення у варіабельному домені можуть розглядатися як гібридні гіперваріабельні положення, оскільки такі положення можна вважати такими, що знаходяться в гіперваріабельній області згідно з однією групою критеріїв, а також вважати такими, що знаходяться поза гіперваріабельною областю згідно з іншою групою критеріїв. Одне або декілька таких положень також можна знайти в розширених гіперваріабельних областях (які додатково визначені нижче). У деяких варіантах антитіло є моноклональним антитілом. У інших варіантах антитіло є поліклональним антитілом. У деяких варіантах антитіло вибране з групи, яка складається з химерного антитіла, антитіла з дозрілою афінністю, гуманізованого антитіла і антитіла людини. У деяких варіантах антитіло являє собою фрагмент антитіла. У деяких варіантах антитіло являє собою Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2 або scFv. У одному варіанті антитіло є химерним антитілом, наприклад, антитілом, яке містить антигензв’язувальні послідовності донора, відмінного від людини, до яких прищеплена гетерологічна послідовність тварини, відмінної від людини, людини або гуманізована послідовність (наприклад, каркасні послідовності і/або послідовності константного домену). У одному варіанті донором, відмінним від людини, є миша. У наступному варіанті антигензв’язувальна послідовність є синтетичною, наприклад, одержана за допомогою мутагенезу (наприклад, з використанням скринінгу в фаговому дисплеї і т. д.). У конкретному варіанті химерне антитіло згідно з винаходом має мишачі V-області і людську С-область. У одному варіанті V-область легкого ланцюга миші зливають з легким ланцюгом каппа людини. У іншому варіанті V-область важкого ланцюга миші зливають з С-областю IgG1 людини. Гуманізовані антитіла згідно з винаходом включають антитіла, які мають амінокислотні заміни в каркасній області (FR), і варіанти по дозріванню афінності із змінами в прищеплених CDR. Замінювані амінокислоти в CDR або FR не обмежені амінокислотами, присутніми в донорному або реципієнтному антитілі. У інших варіантах антитіла згідно з винаходом додатково містять зміни в амінокислотних залишках в Fc-області, які приводять до поліпшеної ефекторної функції, включаючи посилену функцію CDC і/або ADCC і В-клітинний кілінг. Інші антитіла згідно з винаходом включають антитіла, що мають специфічні зміни, які підвищують стабільність. У інших варіантах антитіла згідно з винаходом містять зміни амінокислотних залишків в Fc-області, які приводять до зниженої ефекторної функції, наприклад, зниженої функції CDC і/або ADCC і/або зниженого В-клітинного кілінгу. У деяких варіантах антитіла згідно з винаходом характеризуються зниженим зв’язуванням (наприклад, відсутністю зв’язування) з фактором комплементу C1q людини і/або Fc-рецептором людини на природних клітинахкілерах (NK). У деяких варіантах антитіла згідно з винаходом характеризуються зниженим зв’язуванням (наприклад, відсутністю зв’язування) з FcγRI, FcγRIIA і/або FcγRIIIA. У деяких варіантах антитіла згідно з винаходом стосуються класу IgG (наприклад, IgG1 або IgG4) і містять щонайменше одну мутацію в E233, L234, G236, D265, D270, N297, E318, K320, K322, A327, A330, P331 і/або P329 (нумерація згідно з покажчиком EU). У деяких варіантах антитіла містять мутації L234A/L235A або D265A/N297A. У одному аспекті у винаході пропонуються анти-NRR Notch1-поліпептиди, які містять будьяку з антигензв’язувальних послідовностей, пропонованих у винаході, при цьому анти-NRR Notch1-поліпептиди специфічно зв'язуються з NRR Notch1, наприклад, з NRR Notch1 людини або миші. Антитіла згідно з винаходом зв'язують (наприклад, специфічно зв'язують) NRR Notch1 і в деяких варіантах можуть модулювати один або декілька аспектів передачі сигналу Notch1 і/або 6 UA 100984 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 порушення будь-якого біологічно важливого біологічного шляху Notch1 і/або ліганду Notch1, і/або лікування і/або профілактику пухлини, клітинного проліферативного порушення або злоякісної пухлини, і/або лікування або профілактику порушення, асоційованого з експресією і/або активністю Notch1 (такою як підвищена експресія і/або активність Notch1). У деяких варіантах антитіло проти NRR Notch1 специфічно зв'язується з поліпептидом, що складається або в основному складається з NRR Notch1 (наприклад, NRR Notch1 людини або миші). У -7 деяких варіантах антитіло специфічно зв'язує Notch1 з Kd 1×10 або сильніше. У деяких варіантах антитіло згідно з винаходом зменшує, інгібує і/або блокує активність Notch1 in vivo і/або in vitro. У одному аспекті винахід стосується застосування антитіла згідно з винаходом для одержання лікарського засобу для терапевтичного і/або профілактичного лікування порушення, такого як злоякісна пухлина, пухлина і/або клітинне проліферативне порушення. У деяких варіантах порушення являє собою невропатію або нейродегенеративне захворювання. У наступних переважних варіантах порушення являє собою патологічний стан, асоційований з ангіогенезом. У деяких варіантах патологічним станом, асоційованим з ангіогенезом, є пухлина, злоякісна пухлина і/або клітинне проліферативне порушення. У деяких варіантах патологічним станом, асоційованим з ангіогенезом, є внутрішньоочне неоваскулярне захворювання. У одному аспекті у винаході пропонуються композиції, які містять одне або декілька антитіл згідно з винаходом і носій. У одному варіанті носій є фармацевтично прийнятним. У іншому аспекті у винаході пропонуються нуклеїнові кислоти, які кодують анти-NRR Notch1антитіло згідно з винаходом. У ще одному аспекті у винаході пропонуються вектори, які містять нуклеїнову кислоту згідно з винаходом. У наступному аспекті у винаході пропонуються композиції, які містять одну або декілька нуклеїнових кислот згідно з винаходом і носій. У одному варіанті носій є фармацевтично прийнятним. У одному аспекті у винаході пропонуються клітини-хазяїни, які містять нуклеїнову кислоту або вектор згідно з винаходом. Вектор може бути будь-якого типу, наприклад, рекомбінантний вектор, такий як експресуючий вектор. Можна використати будь-які з множини клітин-хазяїнів. У одному варіанті клітиною-хазяїном є прокаріотична клітина, наприклад, Е. coli. У іншому варіанті клітиною-хазяїном є еукаріотична клітина, наприклад, клітина ссавця, така як клітина яєчника китайського хом’ячка (CHO). У наступному аспекті у винаході пропонуються способи одержання антитіла згідно з винаходом. Наприклад, у винаході пропонуються способи одержання анти-NRR Notch1антитіла (яке, як визначено в даному описі, включає повнорозмірне антитіло і його фрагменти), де вказаний спосіб включає експресію у придатній клітині-хазяїні рекомбінантного вектора згідно з винаходом, що кодує антитіло (або його фрагмент), і витягання антитіла. У одному аспекті у винаході пропонується виріб, який містить місткість і композицію, що знаходиться в місткості, при цьому композиція містить одне або декілька анти-NRR Notch1антитіл згідно з винаходом. У одному варіанті композиція містить нуклеїнову кислоту згідно з винаходом. У іншому варіанті композиція, яка містить антитіло, додатково містить носій, який в деяких варіантах є фармацевтично прийнятним. У одному варіанті виріб згідно з винаходом додатково включає інструкції по введенню композиції (наприклад, антитіла) людині (наприклад, інструкції по застосуванню будь-якого зі способів, описаних в цьому документі). У іншому аспекті у винаході пропонується набір, який включає першу місткість, що містить композицію, яка містить одне або декілька анти-NRR Notch1-антитіл згідно з винаходом, і другу місткість, що містить буфер. У одному варіанті буфер є фармацевтично прийнятним. У одному варіанті композиція, яка містить антитіло, додатково містить носій, який в деяких варіантах є фармацевтично прийнятним. У іншому варіанті набір додатково містить інструкції по введенню композиції (наприклад, антитіла) людині. У наступному аспекті винахід стосується застосування анти-NRR Notch1-антитіла згідно з винаходом для одержання лікарського засобу для терапевтичного і/або профілактичного лікування порушення, такого як злоякісна пухлина, пухлина і/або клітинне проліферативне порушення. У деяких варіантах порушення являє собою невропатію або нейродегенеративне захворювання. У наступних переважних варіантах порушенням є патологічний стан, асоційований з ангіогенезом. У деяких варіантах патологічним станом, асоційованим з ангіогенезом, є пухлина, злоякісна пухлина і/або клітинне проліферативне порушення. У деяких варіантах патологічним станом, асоційованим з ангіогенезом, є внутрішньоочне неоваскулярне захворювання. 7 UA 100984 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 У одному аспекті винахід стосується застосування нуклеїнової кислоти згідно з винаходом для одержання лікарського засобу для терапевтичного і/або профілактичного лікування порушення, такого як злоякісна пухлина, пухлина і/або клітинне проліферативне порушення. У деяких варіантах порушення являє собою невропатію або нейродегенеративне захворювання. У наступних переважних варіантах порушенням є патологічний стан, асоційований з ангіогенезом. У деяких варіантах патологічним станом, асоційованим з ангіогенезом, є пухлина, злоякісна пухлина і/або клітинне проліферативне порушення. У деяких варіантах патологічним станом, асоційованим з ангіогенезом, є внутрішньоочне неоваскулярне захворювання. У іншому аспекті винахід стосується застосування експресуючого вектора згідно з винаходом для одержання лікарського засобу для терапевтичного і/або профілактичного лікування порушення, такого як злоякісна пухлина, пухлина і/або клітинне проліферативне порушення. У деяких варіантах порушення являє собою невропатію або нейродегенеративне захворювання. У наступних переважних варіантах порушенням є патологічний стан, асоційований з ангіогенезом. У деяких варіантах патологічним станом, асоційованим з ангіогенезом, є пухлина, злоякісна пухлина і/або клітинне проліферативне порушення. У деяких варіантах патологічним станом, асоційованим з ангіогенезом, є внутрішньоочне неоваскулярне захворювання. У наступному аспекті винахід стосується застосування клітини-хазяїна згідно з винаходом для одержання лікарського засобу для терапевтичного і/або профілактичного лікування порушення, такого як злоякісна пухлина, пухлина і/або клітинне проліферативне порушення. У деяких варіантах порушення являє собою невропатію або нейродегенеративне захворювання. У наступних переважних варіантах порушенням є патологічний стан, асоційований з ангіогенезом. У деяких варіантах патологічним станом, асоційованим з ангіогенезом, є пухлина, злоякісна пухлина і/або клітинне проліферативне порушення. У деяких варіантах патологічним станом, асоційованим з ангіогенезом, є внутрішньоочне неоваскулярне захворювання. У наступному аспекті винахід стосується застосування виробу згідно з винаходом для одержання лікарського засобу для терапевтичного і/або профілактичного лікування порушення, такого як злоякісна пухлина, пухлина і/або клітинне проліферативне порушення. У деяких варіантах порушення являє собою невропатію або нейродегенеративне захворювання. У наступних переважних варіантах порушенням є патологічний стан, асоційований з ангіогенезом. У деяких варіантах патологічним станом, асоційованим з ангіогенезом, є пухлина, злоякісна пухлина і/або клітинне проліферативне порушення. У деяких варіантах патологічним станом, асоційованим з ангіогенезом, є внутрішньоочне неоваскулярне захворювання. У одному аспекті винахід також стосується застосування набору згідно з винаходом для одержання лікарського засобу для терапевтичного і/або профілактичного лікування порушення, такого як злоякісна пухлина, пухлина і/або клітинне проліферативне порушення. У деяких варіантах порушення являє собою невропатію або нейродегенеративне захворювання. У наступних переважних варіантах порушенням є патологічний стан, асоційований з ангіогенезом. У деяких варіантах патологічним станом, асоційованим з ангіогенезом, є пухлина, злоякісна пухлина і/або клітинне проліферативне порушення. У деяких варіантах патологічним станом, асоційованим з ангіогенезом, є внутрішньоочне неоваскулярне захворювання. У винаході пропонуються способи і композиції, придатні для модулювання порушень, асоційованих з експресією і/або передачею сигналів Notch1, наприклад, з підвищеною або зниженою експресією і/або передачею сигналів або з небажаною експресією і/або передачею сигналів. Винахід також стосується способів і композицій, придатних для модулювання порушень, асоційованих з активованими рецепторами Notch1. Такі порушення можуть бути асоційовані з транслокацією або активуючою мутацією в амінокислотній послідовності Notch1. Приклади порушень, асоційованих з активованими рецепторами Notch1, включають Т-клітинний гострий лімфобластний лейкоз (T-ALL). У одному аспекті у винаході пропонуються способи лікування пухлини, злоякісної пухлини і/або клітинного проліферативного порушення, асоційованого з підвищеною експресією і/або активністю Notch1 у людини, де способи включають введення ефективної кількості анти-NRR Notch1-антитіла людині. У одному варіанті в пухлину, злоякісну пухлину і/або клітинне проліферативне порушення залучена мутація, яка активує Notch1. У одному аспекті у винаході пропонуються способи цитолізу клітини (такої як ракова або пухлинна клітина) у людини, де способи включають введення людині ефективної кількості антиNRR Notch1-антитіла. 8 UA 100984 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У іншому аспекті у винаході пропонуються способи зменшення, інгібування, блокування або попередження росту пухлини або злоякісної пухлини у людини, при цьому способи включають введення людині ефективної кількості анти-NRR Notch1-антитіла. У іншому аспекті у винаході пропонуються способи зменшення, інгібування, блокування або попередження ангіогенезу у індивідуума, де способи включають введення індивідууму ефективної кількості анти-NRR Notch1-антитіла. У іншому аспекті у винаході пропонуються способи лікування патологічного стану, асоційованого з ангіогенезом, у індивідуума, де способи включають введення індивідууму ефективної кількості анти-NRR Notch1-антитіла. У деяких варіантах патологічним станом, асоційованим з ангіогенезом, є пухлина, злоякісна пухлина і/або клітинне проліферативне порушення. У деяких варіантах патологічним станом, асоційованим з ангіогенезом, є внутрішньоочне неоваскулярне захворювання. У наступному аспекті у винаході пропонуються способи лікування або профілактики невропатії або нейродегенеративного захворювання або відновлення пошкодженої нервової клітини або порушень, які приводять до роз'єднання аксонів і/або демієлінізації у індивідуума, де способи включають введення індивідууму ефективної кількості анти-NRR Notch1-антитіла. У одному аспекті у винаході пропонуються способи стимулювання розвитку, проліферації, збереження або регенерації нейронів у індивідуума, де способи включають введення індивідууму ефективної кількості анти-NRR Notch1-антитіла. У наступному аспекті у винаході пропонуються способи посилення у індивідуума імунної відповіді на антиген, де способи включають введення індивідууму ефективної кількості антиNRR Notch1-антитіла. У деяких варіантах антиген, до якого потрібна імунна відповідь, вводять одночасно з анти-NRR Notch1-антитілом. У інших варіантах у винаході пропонуються способи посилення у індивідуума імунної відповіді на антиген, які включають введення індивідууму агоністичного антитіла проти NRR Notch1; і при цьому індивідууму вводять композицію так, щоб агоністичне антитіло проти NRR Notch1 було презентоване імунним клітинам (таким як Тклітини) індивідуума під час або відразу після примування імунних клітин (таких як Т-клітини) антигеном, таким чином посилюючи імунну відповідь. У деяких варіантах антигеном є злоякісна пухлина. У наступному аспекті у винаході пропонуються способи стимулювання у індивідуума регенерації і/або репарації тканин, наприклад, регенерації скелетного або серцевого м'яза або кістки, де способи включають введення індивідууму ефективної кількості агоністичного антитіла проти NRR Notch1. У наступному аспекті у винаході пропонуються способи зниження, інгібування, блокування або попередження імунної відповіді на антиген у індивідуума, де способи включають введення індивідууму ефективної кількості агоністичного антитіла проти NRR Notch1. У одному варіанті імунна відповідь являє собою імунологічне порушення внаслідок аномального розвитку або регуляції Т-клітин. У наступному аспекті у винаході пропонуються способи лікування аутоімунного порушення у індивідуума, де способи включають введення індивідууму ефективної кількості агоністичного антитіла проти NRR Notch1. У деяких варіантах аутоімунним порушенням є аутоімунний діабет, розсіяний склероз, відторгнення трансплантата або ревматоїдний артрит. Способи згідно з винаходом можна застосовувати для впливу на будь-який патологічний стан. Приклади порушень описані в цьому документі і включають злоякісну пухлину, вибрану з групи, яка складається з дрібноклітинного раку легені, раку головного мозку (наприклад, нейробластоми або менінгіоми), раку шкіри (наприклад, меланоми, карциноми базальних клітин або карциноми сквамозних клітин), карциноми молочної залози, раку шлунка, раку прямої і ободової кишки (CRC), гепатоклітинної карциноми, раку шийки матки, раку легені, раку підшлункової залози, раку передміхурової залози і гематологічних злоякісних захворювань (наприклад, Т-клітинного гострого лімфобластного лейкозу (T-ALL), В-клітинного гострого лімфобластного лейкозу (B-ALL), гострого мієлогенного лейкозу (AML), лімфоми Ходжкіна і множинної мієломи). У одному варіанті клітина, яка є мішенню в способі згідно з винаходом, є злоякісною клітиною. Наприклад, злоякісна клітина може являти собою клітину, вибрану з групи, яка складається з клітини раку молочної залози, клітини раку прямої і ободової кишки, клітини раку легені, клітини папілярної карциноми, клітини раку ободової кишки, клітини раку підшлункової залози, клітини раку яєчника, клітини раку шийки матки, клітини раку центральної нервової системи, клітини остеогенної саркоми, клітини карциноми нирок, клітини гепатоклітинної карциноми, клітини раку сечового міхура, клітини раку шлунка, клітини сквамозної карциноми голови і шиї, клітини меланоми, лейкозної клітини і клітини аденоми товстої кишки. У одному 9 UA 100984 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 варіанті клітина, яка є мішенню в способі згідно з винаходом, є гіперпроліферуючою і/або гіперпластичною клітиною. У іншому варіанті клітина, яка є мішенню в способі згідно з винаходом, є диспластично зміненою клітиною. У ще одному варіанті клітина, яка є мішенню в способі згідно з винаходом, є метастатичною клітиною. Способи згідно з винаходом додатково можуть включати додаткові стадії обробки. Наприклад, в одному варіанті спосіб додатково включає стадію, на якій клітину-мішень і/або тканину-мішень (наприклад, злоякісну клітину) піддають опроміненню або впливу хіміотерапевтичним засобом. У одному аспекті у винаході пропонуються способи, які включають введення ефективної кількості анти-NRR Notch1-антитіла в поєднанні з ефективною кількістю іншого терапевтичного засобу (такого як засіб проти ангіогенезу, інше антитіло, хіміотерапевтичний засіб, цитотоксичний засіб, імунодепресант, проліки, цитокін, цитотоксична променева терапія, кортикостероїд, протиблювотний засіб, протипухлинна вакцина, анальгетик або інгібуючий ріст засіб). Наприклад, анти-NRR Notch1-антитіла застосовують в поєднанні з протипухлинним засобом або антиангіогенним засобом для лікування різних неопластичних або не неопластичних станів. У конкретних прикладах анти-NRR Notch1-антитіла застосовують в поєднанні з тамоксифеном, летрозолом, ексеместаном, анастрозолом, іринотеканом, цетуксимабом, фулвестрантом, вінорелбіном, ерлотинібом, бевацизумабом, вінкристином, іматинібом, сорафенібом, лапатинібом або трастузумабом. Анти-NRR Notch1-антитіло можна вводити послідовно або в поєднанні з іншим терапевтичним засобом, який є ефективним для таких цілей, або в одній і тій же композиції, або у вигляді окремих композицій. Введення анти-NRR Notch1-антитіла і іншого терапевтичного засобу (наприклад, протипухлинного засобу) можна здійснювати одночасно, наприклад, у вигляді однієї композиції або у вигляді двох або більше окремих композицій, використовуючи один і той самий або різні шляхи введення. Альтернативно або додатково, введення можна здійснювати послідовно в будь-якому порядку. Альтернативно або додатково, стадії можуть бути здійснені у вигляді поєднання як послідовного, так і одночасного введення в будь-якому порядку. У деяких варіантах можуть мати місце інтервали в діапазоні від хвилин до діб, тижнів і місяців між введеннями двох або більше композицій. Наприклад, спочатку може бути введений протипухлинний засіб з подальшим введенням анти-NRR Notch1-антитіла. Однак також передбачається одночасне введення або введення анти-NRR Notch1-антитіла в першу чергу. У деяких варіантах можуть мати місце інтервали в діапазоні від хвилин до діб, тижнів, місяців між введеннями двох або більше композицій. У деяких аспектах у винаході пропонується спосіб лікування порушення (такого як пухлина, злоякісна пухлина і/або клітинне проліферативне порушення) за допомогою введення ефективних кількостей анти-NRR Notch1-антитіла і/або інгібітору(ів) ангіогенезу і одного або декількох хіміотерапевтичних засобів. Можна використовувати різні хіміотерапевтичні засоби в способах комбінованого лікування згідно з винаходом. Зразковий і необмежувальний список передбачуваних хіміотерапевтичних засобів наведений в даному описі в розділі «Визначення». Введення анти-NRR Notch1-антитіла і хіміотерапевтичного засобу можна здійснювати одночасно, наприклад, у вигляді однієї композиції або у вигляді двох або більше різних композицій, використовуючи один і той самий або різні шляхи введення. Альтернативно або додатково, введення можна здійснювати послідовно в будь-якому порядку. Альтернативно або додатково, стадії можуть бути здійснені у вигляді поєднання як послідовного, так і одночасного введення в будь-якому порядку. У деяких варіантах можуть мати місце інтервали в діапазоні від хвилин до діб, тижнів, місяців між введеннями двох або більше композицій. Наприклад, спочатку може бути введений хіміотерапевтичний засіб з подальшим введенням анти-NRR Notch1-антитіла. Однак також передбачається одночасне введення або введення анти-NRR Notch1-антитіла в першу чергу. Відповідно, в одному аспекті у винаході пропонуються способи, які включають введення анти-NRR Notch1-антитіла з подальшим введенням хіміотерапевтичного засобу. У деяких варіантах можуть мати місце інтервали в діапазоні від хвилин до діб, тижнів, місяців між введеннями двох або більше композицій. У іншому аспекті у винаході пропонуються способи виявлення Notch1, де способи включають виявлення комплексу Notch1-анти-NRR Notch1-антитіло в зразку. Термін «виявлення» у використовуваному в даному описі значенні включає якісне і/або кількісне визначення (рівні вимірювання) відносно або безвідносно контролю. У іншому аспекті у винаході пропонуються способи діагностики порушення, асоційованого з експресією і/або активністю Notch1, де способи включають виявлення комплексу Notch1-антиNRR Notch1-антитіло в біологічному зразку, одержаному від індивідуума, у якого є або підозрюється наявність порушення. У деяких варіантах експресія Notch1 являє собою 10 UA 100984 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 підвищену експресію або аномальну експресію. У деяких варіантах порушення являє собою пухлину, злоякісну пухлину і/або клітинне проліферативне порушення. У іншому аспекті у винаході пропонуються способи лікування індивідуума, який має злоякісну пухлину, пухлину і/або клітинне проліферативне порушення, за допомогою введення індивідууму ефективної кількості анти-NRR Notch1-антитіла, при цьому додатково визначають експресію Notch1 і/або експресію ліганду Notch1 в біологічному зразку індивідуума перед, під час або після введення анти-NRR Notch1-антитіла. У деяких варіантах біологічним зразком є злоякісна пухлина, пухлина і/або клітинне проліферативне порушення. У деяких варіантах виявляють надекспресію Notch1 перед, під час і/або після введення анти-NRR Notch1-антитіла. У деяких варіантах виявляють експресію ліганду Notch1 перед, під час і/або після введення анти-NRR Notch1-антитіла. Експресію можна реєструвати перед; під час; після; перед і під час; перед і після; під час і після; або перед, під час і після введення анти-NRR Notch1-антитіла. У іншому аспекті у винаході пропонуються способи лікування індивідуума, який має злоякісну пухлину, пухлину і/або клітинне проліферативне порушення, за допомогою введення ефективної кількості анти-NRR Notch1-антитіла індивідууму, при цьому біологічний зразок злоякісної пухлини, пухлини і/або клітинного порушення або порушення печінки експресує Notch1 або ліганд Notch1. У іншому аспекті у винаході пропонуються способи вибору лікування індивідуума, де способи включають: (a) виявлення експресії Notch1 або експресії ліганду Notch1, якщо така має місце, в біологічному зразку індивідуума; і (b) після стадії (a) вибір лікування індивідуума, при цьому вибір лікування оснований на експресії Notch1 або ліганду Notch1, виявленої на стадії (a). У деяких варіантах виявляють підвищену експресію Notch1 або ліганду Notch1 в біологічному зразку індивідуума в порівнянні з еталонним значенням або контрольним зразком. У деяких варіантах у індивідуума виявляють знижену експресію Notch1 або ліганду Notch1 в біологічному зразку індивідуума в порівнянні з еталонним значенням або контрольним зразком. У деяких варіантах визначають експресію Notch1 або ліганду Notch1 і вибирають лікування анти-Notch1антитілом. У деяких варіантах індивідуум має пухлину, злоякісну пухлину і/або клітинне проліферативне порушення. У деяких варіантах, які включають виявлення експресії Notch1, здійснюють виявлення делеції гена Notch1, ампліфікації гена і/або мутації гена. У деяких варіантах, які включають виявлення експресії ліганду Notch1, здійснюють виявлення делеції гена Notch1, ампліфікації гена і/або мутації гена. Біологічні зразки описані в цьому документі, наприклад, при визначенні біологічного зразка. У деяких варіантах біологічний зразок являє собою сироватку або пухлину. У варіантах, які полягають у виявленні експресії Notch1 і/або ліганду Notch1 (наприклад, Jagged 1, Jagged 2, Delta-подібний 1, Delta-подібний 3 і/або Delta-подібний 4), може бути виявлена експресія полінуклеотидів Notch1 і/або ліганду Notch1 і/або експресія поліпептидів Notch1 і/або ліганду Notch1. У деяких варіантах, які полягають у виявленні експресії Notch1 і/або ліганду Notch1, виявляють експресію мРНК Notch1 і/або ліганду Notch1. У інших варіантах виявляють експресію поліпептиду Notch1 і/або ліганду Notch1, використовуючи засіб проти NRR Notch1 і/або засіб проти ліганду Notch1. У деяких варіантах експресію поліпептидів Notch1 і/або ліганду Notch1 виявляють, використовуючи антитіло. Можна використовувати будь-яке придатне антитіло для виявлення і/або діагностики, включаючи моноклональні і/або поліклональні антитіла, людське антитіло, химерне антитіло, антитіло з дозрілою афінністю, гуманізоване антитіло і/або фрагмент антитіла. У деяких варіантах для виявлення застосовують анти-NRR Notch1-антитіло, описане в цьому документі. У деяких варіантах експресію поліпептидів Notch1 і/або ліганду Notch1 виявляють, використовуючи імуногістохімію («IHC»). У деяких варіантах експресію Notch1 оцінюють значенням 2 або вище, використовуючи IHCаналіз. У деяких варіантах, які полягають у виявленні експресії Notch1 і/або ліганду Notch1, може бути визначена наявність і/або відсутність, і/або рівень експресії Notch1 і/або ліганду Notch1. Експресія Notch1 і/або ліганду Notch1 може бути підвищена. Потрібно розуміти, що відсутність експресії Notch1 і/або ліганду Notch1 включає незначні або мінімальні рівні. У деяких варіантах експресія Notch1 в тестованому біологічному зразку вище, ніж експресія, спостережувана в контрольному біологічному зразку (контрольний або еталонний рівень експресії). У деяких варіантах експресія Notch1 щонайменше приблизно в 2 рази, 5 разів, 10 разів, 20 разів, 30 разів, 40 разів, 50 разів, 75 разів, 100 разів, 150 разів або більше разів вище в тестованому біологічному зразку, ніж в контрольному біологічному зразку. У деяких варіантах експресію поліпептиду Notch1 визначають в імуногістохімічному («IHC») аналізі, оцінюючи інтенсивність фарбування щонайменше значенням 2 або вище. У деяких варіантах експресію поліпептиду 11 UA 100984 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Notch1 визначають в IHC-аналізі, оцінюючи інтенсивність фарбування щонайменше значенням 1 або вище або щонайменше 3 або вище. У деяких варіантах експресія Notch1 в тестованому біологічному зразку нижче, ніж експресія, яка спостерігається в контрольному біологічному зразку (або ніж контрольний рівень експресії). У іншому аспекті у винаході пропонується будь-яке з анти-NRR Notch1-антитіл, описаних в цьому документі, де анти-NRR Notch1-антитіло містить мітку, що реєструється. У іншому аспекті у винаході пропонується комплекс будь-якого з анти-NRR Notch1-антитіл, описаних в цьому документі, і Notch1. У деяких варіантах комплекс утворюється in vivo або in vitro. У деяких варіантах комплекс містить злоякісну клітину. У деяких варіантах анти-NRR Notch1-антитіло мітять міткою, що реєструється. КОРОТКИЙ ОПИС КРЕСЛЕНЬ Фігури 1-1 і 1-2: послідовності петлі HVR важкого ланцюга і легкого ланцюга анти-NRR Notch1-антитіл. На фігурах показані послідовності HVR важкого ланцюга, H1, H2 і H3, і послідовності HVR легкого ланцюга, L1, L2 і L3. Послідовності пронумеровані таким чином: антитіло А (HVR-H1 має послідовність SEQ ID NO: 1; HVR-H2 має послідовність SEQ ID NO: 2; HVR-H3 має послідовність SEQ ID NO: 6; HVR-L1 має послідовність SEQ ID NO: 7; HVR-L2 має послідовність SEQ ID NO: 8; HVR-L3 має послідовність SEQ ID NO: 9); антитіло А-1 (HVR-H1 має послідовність SEQ ID NO: 1; HVR-H2 має послідовність SEQ ID NO: 3; HVR-H3 має послідовність SEQ ID NO: 6; HVR-L1 має послідовність SEQ ID NO: 7; HVR-L2 має послідовність SEQ ID NO: 8; HVR-L3 має послідовність SEQ ID NO: 10); антитіло А-2 (HVR-H1 має послідовність SEQ ID NO: 1; HVR-H2 має послідовність SEQ ID NO: 4; HVR-H3 має послідовність SEQ ID NO: 6; HVR-L1 має послідовність SEQ ID NO: 7; HVR-L2 має послідовність SEQ ID NO: 8; HVR-L3 має послідовність SEQ ID NO: 11); і антитіло А-3 (HVR-H1 має послідовність SEQ ID NO: 1; HVR-H2 має послідовність SEQ ID NO: 5; HVR-H3 має послідовність SEQ ID NO: 6; HVR-L1 має послідовність SEQ ID NO: 7; HVR-L2 має послідовність SEQ ID NO: 8; HVR-L3 має послідовність SEQ ID NO: 12). Положення амінокислот пронумеровані згідно з системою нумерації Кабата, як описано нижче. На фігурі 2 зображені амінокислотні послідовності варіабельних областей важкого ланцюга і варіабельних областей легкого ланцюга антитіл А, А-1, А-2 і А-3 (SEQ ID NO: 58-65). На фігурах 3A, 3B і 4 зображені зразкові акцепторні консенсусні каркасні послідовності для застосування при практичному здійсненні даного винаходу, які мають наступні ідентифікаційні номери послідовностей: Консенсусні каркаси варіабельної області важкого ланцюга (VH) (фіг. 3A, 3B) консенсусний каркас підгрупи I VH людини мінус CDR за Кабатом (SEQ ID NO: 19); консенсусний каркас підгрупи I VH людини мінус розширені гіперваріабельні області (SEQ ID NO: 20-22); консенсусний каркас підгрупи II VH людини мінус CDR за Кабатом (SEQ ID NO: 23); консенсусний каркас підгрупи II VH людини мінус розширені гіперваріабельні області (SEQ ID NO: 24-26); консенсусний каркас підгрупи II VH людини мінус розширені; консенсусний каркас підгрупи III VH людини мінус CDR за Кабатом (SEQ ID NO: 27); консенсусний каркас підгрупи III VH людини мінус розширені гіперваріабельні області (SEQ ID NO: 28-30); акцепторний каркас VH людини мінус CDR за Кабатом (SEQ ID NO: 31); акцепторний каркас VH людини мінус розширені гіперваріабельні області (SEQ ID NO: 3233); акцепторний каркас 2 VH людини мінус CDR за Кабатом (SEQ ID NO: 34); акцепторний каркас 2 VH людини мінус розширені гіперваріабельні області (SEQ ID NO: 3537). Консенсусні каркаси варіабельної області легкого ланцюга (VL) (фіг. 4) консенсусний каркас підгрупи I VL каппа людини (SEQ ID NO: 38); консенсусний каркас підгрупи II VL каппа людини (SEQ ID NO: 39); консенсусний каркас підгрупи III VL каппа людини (SEQ ID NO: 40); консенсусний каркас підгрупи IV VL каппа людини (SEQ ID NO: 41). На фігурі 5 зображені послідовності каркасної області легкого (SEQ ID NO: 15-18) і важкого ланцюгів (SEQ ID NO: 42-45) huMAb4D5-8. Надрядкові/зображені жирним шрифтом номери вказують положення амінокислот згідно з Кабатом. На фігурі 6 зображені модифіковані/варіантні послідовності каркасних областей легкого (SEQ ID NO: 15, 16, 18 і 46) і важкого ланцюгів (SEQ ID NO: 42, 43, 45 і 47) huMAb4D5-8. 12 UA 100984 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Надрядкові/зображені жирним шрифтом номери вказують положення амінокислот згідно з Кабатом. Фігура 7 являє собою графік, який показує, що антитіло А є сильним інгібітором Notch1, що виміряно з використанням репортерного гена люциферази. У кожній колонці A-L клітинами, що несуть рецептор, були клітини NIH-3T3-Notch1. У випадку А клітиною, що несе ліганд, була батьківська клітина NIH-3T3, у випадку B-L клітиною, що несе ліганд, була клітина NIH-3T3-Jag1. У випадку А, В і K не додавали ні антитіла, ні сполуки Е (інгібітор гамма-секретази); у випадку С додавали антитіло, використовуване як контроль ізотипу, в концентрації 400 нг/мл; у випадку D додавали антитіло А в концентрації 16 нг/мл; у випадку Е додавали антитіло А в концентрації 80 нг/мл; у випадку F додавали антитіло А в концентрації 400 нг/мл; у випадку G додавали антитіло А в концентрації 2000 нг/мл; у випадку Н додавали антитіло А в концентрації 400 нг/мл; у випадку I додавали антитіло А в концентрації 400 нг/мл; у випадку J додавали антитіло, використовуване як контроль ізотипу, в концентрації 400 нг/мл; у випадку K додавали 0,01% ДМСО; і у випадку L додавали сполуку Е в концентрації 1 мкМ в 0,01% ДМСО. У випадку Н додавали білок NRR Notch1 в концентрації 5 мкг/мл (100 мкл); у випадку I додавали білок БСА (бичачий сироватковий альбумін) в концентрації 6,5 мкг/мл (100 мкл); у випадку J додавали білок NRR Notch1 в концентрації 5 мкг/мл (100 мкл); у випадку A-G, K і L не додавали білка. Фігура 8 являє собою графік, який показує, що антитіла А, А-1, А-2 і А-3 інгібують Notch1, як виміряно з використанням аналізу на основі репортера люциферази. Чорні стовпчики показують результати, одержані з використанням батьківського антитіла А, а інші стовпчики показують результати, одержані з використанням антитіла А-1 (горизонтальні смужки), антитіла А-2 (сіра штриховка) і антитіла А-3 (діагональні смужки). Як виявлено при використанні 80 нг/мл антитіла, антитіла А-1 і А-2 давали більш сильне блокування сигналу Notch1, ніж батьківське антитіло A. На осі X на графіку представлена концентрація антитіл (нг/мл), і на осі Y графіка представлена люмінесценція люциферази світляка/Renilla. Фігура 9 являє собою графік, який показує, що антитіло А знижує блокування диференціювання міоцитів C2C12 миші, викликаного активацією передачі сигналів Notch. У випадку A-F середовище являло собою середовище для диференціювання. У випадку А міобласти C2C12 миші не культивували спільно з клітинами NIH-3T3, експресуючими ліганд Jagged1, тоді як у випадку B-F міобласти C2C12 миші культивували спільно з клітинами NIH3T3, експресуючими ліганд Jagged1. Додавали наступне антитіло/проводили наступну обробку клітин: у випадку А і В без антитіла/обробки, контроль ізотипу у випадку С, антитіло А в концентрації 200 нг/мл у випадку D, ДМСО у випадку Е, і сполука Е в концентрації 1 мкМ у випадку F. На фігурах 10A-10F показані зображення клітин міоцитів C2C12 миші, забарвлених MHC/Alexa® 488 (верхній ряд) або DAPI (гідрохлорид 4',6'-діамідино-2-феніліндолу; нижній ряд). У випадку A-F середовище являло собою середовище для диференціювання. У випадку А міобласти C2C12 миші не культивували спільно з клітинами NIH-3T3, експресуючими ліганд Jagged1, тоді як у випадку B-F міобласти C2C12 миші культивували спільно з клітинами NIH3T3, експресуючими ліганд Jagged1. Додавали наступне антитіло/проводили наступну обробку клітин: у випадку А і В без антитіла/обробки, контроль ізотипу у випадку С, антитіло А в концентрації 200 нг/мл у випадку D, ДМСО у випадку Е, і сполука Е в концентрації 1 мкМ у випадку F. На фігурах 11-1-11-4 показане вирівнювання амінокислотних послідовностей Notch1 людини і миші (SEQ ID NO: 56 і 57). Використовували програму для вирівнювання SIM (доступну на вебсайті ExPASy), щоб провести вирівнювання повних послідовностей білків Notch1 людини і миші. Були вибрані параметри за умовчанням зі штрафом за відкриття пропуску 12, штрафом за розширення пропуску 4 і BLOSUM62 як матриці порівняння. Домени білків підкреслені і помічені. Границі сигнального пептиду, трансмембранного і EGF-домену основані на результатах, одержаних для Notch1 людини з Expasy.org; границі LNR основані на даних Vardar et al. (Biochemistry, 42: 7061-7067, 2003); границі HD-N і HD-C основані на даних Malecki et al. (Mol. Cell. Biol. 26: 4642-4651, 2006). Область негативної регуляції (NRR) відповідає послідовностям, починаючи з LNR_A і закінчуючи після HD-C. Імуногенні послідовності, використовувані для створення антитіл проти NRR Notch1, підкреслені зверху заштрихованою лінією і включають повтори EGF 34-36 плюс NRR. Скорочення: амінокислоти показані однобуквеним кодом; TM, трансмембранна; EGF, повтори епідермального фактора росту; LNR, повтори Lin 12-Notch; HD-N, домен гетеродимеризації - з амінокінцевої сторони від сайта розщеплення S1; HD-C, домен гетеродимеризації - зі сторони карбоксильного кінця від сайта розщеплення S1; S1, сайт розщеплення S1 для фуринових протеаз; S2, сайт розщеплення S2 для протеаз ADAM (сімейство дезінтегринів і металопротеїназ). 13 UA 100984 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Фігури 12A-12C являють собою графіки, які показують результати експериментів по картуванню епітопів для антитіла А (фігура 12A), антитіла А-1 (фігура 12B) і антитіла А-2 (фігура 12C). Фігура 13 являє собою графік, який показує, що анти-Notch1-NRR-антитіла інгібують передачу сигналів рецептора Notch1 дикого типу і мутантного рецептора Notch1. Повністю заштриховані чорні стовпчики показують результати, одержані з використанням контрольного антитіла в концентрації 2000 нг/мл; стовпчики з великими точками показують результати, одержані з використанням антитіла А в концентрації 80 нг/мл; стовпчики з тонкими смужками показують результати, одержані з використанням антитіла А в концентрації 400 нг/мл; стовпчики з товстими смужками показують результати, одержані з використанням антитіла А в концентрації 2000 нг/мл; стовпчики з поперечними штрихами показують результати, одержані з використанням сполуки Е в концентрації 10 мкМ; і стовпчики з дрібними точками показують результати, одержані з використанням ДМСО (носій для сполуки Е). Результати для кожної умови вимірювали у восьми повторах і потім виражали у вигляді середнього значення із зображенням відрізків, які показують стандартне відхилення. На фігурі 14A представлена серія зображень, які показують, що обробка анти-NRR Notch1антитілом і анти-D114-антитілом викликає помітне збільшення проростання і довжини судин в аналізі проростання клітин HUVEC (ендотеліальні клітини пупкової вени людини). Результати показані для клітин, оброблених PBS (фосфатно-сольовим буфером) як контролем або антиNRR Notch1-антитілом А або А-2. На фігурі 14B представлена серія зображень, які показують вплив анти-NRR Notch1-антитіл на васкуляризацію і ангіогенез у випадку використання аналізу кармана рогівки. Обробка антиNRR Notch1-антитілом (антитілом А-2) значуще збільшувала густину судинної мережі. На фігурі 14C представлена серія зображень, які показують вплив анти-D114- і анти-NRR Notch1-обробки на плин рідини по судинах в аналізі рогівки. Перфузія через анти-D114- і антиNRR Notch1-оброблені судини була обмежена. На фігурі 14D представлена серія зображень, які показують вплив анти-NRR Notch1-антитіл в моделі ангіогенезу в сітківці мишей. Обробка анти-NRR Notch1-антитілом (антитілом А-2) збільшувала густину судинної мережі і створювала фенотип з гіперпроростанням. На фігурі 14E представлена серія зображень, які показують, що в моделі ангіогенезу в сітківці мишей анти-NRR Notch1-обробка (антитілом А-2) викликає збільшення кількості ядер, яка узгоджується із збільшенням проліферації клітин. Фігура 15A являє собою графік, який показує вплив анти-NRR Notch1-антитіла на ріст пухлини в мишачій моделі in vivo. Обробка анти-NRR Notch1-антитілом А-2 затримувала ріст пухлини. Фігура 15B являє собою графік, який показує, що різні дози анти-NRR Notch1-антитіла А-2 затримували або сповільнювали ріст пухлини в мишачій моделі in vivo. Фігура 15C являє собою графік, який показує, що в мишачій моделі in vivo анти-NRR Notch1антитіло А-2 зменшувало об'єм пухлини. Фігура 15D являє собою графік, який показує, що в мишачій моделі in vivo анти-NRR Notch1антитіло А-2 викликає втрату маси залежним від дози чином. Фігура 15E являє собою графік, який показує кліренс анти-NRR Notch1-антитіла А-2 з перебігом часу з сироватки імунодефіцитних мишей (Balb-C Nu/Nu). На фігурах 16A і 16B представлена серія зображень, які показують приклади кишкових крипт і ворсинок тонкого (фігура 16A) або товстого (фігура 16B) кишечнику мишей, оброблених контрольним антитілом (наповнювачем) або анти-NRR Notch1-антитілом А-2 в концентрації 10 мг/кг. Фігура 17 являє собою графік, який показує, що анти-NRR Notch1-антитіла і інгібітори гаммасекретази знижують життєздатність деяких ліній злоякісних клітин. Використовували анти-NRR Notch1-антитіло А-2 і інгібітори гамма-секретази, трет-бутиловий ефір N-[N-(3,5дифторфенацетил)-L-аланіл]-S-фенілгліцину (DAPT) і сполуку Е (CmpE). Лінії злоякісних клітин вказані на осі х. ДОКЛАДНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ Даний винахід стосується анти-NRR Notch1-антитіл, які застосовні, наприклад, для лікування або профілактики патологічних станів, асоційованих з експресією і/або активністю Notch, наприклад, з підвищеною експресією і/або активністю або небажаною експресією і/або активністю. У деяких варіантах антитіла згідно з винаходом застосовують для лікування пухлини, злоякісної пухлини і/або клітинного проліферативного порушення. 14 UA 100984 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У іншому аспекті анти-NRR Notch1-антитіла згідно з винаходом знаходять застосування як реагенти для виявлення і/або виділення Notch1, наприклад, для виявлення Notch1 в різних тканинах і різних типах клітин. Винахід, крім того, стосується способів одержання анти-NRR Notch1-антитіл і полінуклеотидів, що кодує анти-NRR Notch1-антитіла. Загальні способи Способи і процедури, які описані в цьому документі або на які в даному документі наведені посилання, загалом, добре відомі і широко застосовуються фахівцями в даній галузі з використанням звичайних методик, таких як, наприклад, широко використовувані методики, описані в Sambrook et al., Molecular Cloning: А Laboratory Manual 3rd. edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel, et al. eds., (2003)); the series METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: А PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hames and G. R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) ANTIBODIES, А LABORATORY MANUAL, та ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney, ed. (1987)). ВИЗНАЧЕННЯ «Ізольоване» антитіло являє собою антитіло, яке було ідентифіковане і відділене і/або витягнуте з його природного оточення, що складається з певних компонентів. Компоненти, що є домішками в природному оточенні, являють собою речовини, які можуть заважати діагностичним або терапевтичним застосуванням антитіла і можуть включати ферменти, гормони і інші білкові і небілкові розчинені речовини. У переважних варіантах антитіло буде очищене (1) до більше ніж 95% мас. антитіла на основі визначення способом Лоурі, і найбільш переважно до більше ніж 99% мас., (2) в достатній мірі для одержання щонайменше 15 залишків N-кінцевої або внутрішньої амінокислотної послідовності з використанням секвенатора з обертовим стаканом, або (3) до гомогенності за допомогою SDS-ПААГ (електрофорез в поліакриламідному гелі з додецилсульфатом натрію) у відновних або не відновних умовах, використовуючи фарбування Кумасі синім або переважно сріблом. Ізольоване антитіло включає антитіло in situ в рекомбінантних клітинах, оскільки щонайменше один компонент природного оточення антитіла не буде присутнім. Однак звичайно ізольоване антитіло може бути одержане щонайменше на одній стадії очищення. «Ізольована» молекула нуклеїнової кислоти являє собою молекулу нуклеїнової кислоти, яка ідентифікована і відділена щонайменше від однієї забруднюючої молекули нуклеїнової кислоти, з якою вона звичайно асоційована в природному джерелі нуклеїнової кислоти. Ізольована молекула нуклеїнової кислоти має іншу форму або оточення, відмінні від тієї форми і оточення, в яких вона зустрічається в природі. Тому ізольовані молекули нуклеїнової кислоти відрізняються від молекули нуклеїнової кислоти, у вигляді якої вони існують в природних клітинах. Однак ізольована молекула нуклеїнової кислоти включає молекули нуклеїнової кислоти, які містяться в клітинах, які звичайно експресують нуклеїнову кислоту (наприклад, нуклеїнову кислоту, що кодує антитіло), в яких молекула нуклеїнової кислоти знаходиться, наприклад, в положенні хромосоми, відмінному від положення в хромосомі в природних клітинах. Термін «нумерація залишків варіабельного домену згідно з Кабатом» або «нумерація положень амінокислот згідно з Кабатом» і його варіанти стосуються системи нумерації, використовуваної для варіабельних доменів важкого ланцюга або варіабельних доменів легкого ланцюга при узагальненні даних про антитіла в публікації Kabat et al., Sequences of th Proteins of Immunological Interest, 5 Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991). При використанні такої системи нумерації реальна лінійна амінокислотна послідовність може містити менше або може містити додаткові амінокислоти, що відповідає укороченню або інсерції в FR або CDR варіабельного домену. Наприклад, варіабельний домен важкого ланцюга може містити інсерцію однієї амінокислоти (залишок 52a згідно з нумерацією Кабата) після залишку 52 в H2 і вбудовані залишки (наприклад, залишки 82a, 82b і 82c і т. д. згідно з нумерацією Кабата) після залишку 82 FR важкого ланцюга. Нумерація залишків згідно з Кабатом може бути визначена для даного антитіла в результаті вирівнювання областей гомології послідовності антитіла зі «стандартною» послідовністю, пронумерованою за Кабатом. Фраза «по суті схожий» або «по суті такий же» у використовуваному в даному описі значенні означає досить високу міру схожості між двома числовими значеннями (звичайно одне асоційоване з антитілом згідно з винаходом, а інше асоційоване з еталонним антитілом/антитілом для порівняння), так що фахівець в даній галузі може вважати відмінність між двома значеннями невеликим або біологічно і/або статистично не значущим в контексті біологічної ознаки, вимірюваної вказаними значеннями (наприклад, значеннями Kd). Відмінність 15 UA 100984 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 між двома вказаними значеннями переважно менше ніж приблизно 50%, переважно менше ніж приблизно 40%, переважно менше ніж приблизно 30%, переважно менше ніж приблизно 20%, переважно менше ніж приблизно 10% від значення для еталонного/порівнюваного антитіла. «Афінність зв’язування» звичайно стосується сили сумарних нековалентних взаємодій між одним сайтом зв’язування молекули (наприклад, антитіла) і його партнером по зв’язуванню (наприклад, антигеном). Якщо не обумовлено особливо, у використовуваному в даному описі значенні «афінність зв’язування» стосується властивої молекулам афінності зв’язування, яка відображає взаємодію 1:1 між членами пари, що зв'язується (наприклад, антитілом і антигеном). Афінність молекули X відносно її партнера Y, як правило, може бути представлена -7 -8 -8 -9 -9 константою дисоціації (Kd). Бажано, щоб Kd становила 1×10 , 1×10 , 5×10 , 1×10 , 3×10 , -9 -10 5×10 або навіть 1×10 або ще сильніше. Афінність може бути виміряна звичайними способами, відомими в даній галузі, включаючи способи, описані в цьому документі. Низькоафінні антитіла звичайно зв'язують антиген повільно і мають тенденцію легко дисоціювати, тоді як високоафінні антитіла звичайно зв'язують антиген швидше і мають тенденцію довше залишатися зв'язаними. У даній галузі відомі різні способи вимірювання афінності зв’язування, будь-які з яких можна застосовувати з метою даного винаходу. Конкретні ілюстративні варіанти описані нижче. У одному варіанті «Kd» або «значення Kd» згідно з даним винаходом вимірюють за допомогою аналізу зв’язування радіоактивно міченого антигену (РІА), здійснюваного з Fabваріантом антитіла, що представляє інтерес, і його антигеном, який описаний на прикладі наступного аналізу, в якому вимірюють афінність зв’язування в розчині Fab для антигену за 125 допомогою зрівноважування Fab з мінімальною концентрацією ( I)-міченого антигену в присутності серії неміченого антигену для титрування, потім вловлюючи зв'язаний антиген на покритому анти-Fab-антитілом планшеті (Chen, et al., (1999) J. Mol. Biol. 293: 865-881). Щоб створити умови для аналізу, планшети для мікротитрування (Dynex) покривають протягом ночі 5 мкг/мл уловлювального анти-Fab-антитіла (Cappel Labs) в 50 мМ карбонаті натрію (pH 9,6) і потім блокують 2% (мас./об.) бичачим сироватковим альбуміном в PBS протягом двох-п'яти годин при кімнатній температурі (приблизно 23°С). У неадсорбуючому планшеті (Nunc 125 №269620), 100 пМ або 26 пМ [ I]-антигену змішують з серійним розведенням Fab, що представляє інтерес (наприклад, відповідно до оцінки анти-VEGF-антитіла, Fab-12, в публікації Presta et al., (1997) Cancer Res. 57: 4593-4599). Потім Fab, що представляє інтерес, інкубують протягом ночі; однак інкубація може продовжуватися протягом більш тривалого періоду (наприклад, 65 годин), щоб гарантувати досягнення рівноваги. Потім суміші переносять в уловлювальний планшет для інкубації при кімнатній температурі (наприклад, протягом однієї години). Потім розчин видаляють і планшет промивають вісім разів 0,1% твін-20 в PBS. Після висихання планшетів додають по 150 мкл/ямку сцинтилятора (MicroScint-20; Packard) і планшети піддають рахуванню в гамма-лічильнику Topcount (Packard) протягом десяти хвилин. Концентрації кожного Fab, які дають зв’язування, яке менше або дорівнює 20% від максимального зв’язування, вибирають для використання в аналізах конкурентного зв’язування. Згідно з іншим варіантом Kd або значення Kd вимірюють, застосовуючи аналізи поверхневого TM TM плазмонного резонансу з використанням BIAcore -2000 або BIAcore -3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, N.J.), при 25°С за допомогою чипів CM5 з іммобілізованим антигеном на рівні 10 одиниць сигнал у відповідь (RU). Коротко, біосенсорні чипи з карбоксиметильованого декстрану (CM5, BIAcore Inc.) активували гідрохлоридом N-етил-N'-(3диметиламінопропіл)карбодііміду (EDC) і N-гідроксисукцинімідом (NHS) згідно з інструкціями постачальника. Антиген розбавляли 10 мМ ацетатом натрію, pH 4,8, в концентрації 5 мкг/мл (0,2 мкМ) перед ін’єктуванням зі швидкістю потоку 5 мкл/хвилину, щоб досягнути приблизно 10 одиниць сигналу у відповідь (RU) від зв'язаного білка. Після ін'єкції антигену ін’єктували 1 М етаноламіну, щоб блокувати групи, які не вступили в реакцію. Для кінетичних вимірювань двократне серійне розведення Fab (від 0,78 нМ до 500 нМ) ін’єктували в PBS з 0,05% твін-20 (PBST) при 25°С зі швидкістю потоку приблизно 25 мкл/хв. Швидкості асоціації (k on) і швидкості дисоціації (koff) обчислювали, використовуючи просту модель зв’язування Ленгмюра «один до одного» (комп'ютерна програма для оцінки BIAcore, версія 3.2), за допомогою одночасної підгонки сенсограми асоціації і дисоціації. Рівноважну константу дисоціації (Kd) обчислюють у вигляді відношення koff/kon. Дивись, наприклад, Chen, Y., et al., (1999) J. Mol. Biol. 293: 865-881. 6 -1 -1 Якщо швидкість утворення комплексу перевищує 10 M сек. за даними вказаного вище аналізу поверхневого плазмонного резонансу, то швидкість утворення комплексу можна визначити, використовуючи методику гасіння флуоресценції, яка дозволяє вимірювати збільшення або зменшення інтенсивності випромінювання флуоресценції (збудження = 295 нм; емісія = 340 нм, смуга пропускання 16 нм) при 25°С 20 нМ антитіла проти антигену (Fab-форма) 16 UA 100984 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 в PBS, pH 7,2, в присутності зростаючих концентрацій антигену, при цьому вимірювання проводять на спектрометрі, такому як спектрофотометр, обладнаний пристроєм для зупинення потоку (Aviv Instruments) або спектрофотометр SLM-Aminco серії 8000 (ThermoSpectronic), в кюветі з перемішуванням вмісту. «Швидкість утворення комплексу» або «швидкість асоціації» або «k on» згідно з даним винаходом також можна визначити таким же способом на основі поверхневого плазмонного TM TM резонансу, який описаний вище, з використанням BIAcore -2000 або BIAcore -3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, N.J.) при 25°С за допомогою чипів CM5 з іммобілізованим антигеном на рівні 10 одиниць сигналу у відповідь (RU). Коротко, біосенсорні чипи з карбоксиметильованого декстрану (CM5, BIAcore Inc.) активували гідрохлоридом N-етил-N'-(3диметиламінопропіл)карбодііміду (EDC) і N-гідроксисукцинімідом (NHS) згідно з інструкціями постачальника. Антиген розбавляли 10 мМ ацетатом натрію, pH 4,8, в концентрації 5 мкг/мл (~0,2 мкМ) перед ін’єктуванням зі швидкістю потоку 5 мкл/хвилину, щоб досягнути приблизно 10 одиниць сигналу у відповідь (RU) від зв'язаного білка. Після ін'єкції антигену ін’єктували 1 М етаноламіну, щоб блокувати групи, які не вступили в реакцію. Для кінетичних вимірювань двократне серійне розведення Fab (від 0,78 нМ до 500 нМ) ін’єктували в PBS з 0,05% твін-20 (PBST) при 25°С зі швидкістю потоку приблизно 25 мкл/хвилину. Швидкості асоціації (k on) і швидкості дисоціації (koff) обчислювали, використовуючи просту модель зв’язування Ленгмюра «один до одного» (комп'ютерна програма для оцінки BIAcore, версія 3.2), за допомогою одночасної підгонки сенсограми асоціації і дисоціації. Рівноважну константу дисоціації (Kd) обчислювали у вигляді відношення koff/kon. Дивись, наприклад, Chen, Y., et al., (1999) J. Mol. Biol. 6 -1 -1 293: 865-881. Однак, якщо швидкість утворення комплексу перевищує 10 M сек. за даними вказаного вище аналізу поверхневого плазмонного резонансу, то швидкість утворення комплексу можна визначити, використовуючи методику гасіння флуоресценції, яка дозволяє вимірювати збільшення або зменшення інтенсивності випромінювання флуоресценції (збудження = 295 нм; емісія = 340 нм, смуга пропускання 16 нм) при 25°С 20 нМ антитіла проти антигену (Fab-форма) в PBS, pH 7,2, в присутності зростаючих концентрацій антигену, при цьому вимірювання проводять на спектрометрі, такому як спектрофотометр, обладнаний пристроєм для зупинення потоку (Aviv Instruments) або спектрофотометр SLM-Aminco серії 8000 (ThermoSpectronic), в кюветі з перемішуванням вмісту. Мають на увазі, що термін «вектор» у використовуваному в даному описі значенні стосується молекули нуклеїнової кислоти, здатної транспортувати іншу нуклеїнову кислоту, з якою вона була зв'язана. Одним з типів векторів є «плазміда», яка являє собою кільцеву двониткову петлю ДНК, в яку можуть бути ліговані додаткові фрагменти ДНК. Іншим типом вектора є фаговий вектор. Наступним типом вектора є вірусний вектор, при цьому додаткові фрагменти ДНК можуть бути ліговані у вірусний геном. Деякі вектори здатні до автономної реплікації в клітині-хазяїні, в яку їх вводять (наприклад, бактеріальні вектори, що мають бактеріальний початок реплікації, і епісомні вектори ссавців). Інші вектори (наприклад, неепісомні вектори ссавців) можуть бути інтегровані в геном клітини-хазяїна при введенні в клітину-хазяїна і при цьому реплікуються разом з геномом хазяїна. Крім того, деякі вектори здатні керувати експресією генів, з якими вони оперативно зв'язані. Такі вектори називають в даному описі «рекомбінантними експресуючими векторами» (або просто «рекомбінантними векторами»). Загалом, експресуючі вектори, застосовні в технологіях рекомбінантної ДНК, часто мають форму плазмід. У даному описі терміни «плазміда» і «вектор» можуть бути використані взаємозамінно, оскільки плазміда являє собою найбільш широко використовувану форму вектора. Терміни «полінуклеотид» або «нуклеїнова кислота», які використовуються в даному описі взаємозамінно, стосуються полімерів нуклеотидів будь-якої довжини і включають ДНК і РНК. Нуклеотиди можуть являти собою дезоксирибонуклеотиди, рибонуклеотиди, модифіковані нуклеотиди або основи і/або їх аналоги, або будь-який субстрат, який може бути введений в полімер ДНК- або РНК-полімеразою або в результаті реакції синтезу. Полінуклеотид може містити модифіковані нуклеотиди, такі як метильовані нуклеотиди і їх аналоги. При наявності модифікація в структурі нуклеотиду може бути введена до або після збирання полімеру. Послідовність нуклеотидів може бути перервана ненуклеотидними компонентами. Полінуклеотид може бути додатково модифікований після синтезу, наприклад, за допомогою кон’югування з міткою. Інші типи модифікацій включають, наприклад, «кепи», заміни одного або декількох природних нуклеотидів аналогом, міжнуклеотидні модифікації, такі як, наприклад, модифікації незарядженими зв'язками (наприклад, метилфосфонати, фосфотриефіри, фосфоамідати, карбамати і т. д.) і зарядженими зв'язками (наприклад, фосфоротіоати, фосфородитіоати і т. д.), модифікації, що містять бічні залишки, такі як, наприклад, білки 17 UA 100984 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 (наприклад, нуклеази, токсини, антитіла, сигнальні пептиди, ply-L-лізин і т. д.), модифікації інтеркаляторами (наприклад, акридин, псорален і т. д.), модифікації, що містять хелатори (наприклад, метали, радіоактивні метали, бор, окислювальні метали і т. д.), модифікації, що містять алкілятори, полінуклеотиди з модифікованими зв'язками (наприклад, альфа-аномерні нуклеїнові кислоти і т. д.), а також немодифіковані форми полінуклеотиду(ів). Крім того, будьяка з гідроксильних груп, звичайно присутніх в цукрах, може бути заміщена, наприклад, фосфонатними групами, фосфатними групами, захищена стандартними захисними групами або активована для одержання додаткових зв'язків з додатковими нуклеотидами, або може бути кон’югована з твердими або напівтвердими підкладками. 5'- і 3'-кінцева OH може бути фосфорилована або заміщена амінами або органічними кепуючими групами з 1-20 атомів вуглецю. Інші гідроксили також можуть бути дериватизовані стандартними захисними групами. Полінуклеотиди також можуть містити аналогічні форми цукрів рибози і дезоксирибози, які звичайно відомі в даній галузі, включаючи, наприклад, 2'-O-метил-, 2'-O-аліл, 2'-фтор- або 2'азидорибозу, карбоциклічні аналоги цукрів, α-аномерні цукри, епімерні цукри, такі як арабіноза, ксилози або ліксози, піранозні цукри, фуранозні цукри, седогептулози, ациклічні аналоги і позбавлені основи аналоги нуклеозидів, такі як метилрибозид. Один або декілька фосфодіефірних зв'язків можуть бути замінені альтернативними зв'язуючими групами. Такі альтернативні зв'язуючі групи включають без обмеження варіанти, в яких фосфат замінений Р(О)S («тіоат»), Р(S)S («дитіоат»), (О)NR2 («амідат»), Р(О)R, Р(О)OR', CO або CH2 («формацеталь»), де кожний R або R' незалежно означає Н або заміщений або незаміщений алкіл (1-20 С), що необов'язково містить ефірний (-О-) зв'язок, арил, алкеніл, циклоалкіл, циклоалкеніл або аралкіл. Не всі зв'язки в полінуклеотиді повинні бути ідентичними. Попередній опис застосовний до всіх вказаних в даному описі полінуклеотидів, включаючи РНК і ДНК. «Олігонуклеотид» у використовуваному в даному описі значенні загалом стосується коротких, звичайно однониткових, звичайно синтетичних полінуклеотидів, які, як правило, але не обов'язково, мають довжину менше ніж приблизно 200 нуклеотидів. Терміни «олігонуклеотид» і «полінуклеотид» не є взаємовиключними. Наведений вище опис полінуклеотидів в рівній мірі і повністю застосовний до олігонуклеотидів. «Ідентичність амінокислотних послідовностей в процентах (%)» відносно пептидної або поліпептидної послідовності визначають у вигляді процентного вмісту амінокислотних залишків у вибраній для дослідження послідовності, які ідентичні амінокислотним залишкам в конкретній пептидній або поліпептидній послідовності після вирівнювання послідовностей і введення пропусків, якщо це необхідно, щоб досягнути максимальної ідентичності послідовностей в процентах, і не беручи до уваги які-небудь консервативні заміни як частину ідентичності послідовностей. Вирівнювання з метою визначення ідентичності амінокислотних послідовностей в процентах можна здійснити різними шляхами, які відомі фахівцеві в даній галузі, наприклад, з використанням загальнодоступної комп'ютерної програми, такої як комп'ютерна програма BLAST, BLAST-2, ALIGN або Megalign (DNASTAR). Фахівці в даній галузі можуть визначити придатні параметри для вимірювання вирівнювання, включаючи будь-які алгоритми, необхідні для досягнення максимального вирівнювання протягом всієї довжини порівнюваних послідовностей. Однак з метою даного винаходу значення ідентичності амінокислотних послідовностей в % одержують, використовуючи комп'ютерну програму для порівняння послідовностей ALIGN-2, при цьому вихідний текст програми ALIGN-2 наведений в таблиці А нижче. Автором комп'ютерної програми для порівняння послідовностей ALIGN-2 є Genentech, Inc., і вихідний текст був поданий разом з документацією для користувача в Бюро охорони авторських прав США, Washington D.C., 20559, де він зареєстрований з номером реєстрації Бюро охорони авторських прав США TXU510087. Програма ALIGN-2 загальнодоступна в Genentech, Inc., South San Francisco, Calif. або може бути компільована з вихідного тексту програми, представленого, наприклад, в WO 2007/001851. Програма ALIGN-2 може бути компільована для застосування в операційній системі UNIX, переважно цифровій UNIX V4.0D. Всі параметри для порівняння послідовностей встановлені програмою ALIGN-2 і не варіюють. У ситуаціях, коли ALIGN-2 застосовують для порівнянь амінокислотних послідовностей, ідентичність амінокислотної послідовності в % для даної амінокислотної послідовності А в порівнянні або відносно даної амінокислотної послідовності В (що альтернативно може бути виражено як дана амінокислотна послідовність А, яка має або містить певну ідентичність амінокислотних послідовностей у % в порівнянні або відносно даної амінокислотної послідовності В) розраховують таким чином: 100×дріб X/Y, 18 UA 100984 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 де X означає кількість амінокислотних залишків, оцінених як ідентичні збіги програмою вирівнювання послідовностей ALIGN-2 при вирівнюванні вказаною програмою А і В, і де Y означає загальну кількість амінокислотних залишків в B. Буде зрозуміло, що, в тому випадку, коли довжина амінокислотної послідовності А не дорівнює довжині амінокислотної послідовності В, ідентичність амінокислотної послідовності А в порівнянні з В в % не буде дорівнювати ідентичності амінокислотної послідовності В в порівнянні з А в %. Бажано, щоб дві або більше амінокислотних послідовностей були ідентичні щонайменше на 50%, 60%, 70%, 80% або 90%. Більш переважно дві або більше амінокислотних послідовностей ідентичні щонайменше на 95%, 97%, 98%, 99% або навіть 100%. Якщо не вказане інше, всі значення ідентичності амінокислотних послідовностей в %, використовувані в даному описі, одержані, як описано безпосередньо в попередньому абзаці, з використанням комп'ютерної програми ALIGN-2. Термін «Notch1» у використовуваному в даному описі значенні, якщо не указано інакше, стосується будь-якого нативного або будь-якого варіанта (або нативного, або синтетичного) поліпептиду Notch1. Термін «нативна послідовність», зокрема, охоплює природні укорочені форми (наприклад, послідовність позаклітинного домену або послідовність трансмембранної субодиниці), природні форми варіантів (наприклад, альтернативно сплайсовані форми) і природні алельні варіанти. Термін «Notch1 дикого типу» загалом стосується поліпептиду, що містить амінокислотну послідовність природного білка Notch1. Термін «послідовність Notch1 дикого типу» загалом стосується амінокислотної послідовності, наявної в природному Notch1. Термін «ліганд Notch1» у використовуваному в даному описі значенні, якщо не указано інакше, стосується будь-якого нативного або будь-якого варіанта (або нативного, або синтетичного) поліпептиду ліганду Notch1 (наприклад, Jagged1, Jagged2, Delta-подібний 1, Delta-подібний 3 і/або Delta-подібний 4). Термін «нативна послідовність», зокрема, охоплює природні укорочені форми (наприклад, послідовність позаклітинного домену або послідовність трансмембранної субодиниці), природні форми варіантів (наприклад, альтернативно сплайсовані форми) і природні алельні варіанти. Термін «ліганд Notch1 дикого типу» загалом стосується поліпептиду, що містить амінокислотну послідовність природного білка ліганду Notch1. Термін «послідовність ліганду Notch1 дикого типу» загалом стосується амінокислотної послідовності, наявної в природному ліганді Notch1. Термін «NRR Notch1» у використовуваному в даному описі значенні, якщо спеціально або відповідно до тексту не указано інше, стосується будь-якої нативної або будь-якого варіанта (або нативного, або синтетичного) області поліпептиду Notch1, що складається з 3 модулів LNR і амінокислотних послідовностей, розташованих з карбоксильного кінця від модулів LNR, що простягаються до трансмембранного домену, наприклад, амінокислоти з номерами приблизно від 1446 до приблизно 1735 амінокислотної послідовності Notch1 людини (SEQ ID NO: 56) і амінокислоти з номерами приблизно від 1446 до приблизно 1725 амінокислотної послідовності Notch1 миші (SEQ ID NO: 57). Термін «нативна послідовність», зокрема, охоплює природні укорочені форми, природні форми варіантів (наприклад, альтернативно сплайсовані форми) і природні алельні варіанти. Термін «NRR Notch1 дикого типу» загалом стосується поліпептиду, що містить амінокислотну послідовність NRR Notch1, який зустрічається в природі. У деяких варіантах NRR Notch1 являє собою поліпептид, що містить амінокислоти від 1446 до 1735 послідовності SEQ ID NO: 56 або амінокислоти від 1446 до 1725 послідовності SEQ ID NO: 57. У деяких варіантах NRR Notch1 знаходиться в Notch1, такому як, наприклад, Notch1, процесований в сайті (сайтах) S1, S2 і/або S3, або непроцесований Notch1. У деяких варіантах NRR Notch1 містить два або більше нековалентно зв'язаних фрагменти амінокислотної послідовності NRR Notch1, наприклад, фрагмент, що містить амінокислоти від 1446 до 1664 послідовності SEQ ID NO: 56, нековалентно зв'язаний з фрагментом, що містить амінокислоти від 1665 до 1735 послідовності SEQ ID NO: 56. У іншому варіанті фрагмент, що містить амінокислоти від 1446 до 1654 послідовності SEQ ID NO: 57, нековалентно зв'язаний з фрагментом, що містить амінокислоти від 1655 до 1725 послідовності SEQ ID NO: 57. Термін «підвищена передача сигналів Notch1» у використовуваному в даному описі значенні стосується підвищення передачі сигналів Notch1, тобто щонайменше в два рази вище рівня передачі сигналів Notch1, спостережуваого в контролі в ідентичних умовах, наприклад, з використанням аналізу люциферази, описаного в цьому документі в прикладах 5 і 6. Бажано, підвищення передачі сигналів Notch1 складає щонайменше в три рази, в чотири рази, в п'ять разів або навіть в десять разів вище (або ще вище) рівня, спостережуваного в контролі. Термін «знижена передача сигналів Notch1» у використовуваному в даному описі значенні стосується зниження передачі сигналів Notch1, тобто щонайменше в два рази нижче рівня передачі сигналів Notch1, спостережуваного в контролі в ідентичних умовах, наприклад, з 19 UA 100984 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 використанням аналізу люциферази, описаного в цьому документі в прикладах 5 і 6. Бажано, зниження передачі сигналу Notch1 складає щонайменше в три рази, в чотири рази, в п'ять разів або навіть в десять разів нижче (або ще нижче) рівня, спостережуваного в контролі. Терміни «мутація, яка активує Notch1» і «мутація, яка активує передачу сигналів Notch1» стосуються інсерції однієї або декількох амінокислот, делеції однієї або декількох амінокислот або заміни однієї або декількох амінокислот в порівнянні з амінокислотною послідовністю Notch1 дикого типу, яка приводить до підвищеної передачі сигналів Notch1 в порівнянні з передачею сигналів Notch1 у випадку відповідної амінокислотної послідовності Notch1 дикого типу, або інсерції одного або декількох нуклеотидів, делеції одного або декількох нуклеотидів, транслокації одного або декількох нуклеотидів або заміни одного або декількох нуклеотидів в порівнянні з послідовністю нуклеїнової кислоти Notch1 дикого типу, що приводить до підвищеної передачі сигналів Notch1 в клітині, що містить мутантну послідовність нуклеїнової кислоти, в порівнянні з передачею сигналів Notch1 в клітині, що містить відповідну послідовність нуклеїнової кислоти Notch1 дикого типу. Передача сигналів Notch1 від рецептора Notch1, що містить активуючу мутацію, може бути залежною від ліганду або незалежною від ліганду. Терміни «антитіло» і «імуноглобулін» використовують взаємозамінно в найбільш широкому значенні, і терміни охоплюють моноклональні антитіла (наприклад, повнорозмірні або інтактні моноклональні антитіла), поліклональні антитіла, полівалентні антитіла, поліспецифічні антитіла (наприклад, біспецифічні антитіла, при умові, що вони виявляють необхідну біологічну активність), а також можуть включати деякі фрагменти антитіл (які більш детально описані в цьому документі). Антитіло може бути людським, гуманізованим і/або афінно дозрілим. Термін «варіабельний» стосується того факту, що деякі частини варіабельних доменів значною мірою відрізняються по послідовності серед антитіл і використовуються в зв’язуванні і забезпеченні специфічності кожного конкретного антитіла відносно його конкретного антигену. Однак варіабельність нерівномірно розподілена протягом варіабельних доменів антитіл. Вона сконцентрована в трьох ділянках, званих областями, які визначають комплементарність (CDR), або гіперваріабельними областями, у варіабельних доменах як легкого ланцюга, так і важкого ланцюга. Більш високо консервативні частини варіабельних доменів називають каркасними областями (FR). Кожний з варіабельних доменів нативних важкого і легкого ланцюгів містить чотири області FR, які в основному приймають конфігурацію β-шарів, сполучених трьома CDR, які утворюють петлі, які зв'язують і в деяких випадках утворюють частину β-шаруватої структури. CDR в кожному ланцюгу утримуються разом в безпосередній близькості за допомогою областей FR і з CDR з іншого ланцюга додають внесок в утворення антигензв’язувальної ділянки антитіл (дивись Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed. National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Константні домени безпосередньо не залучені у зв’язування антитіла з антигеном, але виявляють різні ефекторні функції, такі як участь антитіла в залежній від антитіл опосередкованій клітинами цитотоксичності. Розщеплення антитіл папаїном дає два ідентичних антигензв’язувальних фрагменти, званих «Fab»-фрагментами, кожний з яких має одну антигензв’язувальну ділянку, і залишковий «Fc»-фрагмент, назва якого відображає його здатність легко кристалізуватися. Обробка пепсином дає F(ab')2-фрагмент, який має дві антигензв’язувальні ділянки і ще здатний до перехресного зв’язування антигену. «Fv» являє собою мінімальний фрагмент антитіла, який містить повний сайт упізнавання і зв’язування антигену. У дволанцюжкових формах Fv така область складається з димеру одного варіабельного домену важкого ланцюга і одного варіабельного домену легкого ланцюга в тісній нековалентній асоціації. У одноланцюжкових формах Fv один варіабельний домен важкого ланцюга і один варіабельний домен легкого ланцюга можуть бути ковалентно зв’язані гнучким пептидним лінкером так, щоб легкий і важкий ланцюги могли асоціювати з утворенням «димерної» структури, аналогічної структурі дволанцюжкових форм Fv. Утворюється така конфігурація, що три CDR кожного варіабельного домену взаємодіють, визначаючи границі антигензв’язувальної ділянки на поверхні димеру VH-VL. Шість CDR разом надають антитілу специфічність в зв’язуванні антигену. Однак навіть один варіабельний домен (або половина Fv, що містить тільки три CDR, специфічні відносно антигену) має здатність упізнавати і зв'язувати антиген, хоч і з більш низькою афінністю, ніж повна ділянка зв’язування. Fab-фрагмент також містить константний домен легкого ланцюга і перший константний домен (CH1) важкого ланцюга. Fab'-фрагменти відрізняються від Fab-фрагментів додаванням декількох залишків на карбоксильному кінці домену CH1 важкого ланцюга, включаючи один або декілька цистеїнів з шарнірної області антитіла. Fab'-SH в даному описі означає Fab', в якому залишок(ки) цистеїну константних доменів несуть вільну тіольну групу. F(ab')2-фрагменти 20 UA 100984 C2 5 10 15 20 25 30 35 антитіл початково одержували у вигляді пар Fab'-фрагментів, між якими є цистеїни шарніра. Також відомі інші типи хімічного зв’язування фрагментів антитіл. «Легкі ланцюги» антитіл (імуноглобулінів) будь-якого виду хребетних можна віднести до одного з двох чітко відмінних типів, званих каппа (κ) і лямбда (λ), на основі амінокислотних послідовностей їх константних доменів. Залежно від амінокислотної послідовності константного домену своїх важких ланцюгів імуноглобуліни можуть бути віднесені до різних «класів». Існує п'ять основних класів імуноглобулінів: IgA, IgD, IgE, IgG і IgM, і деякі з них можуть бути додатково розділені на підкласи (ізотипи), наприклад IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 і IgA2. Константні домени важкого ланцюга, які відповідають різним класам імуноглобулінів, названі α, δ, ε, γ і μ, відповідно. Субодиничні структури і тривимірні конфігурації різних класів імуноглобулінів добре відомі. «Фрагменти антитіла» містять тільки частину інтактного антитіла, при цьому частина переважно зберігає щонайменше одну, переважно більшість або всі функції, в нормі асоційовані з такою частиною, коли вона присутня в інтактному антитілі. Приклади фрагментів антитіла включають фрагменти Fab, Fab', F(ab')2 і Fv; димерні антитіла (diabodies); лінійні антитіла; одноланцюжкові молекули антитіл і поліспецифічні антитіла, утворені з фрагментів антитіл. У одному варіанті фрагмент антитіла містить антигензв’язувальну ділянку інтактного антитіла і, отже, зберігає здатність зв'язувати антиген. У іншому варіанті фрагмент антитіла, наприклад фрагмент, який містить Fc-область, зберігає щонайменше одну з біологічних функцій, в нормі асоційованих з Fc-областю, коли така присутня в інтактному антитілі, таку як зв’язування FcRn, модулювання часу напівжиття антитіла, функцію ADCC і зв’язування комплементу. У одному варіанті фрагмент антитіла являє собою моновалентне антитіло, яке має час напівжиття in vivo, по суті схожий з часом напівжиття інтактного антитіла. Наприклад, такий фрагмент антитіла може містити антигензв’язувальне плече, зв'язане з послідовністю Fc, здатною надавати фрагментам стабільність in vivo. Термін «гіперваріабельна область», «HVR» або «HV» при використанні в даному описі стосується областей варіабельного домену антитіла, які є гіперваріабельними по послідовності і/або утворюють структурно обмежені петлі. Загалом, антитіла містять шість гіперваріабельних областей; три в VH (H1, H2, H3) і три в VL (L1, L2, L3). Використовують декілька варіантів визначення границь гіперваріабельних областей і вони розглядаються в даному описі. Області (CDR), що визначають комплементарність, згідно з системою Kabat основані на варіабельності послідовностей і найбільш широко використовуються (Kabat et al., Sequences of Proteins of th Immunological Interest, 5 Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). Замість цього Chothia розглядає положення структурних петель (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)). Гіперваріабельні області AbM являють собою компроміс між CDR згідно з Kabat і структурними петлями згідно з Chothia і використовуються в комп'ютерній програмі для моделювання антитіл AbM Oxford Molecular. Гіперваріабельні області «контакту» основані на аналізі наявних кристалічних структур комплексів. Залишки для кожної з таких гіперваріабельних областей вказані нижче. 40 Гіперваріабельні області можуть містити наступні «розширені гіперваріабельні області»: 2436 або 24-34 (L1), 46-56 або 50-56 (L2) і 89-97 (L3) в VL і 26-35 (H1), 50-65 або 49-65 (H2) і 93 21 UA 100984 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 102, 94-102 або 95-102 (H3) в VH. Залишки варіабельних доменів пронумеровані згідно з Kabat et al. (посилання вказане вище) для кожного з наведених визначень. Залишки «каркаса» або «FR» являють собою інші залишки варіабельного домену, відмінні від залишків гіперваріабельної області, яка визначена в даному описі. «Гуманізовані» форми антитіл тварин, відмінних від людини (наприклад мишей), являють собою химерні антитіла, які містять мінімальну послідовність, одержану з імуноглобуліну тварини, відмінної від людини. Головним чином гуманізовані антитіла являють собою імуноглобуліни людини (реципієнтне антитіло), в яких залишки з гіперваріабельної області реципієнта замінені залишками з гіперваріабельної області виду, відмінного від людини (донорне антитіло), такого як миша, щур, кролик або примат, відмінний від людини, що має необхідну специфічність, афінність і місткість. У деяких випадках залишки каркасної області (FR) імуноглобуліну людини замінюють відповідними залишками тварини, відмінної від людини. Крім того, гуманізовані антитіла можуть містити залишки, які не зустрічаються ні в реципієнтному антитілі, ні в донорному антитілі. Такі модифікації здійснюють для того, щоб додатково поліпшити ефективність антитіла. Загалом, гуманізоване антитіло буде містити в основному повністю щонайменше один і звичайно два варіабельних домени, в яких всі або в основному всі гіперваріабельні петлі відповідають петлям імуноглобуліну тварини, відмінної від людини, і всі або в основному всі FR є FR з послідовності імуноглобуліну людини. Гуманізоване антитіло необов'язково також буде містити щонайменше частину константної області імуноглобуліну (Fc), звичайно константної області імуноглобуліну людини. Більш докладний опис дивись в Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332: 323-329 (1988) і Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992). Також дивись наступні оглядові статті і наведені в них посилання: Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma and Immunol. 1: 105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23: 1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5: 428-433 (1994). «Химерні» антитіла (імуноглобуліни) мають частину важкого і/або легкого ланцюга, ідентичну або гомологічну відповідним послідовностям в антитілах, які одержані від конкретного виду або стосуються конкретного класу або підкласу антитіл, тоді як інша частина ланцюга (ланцюгів) ідентична або гомологічна відповідним послідовностям в антитілах, які одержані від іншого виду або стосуються іншого класу або підкласу антитіл, а також фрагменти таких антитіл, при умові, що вони виявляють необхідну біологічну активність (патент США № 4816567; і Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855 (1984)). Гуманізовані антитіла у використовуваному в даному описі значенні є підгрупою химерних антитіл. «Одноланцюжкові Fv» або «scFv» фрагменти антитіл містять домени VH і VL антитіла, при цьому такі домени знаходяться в одному поліпептидному ланцюгу. Звичайно поліпептид scFv додатково містить поліпептидний лінкер між доменами VH і VL, який забезпечує можливість утворення необхідної структури scFv для зв’язування антигену. Огляд scFv дивись в Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., SpringerVerlag, New York, pp. 269-315 (1994). «Антиген» являє собою попередньо визначуваний антиген, з яким антитіло може вибірно зв'язуватися. Антигеном-мішенню може бути поліпептид, вуглевод, нуклеїнова кислота, ліпід, гаптен або інша природна або синтетична сполука. Переважно антигеном-мішенню є поліпептид. Термін «димерні антитіла» стосується невеликих фрагментів антитіл з двома антигензв’язувальними ділянками, і такі фрагменти містять варіабельний домен важкого ланцюга (VH), зв'язаний з варіабельним доменом легкого ланцюга (VL) в одному і тому ж поліпептидному ланцюгу (VH-VL). У випадку використання лінкера, який є дуже коротким, щоб забезпечити можливість спарювання між двома доменами на одному і тому ж ланцюгу, домени вимушені спарюватися з комплементарними доменами іншого ланцюга і утворювати дві антигензв’язувальні ділянки. Димерні антитіла більш повно описані, наприклад, в EP 404097, WO 93/11161 і в Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993). «Людським антитілом» є антитіло, яке має амінокислотну послідовність, відповідну амінокислотній послідовності антитіла, утворюваного в організмі людини і/або одержуваного з використанням будь-якого способу одержання людських антитіл, який описаний в даному документі. Таке визначення людського антитіла спеціально включає гуманізоване антитіло, яке містить антигензв’язувальні залишки тварини, відмінної від людини. Антитіло з «дозрілою афінністю» являє собою антитіло з однією або декількома змінами в одній або декількох його CDR, які приводять до підвищення афінності антитіла до антигену в порівнянні з вихідним антитілом, яке не має такої зміни (змін). Переважні антитіла з дозрілою афінністю будуть мати наномолярні або навіть пікомолярні афінності відносно антигену 22 UA 100984 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 мішені. Антитіла з дозрілою афінністю одержують способами, відомими в даній галузі. Marks et al. Bio/Technology 10: 779-783 (1992) описують дозрівання афінності в результаті перетасовування доменів VH і VL. Випадковий мутагенез залишків CDR і/або каркаса описаний в: Barbas et al., Proc Nat. Acad. Sci, USA 91: 3809-3813 (1994); Schier et al., Gene 169: 147-155 (1995); Yelton et al., J. Immunol. 155: 1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7): 3310-9 (1995); і Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226: 889-896 (1992). «Ефекторні функції» антитіл стосуються біологічних активностей, властивих Fc-області (Fcобласті з нативною послідовністю або Fc-області з варіантом амінокислотної послідовності) антитіла, і варіюють залежно від ізотипу антитіл. Приклади ефекторних функцій антитіл включають: зв’язування C1q і комплементзалежну цитотоксичність (CDC); зв’язування рецептора Fc; залежну від антитіл опосередковану клітинами цитотоксичність (ADCC); фагоцитоз; знижувальну регуляцію рецепторів клітинної поверхні (наприклад, В-клітинного рецептора) і активацію В-клітин. Терміни «залежна від антитіл опосередкована клітинами цитотоксичність» і «ADCC» стосуються форми цитотоксичності, при якій секретований Ig, зв'язаний рецепторами Fc (FcR), присутній на деяких цитотоксичних клітинах (наприклад, природних клітинах-кілерах (NK), нейтрофілах і макрофагах), забезпечує можливість специфічного зв’язування таких цитотоксичних ефекторних клітин з несучою антиген клітиною-мішенню і потім викликає лізис клітини-мішені. Антитіла «озброюють» цитотоксичні клітини і абсолютно необхідні для такого лізису. Первинні клітини для опосередковування ADCC, NK-клітини, експресують тільки FcγRIII, тоді як моноцити експресують FcγRI, FcγRII і FcγRIII. Експресія FcR на гематопоетичних клітинах підсумована в таблиці 3 на сторінці 464 в Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 45792 (1991). Щоб оцінити активність в ADCC молекули, що представляє інтерес, можна здійснити аналізи ADCC in vitro, такі як аналізи, описані в патентах США №№ 5500362 або 5821337, або в Presta U.S. Pat. № 6737056. Застосовні ефекторні клітини для таких аналізів включають мононуклеарні клітини периферичної крові (PBMC) і природні клітини-кілери (NK). Альтернативно або додатково, ADCC-активність молекули, що представляє інтерес, можна оцінити in vivo, наприклад в тваринній моделі, такій як модель,описана в Clynes et al. PNAS (USA) 95: 652-656 (1998). «Ефекторними клітинами людини» є лейкоцити, які експресують один або декілька FcR і здійснюють ефекторні функції. Переважно клітини експресують щонайменше FcγRIII і здійснюють ADCC-ефекторну функцію. Приклади лейкоцитів людини, які опосередковують ADCC, включають мононуклеарні клітини периферичної крові (PBMC), природні клітини-кілери (NK), моноцити, цитотоксичні Т-клітини і нейтрофіли; при цьому звичайно переважні PBMC і NK-клітини. Ефекторні клітини можуть бути виділені з їх природного джерела, наприклад з крові. Терміни «Fc-рецептор» і «FcR» використовують для опису рецептора, який зв'язується з Fcобластю антитіла. Переважним FcR є FcR людини з нативною послідовністю. Крім того, переважним FcR є FcR, який зв'язує IgG-антитіло (гамма-рецептор), і до переважних рецепторів належать рецептори підкласів FcγRI, FcγRII і FcγRIII, включаючи алельні варіанти і альтернативно сплайсовані форми вказаних рецепторів. Рецептори FcγRII включають FcγRIIA («активуючий рецептор») і FcγRIIB («інгібуючий рецептор»), які мають схожі амінокислотні послідовності, що відрізняються головним чином своїми цитоплазматичними доменами. Активуючий рецептор FcγRIIA містить в своєму цитоплазматичному домені оснований на тирозині мотив активації імунорецептора (ITAM). Інгібуючий рецептор FcγRIIB містить в своєму цитоплазматичному домені оснований на тирозині мотив інгібування імунорецептора (ITIM) (огляд в Daëron, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234 (1997)). Огляд, присвячений FcR, представлений в Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4: 25-34 (1994); і de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995). Інші FcR, включаючи FcR, що ідентифікуються в природі, включені в даному описі в термін «FcR». Термін також охоплює неонатальний рецептор, FcRn, який відповідає за перенесення материнських IgG в плід (Guyer et al., J. Immunol. 117: 587 (1976) і Kim et al., J. Immunol. 24: 249 (1994)) і регулює гомеостаз імуноглобулінів. У WO 00/42072 (Presta) описані варіанти антитіл з підвищеним або зменшеним зв’язуванням з FcR. Вміст вказаної патентної публікації спеціально включений в даний опис у вигляді посилання. Дивись також Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001). Способи вимірювання зв’язування з FcRn відомі (дивись, наприклад, Ghetie 1997, Hinton 2004). Зв’язування з FcRn людини in vivo і час напівжиття в сироватці поліпептидів, які з високою афінністю зв'язують FcRn людини, можна аналізувати, наприклад, у трансгенних 23 UA 100984 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 мишей або в трансфекованих лініях клітин людини, експресуючих FcRn людини, або у приматів, яким вводять варіанти поліпептидів Fc. «Комплементзалежна цитотоксичність» і «CDC» стосуються лізису мішені в присутності комплементу. Шлях активації комплементу ініціюється зв’язуванням першого компонента системи комплементу (C1q) з антитілами (відповідного підкласу), які зв'язані зі своїм антигеном. Щоб оцінити активацію комплементу можна здійснити аналіз CDC, наприклад, як описано в Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996). Варіанти поліпептидів із зміненою амінокислотною послідовністю Fc-області і підвищеною або зниженою здатністю зв'язувати C1q описані в патенті США № 6194551B1 і в WO 99/51642. Зміст вказаних патентних публікацій спеціально включений в даний опис у вигляді посилання. Дивись також Idusogie et al., J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000). Термін «поліпептид, який містить Fc-область» стосується поліпептиду, такого як антитіло або імуноадгезин, який містить Fc-область. С-кінцевий лізин (залишок 447 згідно з системою нумерації EU) Fc-області може бути видалений, наприклад, під час очищення поліпептиду або в результаті конструювання рекомбінантної нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептид. Відповідно, композиція, що містить поліпептид, який має Fc-область, згідно з даним винаходом може містити поліпептиди з K447, зі всіма видаленими K447 або суміш поліпептидів, які мають і не мають залишок K447. «Блокувальне» антитіло або «антагоністичне» антитіло являє собою антитіло, яке інгібує або знижує біологічну активність антигену, який воно зв'язує. Переважні блокувальні антитіла або антагоністичні антитіла значною мірою або повністю інгібують біологічну активність антигену. Бажано, щоб біологічна активність була знижена на 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% або навіть на 100%. «Агоністичне антитіло» у використовуваному в даному описі значенні являє собою антитіло, яке імітує щонайменше одну з функціональних активностей поліпептиду, що представляє інтерес. «Акцепторний каркас людини» з метою даного опису означає каркас, що містить амінокислотну послідовність каркаса VL або VH, одержану з каркаса імуноглобуліну людини або з консенсусного каркаса людини. Акцепторний каркас людини, «одержаний з» каркаса імуноглобуліну людини або з консенсусного каркаса людини, може містити ту ж саму амінокислотну послідовність або може містити попередні зміни амінокислотної послідовності. У тому випадку, коли є попередні зміни амінокислот, переважно присутні не більше 5 і переважно 4 або менше або 3 або менше попередніх змін амінокислот. У тому випадку, коли попередні зміни амінокислот присутні в VH, переважно такі зміни мають місце тільки в трьох, двох або одному положенні 71H, 73H, і 78H; наприклад, амінокислотними залишками в таких положеннях можуть бути 71A, 73T і/або 78A. У одному варіанті акцепторний каркас VL людини ідентичний по послідовності каркасній послідовності VL імуноглобуліну людини або консенсусній каркасній послідовності людини. «Консенсусним каркасом людини» є каркас, який має амінокислотний залишок, що найбільш часто зустрічається, при селекції каркасних послідовностей VL або VH імуноглобуліну людини. В основному селекція послідовностей VL або VH імуноглобуліну людини здійснюється з підгрупи послідовностей варіабельних доменів. Звичайно підгрупа послідовностей являє собою підгрупу згідно з системою Kabat et al. У одному варіанті для VL підгрупою є підгрупа каппа I згідно з Kabat et al. У одному варіанті для VH підгрупою є підгрупа III згідно з Kabat et al. «Консенсусний каркас підгрупи III VH» містить консенсусну послідовність, одержану з амінокислотних послідовностей в підгрупі III варіабельних областей важкого ланцюга згідно з Kabat et al. У одному варіанті амінокислотна послідовність консенсусного каркаса підгрупи III VH містить щонайменше частину або повністю кожну з наступних послідовностей: 50 55 «Консенсусний каркас підгрупи I VL» містить консенсусну послідовність, одержану з амінокислотних послідовностей в підгрупі I варіабельної області легкого ланцюга каппа згідно з Kabat et al. У одному варіанті амінокислотна послідовність консенсусного каркаса підгрупи I VH містить щонайменше частину або повністю кожну з наступних послідовностей: 24 UA 100984 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 «Порушення» або «захворювання» означає будь-який стан, при якому може бути корисне лікування речовиною/молекулою або способом згідно з винаходом. Такий стан включає хронічні і гострі порушення або захворювання, включаючи такі патологічні стани, які зумовлюють схильність ссавця до порушення, що розглядається. Необмежувальними прикладами порушень, які піддаються лікуванню згідно з винаходом, є злоякісні і доброякісні пухлини; карцинома, бластома і саркома. Терміни «клітинне проліферативне порушення» і «проліферативне порушення» стосуються порушень, які асоційовані з певною мірою аномальної проліферації клітин. У одному варіанті клітинним проліферативним порушенням є злоякісна пухлина. «Пухлина» у використовуваному в даному описі значенні стосується проліферації клітин і неопластичного росту, або злоякісного, або доброякісного, і всіх передзлоякісних і злоякісних клітин і тканин. Терміни «злоякісна пухлина», «злоякісна», «клітинне проліферативне порушення», «проліферативне порушення» і «пухлина» не є взаємовиключними при згадуванні в даному описі. Терміни «злоякісна пухлина» і «злоякісний» стосуються або описують фізіологічний стан у ссавців, який звичайно характеризується нерегульованим клітинним ростом/проліферацією. Приклади злоякісної пухлини включають без обмеження карциному, лімфому, бластому, саркому і лейкоз. Більш конкретні приклади таких злоякісних пухлин включають рак сквамозних клітин, дрібноклітинний рак легені, недрібноклітинний рак легені, аденокарциному легені, сквамозну карциному легені, рак очеревини, гепатоклітинний рак, рак шлунково-кишкового тракту, рак підшлункової залози, гліобластому, рак шийки матки, рак яєчника, рак печінки, рак сечового міхура, гепатому, рак молочної залози, рак ободової кишки, рак прямої і ободової кишки, карциному ендометрія або матки, карциному слинних залоз, рак нирок, рак печінки, рак простати, рак вульви, рак щитовидної залози, карциному печінки, рак шлунка, меланому і різні типи раку голови і шиї. Порушення регуляції ангіогенезу може приводити до багатьох порушень, які можна лікувати, застосовуючи композиції і способи згідно з винаходом. Такі порушення включають як не неопластичні, так і неопластичні стани. Неопластичні порушення включають без обмеження описані вище порушення. Не неопластичні порушення включають без обмеження небажану гіпертрофію або гіпертрофію, що відхиляється від норми, артрит, ревматоїдний артрит (RA), псоріаз, псоріазні бляшки, саркоїдоз, атеросклероз, атеросклеротичні бляшки, діабетичні і інші проліферативні ретинопатії, включаючи ретинопатію недоношених, ретролентальну фіброплазію, неоваскулярну глаукому, пов'язану з віком дегенерацію жовтої плями, діабетичний макулярний набряк, неоваскуляризацію рогівки, неоваскуляризацію трансплантата рогівки, відторгнення трансплантата рогівки, неоваскуляризацію сітківки/хоріоїду, неоваскуляризацію кутка ока (почервоніння райдужки), неоваскулярне захворювання ока, рестеноз судин, артеріовенозні мальформації (AVM), менінгіому, гемангіому, ангіофіброму, гіперплазії щитовидної залози (включаючи дифузний токсичний зоб), трансплантацію рогівки і інших тканин, хронічне запалення, запалення легень, гостре легеневе ушкодження/ARDS, сепсис, первинну легеневу гіпертонію, злоякісні легеневі випоти, набряк головного мозку (наприклад, пов'язаний з гострим інсультом/закритою травмою черепа/травмою), синовіальне запалення, утворення пануса при RA, осифікувальний міозит, гіпертрофічне утворення кісток, остеоартрит (OA), рефрактерні асцити, полікістоз яєчника, ендометріоз, захворювання, пов'язані з втратою рідини в 3-тій простір (панкреатит, синдром міжфасціального простору, опіки, захворювання кишечнику), фіброїди матки, передчасні роди, хронічне запалення, таке як IBD (хвороба Крона і виразковий коліт), відторгнення алотрансплантата нирки, запальне захворювання кишечнику, нефротичний синдром, небажаний ріст маси тканини або ріст маси тканини, що відхиляється від норми (не злоякісний), гемофілічні гемартрози, гіпертрофічні рубці, інгібування росту волосся, синдром ОслераВебера, піогенну гранульому, ретролентальні фіброплазії, склеродермію, трахому, спайки судин, синовіт, дерматит, передеклампсію, асцити, перикардіальний випіт (такий як перикардіальний випіт, пов'язаний з перикардитом) і плевральний випіт. Терміни «нейродегенеративне захворювання» і «нейродегенеративне порушення» використовують в найбільш широкому значенні, і терміни включають всі порушення, патологія при яких полягає в дегенерації і/або порушенні функції нейронів, включаючи без обмеження периферичні невропатії; порушення рухових нейронів, такі як бічний аміотрофічний склероз 25 UA 100984 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (ALS, хвороба Лу Геріга), периферичний параліч лицьового нерва і різні стани, в які залучена м’язова атрофія спинного мозку або параліч; і інші нейродегенеративні захворювання людини, такі як хвороба Альцгеймера, хвороба Паркінсона, епілепсія, розсіяний склероз, хорея Хантінгтона, синдром Дауна, нервова глухота і хвороба Меньєра. «Периферична невропатія» є нейродегенеративним порушенням, яке уражає периферичні нерви, що найчастіше виявляється у вигляді одного порушення моторної, сенсорної, сенсомоторної або аутоімунної функції або у вигляді поєднання порушень вказаних функцій. Периферичні невропатії, наприклад, можуть бути спадковими, можуть бути результатом системного захворювання або можуть бути індуковані токсичним агентом, таким як нейротоксичний лікарський засіб, наприклад, антинеопластичний засіб або промислова забруднююча речовина або забруднююча речовина навколишнього середовища. «Периферична сенсорна невропатія» характеризується дегенерацією периферичних сенсорних нейронів, яка може бути ідіопатичною, може виникати, наприклад, як наслідок діабету (діабетична невропатія), лікування цитостатичними лікарськими засобами при злоякісній пухлині (наприклад, лікування такими хіміотерапевтичними засобами як вінкристин, цисплатин, метотрексат, 3'-азидо-3'-дезокситимідин або таксани, наприклад, паклітаксел [TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.] і доксетаксел [TAXOTERE®, RhônePoulenc Rorer, Antony, France]), алкоголізму, синдрому набутого імунодефіциту (AIDS) або генетичної схильності. Генетично зумовлені периферичні невропатії включають, наприклад, синдром Рефсума, хворобу Краббе, метахроматичну лейкодистрофію, хворобу Фабрі, синдром Дежеріна-Сотта, абеталіпопротеїнемію і хворобу Шарко-Марі-Тута (CMT) (також звану м’язовою атрофією перонеального типу або спадковою сенсомоторною невропатією (HMSN)). Більшість типів периферичної невропатії розвивається повільно, протягом декількох місяців або років. У клінічній практиці такі невропатії називають хронічними. Іноді периферична невропатія розвивається швидко, протягом декількох днів, і тоді її називають гострою. Периферична невропатія звичайно уражає сенсорні і моторні нейрони разом, так що виникає змішана сенсомоторна нефропатія, але також відомі незмішані сенсорна і моторна невропатії. «Аутоімунне захворювання» у використовуваному в даному описі значенні стосується будьякого порушення, в патологію якого залучена імунна відповідь проти власної тканини індивідуума. Аутоімунні захворювання включають без обмеження ревматоїдний артрит (RA), астму, хронічне обструктивне легеневе захворювання (COPD), запальне захворювання кишечнику, целіакію, алергічний риніт, алергічну кропивницю, хворобу Крона, хворобу Гіршспрунга, дифузний токсичний зоб, Аддісонову хворобу, синдром Гійєна-Барре, хворобу Хашимото, алергічні внутрішньоочні запальні захворювання, анкілозуючий спондиліт, атопічний дерматит, аутоімунну гемолітичну анемію, аутоімунний гепатит, хворобу Бехчета, синдром Когана, контактний дерматит, синдром Кушинга, дерматоміозит, цукровий діабет, дискоїдний червоний вовчак, вовчаковий нефрит, еозинофільний фасціїт, вузлувату еритему, ексфоліативний дерматит, осередковий або сегментарний гломерулосклероз, гігантоклітинний артеріїт, подагру, подагричний артрит, екзему рук, пурпуру Геноха-Шенлейна, герпес вагітних, гірсутизм, ідіопатичний кератосклероз, ідіопатичну тромбоцитопенічну пурпуру, запальні дерматози, розсіяний склероз, бульбоспінальний параліч, міозит, остеоартрит, панкреатит, пемфігоїд вагітних, вульгарний пемфігус, періодонтит; нодозний поліартеріїт, ревматичну поліміалгію, мошонковий свербіж, прурит/запалення, псоріаз, псоріатичний артрит, легеневий гістоплазмоз, рецидивуючий поліхондрит, рожеві вугри, саркоїдоз, склеродермію, синдром септичного шоку, тендиніт або бурсит плеча, синдром Шегрена, синдром Стілла, хворобу Світа, системний червоний вовчак, системний склероз, артеріїт Такаясу, темпоральний артеріїт, токсичний епідермальний некроліз, відторгнення трансплантата, туберкульоз, діабет типу 1, виразковий коліт, увеїт, васкуліт і гранулематоз Вегенера. «Імунологічне порушення» у використовуваному в даному описі значенні стосується будьякого порушення, в патологію якого залучений аномальний розвиток або аномальна регуляція імунної системи у індивідуума. Переважно в імунологічне порушення залучений аномальний розвиток або аномальна регуляція Т-клітин. «Лікарським засобом» є активний засіб для лікування порушення, що розглядається, або його синдромів, або побічних ефектів. У використовуваному в даному описі значенні «лікування» стосується клінічного втручання з метою спроби змінити природний перебіг процесу в організмі індивідуума або в клітині, що піддається лікуванню, і лікування можна здійснювати або для профілактики, або під час перебігу клінічної патології. Необхідні ефекти лікування включають профілактику виникнення або рецидивів захворювання, ослаблення симптомів, зниження яких-небудь прямих або опосередкованих патологічних наслідків захворювання, попередження метастазів, зниження 26 UA 100984 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 швидкості прогресування захворювання, ослаблення або полегшення патологічного стану і ремісію або поліпшений прогноз. У деяких варіантах антитіла згідно з винаходом використовують для сповільнення розвитку захворювання або порушення. «Індивідуумом» є хребетне, переважно ссавець, більш переважно людина. Ссавці включають без обмеження сільськогосподарських тварин (таких як корови), спортивних тварин, домашніх тварин (таких як кішки, собаки, коні), приматів, мишей і щурів. «Ссавець» з метою лікування стосується будь-якої тварини, що класифікується як ссавець, включаючи людину, домашніх і сільськогосподарських тварин і тварин в зоопарках, спортивних тварин або кімнатних тварин, таких як собаки, коні, кішки, корови і т. д. Переважно ссавцем є людина. Термін «ефективна кількість» стосується кількості, ефективної в дозах і протягом необхідних періодів часу стосовно досягнення необхідного терапевтичного або профілактичного результату. «Терапевтична ефективна кількість» речовини/молекули згідно з винаходом, агоніста або антагоніста може варіювати залежно від таких факторів, як тип патологічного стану, вік, стать і маса пацієнта і здатність речовини/молекули, агоніста або антагоніста викликати необхідну відповідь у індивідуума. Терапевтично ефективна кількість також являє собою таку кількість, при використанні якої будь-які токсичні або шкідливі ефекти речовини/молекули, агоніста або антагоніста переважуються терапевтично корисними ефектами. «Профілактично ефективна кількість» стосується кількості, ефективної в дозах і протягом необхідного періоду часу стосовно досягнення необхідного профілактичного результату. Звичайно, але не обов'язково, в зв'язку з тим, що профілактичну дозу використовують для індивідуума до виникнення або на ранній стадії захворювання, профілактично ефективна кількість буде меншою, ніж терапевтично ефективна кількість. Термін «цитотоксичний засіб» у використовуваному в даному описі значенні стосується речовини, яка інгібує або попереджує функцію клітин і/або викликає руйнування клітин. Мається 211 131 125 90 186 188 на увазі, що термін включає радіоактивні ізотопи (наприклад At, I, I, Y, Re, Re, 153 212 32 Sm, Bi, P і радіоактивні ізотопи Lu), хіміотерапевтичні засоби, наприклад, метотрексат, адріаміцин, алкалоїди барвінку (вінкристин, вінбластин, етопозид), доксорубіцин, мелфалан, мітоміцин С, хлорамбуцил, даунорубіцин або інші інтеркалюючі агенти, ферменти і їх фрагменти, такі як нуклеолітичні ферменти, антибіотики і токсини, такі як низькомолекулярні токсини або ферментативно активні токсини бактеріального, грибкового, рослинного або тваринного походження, включаючи їх фрагменти і/або варіанти, і різні протипухлинні або протиракові засоби, описані нижче. Інші цитотоксичні засоби описані нижче. Тумороцидний засіб викликає руйнування пухлинних клітин. «Хіміотерапевтичним засобом» є хімічна сполука, застосовна для лікування злоякісної пухлини. Приклади хіміотерапевтичних засобів включають алкілувальні агенти, такі як тіотепа і CYTOXAN® циклофосфамід; алкілсульфонати, такі як бусульфан, імпросульфан і піпосульфан; азиридини, такі як бензодопа, карбоквон, метуредопа і уредопа; етиленіміни і метилмеламіни, включаючи алтретамін, триетиленмеламін, триетиленфосфорамід, триетилентіофосфорамід і триметилмеламін; ацетогеніни (зокрема булатацин і булатацинон); дельта-9-тетрагідроканабінол (дронабінол, MARINOL®); бета-лапахон; лапахол; колхіцини; бетулінову кислоту; камптотецин (включаючи синтетичний аналог топотекан (HYCAMTIN®), CPT-11 (іринотекан, CAMPTOSAR®), ацетилкамптотецин, скополектин і 9-амінокамптотецин); бріостатин; калістатин; CC-1065 (включаючи його синтетичні аналоги адозелезин, карзелезин і бізелезин); подофілотоксин; подофілінову кислоту; теніпозид; криптофіцини (зокрема криптофіцин 1 і криптофіцин 8); доластатин; дуокарміцин (включаючи синтетичні аналоги KW2189 і CB1-TM1); елеутеробін; панкратистатин; саркодиктиїн; спонгістатин; азотистий іприт, такий як хлорамбуцил, хлорнафазин, холофосфамід, естрамустин, іфосфамід, мехлоретамін, гідрохлорид оксиду мехлоретаміну, мелфалан, новембіхін, фенестерин, преднімустин, трофосфамід, урамустин; нітрозосечовини, такі як кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, німустин і ранімустин; антибіотики, такі як енедіїнові антибіотики (наприклад, каліхеаміцин, зокрема каліхеаміцин гамма II і каліхеаміцин омега II (дивись, наприклад, Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); динеміцин, включаючи динеміцин А; еспераміцин; а також хромофор неокарциностатину і споріднені хромофори хромопротеїнів - енедіїнові антибіотики), аклациномізини, актиноміцин, аутраміцин, азасерин, блеоміцини, кактиноміцин, карабіцин, карміноміцин, карзинофілін, хромоміцин, дактиноміцин, даунорубіцин, деторубіцин, 6-діазо-5-оксо-L-норлейцин, доксорубіцин ADRIAMICIN® (включаючи морфолінодоксорубіцин, ціаноморфолінодоксорубіцин, 2-піролінодоксорубіцин і дезоксидоксорубіцин), епірубіцин, езорубіцин, ідарубіцин, марцеломіцин, мітоміцини, такі як мітоміцин С, мікофенолову кислоту, 27 UA 100984 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 ногаламіцин, оливоміцини, пепломіцин, потфіроміцин, пуроміцин, квеламіцин, родорубіцин, стрептонігрин, стрептозоцин, туберцидин, убенімекс, зиностатин, зорубіцин; антиметаболіти, такі як метотрексат і 5-фторурацил (5-FU); аналоги фолієвої кислоти, такі як деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; аналоги пурину, такі як флударабін, 6меркаптопурин, тіаміприн, тіогуанін; аналоги піримідину, такі як анцитабін, азацитидин, 6азауридин, кармофур, цитарабін, дидезоксіуридин, доксифлуридин, еноцитабін, флоксуридин; андрогени, такі як калустерон, пропіонат дромостанолону, епітіостанол, мепітіостан, тестолактон; засоби, по пригнічують функції надниркових залоз, такі як аміноглютетимід, мітотан, трилостан; компенсатор фолієвої кислоти, такий як фолінова кислота; ацеглатон; глікозид альдофосфамід; амінолевулінову кислоту; енілурацил; амсакрин; бестрабуцил; бісантрен; едатраксат; дефофамін; демеколцин; діазиквон; елфорнітин; ацетат еліптинію; епотилон; етоглуцид; нітрат галію; гідроксисечовину; лентинан; лонідаїнін; мейтанзиноїди, такі як мейтанзин і ансамітоцини; мітогуазон; мітоксантрон; мопіданмол; нітраерин; пентостатин; фенамет; пірарубіцин; лозоксантрон; 2-етилгідразид; прокарбазин; полісахаридний комплекс PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR); разоксан; ризоксин; сизофіран; спірогерманій; тенуазонову кислоту; триазиквон; 2,2',2"-трихлортриетиламін; трихотецени (зокрема токсин Т-2, веракурин А, роридин А і ангуїдин); уретан; віндезин (ELDISINE®, FILDESIN®); дакарбазин; маномустин; мітобронітол; мітолактол; піпоброман; гацитозин; арабінозид («ara-C»); тіотепу; таксоїди, наприклад паклітаксел (TAXOL®) (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), TM ABRAXANE , препарат паклітакселу, що не містить кремофору, на основі сконструйованих зв'язаних з альбуміном наночастинок (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Ill.), і доксетаксел TAXOTERE® (Rhône-Poulenc Rorer, Antony, France); хлорамбуцил; гемцитабін (GEMZAR®); 6-тіогуанін; меркаптопурин; метотрексат; аналоги платини, такі як цисплатин і карбоплатин; вінбластин (VELBAN®); платину; етопозид (VP-16); іфосфамід; мітоксантрон; вінкристин (ONCOVIN®); оксаліплатин; лейковорин; вінорелбін (NAVELBINE®); новантрон; едатрексат; дауноміцин; аміноптерин; ібандронат; інгібітор топоізомерази RFS 2000; дифторметилорнітин (DMFO); ретиноїди, такі як ретиноєва кислота; капецитабін (XELODA®); фармацевтично прийнятні солі, кислоти і похідні будь-якого засобу, вказаного вище; а також поєднання двох або більше вказаних вище засобів, такі як CHOP, скорочена назва комбінованої терапії циклофосфамідом, доксорубіцином, вінкристином і преднізолоном, і FOLFOX, TM скорочена назва схеми лікування оксаліплатином (ELOXATIN ) в поєднанні з 5-FU і лейковорином. Також у вказане визначення включені протигормональні засоби, які діють, регулюючи, зменшуючи, блокуючи або інгібуючи ефекти гормонів, які можуть стимулювати ріст злоякісної пухлини, і часто їх використовують у формі системного лікування або лікування на рівні цілого організму. Вони самі можуть бути гормонами. Приклади включають антиестрогени і вибірні модулятори рецепторів естрогену (SERM), включаючи, наприклад, тамоксифен (включаючи тамоксифен NOLVADEX®), ралоксифен EVISTA®, дролоксифен, 4-гідрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, LY117018, онапристон і тореміфен FARESTON®; антипрогестерони; знижувальні регулятори рецептора естрогену (ERD); засоби, які функціонують, пригнічуючи або припиняючи роботу яєчників, наприклад, агоністи рилізинг-гормону лютеїнізуючого гормону (LHRH), такі як ацетат лейпроліду (LUPRON® і ELIGARD®), ацетат гозереліну, ацетат бузереліну і триптерелін; інші антиандрогени, такі як флутамід, нілутамід і бікалутамід; і інгібітори ароматази, які інгібують фермент ароматазу, яка регулює продукцію естрогену в надниркових залозах, такі як, наприклад, 4(5)-імідазоли, аміноглутетимід, ацетат мегестролу (MEGASE®), ексеместан (AROMASIN®), форместан, фадрозол, ворозол (RIVISOR®), летрозол (FEMARA®) і анастрозол (ARIMIDEX®). Крім того, таке визначення хіміотерапевтичних засобів включає бісфосфонати, такі як клодронат (наприклад, BONEFOS® або OSTAC®), етидронат (DIDROCAL®), NE-58095, золедронову кислоту/золедронат (ZOMETA®), алендронат (FOSAMAX®), памідронат (AREDIA®), тилудронат (SKELID®) або ризедронат (ACTONEL®); а також троксацитабін (1,3-діоксолановий нуклеозидний аналог цитозину); антисмислові олігонуклеотиди, зокрема олігонуклеотиди, які інгібують експресію генів в шляхах передачі сигналів, залучених в аномальну проліферацію клітин, таких як, наприклад, PKC-альфа, Raf, HRas і рецептор епідермального фактора росту (EGF-R); вакцини, такі як вакцина THERATOPE® і вакцини для генної терапії, наприклад, вакцина ALLOVECTIN®, вакцина LEUVECTIN® і вакцина VAXID®; інгібітор топоізомерази 1 LURTOTECAN®; rmRH ABARELIX®; дитозилат лапатинібу (низькомолекулярний подвійний інгібітор тирозинкіназ ErbB-2 і EGFR, також відомий як GW572016); і фармацевтично прийнятні солі, кислоти або похідні будь-кого з вказаних вище засобів. 28