Застосування антитіла проти білка, спорідненого з паратиреоїдним гормоном (pthrp), або його функціонально активного фрагмента і/або його модифікованого фрагмента для виробництва лікарського засобу для профілакт

Даний винахід відноситься до терапевтичного агента для лікування кахексії, що містить в якості активного інгредієнта речовину, здатну інгібувати зв'язування між білком, спорідненим паращитовидному гормону людини, (РТНrР) і його рецептором. Кахексія, що виявляється у суб'єктів з кінцевою стадією рака, є одним з типових паранеопластичних синдромів розвитку злоякісного захворювання і характеризується такими системними порушеннями, як анорексія, втрата у вазі, анемія, електролітний дисбаланс і порушення імунної функції. Розвиток кахексії у ракових хворих веде до появи летальних і термінальних симптомів, погіршує якість життя (QOL) і чинить сильний психологічний, фізичний і соціальний вплив на хворих, їх сім'ю і оточуючих людей. Дослідження останніх років дозволили встановити, що кахектин, який, як вважають, є причиною виникнення ракової кахексії, ідентичний фактору некрозу пухлин (TNF). Крім того, виявлено, що цитокіни (наприклад, інтерлейкін (IL)-1, IL-6, LIF, IFN) чинять таку ж дію, що і кахектин, і таким чином причиною виникнення кахексії є комплексна дія декількох факторів. Відомо, що лінія кліток ОСС-1, виділена з карциноми ротової порожнини людини, продукує різні типи рідких факторів, що викликають ракову кахексію. У "голої" миші, якій імплантовані клітки ОСС-1, розвиваються різні синдроми, включаючи кахексію [Kajimura N. et al., Cancer Chemother. Pharmacol., 1996, 38 Suppl., pS48-52; Tanaka R. et al., Jpn. J. Clin. Oncology Apr. 1996, 26 (2), p.88-94]. Вважається, що лінія кліток ОСС-1, імплантована "голій" миші, в процесі зростання продукує різні цитокіни (наприклад, G-CSF, IL6, LIF, IL-11, PTHrP), і ці фактори чинять комплексну дію на голу мишу, викликаючи такі симптоми. Симптоми, виявлені у "голої" миші, якій імплантована лінія кліток ОСС-1, вельми схожі з симптомами, що виявляються у пацієнтів в кінцевій стадії рака. Однак досі не описувалися лікувальні препарати або засоби проти кахексії. Метою даного винаходу є створення терапевтичного агента проти кахексії, що містить в якості активного інгредієнта речовину, здатну інгібувати зв'язування між білком, спорідненим паращитовидному гормону людини, (PTHrP) і його рецептором. Автори даного винаходу провели всебічні і глибокі дослідження з метою відкриття такого терапевтичного агента. В результаті вони виявили речовину, яка дозволяє інгібувати зв'язування між PTHrP і його рецептором, тобто змогли досягнути поставленої мети. Ці дослідження привели до результатів, описаних в даній заявці. Даний винахід відноситься до терапевтичного агента проти кахексії, що містить в якості активного інгредієнта речовину, здатну інгібувати зв'язування між PTHrP і його рецептором. У даному винаході термін "кахексія" означає загальне виснаження, викликане раком. Даний винахід відноситься до терапевтичного агента проти кахексії, що містить в якості активного інгредієнта речовину, здатну інгібувати зв'язування між білком, спорідненим паращитовидному гормону людини, (далі визначається як "PTHrP") і його рецептором (далі визначається як "рецептор PTHrP"). У значенні, що використовується тут, термін "рецептор PTHrP" означає будь-який рецептор, який зв'язується з PTHrP (наприклад описуваний в публікації відкритої заявки, що розглядається на національному рівні на патент Японії №6-506598), незалежно від того, присутній або відсутній рецептор PTHrP в органі-мішені (наприклад, в кістках, нирках). У значенні, що використовується тут, термін "речовина, здатна інгібувати зв'язування між PTHrP і його рецептором (рецептором PTHrP)" означає будь-яку речовину, яка може зв'язуватися з PTHrP, перешкоджаючи зв'язуванню PTHrP з рецептором PTHrP, наприклад, антитіло проти PTHrP; будь-яка речовина, яка може зв'язуватися з рецептором PTHrP, перешкоджаючи зв'язуванню рецептора PTHrP з PTHrP, наприклад, антагоніст рецептора PTHrP (антагоніст PTHrP), зокрема пептид із заміною або делецією принаймні одного амінокислотного залишку в пептиді PTHrP або частковій послідовності пептиду PTHrP; або їх комбінацію. Антитіло проти PTHrP включає антитіла будь-яких відомих типів, зокрема олюднене антитіло, антитіло людини (WO 96/33735) або химерне антитіло (відкрита заявка на патент Японії №4-228089) і антитіло, що використовується як приклад в даному винаході (антитіло №23-57-137-1). Таке антитіло може відноситися до поліклонального або моноклонального типу, але переважним є антитіло моноклонального типу. Антагоніст PTHrP включає поліпептид або низькомолекулярну речовину. Антагоністом PTHrP є речовина, яка зв'язується з рецептором PTHrP, викликаючи антагонізм до PTHrP, наприклад, поліпептид, що володіє антагоністичною активністю проти PTHrP, який описується у відкритій заявці на патент Японії №7-165790; Peptides (UNITED STATES), 1995, 16(6) 1031-1037; Biochemistry (UNITED STATES), Apr. 281992, 31(16) 4026-4033; і у відкритій заявці, що розглядається на національному рівні на патент Японії №5-509098. Ці поліпептиди можуть мати делецію, заміну, аддитивий сегмент або вставку принаймні одного амінокислотного залишку, якщо вони виявляють еквівалентну антагоністичну активність проти PTHrP, і всі вищезгадані модифікації також входять в обсяг антагоністів PTHrP за даним винаходом. Нижче приведений докладний опис даного винаходу з використанням типового антитіла проти PTHrP в якості "речовини, здатної інгібувати зв·'язування між PTHrP і рецептором PTHrP ". 1. Антитіло проти PTHrP Антитіло проти PTHrP, що використовується в даному винаході, може бути будь-яким антитілом, якщо воно надає лікувальну дію проти кахексії незалежно від джерела його походження, типу (моноклонального або поліклонального) і конфігурації. Антитіло проти PTHrP, що використовується в даному винаході, може бути отримане будь-яким відомим способом у вигляді поліклонального або моноклонального антитіла. Антитіло проти PTHrP переважно є моноклональним антитілом, виділеним у ссавця. Моноклональне антитіло ссавця включає антитіла, отримані з гібридоми, і антитіла, отримані за допомогою методик генної інженерії з хазяїна, трансформованого рекомбінатним експресуючим вектором, що несе ген для цього антитіла. Антитіло, що використовується в даному винаході, є антитілом, яке може зв'язуватися з PTHrP, перешкоджаючи зв'язуванню PTHrP з рецептором ΡΤΗ/PTHrP, внаслідок чого блокується трансдукція сигналу PTHrP і як наслідок цього придушується біологічна активність PTHrP. Типовим прикладом такого антитіла є антитіло №23-57-137-1, яке можна продукувати за допомогою гібридомного клону №23-57-137-1. Гібридомний клон №23-57-137-1 отримав назву "гібридома типу "миша-миша" №23-57-137-1" і депонований відповідно до положень Будапештського Договору від 15 серпня 1996р, в колекції Національного інституту біонауки і людської технології, агентство промислової науки і технології, Японія (13, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japan) під номером доступу FER M BP-5631. 2. Анти тілопродукуюча гібридома Гібридому, продукуючу моноклональне антитіло, можна отримати будь-яким відомим способом. Тобто PTHrP використовують в якості антигена для імунізації відповідно до відомого способу імунізації. Отримані імуноцити піддають злиттю з відомими батьківськими клітками за допомогою відомого способу злиття кліток, після чого клітки, продукуючі моноклональні антитіла, відділяють від злитих кліток відомим способом скринінгу. Зокрема, клітки, продукуючі моноклональні антитіла, можна отримати таким чином. Спочатку отримують PTHrP людини, яку використовують в якості сенсибілізуючого антигена для продукування антитіла, для чого ген PTHrP і амінокислотну послідовність експресують у відповідності зі способом, описаним Suva, L. J. et al., Science (1987) 237, 893. Тобто нуклеотидну послідовність, що кодує PTHrP, вводять в будь-який відомий експресуючий вектор і прийнятну клітку-хазяїна трансформують цим експресуючим вектором. Білок PTHrP виділяють і очищають будь-яким відомим способом з трансформованої клітки-хазяїна або культурального супернатанту трансформованої клітки-хазяїна. Потім очищений білок PTHrP використовують в якості сенсибілізуючого антигена. Альтернативно в якості сенсибілізуючого антигена можна використати пептид N-кінцевої області, що складається з 34 амінокислот PTHrP, який можна синтезувати хімічним шляхом. Ссавець, призначений для імунізації сенсибілізуючим антигеном, може відноситися до будь-якого виду. Однак ссавця переважно вибирають з урахуванням сумісності батьківської клітки, що використовується для злиття кліток. Як правило, можна використати гризуна (наприклад, мишу, пацюка, хом'ячка, кролика) або мавпу. Імунізацію ссавця сенсибілізуючим антигеном можна виконувати у відповідності з будь-яким відомим способом, наприклад, шляхом введення сенсибілізуючого антигена ссавцю у вигляді внутришньочеревинної або підшкірної ін'єкції. Зокрема сенсибілізуючий антиген розводять і суспензують у фізіологічному розчині з фосфатним буфером (PBS) або в звичайному фізіологічному розчині, після чого отриману суспензію змішують з необхідною кількістю ад'юванту (наприклад, повного ад'юванту Фрейнда) для отримання емульсії. Емульсію ін'єкують ссавцю декілька разів з інтервалами в 4-21 день. Призначений для імунізації сенсибілізуючий антиген може бути приєднаний до прийнятного носія. Після імунізації контролюють рівень сироваткових антитіл. Після підтвердження того, що кількість сироваткових антитіл досягла необхідного рівня, у ссавця виділяють імуноцити і піддають їх злиттю з клітками. Переважним імуноцитом є клітка селезінки. Батьківська клітка, що використовується для злиття кліток (тобто клітка, що піддається злиттю з імуноцитом), є мієломною кліткою, отриманою у ссавця. Мієломна клітка може відноситися до будь-якої відомої лінії кліток, наприклад, Р3 (P3x63Ag8.653) (J. Immol. (1979) 123, 1548-1550), P3x63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7), NS-1 (Kohler, G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511-519), MPC-11 (Margulies, D. n. et al. Cell (1976) 8, 405-415), SP2/0 (Shulman, M. et al., Nature (1978) 276, 269-270), FO (de St. Groth, S. F. et al., J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21), S194 (Trowbridge, I. S., J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323) або R210 (Galfre, G. et al., Nature (1979) 277, 131-133). Клітинне злиття імуноциту з мієломною кліткою, як правило, здійснюють відповідно до будь-якого відомого способу, наприклад, можна переважно використати спосіб, описаний Milstein et al. (Kohler, G. and Milstein, C, Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46). Зокрема злиття кліток здійснюють в звичайному поживному культуральному середовищі в присутності промотору злиття кліток. Промотором злиття кліток може бути поліетиленгліколь (PEG) або вірус Сендай (гемагглютинуючий вірус з Японії, HVJ) . При бажанні з метою підвищення ефективності злиття можна також використати таку добавку, як диметилсульфоксид. Співвідношення між імуноцитами і мієломними клітками, що використовуються для клітинного злиття, може бути будь-яким. Наприклад, кількість імуноцитів може в 1-10 раз перевищувати кількість мієломних кліток. В якості культурального середовища для злиття кліток, можна використати, наприклад, середовище RPMI 1640 або MEM, придатне для зростання лінії мієломних кліток, або інше середовище, що звичайно застосовується для культивування таких кліток. При бажанні в культуральне середовище можна додати сироватку, наприклад, плідну телячу сироватку (FCS). Для здійснення злиття кліток імуноцити добре змішують з мієломними клітками в заздалегідь визначених кількостях в культуральному середовищі, додають розчин PEG (наприклад, з середньою молекулярною масою біля 1000-6000) (який заздалегідь був нагрітий приблизно до 37°С) звичайно в концентрації 30-60% (у відношенні ваги до об'єму) і отриманий розчин ретельно перемішують з утворенням злитих кліток (гібридом). Потім в культуральний розчин вводять відповідне культуральне середовище і центрифугують для видалення супернатанту. Цю процедуру повторюють декілька разів, щоб видалити промотор злиття кліток або подібну речовину, присутність якої небажана під час вирощування гібридом в культуральному середовищі. Отримані гібридоми можна виділити, проводячи культивування в звичайному селективному середовищі, такому як гіпоксантин-аміноптерин-тимідинове (HAT) середовище. Гібридоми культивують в НАТ-середовищі протягом періоду часу, достатнього для загибелі всіх кліток, крім цільових гібридом (тобто всіх незлитих кліток), який звичайно складає від декількох днів до декількох тижнів. Потім за допомогою відомого способу обмеженого розведення проводять скринінг і моноклонування гібридом, які секретують необхідне антитіло. Альтернативно антитіло людини, що володіє зв'язуючою активністю проти PTHrP, можна отримати шляхом сенсибілізації лімфоциту людини за допомогою PTHrP in vitro, після чого сенсибілізований лімфоцит піддають злиттю з виділеною у людини мієломною кліткою, здатною до нескінченного росту (публікація патенту Японії №1-59878). Альтернативно антитіло людини проти PTHrP можна отримати шляхом ін'єкування PTHrP в якості антигена трансгенній тварині, що має повний спектр генів антитіла людини, для отримання клітки, продукуючої антитіло проти PTHrP, та іморталізації цих кліток, внаслідок чого антитіло людини може бути отримане з іморталізованої клітки (публікація міжнародних патентів №№ WО 94/25585, WО 93/12227, WО 92/03918 і WO 94/02602). Отриману вище гібридому, продукуючу моноклональне антитіло, можна субкультивувати в звичайному культуральному середовищі і зберігати під шаром рідкого азоту протягом тривалого періоду часу. Для отримання моноклонального антитіла з гібридоми можна використати спосіб, який включає культивування гібридоми відомим способом і збір моноклонального антитіла з культурального супернатанту, або спосіб, який включає ін'єковані гібридоми ссавцю, сумісному з даною гібридомою, для вирощування гібридоми в тілі ссавця і збір гібридоми з асцитів цього ссавця. Перший спосіб придатний для продукування антитіла з високою мірою чистоти, в той час як другий спосіб придатний для продукування антитіла у великій кількості. 3. Рекомбінантне антитіло При здійсненні даного винаходу можна також використати моноклональне антитіло рекомбінантного типу, яке можна отримати шляхом клонування гена антитіла з гібридоми, інтеграції гена антитіла в прийнятний вектор, введення цього вектора в хазяїна і отримання антитіла з хазяїна відповідно до звичайної технології генетичної рекомбінації (див., наприклад, Vandamme, А. М. et al., Eur. J. Biochem. (1990) 192, 767-775). Зокрема мРНК, що кодує варіабельну (V) область антитіла проти PTHrP, виділяють з гібридоми, продукуючої антитіло проти PTHrP. Щоб виділити мРНК, спочатку отримують повну РНК будь-яким відомим способом, наприклад, ультрацентрифугуванням гуанідину (Chirgwin, J. Μ. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299) і способом AGPC (Chomczynski, P. Et al., Anal. Biochem. (1987)162, 156-159), після чого з повної РНК отримують необхідну мРНК, використовуючи набір для очищення мРНК (Pharmacia), або подібним способом. Альтернативно, мРНК можна відразу ж отримати за допомогою набору для очищення мРНК QuickPrep (Pharmacia). Потім з мРНК за допомогою зворотної транскриптази синтезують кДНК для V-області антитіла. кДНК синтезують, використовуючи набір для синтезу одноланцюжкової кДНК за допомогою зворотної транскриптази AMV (Seikagaku Corporation) або подібний набір. Крім того, кДНК можна синтезувати або ампліфікувати за способом 5'-RACE (Frohman, Μ.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 8998-9002; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932), використовуючи набір для ампліфікації 5'-кінця FINDER RACE (Clontech) в поєднанні з полімеразною реакцією синтезу ланцюга або подібний набір. Цікавлячий фрагмент ДНК виділяють, очищають від продукту полімеразної реакції синтезу ланцюга (PCR) і лігують у вектор ДНК для отримання рекомбінантного вектора. Цей рекомбінантний вектор вводять в хазяїна, такого як Е. соІі, і відбирають колонію, що містить необхідний рекомбінантний вектор. Нуклеотидну послідовність цікавлячої ДНК в рекомбінантному векторі підтверджують, наприклад, способом термінації дидезоксинуклеотидного ланцюга. Отриману ДНК, що кодує V-область антитіла проти PTHrP, вводять в експресуючий вектор, що містить ДНК, який кодує константну (С) область антитіла. Щоб отримати антитіло проти PTHrP, що використовується в даному винаході, ген антитіла інтегрують в експресуючий вектор так, щоб ген антитіла можна було експресувати під контролем контролюючих експресію областей (наприклад, енхансер, промотор). Клітку-хазяїна трансформують експресуючим вектором для експресії антитіла. Під час експресії гена антитіла, ДНК, що кодує важкий (Н) ланцюг, і ДНК, що кодує легкий (L) ланцюг антитіла, можна інтегрувати в окремі експресуючі вектори, і тоді клітку-хазяїна котрансформують отриманими рекомбінантними експресуючими векторами. Альтернативно, як ДНК, що кодує Н-ланцюг, так і ДНК, що кодує L-ланцюг антитіла можна разом інтегрувати в одиничний експресуючий вектор і трансформувати клітку-хазяїна отриманим рекомбінантним експресуючим вектором (WO 94,11523). Для отримання рекомбінантного антитіла окрім вищезгаданих кліток-хазяїв в якості хазяїна можна також використати трансгенну тварину. Наприклад, ген антитіла вводять в заздалегідь визначений сайт гена, що кодує білок, який утворюється в молоці тварини (наприклад, b-казеїн козячого молока), для отримання злитого гена. Фрагмент ДНК, що містить злитий ген, введений в ген антитіла, ін'єкують в ембріон кози і вводять цей ембріон козі. Коза, якій був введений вказаний ембріон, виношує трансгенну козу. Цікавляче антитіло секретується в молоці трансгенної кози або її потомства. Щоб збільшити кількість молока, що містить необхідне антитіло, трансгенній козі можна ввести відповідний гормон (Ebert, Κ. Μ. et al., Bio/Technoiogy (1994) 12, 699-702). 4. Моди фіковане антитіло Для зменшення гетерогенного впливу на організм людини або інших ссавців при здійсненні даного винаходу можна використати штучно модифіковане рекомбінантне антитіло, включаючи химерне і олюднене антитіла. Ці модифіковані антитіла можна отримати будь-яким відомим способом. Химерне антитіло, придатне для використання в даному винаході, можна отримати шляхом літування отриманої вище ДНК, що кодує V-область антитіла, з ДНК, що кодує С-область антитіла людини, інтеграції продукту літування в експресуючий вектор і введення отриманого рекомбінантного експресуючого вектора в хазяїна для продукування химерного антитіла. Олюднене антитіло визначається також як "реконструйоване антитіло людини", в якому гіперваріабельні дільниці (CDR) антитіла ссавця, що не є людиною, (наприклад, мавпи) прищеплюють до аналогічних дільниць антитіла людини. Загальна процедура генетичної рекомбінації, що використовується для отримання такого олюдненого антитіла, також відома (патенти ЕР №125023; WO 96/02576). Зокрема, з цією метою конструюють послідовність ДНК, в якій гіперваріабельні дільниці антитіла миші лігують за допомогою каркасних областей (FR) і синтезують за способом PCR, використовуючи як затравки декілька олігонуклеотидів, в яких є області, що перекривають кінцеві області гіперваріабельних дільниць і каркасних областей. Отриману ДНК лігують з ДНК, що кодує С-область антитіла людини, і продукт літування інтегрують в експресуючий вектор. Отриманий рекомбінантний експресуючий вектор вводять в хазяїна, отримуючи таким чином олюднене антитіло (патенти ЕР 239044, WO 96/02576). Каркасні області, ліговані за допомогою гіперваріабельних дільниць, вибирають так, щоб гіперваріабельні дільниці могли утворювати прийнятний сайт зв'язування антигена. При необхідності одну або декілька амінокислот в каркасних областях V-області антитіла можна замінити так, щоб гіперваріабельні дільниці реконструйованого антитіла людини могли утворювати необхідний сайт зв'язування антитіла (Sato, К. et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856). С-область химерного або олюдненого антитіла може бути будь-якою С-областю антитіла людини, такою як Сg1, Сg2, Сg3 або Сg4 для Η-ланцюга і Сk або Сl, для L-ланцюга. С-область антитіла людини можна модифікувати з метою підвищення стабільності антитіла або забезпечення стабільного продукування цього антитіла. Химерне антитіло складається з V-областей, виділених з антитіла ссавця, що не є людиною, і Собластей, виділених з антитіла людини. Олюднене антитіло складається з гіперваріабельних дільниць , виділених з антитіла ссавця, що не є людиною, і каркасних областей і С-областей, виділених з антитіла людини. Олюднене антитіло особливо придатне для використання в якості активного інгредієнта лікувального засобу за даним винаходом завдяки більш слабкій антигенності цього антитіла до організму людини. Типовим прикладом олюдненого антитіла, що використовується в даному винаході, є олюднене антитіло №23-57-137-1, в якому гіперваріабельні дільниці виділені з антитіла миші №23-57-137-1; L-ланцюг складається з гіперваріабельних дільниць, лігованих за допомогою трьох каркасних областей (FR1, FR2 і FR3), виділених з антитіла людини HSU 03868 (GEN-BANK, Deftos, Μ. et. al., Scand. J. Immunol. 39, 95-103, 1994), і каркасної області (FR4), виділеної з антитіла людини S25755 (NBRF-PDB) ; і Н-ланцюг складається з гіперваріабельних дільниць, лігованих за допомогою каркасних областей, виділених з антитіла людини S31679 (NBRF-PDB, Cuisinier, А. М. et al., Eur. J. Iminunol. 23, 110-118, 1993), в якій частина амінокислотних залишків в каркасних областях замінена таким чином, щоб реконструйоване олюднене антитіло могло виявляти антигензв'язуючу активність. Штами Е. соІі, що містять плазміди з ДНК, кодуючої відповідно Η-ланцюг і L-ланцюг олюдненого антитіла №23-57-137-1, були відповідно названі Escherichia coli JM109 (hMBC1LkДHK/pUC19) (для Ηланцюга) і Escherichia coli JM109 (hΜΒClLql/pUC19) (для L-ланцюга). Ці штами депоновані відповідно до положень Будапештського договору від 15 серпня 1996p. в колекції Національного інституту біонауки і людської технології, агентство промислової науки і технології, Японія (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japan) під номером доступу FER M ВР-5629 для Escherichia coli JM109 (hMBC1LkДHK/pUC19) і під номером доступу FERM BP-5630 для Escherichia coli JM109 (hMBClLql/pUC19). 5. Варіанти антитіл Антитіло, що використовується в даному винаході, може являти собою будь-який його фрагмент або модифікований продукт цього фрагмента, якщо воно здатне зв'язуватися з PTHrPі придушува ти активність PTHrP. Наприклад, таким фрагментом антитіла може бути. Fab, Р(аb')2, Fv або .одиночний ланцюг Fv (scFv), що включає Fv-фрагмент Н-ланцюга або Fv-фрагмент L-ланцюга, пов'язаний один з одним прийнятним лінкером. Зокрема, такі фрагменти антитіла можна отримати шляхом розщеплення антитіла ферментом (наприклад, папаїном, пепсіном) на фрагменти антитіла або конструювання гена, що кодує фрагмент антитіла, вставки цього гена в експресуючий вектор і введення отриманого рекомбінантного експресуючого вектора в прийнятну клітку-хазяїна, забезпечуючи таким чином експресію фрагмента антитіла (див., наприклад. Co, Μ. S. et al., J. Immnunol. : (1994), 152, 2968-2976; Better, M. & Horwitz, A. H., Methods in Enzymoiogy (1989), 178, 476-496, Academic Press, Inc., Plueckthun, A. & Skerra, Α., Methods in Enzymoiogy (1989) 178, 476-496, Academic Press, Inc.; Lamoyi, E., Methods in Enzymoiogy (1989) 121, 652-663; Rousseaux, J. et al., Methods in Enzymoiogy (1989) 121, 663-669; і Bird, R. E. Et al., TIBTECH (1991) 9, 132-137). scFv можна отримати, лігуючи V-область Η-ланцюга з V-областю L-ланцюга за допомогою лінкера, переважно пептидного лінкера (Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 85, 5879-5883) . Vобласть Η-ланцюга і V-область L-ланцюга в scFv можна виділити з будь-якого описаного тут антитіла. Пептидний лінкер, який зв'язує V-області, може бути будь-яким пептидом з одиночним ланцюгом, наприклад, маючим 12-19 амінокислотних залишків. ДНК, що кодує scFv, можна отримати шляхом роздільної ампліфікації ДНК, що кодує V-область Ηланцюга, і ДНК, що кодує V-область L-ланцюга антитіла з використанням в якості матриці фрагмента ДНК, що кодує всю область Η-ланцюга або його частину, яка включає V-область, і фрагмента ДНК, що кодує всю область L-ланцюга або його частину, яка включає V-область, і пари затравок, що визначають кінцеві області фрагментів ДНК; і подальшої ампліфікації ДНК, що кодує пептидний лінкер, з використанням в якості матриці фрагмента ДНК, що кодує пептидний лінкер, і пари затравок, що визначає кінцеві області фрагмента ДНК, так, щоб кожна кінцева область пептидного лінкера була лігована відповідно з V-областю Η-ланцюга і V-областю L-ланцюга. Отримавши ДНК, що кодує scFv, можна відомими способами отримати експресуючий вектор, що несе цю ДНК, і хазяїна, трансформованого цим експресуючим вектором. scFv можна отримати з трансформованого хазяїна будь-яким відомим способом. Фрагменти антитіла, що використовуються в даному винаході, можна отримати шляхом отримання генів для вказаних фрагментів і експресування цих генів в прийнятних хазяїнах, як це описувалося вище. Ці фрагменти антитіла також входять у визначення "антитіла" за даним винаходом. В якості модифікованої форми вищезгаданих антитіл можна використати, наприклад, антитіло проти PTHrP, кон'юговане з будь-якою молекулою (наприклад, з поліетиленгліколем). Такі модифіковані антитіла також охоплюються поняттям «антитіло» в даному винаході. Модифіковані антитіла можна отримати шляхом хімічних модифікацій антитіл. Методи хімічної модифікації, придатні для досягнення вказаної мети, відомі в цій області. 6. Експресія і продукування рекомбінантного антитіла або модифікованого антитіла Ген антитіла, сконструйований, як описувалося вище, можна продукувати і експресувати відомими способами. Для експресії в клітці ссавця активно зв'язують придатний промотор, експрессуємий ген антитіла і полі(А) сигнал (розташований нижче 3'-кінця гена антитіла). Наприклад, в якості системи придатний промотор/енхансер можна використати систему швидкодіючий промотор цитомегаловіруса людини/енхансер. Крім того, для експресії антитіла за даним винаходом можна використати інші системи промотор/енхансер, зокрема виділені з вірусів (наприклад, ретровірус, вірус поліоми, аденовірус і вірус мавп 40 (SV40)) та з кліток ссавців (наприклад, фактор елонгації людини 1a (HEF1a)). При використанні системи промотор SV40, енхансер генів можна, легко експресувати за способом Mulligan et al. (Nature (1979) 277, 108). При використанні системи промотор HEF1a/енхансер ген можна легко експресувати за способом Mizushima et al. (Nucleic Acids Res. (1990) IS, 5322). Для експресії в Ε. coli можна активно зв'язувати відповідний для використання промотор, сигнальну послідовність для секреції цікавлячого антитіла і ген антитіла. У якості промотору можна використати промотор lacZ або аrаВ. При використанні промотору lacZ ген можна експресувати за способом Ward et. al. (Nature (1098) 341, 544-546; FASBE J. (1992) 6, 2422-2427), а при використанні промотору аrаВ ген можна експресувати за способом Better et. al. (Better et. al., Science (1988) 240, 1041-1043). Що стосується сигнальної послідовності для секреції антитіла, то в тому випадку, коли цікавляче антитіло повинно бути секретованим в периплазматичному просторі Е. coli, можна використати сигнальну послідовність pe1B (Lei, S. P. et al., J. Bacteriol. (1987) 169, 4379). Антитіло, секретоване в периплазматичному просторі, виділяють і знову укладають так, щоб антитіло придбало необхідну конфігурацію. Можна використати реплікатор, виділений з вірусів (наприклад, SV40, вірус поліоми, аденовірус, вірус папіломи великої рогатої худоби (BPV)), або тому подібний. Щоб збільшити кількість копій гена в системі кліток-хазяїв, експресуючий вектор може далі містити ген селективного маркера, такий як ген аміноглікозидфосфо трансферази (ΑΡΗ), ген тимідинкінази (ТК), ген ксантингуанідин-фосфорибозилтрансферази (Ecogpt) Ε. coli і ген дигідрофолат-редуктази (dhfr). Для продукування антитіла за даним винаходом можна використати будь-яку експресуючу систему, включаючи системи еукаріотичних і прокаріотичних кліток. Еукаріотичні клітки включають відомі лінії кліток тваринних наприклад, ссавців, комах, плісняви, грибів і дріжджів). Прокаріотичні клітки включають бактеріальні клітки, такі як клітки Е. соlі. Антитіло, що використовується в даному винаході, бажано експресувати в клітці ссавця, такій як яєчник китайського хом'ячка (СНО), COS, мієлома, ВНК, кліткаVero і HeLa. Потім трансформовану клітку-хазяїна культивують in vitro або in vivo для продукування цікавлячого антитіла. Клітку-хазяїна можна культивува ти будь-яким відомим способом. В якості культурального середовища можна використати середовище DMEM, MEM, RPMI 1640 або IMD M. Культуральне середовище може містити додаткову сироватку, таку як плідна теляча сироватка (FCS). 7. Виділення і очищення антитіла Антитіло, експресоване і продуковане, як описувалося вище, можна виділити з кліток або з організму тварини-хазяїна і очистити до однорідного стану. Антитіло, що використовується в даному винаході, можна виділити і очистити на колонці для афінного очищення. Прикладами колонки з білком А є Hyper D, POROS і Sepharose F.F. (Pharmacia). Крім того, можна використати інші способи, що звичайно застосовуються для виділення і очищення антитіла; таким чином, не існує яких-небудь обмежень відносно способу, що використовується. Наприклад, для виділення і очищення необхідного антитіла можна окремо або в поєднанні використати різні хроматографи з колонками, включаючи вищезгадану колонку для афінного очищення, фільтрацію, ультрафільтрацію, висолювання і діаліз (Antibodies A Laboratory Manual. Ed. Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). 8. Визначення активності антитіла Антигензв'язуючу активність (Antibodies A Laboratory Manual. Ed. Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) або інгібуючу активність антитіла за даним, винаходом проти рецептора ліганду (Harada, A. et al., International Immunology (1993) 5, 681-690) можна визначити будь-якими відомими способами. Як спосіб для визначення антигензв'язуючої активності антитіла проти PTHrP за даним винаходом можна використати такі способи, як ELISA (твердофазний імуноферментний аналіз), ЕІА (імуноферментний аналіз), RIA (радиоімуноаналіз) або флуоресцентний аналіз антитіл. Наприклад, при виконанні імуноферментного аналізу розчин, що містить антитіло проти PTHrP (наприклад, культуральний супернатант кліток, продукуючи х антитіло проти PTHrP, або саме антитіло проти PTHrP в очищеному вигляді), вміщують в чашку, стінки якої заздалегідь покривають PTHrP (1-34). У ту ж чашку вводять друге антитіло, мічене ферментом (наприклад, лужною фосфатазою). Чашку інкубують і промивають. У чашку додають субстрат для ферменту (наприклад, п-нітрофенілфосфорну кислоту) і вимірюють оптичну щільність розчину в чашці для визначення антигензв'язуючої активності антитіла. Для підтвердження активності антитіла, що використовується в даному винаході, визначають нейтралізуючу активність антитіла (наприклад, антитіла проти PTHrP). 9. Способи введення і фармацевтичні препарати Терапевтичний агент за даним винаходом можна використати . для лікування або придушення кахексії. Підлягаюча лікуванню або придушенню кахексія за даним винаходом може відноситися до будь-якого типу, включаючи ракову кахексію. Приклади ракової кахексії описані в журналах [J. Urol. (UNITED STATES) Mar 1995, 153 (3 Pt 1) p.854-857; Langenbecks Arch. Chir. Suppl II Verb Dtsch Ges Chir (GERMANY) 1990, p.261265; Oncology (SWITZERL AND) 1990, 47 (1) p.87-91; Int. J. Pancreatol.(UNITED STATES) Aug-Nov 1990, 7 (13) p.141-150; J. Natl. Cancer Inst. (UNITED STATES) Dec 19, 1990, 82 (24) p.1922-1926]. Приклади інших типів кахексії, що не є раковою кахексією, описані в журналах [JPEN J. Parenter. Enteral Nutr. (UNITED STATES) Nov-Dec 1990, 14 (6) p.605-609; Chest (UNITED STATES) Nov 1990, 98 (5) p.10911094; Bone Marrow Transplant. (ENGLAND) Jul 1990, 6 (1) p. 53-57]. Терапевтичний агент, що містить антитіло проти PTHrP в якості активного інгредієнта за даним винаходом, можна вводити перорально або парентерально, переважно парентерально. Цей терапевтичний агент може являти собою будь-яку лікарську форму, зокрема транслегеневий засіб (наприклад, засіб, що вводиться за допомогою такого пристрою, як інгалятор), носошлунковий засіб, черезшкірний засіб (наприклад, мазь, крем) або ін'єкційний розчин. Приклади ін'єкційних розчинів включають розчин для внутрішньовенних ін'єкцій (наприклад, розчин для капельниці), розчини для внутрішньом'язових, внутрішньочеревинних і підшкірних ін'єкцій, призначені для системного або місцевого застосування. Спосіб введення може бути вибраний в залежності від віку потребуючого суб'єкта і важкості захворювання. Ефективна однократна доза може складати від 0,001 до 1000мг/кг маси тіла. Альтернативно, доза, що вводиться суб'єкту, може знаходитися в межах від 0,01 до 100000мг/кг маси тіла. Однак доза терапевтичного агента, що містить антитіло проти PTHrP за даним винаходом, не обмежується вищезгаданими межами. Цей терапевтичний агент можна вводити суб'єкту на будь-якій стадії, в тому числі до або після розвитку кахексії. Альтернативно, цей терапевтичний агент можна вводити на стадії хвороби, коли можна прогнозувати у пацієнта подальшу втрату у вазі. Терапевтичний агент, що містить антитіло проти PTHrP в якості активного інгредієнта за даним винаходом, можна отримати будь-яким відомим способом (Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton, USA). Лікарський препарат може далі .містити фармацевтично прийнятні носії і добавки. Прикладами таких носіїв і добавок є вода, фармацевтично прийнятні органічні розчинники, колаген, полівініловий спирт, полівінілпіролідон, карбоксивінільний полімер, натрій-карбоксиметил-целюлоза, полі(акрилат натрію), аргінат натрію, водорозчинний декстран, натрій-карбоксиметиловий крохмаль, пектин, метилцелюлоза, етилцелюлоза, ксантанова камедь, аравійська камедь, казеїн, агар, поліетиленгліколь, дигліцерин, гліцерин, пропіленгліколь, вазелін, парафін, стеариновий спирт, стеаринова кислота, сироватковий альбумін людини (HSA), манітол, сорбітол, лактоза і сурфактанти, придатні для використання в якості фармацевтичних добавок. На практиці добавку вибирають з вищезгаданих речовин окремо або в комплексі в залежності від лікарської форми, що використовується, але не обмежуються ними. Наприклад, можна використати ін'єкційний розчин, який отримують, розчиняючи очищене антитіло проти PTHrP в розчиннику (наприклад, звичайний фізіологічний розчин, буфер, розчин глюкози) і додаючи засіб, що запобігає адсорбції, (наприклад, твин-80, твин-20, желатин, сироватковий альбумін людини). Терапевтичний агент за даним винаходом може являти собою відновлювану, висушену виморожуванням речовину, яку розчиняють перед використанням. Для отримання висушеної виморожуванням лікарської форми можна використати такий наповнювач, як цукровий спирт (наприклад, манітол, глюкозу) і цукор. На Фіг.1 дана графічна ілюстрація лікувальної дії антитіла проти PTHrP при кахексії. На Фіг.2 дана графічна ілюстрація лікувальної дії антитіла проти PTHrP при кахексії. На Фіг.3 дана графічна ілюстрація лікувальної дії антитіла проти PTHrP при кахексії. На Фіг.4 дана графічна ілюстрація лікувальної дії антитіла проти PTHrP при кахексії. На Фіг.5 дана графічна ілюстрація результатів вимірювання антигензв'язуючої активності. На Фіг.6 дана графічна ілюстрація результатів вимірювання антигензв'язуючої активності. На Фіг.7 дана графічна ілюстрація результатів вимірювання антигензв'язуючої активності. На Фіг.8 дана графічна ілюстрація результатів вимірювання антигензв'язуючої активності. На Фіг.9 дана графічна ілюстрація результатів вимірювання антигензв'язуючої активності. На Фіг.10 дана графічна ілюстрація результатів вимірювання антигензв'язуючої активності. На Фіг.11 дана графічна ілюстрація результатів вимірювання антигензв'язуючої активності. На Фіг.12 дана графічна ілюстрація результатів вимірювання антигензв'язуючої активності. На Фіг.13 дана графічна ілюстрація нейтралізуючої активності олюдненого антитіла. На Фіг.14 дана графічна ілюстрація нейтралізуючої активності олюдненого антитіла. На Фіг.15 дана графічна ілюстрація нейтралізуючої активності олюдненого антитіла. На Фіг.16 дана графічна ілюстрація лікувальної дії олюдненого антитіла проти кахексії. На Фіг.17 дана графічна ілюстрація лікувальної дії олюдненого антитіла проти кахексії. На Фіг.18 дана графічна ілюстрація лікувальної дії олюдненого антитіла проти кахексії. На Фіг.19 дана графічна ілюстрація лікувальної дії олюдненого антитіла проти кахексії. Далі даний винахід детально описується з посиланням на нижченаведені конкретні і посилальні приклади, які не повинні обмежувати технічний обсяг даного винаходу. [Приклад 1] Фармакологічне випробування з використанням тваринної моделі кахексії Терапевтичний агент проти кахексії моноклонального антитіла миші проти PTHrP досліджували з використанням тваринної моделі кахексії ("гола" миша, якій імплантована пухлина людини). В якості тваринної моделі кахексії використали "голу" мишу, якій була імплантована карцинома ОСС-1 ротової порожнини людини [піддослідні миші були придбані в Центральному інституті експериментальних тварин]. Відомо, що у "голої" миші, якій імплантована карцинома ОСС-1 ротової порожнини людини, підвищується концентрація кальцію в крові по мірі збільшення обсягу пухлини і з'являються симптоми кахексії, такі як втрата у вазі і зменшення рухливості. При виконанні цього випробування придушення моноклональним антитілом миші симптомів кахексії, викликаної карциномою ОСС-1 ротової порожнини людини, оцінювали на основі концентрації кальцію в крові, ваги тіла і впливу на збільшення часу виживання. Карциному ОСС-1 ротової порожнини людини пасирували in vi vo, використовуючи "голи х" мишей BALB/c-nu/nu (Japan CLEA Co., Inc.). Для оцінки фармакологічної дії були придбані 6-тижневі самці "голих" мишей BALB/c-nu/nu (Japan CLEA. Co., Inc.); піддослідних мишей акліматизували протягом 1 тижня, внаслідок чого були отримані 7-тижневі миші, яких використали у випробуванні. Мишей використали для отримання тваринної моделі кахексії і ділили на групи таким чином. Пасировану карциному ОСС-1 ротової порожнини людини видаляли у "голої" миші і акуратно розрізали на 3мм кубічні зрізи. Кожній миші підшкірно імплантували по одному зрізу пухлини в бокову частину тіла. Через десять днів після імплантації, коли було підтверджено, що обсяг пухлини у всіх мишей значно збільшився, мишей розподіляли по групах з урахуванням середніх показників концентрації кальцію в крові, маси тіла і обсягу пухлини і використовували їх як тваринну модель кахексії. Терапевтичний агент при кахексії досліджували таким чином. (1) Спостереження за часом виживання При дослідженні впливу на збільшення часу виживання мишам однієї випробуваної групи двічі на тиждень вводили моноклональне антитіло миші і визначали час виживання мишей. Мишам іншої випробуваної групи одноразово вводили в хвостову вену відомий засіб для придушення гіперкальціємії, памідронат (динатрійпамідронат; Aredia), в дозі 15мг/кг. В якості контрольного випробування мишам контрольної групи двічі на тиждень вводили в хвостову вену фізіологічний розчин з фосфатним буфером (PBS) в дозі 0,2мл/миша. Результати показані на Фіг.1. (2) Спостереження за концентрацією кальцію в'крові Моноклональне антитіло миші проти PTHrP двічі вводили в хвостову вен у мишам, що використовуються в якості тваринної моделі кахексії, з інтервалом в два дні в дозі 10мкг або 100мкг/мишу при кржному введенні. Існуючий засіб для придушення гіперкальціємії, памідронат (динатрійпамідронат, Aredia) вводили однократно в хвостову вен у мишам іншої випробуваної групи в дозі 15мг/кг. В якості контрольного випробування мишам контрольної групи. двічі вводили в хвостову вену фізіологічний розчин з фосфатним буфером (PBS) з інтервалом в два дні в дозі 0,2мл/мишу при кожному введенні. (3) Визначення концентрації кальцію в крові Через один і чотири дні після введення моноклонального антитіла миші у всіх мишей визначали концентрацію кальцію в крові з метою оцінки фармакологічної ефективності антитіла. Концентрацію кальцію в крові визначали на основі концентрації іонізованого кальцію в суцільній крові, для чого у всіх мишей брали кров через очну ямку за допомогою гематокритної трубки і аналізували в автоматичному аналізаторі 64 3 Са/рН (СІВА-CORNING). Всіх мишей щодня зважували протягом чотирьох днів після введення антитіла. Результати показані на Фіг.2 і 3. 4) Визначення об'єму пухлини Об'єм пухлини визначали через чотири дні після введення антитіла, для чого вимірювали найбільшу вісь (а мм) і найменшу вісь (b мм) пухлини і отримані результати вводили в рівняння Таланта [аb2/2]. Результати показані на Фіг.4. Отримані результати ясно показують, що незважаючи на те, що при введенні мишам антитіла в дозі 10мкг концентрація кальцію в крові аналогічна цьому показнику у мишей, яким вводили памідромат, у мишей, яким вводили вводили памідронат, у мишей, яким вводили антитіло в дозі 100мкг, не відбувалося збільшення концентрації кальцію в кров і втрата у вазі була менше в порівнянні з мишами, яким вводили памідронат, і з контрольними мишами. У мишей, яким вводили нейтралізуюче антитіло проти PTHrP в дозі 100мкг двічі на тиждень, спостерігалося значне збільшення часу виживання в порівнянні з мишами, яким вводили памідронат, і з контрольними мишами (р=0,0003: логарифмічний розподіл). Внаслідок цього встановлено, що нейтралізуюче моноклональне антитіло миші проти PTHrP володіє прекрасними властивостями, які відсутні у всіх існуючих засобів для придушення гіперкальціємії, такими як запобігання втраті у вазі і збільшення .часу виживання. Ці результати показують, що антитіло, використане в цьому випробуванні, є ефективним засобом при лікуванні кахексії, зумовленої злоякісною пухлиною. [Приклад 2] Фармакологічне випробування з використанням тваринних моделей гіперкальціємії і кахексії Лікувальну дію при кахексії олюдненого антитіла варіанту «q» проти PTHrP досліджували з використанням тваринної моделі кахексії («гола» миша, якій імплантована пухлина людини). В якості тваринної моделі використали «голу» мишу, якій була імплантована карцинома ОСС-1 ротової порожнини людини [піддослідні миші були придбані в Центральному інституті експериментальних тварин]. Відомо, що у «голої» миші, якій імплантована карцинома ОСС-1 ротової порожнини людини, підвищується концентрація кальцію в крові по мірі збільшення обсягу п ухлини і з'являються симптоми кахексії, такі як втрата у вазі і зменшення рухливості. При виконанні цього випробування придушення олюдненим антитілом варіанту «q» симптомів кахексії, викликаної карценомою ОСС-1 ротової порожнини людини, оцінювали на основі концентрації кальцію в крові, втрати у вазі і впливу на збільшення часу виживання. Субкультуру карциноми ОСС-1 ротової порожнини людини отримували in vivo, використовуючи "голих" мишей BALB/c-nu/nu (Japan CLEA Co., Inc.). Для оцінки фармакологічної дії були придбані 6-тижневі самці "голих" мишей BALB/c-nu/nu (Japan CLEA Co., Inc.); піддослідних мишей акліматизували протягом 1 тижня, внаслідок чого були отримані 7-тижневі миші, яких використали у випробуванні. Мишей використали для отримання тваринної моделі кахексії і ділили на групи таким чином. Пасировану карциному ОСС-1 ротової порожнини людини видаляли у "голої" миші і акуратно розрізали на 3мм кубічні зрізи. Кожній миші підшкірно імплантували по одному зрізу пухлини в бокову частину тіла. Через десять днів після імплантації, коли було підтверджено, що обсяг пухлини у всіх мишей значно збільшився, мишей розподіляли по групах з урахуванням середніх показників концентрації кальцію в крові, маси тіла і обсягу пухлини і використовували їх як тваринну модель кахексії. Лікувальну дію проти кахексії досліджували таким чином. (1) Спостереження за часом виживання При дослідженні впливу на збільшення часу виживання мишам випробуваної групи двічі на тиждень вводили олюднене антитіло варіанту "q" і визначали час виживання миші. Як контрольне випробування мишам контрольної групи двічі на тиждень вводили в хвостову вен у фізіологічний розчин з фосфатним буфером (PBS) в дозі 0,1мл/мишу. Результати показані на Фіг.16. (2) Спостереження за концентрацією кальцію в крові Олюднене антитіло варіанту "q" двічі вводили в хвостову вен у мишам, що використовуються як тваринна модель кахексії, з інтервалом в два дні в дозі 10мкг або 100мкг/мишу при кожному введенні. Як контрольне випробування мишам контрольної групи двічі вводили в хвостову вену фізіологічний розчин з фосфатним буфером (PBS) з інтервалом в два дні в дозі 0,1мл/мишу при кожному введенні. (3) Визначення концентрації кальцію в крові Через один і чотири дні після першого введення олюдненого антитіла варіанту "q" у всіх мишей визначали концентрацію кальцію в крові з метою оцінки фармакологічної ефективності антитіла. Концентрацію кальцію в крові визначали на основі концентрації іонізованого кальцію в суцільній крові, для чого у всі х мишей брали кров через очну ямку за допомогою гематокритної трубки і аналізували в автоматичному аналізаторі 643 Са/рН (CIBA-CORNING). Всіх мишей щодня зважували протягом чотирьох днів після введення антитіла. Результати показані на Фіг.17 і 18. (4) Визначення обсягу пухлини Обсяг пухлини визначали через чотири дні після першого введення антитіла, для чого вимірювали найбільшу вісь (а мм) і найменшу вісь (b мм) пухлини і отримані результати вводили в рівняння Таланта [аb2/2]. Результати показані на Фіг.19. Отримані результати ясно показують, що у мишей, яким . вводили олюднене антитіло варіанту "q" в дозі 10мкг або 100мкг, не відбувалося збільшення концентрації кальцію в крові і втрата у вазі була меншою, ніж у контрольних мишей. У мишей, яким вводили олюднене антитіло варіанту "q" в дозі 100мкг двічі на тиждень, спостерігалося значне збільшення часу виживання в порівнянні з контрольними мишами (р=0,0108:логарифмічний розподіл). Олюднене антитіло варіанту "q" впливає таким же чином на тваринні моделі ракової кахексії, що і досліджене вище моноклональне антитіло миші. Ці результати показують, що антитіло, використане в цьому випробуванні, є корисним лікувальним засобом проти кахексії, зумовленої злоякісною пухлиною. [Посилальний приклад 1] Отримання гібридом, продукуючих моноклональне антитіло миші проти PTHrP (1-34) Гібридоми, здатні продукувати моноклональне антитіло проти PTHrP людини (1-34) (SEQ ID №75), №23-57-154 і №23-57-137-1, отримують у відповідності зі способом, описаним Kanji Sato et al. (Sato, К. et al., J. Bone Miner. Res. 8, 849-860, 1993). В якості імуногена використовують PTHrP (1-34) (Peninsula), з яким за допомогою карбодііміду (Dojinn) кон'югують білок-носій тироглобуліну. Кон'югований з тироглобуліном PTHrP (1-34) діалізують для отримання розчину з концентрацією білка 2мкг/мл. Отриманий . розчин змішують з ад'ювантом Фрейнда (Difco) у відношенні 1:1 для отримання емульсії. Цю емульсію вводять 16 самицям мишей BALB/3 у вигляді дорсально-підшкірних або внутрішньочеревинних ін'єкцій в дозі 100мкг/мишу для кожної ін'єкції з метою імунізації мишей, повторюючи цю процедуру 11 разів. Для початкової імунізації використовують повний ад'ювант Фрейнда і для повторної імунізації використовують неповний ад'ювант Фрейнда. У всіх імунізованих мишей визначають титри антитіл в сироватці таким чином. Для цього у всіх мишей беруть кров з хвостової вени і відділяють антисироватку від крові. Антисироватку розводять буфером для радіоімунного аналізу (RIA) і змішують з PTHrP (1-34), меченим 125І, для визначення зв'язуючої активності. Мишам, у яких підтверджено значне збільшення титру, внутрішньочеревинно ін'єкують PTHrP (1-34) без білка-носія в дозі 50мкг/миша для остаточної імунізації. Через три дні після остаточної імунізації мишей умертвляють і видаляють у них селезінку. Потім проводять злиття кліток селезінки з лінією мієломних кліток миші P3x63Ag8U.l відповідно до будь-якого відомого способу, використовуючи 50% поліетиленгліколь 4000. Отримані таким чином злиті клітки висівають в ямки 96-ямкових планшетів (85 планшетів) в кількості 2´104/ямку. Гібридоми досліджують в HAT-середовищі таким чином. Гібридоми досліджують за допомогою твердофазного радіоімуноаналізу (RIA) на наявність PTHrPвпізнаючих антитіл в к ультуральному супернатанті тієї ямки, де спостерігається зростання кліток в HΑΤсередовищі. Гібридоми збирають з ямки, в якій підтверджена здатність зв'язування з PTHrP-впізнаючими антитілами. Отримані гібридоми суспендують в середовищі RPMI-1640, що містить 15% FCS і ОРІ-добавку (Sigma) з подальшою уніфікацією гібридів за допомогою способу, що обмежує розведення. Таким чином отримують два типи, гібридомних клонів №23-57-154 і №23-57-137-1, кожний з яких володіє сильною здатністю зв'язування з PTHrP (1-34). Гібридомний клон №23-57-137-1, що отримав призначення "гібридома типу "миша-миша" №23-57-1371", депонований відповідно до положень Будапештського договору від 15 серпня 1996p. в колекції Національного інституту біонауки і людської технології, агентство промислової науки і технології, Японія (13, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japan) під номером доступу FER M BP-5631. [Посилальний приклад 2] Клонування ДНК, що кодує V-область моноклонального антитіла миші проти PTHrP людини (1-34) Клонування ДНК, що кодує V-область моноклонального антитіла миші проти PTHrP (1-34) людини №2357-137-1, виконують таким чином. (1) Отримання мРНК мРНК отримують з гібридоми №23-57-137-1, використовуючи набір для очищення мРНК QuickPrep (Pharmacia Biotech). Для цього клітки гібридоми №23-57-137-1 повністю гомогенізують екстракціонним буфером, після чого мРНК виділяють і очищають від буфера на колонці з оліго(тимідин) целюлозним наповнювачем відповідно до інструкцій, прикладених до колонки. мРНК отримують у вигляді осаду, проводячи осадження отриманого розчину етанолом. Осад мРНК розчиняють в буфері для елюювання. (2) Отримання і ампліфікація кДНК для гена, що кодує V-область Η-ланцюга миші (і) Клонування кДНК для V-області Η-ланцюга антитіла №23-57-137-1 Ген, що кодує V-область Η-ланцюга моноклонального антитіла миші проти PTHrP людини, клонують за способом 5'-RACE (Frohman, M.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8 998-9002, 1988; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. 17, 2919-2932, 1989). Спосіб 5'-RACE виконують, використовуючи набір S'-Ampli FINDER RACE (CLONETECH) відповідно до прикладених до нього інструкцій. При здійсненні цього способу використовують затравку для синтезу кДНК, зокрема затравку МНС2 (SEQ ID №1), яка здатна гібридизувати з С-областю Η-ланцюга миші. Отриману вище мРНК (приблизно 2мкг), яка є матрицею для синтезу кДНК, змішують із затравкою МНС2 (10пмоль). Отриману суміш піддають взаємодії із зворотною транскриптазою при температурі 52°С протягом 30 хвилин для здійснення зворотної транскрипції мРНК в кДНК. Отриманий реакційний розчин змішують з 6н NaOH для гідролізу РНК, що залишилася (при температурі 65°С протягом 30 хвилин), після чого його осаджують етанолом для виділення і очищення кДНК у вигляді осаду. Очи щену кДНК лігують з Ampli FINDER Anchor (SEQ ID №42) у 5'-кінця внаслідок взаємодії з РНКлігазою Т4 при температурі 37°С протягом 6 годин і додатково при кімнатній температурі протягом 16 годин. В якості затравки для ампліфікації кДНК за способом PCR використовують затравку Anchor (SEQ ID №2) і затравку MHC-G1 (SEQ ID №3) (S.T. Jones, et al., Biotechnology, 9, 88, 1991). Розчин для полімеразної реакції синтезу ланцюга (на 50мкл) містить 10мМ трис-НСІ (рН 8,3), 50мМ КСl, 0,25мМ dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 1,5мМ MgCl2, 2,5 одиниці TaKaRa Taq (Takara Shuzo Co., Ltd.), 10 пмолей «якірної» затравки Anchor і 1мкл реакційної суміші кДНК, лігованої із затравками MHC-G1 і Ampli FINDER Anchor, понад якого вміщують мінеральне масло (50мкл). У термоциклізаторі моделі 480J (Perkin Elmer) виконують 30 циклів полімеразної реакції синтезу ланцюга при наступних умовах: 94°С протягом 45 секунд; 60°С протягом 45 секунд і 72°С протягом 2 хвилин. (іі) Клонування кДНК для V-області L-ланцюга антитіла №23-57-137-1 Ген, що кодує V-область L-ланцюга моноклонального антитіла миші проти PTHrP людини, клонують.за способом 5'-RACE (Frohman, M.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998-9002, 1988; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. 17, 2919-2932, 1989). Спосіб 5'-RACE виконують, використовуючи набір 5'-Ampli Finder PACE (Clonetech) відповідно до прикладених до нього інструкцій. При здійсненні цього способу в якості затравки для синтезу кДНК використовують оліго(тимідинову) затравку. Отриману вище мРНК (приблизно 2мкг), яка є матрицею для синтезу кДНК, змішують з олиготимідиновою затравкою. Отриману суміш піддають взаємодії із зворотною транскриптазою при температурі 52°С протягом 30 хвилин для здійснення зворотної транскрипції мРНК в кДНК. Отриманий реакційний розчин змішують з 6н NaOH для гідролізу будьякої РНК, що залишилася (при температурі 65°С протягом 30 хвилин). Отриманий розчин осаджують етанолом з метою виділення і очищення кДНК у вигляді осаду. Синтезовану таким чином кДНК лігують з Ampli FINDER Anchor у 5'-кінця внаслідок взаємодії з РНК-лігазою Т4 при температурі 37°С протягом 6 годин і потім при кімнатній температурі протягом 16 годин. Затравку MLC (SEQ ID №4) для полімеразної реакції синтезу ланцюга конструюють на основі консервативної послідовності С-області l-ланцюга L-ланцюга миші і синтезують в синтезаторі 394 ДНК/РНК (АВІ). Розчин для полімеразної реакції синтезу ланцюга (на 100мкл) містить 10мМ трис-НСІ (рН 8,3), 50мМ КСl, 0,25мМ dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) , 1,5mm MgCl2, 2,5 одиниці AmpliTaq (PERKIN ELMER), 50пмолей затравки Anchor (SEQ ID №2) і 1мкл реакційної суміші кДНК, лігованої із затравками MLC (SEQ ID №4) і Ampli FINDER Anchor, понад якого вміщують 50мкл мінерального масла. У термоциклізаторі моделі 480J (Perkin Elmer) виконують 35 циклів полімеразної реакції синтезу ланцюга в наступних умовах: 94°С протягом 45 секунд, 60°С протягом 45 секунд і 72°С протягом 2 хвилин. (3) Очищення і фрагментація продуктів полімеразної реакції синтезу ланцюга. Всі фрагменти ДНК, ампліфіковані вищеописаними полімеразними реакціями синтезу ланцюга, розділяють за допомогою електрофорезу в агарозному гелі з використанням 3% агарози Nu Sieve GTG (FMC Bio. Products). Для кожної V-області Η-ланцюга і V-області L-ланцюга з гелю вирізають фракцію агарозного гелю, що містить фрагмент ДНК довжиною біля 550 пар основ. У всіх отриманих гель-фракціях очищають цікавлячу ДНК, використовуючи набір GENECLEAN II (ВІ0101) відповідно до прикладених до нього інструкцій. Очищену ДНК осаджують етанолом і осад ДНК розчиняють в 2 і мкл розчину, що містить 10мМ трис-НСІ (рН 7,4) і 1мМ EDTA. Порцію (1мкл) розчину ДНК розщеплюють рестрикційним ферментом Xmal (New England Biolabs) при температурі 37°С протягом 1 години і рестрикційним ферментом EcoRI (Takara Shuzo Co., Ltd.) при температурі 37°С протягом ще 1 години. Гідролізований «розщеплений» розчин екстрагують фенолом і хлороформом і збирають ДНК, проводячи осадження етанолом. Аналогічним чином отримують два фрагменти ДНК, що містять відповідно ген, що кодує V-область Ηланцюга миші, і ген, кодуючий V-область L-ланцюга миші, які мають EcoRI-впізнаючу послідовність у 5'кінця і Xmal-впізнаючу послідовність у 3'-кінця. Фрагменти ДНК EcoRI-Xmal, що містять відповідно ген, що кодує V-область Η-ланцюга миші, і ген, що кодує V-область L-ланцюга миші, окремо лігують з вектором pUC19, який був приготований розщепленням ферментами EcoRI і Xmal, при температурі 16°С протягом 1 години з використанням набору для літування ДНК, варіант 2 (Takara Shuzo Зі. Ltd.) відповідно до прикладених до нього інструкцій. Порцію лігованої суміші (10мкл) додають до 100мкл розчину, що містить компетентні клітки Е. соlі, JM 109 (Nippon Gene Co., Ltd.). Суміш кліток залишають вистоюватися на льоду протягом 15 хвилин, потім при температурі 42°С протягом 1 хвилини і знов на льоду протягом ще 1 хвилини. Отриману суміш кліток змішують з 300мкл SOCсередовища (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook, et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) та інкубують при температурі 37°С протягом 30 хвилин. Отриманий розчин кліток вміщують на агарове середовище LB або 2xYT (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook, et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), утримуюче 100 або 50мкг/мл ампіциліну, 0,1мМ IPTG і 20мкг/мл X-gal, та інкубують при температурі 37°С протягом ночі. Аналогічним чином отримують трансформанти Е. соlі. Трансформанти культивують протягом ночі при температурі 37°С в 2мл середовища LB або 2xYT, що містить 100 або 50мкг/мл ампіциліну. З клітинної фракції отримують плазмідну ДНК в плазмідному екстракторі ΡΙ-100S (Kurabo Industries, Ltd.) або за допомогою набору для виділення плазмід QIAprep (QIAGEN). Отриману таким чином плазмідну ДНК секвенують. (4) Секвенування гена, що кодує V-область антитіла миші Нуклеотидну послідовність кДНК, що кодує область плазміди, визначають в секвенаторі ДНК 373А (АВІ; Perkin-Eimer), використовуючи набір для циклічного секвенування з фарбуванням термінатора (Perkin-Eimer). Для секвенування використовують затравки М13 Primer M4 (Takara Shuzo Co., Ltd.) (SEQ ID №5) і M13 Primer RV (Takara Shuzo Co., Ltd.) (3EQ ID №6) і нуклеотидну послідовність підтверджують в обох напрямах. Плазміда, що містить ген, кодучий V-область Н-ланцюга миші, виділений з гібридоми №23-57-137-1, названа "MBC1H04", і плазміда, що містить ген, кодучий V-область L-ланцюга миші, виділений з гібридоми №23-57-137-1, названа "MBC1L24". Нуклеотидні послідовності (включаючи відповідні амінокислотні послідовності) ДНК, що кодує V-область Η-ланцюга антитіла миші №23-57-137-1 в плазміді МВС1Н04, і ген, що кодує V-область L-ланцюга антитіла миші №23-57-137-1 в плазміді МВС1Н24, показані відповідно в 3EQ ID №№ 57 і 65. Обидва поліпептиди для фрагмента V-області Η-ланцюга і фрагмента V-області L-ланцюга починаються з 58-го нуклеотиду (кодуючого глутамін) в послідовностях ДНК, показаних відповідно в SEQ ID №№ 57 і 65. Амінокислотні послідовності поліпептидів для V-області Η-ланцюга і V-області L-ланцюга також показані відповідно в SEQ ID №№ 46 і 45. Штам Е. соlі, що містить плазміду МВС1Н04, і штам Е. coli, що містить плазміду MBClL24, названі відповідно «Escherichia coli JM109 (МВС1Н04) і Escherichia coli JM109 (MBC1L24)». Ці штами Е. coli депоновані відповідно до положень Будапештського договору від 15 серпня 1996р. в колекції Національного інституту біонауки і людської технології, агентство промислової науки і технології, Японія (1-3, Higashi 1chome, Tsukuba-shi, Ibaraki, Японія), під номерами доступу FERM ВР-5628 для Escherichia coli JM109 (МВСlН04) і FERM ВР-5627 для Escherichia coli JM109 (MBC1L24). (5) Визначення гіперваріабельних дільниць моноклонального антитіла миші №23-57-137-1 проти PTHrP людини V-область Η-ланцюга і V-область L-ланцюга мають спільні структури, що володіють значною схожістю, які складаються з чотирьох каркасних областей (FR), лігованих за допомогою трьох гіперваріабельних дільниць (тобто, CDR). Амінокислотні послідовності каркасних областей є досить консервативними, в той час як амінокислотні послідовності гіперваріабельних дільниць характеризуються надзвичайно високою варіабельністью (Kabat, Ε. A. et al., "Sequence of Proteins of. Immunological Interest", US Dept. Health and Human Services, 1983). З урахуванням цих чинників гомологію амінокислот між V-областями моноклонального антитіла миші проти PTHrP людини визначають з посиланням на базу даних по структурі амінокислотних послідовностей для антитіл, створеної Кабатом та інш. Так визначені гіперваріабельні дільниці V-областей, показані в таблиці 1. Амінокислотні послідовності для гіперваріабельних дільниць 1-3 V-області L-ланцюга показані відповідно в SEQ ID №№59-61, і амінокислотні послідовності для гіперваріабельних дільниць 1-3 V-області Η-ланцюга показані відповідно в SEQ ID №№62-64. Таблиця 1 V-область V-область Н-ланцюга V-область L-ланцюга SEQ ID № CDR1 CDR2 CDR3 57 31-35 50-66 99-107 65 23-34 50-60 93-105 [Посилальний приклад 3] Конструювання химерного антитіла (1) Конструювання Η-ланцюга химерного антитіла (і) Конструювання V-області Н-ланцюга Щоб провести літування з експресуючим вектором, що несе геномну ДНК для Сg1 С-області Н-ланцюга людини, клоновану ДНК, що кодує V-область Н-ланцюга миші, модифікують за способом PCR. Нижню затравку MBC1-S1 (SEQ ID №7) конструюють таким чином, щоб вона гібридизувала з послідовністю ДНК, що кодує 5'-кінцеву область лидерної послідовності V-області, і мала узгоджену послідовність Козака (Kozak, Μ. et al., J. МоІ. Biol., 196, 947-950, 1987) і HindIII-впізнаючу послідовність. Верхню затравку MBC1-a (SEQ ID №8) конструюють таким чином, щоб вона гібридизувала з послідовністю ДНК, що кодує 3’-кінцеву область J-області, і мала донорську послідовність сплайсованого фрагмента і BamHI-впізнаючу послідовність. Полімеразну реакцію синтезу ланцюга здійснюють з використанням TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo Co., Ltd.) і відповідного буфера. Розчин для полімеразної реакції синтезу ланцюга (на 50мкл) містить 0,07мкг плазміди МСВ1Н04 в якості матричної ДНК, 50пмолей МВС1-а і 50пмолей MBC1-S1 в якості затравки, 2,5 одиниці TaKaRa Ex Taq і 0,25мМ dNTP в буфері, понад якого вміщують 50мкл мінерального масла. Виконують 30 циклів полімеразної реакції синтезу ланцюга в наступних умовах: 94°С протягом 1 хвилини, 55°С протягом 1 хвилини, 72°С протягом 2 хвилин. Фрагменти ДНК, ампліфіковані за способом PCR, розділяють електрофорезом в агарозному гелі з використанням 3% агарози Nu Sieve GTG (FMC Bio. Products). Потім вирізають дільницю агарозного гелю, що містить фрагмент ДНК довжиною 437 пар основ, і очищають цей фрагмент ДНК за допомогою набору GENECLEAN II (ΒΙΟ 101) відповідно до прикладених до нього інструкцій. Очищену ДНК збирають, осаджуючи її етанолом, і розчиняють в 20мкл розчину, що містить 10мМ трис-КСІ (рН 7,4) і 1мМ EDTA. Порцію (1мкл) отриманого розчину ДНК розщеплюють рестрикційними ферментами ВатНІ і Hindlll (Takara Shuzo Co., Ltd.) при температурі 37°С протягом 1 години. «Розщеплену» суміш екстрагують фенолом і хлороформом і збирають цікавлячу ДНК, проводячи осадження етанолом. Отриманий фрагмент ДНК Hindlll-BamHI, який містить ген, що кодує V-область Η-ланцюга миші, субклонують у векторі pUC19, який, був приготований шляхом розщеплення ферментами Hindlll і ВатНІ. Отриману плазміду секвенують в секвенаторі ДНК 373А (Perkin-Elmer), використовуючи затравки М13 Primer M4 і Ml3 Primer RV і набір для циклічного секвенування з фарбуванням термінатора (Perkin-Elmer). В результаті отримують плазміду, що несе ген правильної нуклеотидної послідовності, кодуючий V-область Ηланцюга миші, виділену з гібридоми №23-57-137-1, і маючу . HindIII-впізнаючу послідовність, послідовність Козака в 5'-кінцевій області і ВатНІ-впізнаючу послідовність в 3'-кінцевій області, яка названа "MBClH/pUC19". (іі) Конструювання V-області Η-ланцюга для кДНК химерного Η-ланцюга типу "миша - людина" Щоб зробити літування з кДНК для Сg1 С-області Н-ланцюга людини, сконструйовану вище ДНК, кодучу V-область Н-ланцюга миші, модифікують за способом PCR. Нижню затравку MBC1HVS2 (SEQ ID №9) для V-області Н-ланцюга конструюють таким чином, щоб, замінити гліцином другу амінокислоту (аспарагин) послідовності, що кодує передню частину лідерної послідовності V-області Н-ланцюга, і отримати узгоджену послідовність Козака (Kozak, Μ. et al., J. МоІ. Biol., 196, 947-950, 1987) і Hindlll- та EcoRI-впізнаючі послідовності. Верхню затравку MBC1HVR2 (SEQ ID №10) для V-облаеті Η-ланцюга конструюють таким чином, щоб вона гібридизувала з послідовністю ДНК, що кодує 3'-кінцеву область J-області, і з послідовністю ДНК, що кодує 5'-кінцеву область С-області, і мала АраІ- і Smal-впізнаючі послідовності. Полімеразну реакцію синтезу ланцюга здійснюють з використанням TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo Co., Ltd.) і відповідного буфера. Розчин для полімеразної реакції синтезу ланцюга (на 50мкл) містить 0,6мкг плазміди MBC1H/pUC19 в якості матричної ДНК, 50пмолей MBC1HVS2 і 50пмолей MBC1HVR2 в якості затравки, 2,5 одиниці TaKaRa Ex Taq і 0,25мМ dNTP в буфері, понад якого вміщують 50мкл мінерального масла. Виконують 30 циклів полімеразної реакції синтезу ланцюга в наступних умовах: 94°С протягом 1 хвилини; 55°С протягом 1 хвилини; 72°С протягом 1 хвилини, фрагменти ДНК, ампліфіковані внаслідок виконання полімеразної реакції синтезу ланцюга, виділяють електрофорезом в агарозному гелі з використанням 1% агарози Sea Kern GTG (FMC Bio. Products). Потім вирізають дільницю агарозного гелю, що містить фрагмент ДНК довжиною 456 пар основ, і очищають вказаний фрагмент ДНК за допомогою набору GENECLEAN II (ВІ0101) у відповідності з прикладеними до нього інструкціями. Очищену ДНК осаджують етанолом і розчиняють в 20мкл розчину, що містить 10мМ трис-НСІ (рН 7,4) і 1мМ EDTA. Отриманий розчин ДНК (1мкг) розщеплюють рестрикційними ферментами EcoRI і Smal (Takara Shuzo Co., Ltd.) при температурі 37°С протягом 1 години. «Розщеплений» розчин екстрагують фенолом і хлороформом і збирають ДНК, проводячи осадження етанолом. Отриманий фрагмент ДНК EcoRI-Smal, який містить ген, що кодує V-область Η-ланцюга миші, субклонують у векторі pUC19, який був приготований шляхом розщеплення ферментами EcoRI і Smal. Отриману плазміду секвенують секвенатором ДНК 373А (Perkin-Elmer), використовуючи затравки M13 Primer M4 і M13 Primer RV і набір для циклічного секвенування з фарбуванням термінатора (Perkin-Elmer). В результаті отримують плазміду, що містить ген, кодуючий V-область Η-ланцюга миші, виділену з гібридоми №23-57-137-1 з правильною нуклеотидною послідовністю, і маючу EcoRI- і HindIII-впізнаючі послідовності, послідовність Козака в 5’-кінцевій області АраІ- і Smal-впізнаючі послідовності в 3’-кінцевій області, яка названа "MBC1Hv/pUC19". (ііі) Конструювання експресуючого вектора для Н-ланцюга химерного антитіла кДНК, що містить ДНК для Сg1 С-області Η-ланцюга антитіла людини, отримують таким чином. Спочатку отримують мРНК з клітки яєчника китайського хом'ячка, в яку заздалегідь був введений експресуючий вектор DHFR-DE-RVh-PM-if (див. WО 92/19759), кодуючий геномні ДНК V-області Η-ланцюга олюдненого антитіла РМ1 і IgGI С-області Η-ланцюга антитіла людини (N. Takahashi et al., Ceil 29, 671-679, 1982), і експресуючий вектор RVl-PMla (див. WO 92/19759), кодуючий геномні ДНК V-області L-ланцюга олюдненого антитіла РМ1 і С-область k-ланцюга L-ланцюга антитіла людини. Отриману мРНК використовують у відповідності зі способом RT-PCR для клонування кДНК, що містить V-область Η-ланцюга олюдненого антитіла РМ1 і Сg1 С-області антитіла людини, яку потім субклонують в сайті Hindlll-BamHI плазміди pUC19. Після секвенування отримують плазміду, що має правильну нуклеотидну послідовність, яка названа "pRVh-PMlf-кДНК". Отримують експресуючий вектор DHFR-DE-RVh-PM-1-f з делецією сайта Hindlll між промотором SV40 і геном DHFR і сайта EcoRI між промотором EF-1a і геном V-області Н-ланцюга олюдненого антитіла РМ1, який використовують для конструювання експресуючого вектора для кДНК, що містить ген V-області Нланцюга олюдненого антитіла РМ1 і ген Сg1 С-області антитіла людини. Отриману плазміду (pRVh-PMlf-кДНК) розщеплюють ВатНІ, дефосфорилюють фрагментом Кленова і ще раз розщеплюють Hindlll з отриманням дефосфорилованого Фрагмента Hindlll-BamHI. Цей дефосфорилований фрагмент Hindlll-BamHI лігують з експресуючим вектором DHFR-DE-RVh-PM-1-f, в якому видалені сайти Hindlll і EcoRI. Таким чином конструюють експресуючий вектор RVh-PMif-кДНК, що містить кДНК, що кодує V-область Н-ланцюга олюдненого антитіла РМ1 і Cg1 С-області антитіла людини. Експресуючий вектор RVh-PMlf-кДНК, що містить кДНК, кодуючу V-область Η-ланцюга олюдненого антитіла РМ1 і Cg1 C-області антитіла людини, розщеплюють АраІ і ВатНІ, внаслідок чого отримують фрагмент ДНК, що містить С-область Н-ланцюга. Отриманий фрагмент ДНК вводять у вищезгадану плазміду MBC1Hv/pUCl9, яка була приготована шляхом розщеплення АраІ і ВатНІ. Отримана таким чином плазміда названа "МВС1НкДНК/рUС19". Ця плазміда містить кДНК, що кодує V-область Η-ланцюга антитіла миші і Cg1 С-області антитіла людини і має EcoRI- і HindIII-впізнаючі послідовності в 5'-кінцевій області і BamHI-впізнаючу послідовність в 3'-кінцевій області. Плазміду МВС1НкДНК/рUC19 розщеплюють EcoRI і ВатНІ з отриманням фрагмента ДНК, що містить нуклеотидну послідовність, кодуючу Η-ланцюг химерного антитіла. Отриманий фрагмент ДНК вводять в експресуючий вектор pCOS1, який був приготований шляхом розщеплення EcoRI і ВатНІ, внаслідок чого отримують експресуючий вектор для химерного антитіла, який названий "МВС1НкДНК/pCOS1". Експресуючий вектор pCOS1 конструюють з використанням HEF-PMh-gg1 (див. WO 92/19759), для чого з нього видаляють гени антитіла шляхом розщеплення EcoRI і Smal і лігують з адаптером EcoRI-Notl-BamHI (Takara Shuzo Co., Ltd.). Щоб отримати плазміду для експресії в клітці яєчника китайського хом'ячка, плазміду МВС1НкДНК/рUC19 розщеплюють ЕсоІ і ВатНІ з отриманням фрагмента ДНК, що містить ген для Нланцюга химерного антитіла. Потім фрагмент ДНК вводять в експресуючу плазміду рСНОІ, приготовану шляхом розщеплення EcoRI і ВатНІ, що дозволяє отримати експресуючу плазміду для химерного антитіла, яка названа «МВС1НкДНК/рСНО1». Експресуючий вектор рСНОІ конструюють з використанням DHFR-DΤrvH-PMl-f (див. WO 92/19759), для чого з нього видаляють ген антитіла шляхом розщеплення EcoRI і Smal і лігують з адаптером EcoRI-Notl-BamHI (Takara Shuzo Co., Ltd). (2) Конструювання С-області L-ланцюга людини (і) Отримання клонуючого вектора Щоб сконструювати вектор pUC19, який містить ген для С-області L-ланцюга людини, отримують вектор pUC19. з делецією сайта Hindlll. Вектор pUC19 (2мкг) розщеплюють в 20мкл реакційного розчину, що містить 20мМ трис-НСІ (рН 8,5), 10мМ МgСI2, 1мМ DTT, 100мМ KСI, 8 одиниць Hindlll (Takara Shuzo Co., Ltd.), при температурі 37°С протягом 1 години. Отриманий «розщеплений» розчин екстрагують фенолом і хлороформом і збирають цікавлячу ДНК, проводячи осадження етанолом. Зібрану ДНК піддають взаємодії в 50мкл реакційного розчину, що містить 50мМ трис-НСІ (рН 7,5), 10мМ МgСl2, 1мМ DTT, 100мМ NaCl 0,5мМ dNTP і 6 одиниць фрагмента Кленова (GIBCO BRL), при кімнатній температурі протягом 20 хвилин, внаслідок чого відбувається дефосфорилування кінцевих областей ДНК. Цю реакційну суміш екстрагують фенолом і хлороформом і збирають векторну ДНК, проводячи осадження етанолом. Зібрану векторну ДНК піддають взаємодії в 10мкл реакційного розчину, що містить 50мМ трис-НСІ (рН 7,6), 10мМ МgСI2 , 1мМ DTT, 5% (об'ємному відношенні) поліетиленгліколю-8000 і 0,5 одиниці ДНК-лігази Т4 (GIBCO BRL), при температурі 16°С протягом 2 годин, внаслідок чого відбувається аутолігування векторної ДНК. Реакційний розчин (5мкл) додають до 100мкл розчину, що містить компетентні клітки штама JM109 Е. coli (Nippon Gene Co., Ltd.), і отриманий розчин залишають вистоюватися на льоду протягом 30 хвилин, потім при температурі 42°С протягом 1 хвилини і знов на льоду протягом 1 хвилини. До реакційного розчину додають культуральне середовище SOC (500мкл) та інкубують при температурі 37°С протягом 1 години. Отриманий розчин вміщують в агарове середовище 2xYT (утримуючу 50мкг/мл ампіциліну), на поверхню якого заздалегідь нанесені X-gal та IPTG (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook, et. al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), і культивують при температурі 37°С протягом ночі, отримуючи таким чином трансформант. Цей трансформант культивують на середовищі 2xYT (20мл), що містить ампіцилін (50мкг/мл), при температурі 37°С протягом ночі. З клітинної фракції культурального середовища виділяють плазмідну ДНК і очищають за допомогою минінабору для очищення плазмід (QIAGEN) відповідно до прикладених до нього інструкцій. Очищену плазміду розщеплюють Hindlll. Ця плазміда з підтвердженою делецією сайта Hindlll названа. "pUC19 DHindlll". (іі) Конструювання ДНК, що кодує С-область l-ланцюга L-ланцюга людини. Відомо, що С-область l-ланцюга L-ланцюга антитіла людини має принаймні чотири ізотипи, що включають Mcg+Ke+Oz-, Mcg-Ke- Oz-, Mcg-Ke- Oz, 1987). У базі даних EMBL зроблений пошук С-області lланцюга L-ланцюга антитіла людини, яка гомологічна С-областям l-ланцюга L-ланцюга миші №23-57-137-1. Внаслідок цього встановлено, що ізотип Mcg+Ke+Oz- l-ланцюга L-ланцюга антитіла людини (№ доступу Х5 7819) (P. Dariavach, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 9074-9078, 1987) в найбільшій мірі гомологічний Собласті l-ланцюга L-ланцюга миші №23-57-137-1, характеризуючись 64,4% гомологією відносно амінокислотної послідовності і 73,4% гомологією відносно нуклеотидної послідовності. Потім за способом PCR конструюють ген, що кодує С-область l-ланцюга L-ланцюга антитіла людини. Затравку для полімеразної реакції синтезу ланцюга синтезують за допомогою синтезатора ДНК/РНК 394 (АВІ). Синтезують затравки HLAMB1 (SEQ ID №11) і HLAMB3 (SEQ ID №13), які містять смислову послідовність ДНК, і затравки HLAMB2 (SEQ ID №12) і HLAMB4 (SEQ ID №12)4, які містять антисмислову послідовність ДНК, при цьому всі затравки мають з обох кінців комплементарну послідовність довжиною 2023 пари основ. Зовнішні затравки HLAMBS (SEQ ID №15) і HLAMBR (SEQ ID №16) мають послідовності, гомологічні відповідно затравкам HLAMB1 і HLAMB4. Затравка HLAMB3 містить EcoRI-, Hindlll- і B1nl-впізнаючі послідовності, і затравка HLAMBR містить EcoRI-впізнаючу послідовність. Під час першої полімеразної реакції синтезу ланцюга відбувається взаємодія між HLAMB1 і HLAMB2 і між HLAMB3 і HLAMB4. Після завершення вищезгаданих реакцій обидва отримані продукти PCR змішують в еквівалентних кількостях і при здійсненні другої полімеразної реакції синтезу ланцюга проводять їх збирання. До реакційного розчину додають зовнішні затравки HLAMBS і HLAMBR. Цю реакційну суміш піддають третій полімеразній реакції синтезу ланцюга для ампліфікації повнорозмірної ДНК. Полімеразні. реакції синтезу ланцюга виконують за допомогою TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo Co., Ltd.) у відповідності з прикладеними до набору інструкціями. При здійсненні першої полімеразної реакції синтезу ланцюга використовують 100мкл реакційного розчину, що містить 5пмолей HLAMB1, 0,5пмоля HLAMB2 і 5 одиниць TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo Co., Ltd.), або реакційний розчин, що містить 0,5пмоля HLAMB3, 5 пмолей HLAMB4 і 5 одиниць TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo Co., Ltd.), понад якого вміщують 50мкл мінерального масла. Виконують 5 циклів полімеразної реакції синтезу ланцюга в наступних умовах: 94°С протягом 1 хвилини, 60°С протягом 1 хвилини і 72°С протягом 1 хвилини. Під час другої полімеразної реакції синтезу ланцюга використовують суміш, що містить обидва реакційних розчини (по 50мкл), понад якою вміщують 50мкл мінерального масла. Виконують 3 цикли полімеразної реакції синтезу ланцюга у наступних умовах: 94°С протягом 1 хвилини, 60°С протягом 1 хвилини і 72°С протягом 1 хвилини. Під час третьої полімеразної реакції синтезу ланцюга використовують реакційний розчин, до якого додають зовнішні затравки HLAMBS і HL AMBR (по 50пмолей кожної). Виконують 30 циклів полімеразної реакції синтезу ланцюга в наступних умовах: 94°С протягом 1 хвилини, 60°С протягом 1 хвилини і 72°С протягом 1 хвилини. Фрагмент ДНК, отриманий внаслідок третьої полімеразної реакції синтезу ланцюга, піддають електрофорезу в 3% низькоплавкому агарозному гелі (NuSieve GTG Agarose, FMC), після чого його виділяють і очищають від гелю за допомогою набору GENECLEAN II (ВІО101) відповідно до прикладених до нього інструкцій. Отриманий фрагмент ДНК розщеплюють в реакційному розчині (20мкл), що містить 50мМ трис-НСІ (рН 7,5), 10мМ МgСI2 , 1мМ DTT, 100мМ NaCl і 8 одиниць EcoRI (Takara Shuzo Co., Ltd.), при температурі 37°С протягом 1 години. «Розщеплений» розчин екстрагують фенолом і хлороформом і збирають ДНК, проводячи осадження етанолом. Отриману ДНК розчиняють в розчині (8мкл), що містить 10мМ трис-НСІ (рН 7,4) і 1мМ EDTA. Плазміду pUCl9 DHindlll (0,8мкг) розщеплюють EcoRI аналогічно вищеописаній процедурі. «Розщеплений» розчин екстрагують фенолом/хлороформом і осаджують етанолом, внаслідок чого отримують розщеплену плазміду pUC19 DHindlll. Розщеплену плазміду піддають взаємодії в реакційному розчині (50мкл), що містить 50мМ трис-НСІ (рН 9,0), 1мМ МgСI 2 і лужну фосфатазу (Е. coli C75; Takara Shuzo Co., Ltd), при температурі 37°С протягом 30 хвилин, щоб дефосфорилувати плазміду (тобто обробляють лужною фосфатазою бактерій). Реакційний розчин екстрагують фенолом/хлороформом і збирають з нього ДНК, проводячи осадження етанолом. Отриману таким чином ДНК розчиняють в розчині (10мкл), що містить 10мМ трис-НСІ (рН 7,4) і 1мМ EDTA. Оброблену фосфатазою бактерій плазміду pUC19 AHindlll (1мкл) лігують з отриманим вище продуктом полімеразної реакції синтезу ланцюга (4мкл), використовуючи набір для літування ДНК, варіант 2 (Takara Shuzo Co., Ltd.). Отриману плазміду вводять в компетентну клітку Е. coli, JM109, для утворення трансформанту. Трансформант культивують протягом ночі в середовищі 2xYT (2мл), що містить 50мкг/мл ампіциліну. Плазміду виділяють з цієї клітинної фракції за допомогою набору для очищення плазмід QIAprep (QIAGEN). Отриману плазміду секвенують для визначення клонованої ДНК. Секвенування здійснюють в секвенаторі ДНК 373А (АВІ), використовуючи затравки М13 Primer М4 і М13 Primer RV (Takara Shuzo Co., Ltd.). Це дозволяє встановити, що клонована ДНК має делецію довжиною 12 пар основ. Ця плазміда названа "clD/pUC19". Потім для отримання видаленої частини знову синтезують затравки HCLMS (SEQ ID №17) і HCLMR (SEQ ID №18) і за допомогою цих затравок реконструюють правильну ДНК за способом PCR. Першу полімеразну реакцію синтезу ланцюга здійснюють, використовуючи в якості матриці плазміду clD/pUC19 з делецією ДНК і набори затравок HLAMBS і HCLMS або HCLMS і Η LAMB 4. Всі продукти полімеразної реакції синтезу ланцюга очищають окремо. При здійсненні другої полімеразної реакції синтезу ланцюга проводять збирання продуктів полімеразної реакції синтезу ланцюга. Під час третьої полімеразної реакції синтезу ланцюга до продукту др угої полімеразної реакції синтезу ланцюга додають зовнішні затравки HLAMBS і HL AMB4 і проводять ампліфікації для отримання повнорозмірної ДНК. Під час першої полімеразної реакції синтезу ланцюга використовують реакційний розчин (100мкл), утримуючий 0,1мкг clD/pUC19 в якості матриці, по 50пмолей затравок HLAMBS і HCLMR або по 50пмолей затравок HCLMS і HLAMB4 і 5 одиниць TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo Co., Ltd.), понад якого вміщують 50мкл мінерального масла. Виконують 30 циклів полімеразної реакції синтезу ланцюга в наступних умовах: 94°С протягом 1 хвилини і 72°С протягом 1 хвилини. Продукти першої полімеразної реакції синтезу ланцюга, HLAMBS-HCLMR (236 пар основ) і HCLMSHLAMB4 (147 пар основ) по окремості піддають електрофорезу в 3% низькоплавкому агарозному гелі, щоб виділити фрагменти ДНК. Фрагменти ДНК збирають і очищають від гелів за допомогою набору GENECLEAN II (ВІО101). Під час другої полімеразної реакції синтезу ланцюга використовують 20мкл реакційного розчину, що містить по 40нг очищених фрагментів ДНК і 1 одиницю TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo Co., Ltd.), понад якого вміщують 25мкл мінерального масла. Виконують 5 циклів полімеразної реакції синтезу ланцюга в наступних умовах: 94°С протягом 1 хвилини, 60°С протягом 1 хвилини і 72°С протягом 1 хвилини. Під час третьої полімеразної реакції синтезу ланцюга використовують 100мкл реакційного розчину, що містить 2мкл реакційного розчину, отриманого при виконанні другої полімеразної реакції синтезу ланцюга, по 50пмолей зовнішніх затравок HLAMBS і HLAMB4 і 5 одиниць TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo Co., Ltd.), понад якого вміщують 50мкл мінерального масла. Виконують 30 циклів полімеразної реакції синтезу ланцюга в наступних умовах: 94°С протягом 1 хвилини, 60°С протягом 1 хвилини і 72°С протягом 1 хвилини, внаслідок чого отримують фрагмент ДНК довжиною 357 пар основ (продукт третьої полімеразної реакції синтезу ланцюга). Цей фрагмент ДНК піддають електрофорезу в 3% низькоплавкому агарозному гелі для виділення фрагмента ДНК. Отриманий фрагмент ДНК збирають і очищають за допомогою набору GENECLEAN (BI0101). Частину (0,1мкг) отриманого таким чином фрагмента ДНК розщеплюють EcoRI і субклонують в плазміді pUC19 AHindlll, яку заздалегідь обробляють лужною фосфатазою бактерій (ВАР). Отриману плазміду вводять в компетентну клітку Е. coli, JM109, для утворення трансформанту. Трансформант культивують протягом ночі в 2мл середовища 2xYT, що містить 50мкг/мл ампіциліну. Плазміду виділяють з клітинної фракції і очищають за допомогою набору для очищення плазмід QIAprep (QIAGEN). Очищену плазміду секвенують в секвенаторі ДНК 373А (АВІ), використовуючи затравки М13 Primer М4 і М13 Primer RV (Takara Shuzo Co., Ltd.). Плазміда, в якій підтверджена наявність правильної нуклеотидної послідовності без будь-якого поділу, названа "Cl/pUC19". (ііі) Конструювання гена, що кодує С-область к-ланцюга L-ланцюга людини Фрагмент ДНК, що кодує С-область к-ланцюга L-ланцюга, клонують з плазміди HEF-PMlk-gk (WO 92/19759) за способом PCR. Верхню затравку HKAPS (SEQ ID №19) конструюють таким чином,щоб вона містила EcoRI-, Hindlll- і Blnl-впізнаючі послідовності, і нижню затравку НКАРА (SEQ ID №20) конструюють таким чином, щоб вона містила EcoRI-впізнаючу послідовність. Ці затравки синтезують в синтезаторі ДНК/РНК 394(АВІ). Полімеразну реакцію синтезу ланцюга здійснюють, використовуючи 100мкл реакційного розчину, що містить 0,1мкг плазміди HEF-PMlk-gk в якості матриці, по 50пмолей кожної з затравок HKAPS і НКАРА і 5 одиниць TaKaRa Ex Taq (Takara Shuso Co., Ltd), понад якого вміщують 50мкл мінерального масла. Виконують 30 полімеразних циклів полімеразної реакції синтезу ланцюга в наступних умовах: 94°С протягом 1 хвилини, 60°С протягом 1 хвилини і 72°С протягом 1 хвилини, внаслідок чого отримують продукт полімеразної реакції синтезу ланцюга довжиною 360 пар основ. Цей фрагмент ДНК виділяють і очищають електрофорезом в 3% низькоплавкому агарозному гелі, а потім збирають і очищають за допомогою набору GENECLEAN 11 (ΒΙΟ101). Отриманий таким чином фрагмент ДНК розщеплюють EcoRI і клонують в плазміді pUC19 DHindlll, яку заздалегідь обробляють лужною фосфатазою бактерій (ВАР). Отриману плазміду вводять в компетентну клітку Е. coLi, JM109, для утворення тарнсформанту. Трансформант культивують протягом ночі в 2мл середовища 2xYT, що містить 50мкг/мл ампіциліну. Виділену з клітинної фракції плазміду очищають за допомогою набору для очищення плазмід QIAprep (QIAGEN). Очищену плазміду секвенують в секвенаторі ДНК 373А (АВІ), використовуючи затравки М13 Primer М4 і М13 Primer RV (Takara Shuzo Co., Ltd.). Плазміда, у якої підтверджена наявність правильної нуклеотидної послідовності, названа "Ck/pUC19". (3) Конструювання експресуючого вектора L-ланцюга химерного антитіла Конструюють експресуючий вектор L-ланцюга химерного антитіла №23-57-137-1. Ген, що кодує Vобласть L-ланцюга №23-57-137-1, лігують з сайтом Hindlll-Blnl (розташованими безпосередньо перед Собластю антитіла людини) обох плазмід Сl/pUC19 і Сk/рUC19, внаслідок чого отримують вектори pUC19, що містять ДНК, кодуючу V-область L-ланцюга химерного антитіла №23-57-137-1 і С-область l-ланцюга Lланцюга або С-область к-ланцюга L-ланцюга відповідно. Кожний отриманий вектор потім розщеплюють EcoRI, щоб виділити ген для L-ланцюга химерного антитіла. Цей ген субклонують в експресуючому векторі HEF. Фрагмент ДНК, що кодує V-область L-ланцюга антитіла №23-57-137-1, клонують з плазміди MBC1L24 за способом PCR. Затравки, що використовуються в цьому способі, синтезують окремо за допомогою синтезатора ДНК/РНК 394 (АВІ). Нижню затравку MBCCHL1 (SEQ ID №21) конструюють таким чином, щоб вона містила HindIII-впізнаючу послідовність і послідовність Козака (Kozak, Μ. et al., J. МоI. Biol. 196, 947950, 1987), і верхню затравку MBCCHL3 (SEQ ID №22) конструюють таким чином, щоб вона містила Bglll- і RcoRI-впізнаючі послідовності. Полімеразну реакцію синтезу ланцюга здійснюють, використовуючи 100мкл реакційного розчину, що містить 10мМ трис-НСІ (рН 8,3), 50мМ KСІ, 1,5мМ МgСI2, 0,2мМ dNTP, 0,1мкг MBC1L24, по 50пмолей затравок MBCCHL1 і MBCCHL3 і 1мкл AmpliTaq (PERKIN ELMER), понад якого вміщують 50мкл мінерального масла. Виконують 30 циклів полімеразної реакції синтезу ланцюга в наступних умовах: 94°С протягом 45 секунд і 60°С протягом 45 секунд і 72°С протягом 2 хвилин. Продукт полімеразної реакції синтезу ланцюга довжиною 444 пари основ піддають електрофорезу в 3% низькоплавкому. агарозному гелі, збирають і очищають за допомогою набору GENECLEAN II (ВІ0101). Очищений продукт полімеразної реакції синтезу ланцюга розчиняють в 20мкл розчину, що містить 10мМ трис-НСІ (рН 7,4) і 1мМ EDTA. Продукт полімеразної реакції синтезу ланцюга (1мкл) розщеплюють в 20мкл реакційного розчину, що містить 10мМ трис-НСІ (рН 7,5), 10мМ МgСI2 1мМ DTT, 50мМ NaCl 8 одиниць Hindlll (Takara Shuzo Co., Ltd..) і 8 одиниць EcoRI (Takara Shuzo Co., Ltd.), при температурі 37°С протягом 1 години. «Розщеплений» розчин екстрагують фенолом і хлороформом і цікавлячу ДНК збирають, проводячи осадження етанолом. ДНК розчиняють в 8мкл розчину, що містить 10мМ трис-НСІ (рН 7,4) і 1мМ EDTA. Аналогічним чином плазміду pUC19 (1мкл) розщеплюють HindiІІ і EcoRI, екстрагують фенолом/хлороформом і осаджують етанолом. Отриману розщеплену плазміду обробляють лужною фосфа тазою бактерій (Е. coli C75; Takara Shuzo Co., Ltd.). Отриманий реакційний розчин екстрагують фенолом і хлороформом і збирають з нього ДНК, проводячи осадження етанолом. ДНК розчиняють в 10мкл розчину, що містить 10мМ трис-НСІ (рН 7,4) і 1мМ EDTA. Плазміду pUC19 (1мкл), оброблену лужною фосфатазою бактерій, лігують з отриманим вище продуктом полімеразної реакції синтезу ланцюга (4мкл), використовуючи набір для літування ДНК, варіант 2 (Takara Shuzo Co., Ltd.). Отриману плазміду вводять в компетентну клітку Е. Coli, JM109 (Nippon Gene Co., Ltd.), як описувалося вище, для утворення тарнсформанту. Трансформант вміщують на агарове середовище2xYT, що містить 50мкг/мл ампіциліну, і культивують протягом ночі при температурі 37°С. Потім отриманий трансформант культивують протягом ночі при температурі 37°С в 2мл середовища 2xΥΤ, що містить 50мкг/мл ампіциліну. Виділену з клітинної фракції плазміду очищають за допомогою набору для очищення плазмід QIAprep (QIAGEN). Після визначення нуклеотидної послідовності плазміда, в якій підтверджена наявність правильної нуклеотидної послідовності, названа "CHL/pUC19". Плазміди Cl/pUC19 і Сk/рUС19 (по 1мкг кожної) розщеплюють в 20мкл реакційного розчину, що містить 20мМ трис-НСІ (рН 8,5), 10мМ MgCl2, 1мМ DTT, 100мМ КСІ, 8 одиниць Hindlll (Takara Shuzo Co., Ltd.) і 2 одиниці Blnl (Takara Shuzo Co., Ltd.), при температурі 37°С протягом 1 години. «Розщеплений» розчин екстрагують фенолом і хлороформом і збирають з нього ДНК, проводячи осадження етанолом. ДНК обробляють лужною фосфатазою бактерій при температурі 37°С протягом 30 хвилин. Реакційний розчин екстрагують фенолом і хлороформом і збирають з нього ДНК, проводячи осадження етанолом. ДНК розчиняють в 10мкл розчину, що містить 10мМ трис-НСІ (рН 7,4) і 1мМ EDTA. Плазміду CHL/pUC1S, яка містить ДНК, що кодує V-область L-ланцюга №23-57-137-1 (8мкг), розщеплюють Hindlll і ВіпІ так, як це описано вище, з отриманням фрагмента ДНК довжиною 409 пар основ. Цей фрагмент ДНК піддають електрофорезу в 3% низькоплавкому агарозному гелі, а потім збирають і очищають від гелю за допомогою набору GENECLEAN II (ВІО101). ДНК розчиняють в 10мкл розчину, що містить 10мм трис-НСІ (рН 7,4) і 1мМ EDTA. ДНК для ДНК V-області L-ланцюга (4мкл) субклонують в 1мкл плазмід ClpUC19 або Сk/рUС19, оброблених лужною фосфатазою бактерій, і вводять в компетентну клітку Е. соIі, JM109, для утворення тарнсформанту. Трансформант культивують протягом ночі в 3мл середовища 2xΥΤ, що містить 50мкг/мл ампіциліну. Виділену з клітинної фракції плазміду очищають за допомогою набору для очищення плазмід QIAprep (QIAGEN). Отримані таким чином дві плазміди відповідно названі "MBC1L(l)/pUC19" і "MBC1L(k)/pUC19". Кожну з плазмід MBC1L(l)/pUC19 і MBC1L(k)/pUC19 розщеплюють EcoRI і піддають електрофорезу в 3% низькоплавкому агарозному гелі. Фрагмент ДНК довжиною 743 пари основ виділяють і очищають від гелю за допомогою набору GENECLEAN II (BIO101), а потім розчиняють в 10мкл розчину, що містить 10мМ трис-НСІ (рН 7,4) і 1мМ EDTA. Експресуючий вектор (плазміда HEF-PMIk-gk) (2,7мкг) розщеплюють EcoRI, екстрагують фенолом і хлороформом і збирають ДНК, проводячи осадження етанолом. Фрагмент ДНК обробляють лужною фосфа тазою бактерій і піддають електрофорезу в 1% низькоплавкому агарозному гелі. Фрагмент ДНК довжиною 6561 пара основ виділяють і очищають від гелю за допомогою набору GENECLEAN II (BIO101). Очищений Фрагмент ДНК розчиняють в 10мкл розчину, що містить 10мМ трис-НСІ (рН 7,4) і 1мМ EDTA. Вектор HEF (2мкл), оброблений лужною фосфатазою бактерій, лігують з Фрагментом EcoRI (3мкл) кожної з плазмід MBC1L(l)/pUC19 і MBC1L(k)/pUC19. Продукт літування вводять в компетентну клітку Е. соlі, JM109, для утворення тарнсформанту. Трансформант культивують в 2мл середовища 2xYT, що містить 50мкг/мл ампіциліну. Виділену з клітинної фракції плазміду очищають за допомогою набору для очищення плазмід QIAprep (QIAGEN). Очищену плазміду розщепляють в 20мкл реакційного розчину, що містить 20мМ трис-НСІ (рН 8,5), 10мМ МgСI2, 1мМ DTT, 100мМ KCl, 8 одиниць Hindlll (Takara Shuzo Co., Ltd) і 2 одиниці Pvul (Takara Shuzo Co., Ltd.), при температурі 37°С протягом 1 години. У результаті виконання цієї реакції отримують розщеплені фрагменти довжиною 5104/2195 пар основ, якщо фрагмент введений з правильною орієнтацією, і розщеплені фрагменти довжиною 4378/2926 пар основ, якщо фрагмент введений із зворотною орієнтацією. Плазміда, у якої підтверджена наявність фрагмента з правильною орієнтацією, названа "MBC1L(l)/neo" для плазміди MBC1L(l)/pUC19 або "MBC1L(k)/nео" для плазміди MBC1L(l)/pUC19. (4) Трансфекція клітки COS-7 Щоб визначити антигензв'язуючу і нейтралізуючу активність химерних антитіл, отримані вище експресуючі плазміди окремо тимчасово експресують в клітці COS-7. Тимчасову експресію химерних антитіл здійснюють, використовуючи комбінації плазмід МВС1НкДНК/pCOS1 і MBC1L(l)/neo і плазмід МВС1НкДНК/pCOS1l і MBC1L(k)/nео, шляхом котрансфекції клітки COS-7 плазмідами електропорацією за допомогою електроімпульсного пристрою Gene Pulser (Bio Rad). Для цього плазміди (по 10мкг кожні) додають до суспензії кліток COS-7 (0,8мл; 1´107кліток/мл) в PBS(-). Отриманий розчин піддають впливу імпульсів при електростатичній місткості 1500В і силі струму 2мкф, щоб викликати електропорацію. Електропоровані клітки витримують протягом 10 хвилин при кімнатній температурі, суспендують в модифікованому за способом Дульбекко середовищі Голка (DMEM), що містить 2% плідну телячу сироватку з ультранизьким вмістом IgG (GIBCO), і культивують в 10см чашці в інкубаторі з СО2. Після культивування протягом 72 годин культуральний супернатант збирають, центрифугують для видалення клітинного дебрису і використовують як зразок для подальшого твердофазного імуноферментного аналізу (ELISA). При виконанні цієї процедури очищення химерного антитіла від культурального супернатанту кліток COS-7 проводять за допомогою набору Affigel Protein A MAPSII (BIO Rad) відповідно до прикладених до нього інструкцій. (5) Твердофазний імуноферментний аналіз (ELISA) (і) Визначення концентрації антитіл Планшет для ELISA, призначений для визначення концентрації антитіл, готують таким чином. Всі ямки 96-ямкового планшета для ELISA (Ma xisorp, NUNC) покриває 100мкл буфера для сенсибілізації поверхонь (0,1Μ розчин NаНСО3, 0,02% NaH3), що містить 1мкг/мл антитіла кози проти IgG людини (TAGO), і блокують 200мкл буфера для розведення [50мМ трис-НСІ, 1мМ МgСl2, 0,1Μ NaCl, 0,05% твину-20, 0,02% NaN3, 1% бичачого сироваткового альбуміну (BSA); рН 7,2]. У всі ямки додають серійні титри культурального супернатанту кліток COS-7, у яких були експресовані химерні антитіла, або серійні титри самих химерних антитіл в очищеному вигляді. Вміст ямок інкубують при кімнатній температурі протягом 1 години і промивають сумішшю PBS твин-20. У кожну ямку додають 100мкл розчину кон'югованих з лужною фосфа тазою антитіл кози проти IgG людини (TAGO). Вміст планшета інкубують при кімнатній температурі протягом 1 години, промивають сумішшю PBS твин-20 і в кожну ямку додають 1мг/мл розчину субстрат ("Sigma104", п-нітрофенілфосфорна кислота, SIGMA). Щоб визначити концентрацію антитіл, у отриманого розчину вимірюють оптичну щільність при 405нм, використовуючи апарат для прочитання мікропланшетів (BIO Rad). В якості еталону при виконанні цього вимірювання використовують очи щений Hu IgG1l (сайт зв'язування). (іі) Визначення антигензв'язуючої здатності Планшет для ELISA, для визначення антигензв'язуючої здатності, готують таким чином. Всі ямки 96ямкового планшета для ELISA покривають 100мкл буфера для сенсибілізації поверхонь, що містить 1мкг/мл РТНrР людини (1-34) (Peptide Research Institute), і блокують 200мкл буфера для розведення. У всі ямки додають серійні титри культурального супернатанту кліток COS-7, в яких були експресовані химерні антитіла, або серійні титри самих химерних антитіл в очи щеному вигляді. Вміст ямок інкубують при кімнатній температурі і промивають сумішшю PBS і твину-20, після чого в кожну ямку додають 100мкл розчину кон'югованих з лужною фосфатазою антитіл кози проти IgG людини (TAGO). Вміст планшета інкубують при кімнатній температурі, промивають сумішшю PBS і твину-20 і в кожну ямку додають 1мг/мл розчину субстрату ("Sigma104", п-нітрофенмлфосфорна кислота, SIGMA). У отриманого розчину вимірюють оптичну щільність при 405нм, використовуючи апарат для прочитування мікропланшетів (BIO Rad). Результати цього аналізу показують, що химерні антитіла володіють здатністю зв'язування з РТНrР людини (1-34), і V-області клонованого антитіла миші мають правильні структури (Фіг.5). Крім того, встановлено, що не існує відмінностей відносно здатності зв'язування з РТНrР (1-3 4) між химерним антитілом, що має С-область l-ланцюга L-ланцюга, і химерним антитілом, що має С-область k-ланцюга Lланцюга. Тому С-область L-ланцюга олюдненого антитіла конструюють з використанням l-ланцюга Lланцюга олюдненого антитіла. (6) Створення лінії кліток СНО, здатної стабільно продукувати химерні антитіла. Щоб створити лінію кліток, здатну стабільно продукувати химерні антитіла, отримані вище експресуючі плазміди вводять в клітки СНО (DXB 11). Для отримання лінії кліток, здатної стабільно продукувати химерні антитіла, можна використати будьяку з наступних комбінацій експресуючих плазмід для кліток СНО: МВС1НкДНК/рСН01 і MBC1L(l)/neo; і МВС1НкДНК/рСН01 і MBC1L(k)/nео. Ці плазміди котрансфеціюють в клітці СНО електропорацією за допомогою електроімпульсного пристрою Gene Pulser (BIO Rad). Всі експресуючі вектори по окремості розщеплюють рестрикційним ферментом Pvul для отримання лінійної ДНК. Отриману ДНК екстрагують фенолом і хлороформом і збирають, проводячи осадження етанолом. Отримані таким чином плазмідні ДНК піддають електропорації. Для цього плазмідні ДНК (по 10мкг кожної) додають до 0,8мл суспензії кліток СНО в PBS(-) (1 ´107кліток/мл). Отриманий розчин піддають впливу імпульсів при електростатичній місткості 1500В і силі струму 25мкф. Електропоровані клітки витримують при кімнатній температурі протягом 10 хвилин і суспендують в середовищі МЕМ-a (GIBCO), що містить 10% фетальну телячу сироватку (GIBCO). Отриману суспензію культивують на трьох 96-ямкових планшетах (Falcon) в інкубаторі з СО2. Наступного дня після початку культивування це середовище замінюють селективним середовищем [середовище MEMa без рибонуклеозиду або дезоксирибонуклеозиду (GIBCO), що містить 10% фетальну телячу сироватку (GIBCO) і 500мг/мл GENETIC1N (G418Sulfate; GIBCO)]. З культурального середовища відбирають клітки, в які був введений ген антитіла. Селективне середовище замінюють свіжим середовищем. Через два тижні після заміни середовища клітки досліджують під мікроскопом. У клітках, що характеризуються задовільним ростом, визначають кількість продукованих антитіл вищеописаним способом ELISA. Досліджують клітки, продукуючі найбільшу кількість антитіл. Підвищення рівня культури отриманої лінії кліток, здатної стабільно продукувати антитіла, проводять у флаконі, що обертається, з використанням мінімального підтримуючого середовища (MEM) без рибонуклеозиду або дезоксирибонуклеозиду, що містить 2% плідну телячу сироватку з ультранизьким вмістом IgG. На 3-ий і 4-ий день культивування культуральний супернатант збирають і фільтрують через фільтр з розміром пор 0,2мкм (Millipore), щоб видалити клітинний дебрис. Химерні антитіла очищають від культурального супернатанту кліток СНО в колонці POROS, заповненій білком A (PerSeptive Biosystemes), на ConSep LC100 (Millipore) відповідно до прикладених інструкцій. Очищені химерні антитіла використовують як зразки для визначення нейтралізуючої активності і для дослідження лікувальної дії на тваринних моделях гіперкальціємії. Концентрацію і антигензв'язуючу активність очищених химерних антитіл визначають за допомогою аналогічної системи ELISA, як це описувалося вище. [Посилальний приклад 4] Конструювання олюдненого антитіла (1) Конструювання Η-ланцюга олюдненого антитіла (і) Конструювання олюдненої V-області Н-ланцюга Η-ланцюг олюдненого антитіла №23-57-137-1 отримують шляхом трансплантації гіперваріабельної дільниці за способом PCR. Щоб отримати Η-ланцюг олюдненого антитіла №23-57-137-1 (варіант "а"), що має каркасні області, виділені з антитіла людини S31679 (NBRF-PDB; Cuisinier, A.M. et al., Eur. J. Immunol., 23, 110-118, 1993), використовують наступні шість типів затравок для полімеразної реакції синтезу ланцюга: затравки для трансплантації гіперваріабельних дільниць MBC1HGP1 (SEQ ID №23) і MBC1HGP3 (SEQ ID №24) (обидві містять смислову послідовність ДНК) і MBC1HGP2 (SEQ ID №25) і MBC1HGP4 (SEQ ID №26) (обидві містять антисмислову послідовність ДНК), які з обох кінців мають комплементарну послідовність довжиною 15-21 пар основ; зовнішні затравки MBC1HVS1 (SEQ ID №27) і MBC1HVR1 (SEQ ID №28), які відповідно гомологічні затравкам для трансплантації гіперваріабельних дільниць MBC1HGP1 і MBC1HGP4. Затравки для трансплантації гіперваріабельних дільниць MBC1HGP1, MBC1HGP2, MBC1HGP3 і MBC1HGP4 виділяють за допомогою денатурованого сечовиною поліакриламідного гелю (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook, et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) і екстрагують способом подрібнення і вимочування (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook, et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) таким чином. Кожну із затравок для трансплантації гіперваріабельних дільниць (1 нмоль) виділяють на 6% денатурованому поліакриламідному гелі з отриманням фрагментів ДНК. З отриманих фрагментів ДНК вибирають фрагмент необхідної довжини, який ідентифікують на тонкій пластині силікагелю, що опромінюється ультрафіолетом, і виділяють його способом подрібнення і вимочування. Отриману ДНК розчиняють в 20мкл розчину, що містить 10мМ трис-НСІ (рН 7,4) і 1мМ EDTA. Полімеразну реакцію синтезу ланцюга здійснюють з використанням TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo Co., Ltd,). Реакційний розчин (100мкл) для полімеразної реакції синтезу ланцюга містить по 1мкл вищезгаданих затравок для трансплантації гіперваріабельних дільниць MBC1HGP1, MBC1HGP2, MBC1HGP3 i MBC1HGP4, 0,25мМ dNTP і 2,5 одиниці TaKaRa Ex Taq в буфері. Виконують 5 циклів полімеразної реакції синтезу ланцюга в наступних умовах: 94°С протягом 1 хвилини, 55°С протягом 1 хвилини і 72°С протягом 1 хвилини. До отриманого реакційного розчину додають зовнішні затравки MBC1HVS1 і MBC1HVR1 (по 50пмолей кожної). Використовуючи цю реакційну суміш, виконують ще 30 циклів полімеразної реакції синтезу ланцюга в тих же умовах. Ампліфікований таким чином фрагмент ДНК виділяють електрофорезом в агарозному гелі з використанням 4% агарози Nu Sieve GTG (FMC Bio. Products). Потім вирізають дільницю агарози, що містить фрагмент ДНК довжиною 421 пара основ, і очищають вказаний фрагмент ДНК за допомогою набору GENECLEANII (BIO101) відповідно до прикладених до нього інструкцій. Очищений фрагмент ДНК осаджують етанолом і розчиняють в 20мкл розчину, що містить 10мМ трис-НСІ (рН 7,4) і 1мМ EDTA. Реакційну суміш для полімеразної реакції синтезу ланцюга використовують для субклонування цього фрагмента ДНК в плазміді pUC19, яка була приготована шляхом розщеплення ВатНІ і HindlII, після чого визначають нуклеотидну послідовність отриманої плазміди. Плазміда, що має правильну нуклеотидну послідовність, названа "hMBCHv/pUC19". (іі) Конструювання V-області Η-ланцюга для кДНК олюдненого Η-ланцюга. Щоб зробити літування з кДНК для олюдненої Сg1 С-області Η-ланцюга, ДНК для олюдненої V-області Η-ланцюга, сконструйовану на попередньому етапі, модифікують за способом PCR. Для цього конструюють нижню затравку MBC1HVS2 таким чином, щоб вона гібридизувала з послідовністю, що кодує 5'-кінцеву область лидерної послідовності V-області, мала узгоджену послідовність Козака (Kozak et al., J. Моl. Biol. 196, 947-950, 1987) і Hindlll- EcoRIвпізнаючі послідовності. Верхню затравку MBC1HVR2 конструюють таким чином, щоб вона гібридизувала з послідовністю ДНК, що кодує 3'-кінцеву область J-області, і з послідовністю ДНК, що кодує 5'-кінцеву область С-області, і мала АlаІ- і Saml-впізнаючі послідовності. Полімеразну реакцію синтезу ланцюга виконують з використанням TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo Co., Ltd.) і відповідного буфера. Реакційний розчин для полімеразної реакції синтезу ланцюга містить 0,4мкг hMBCHv/pUC19 в якості матриці ДНК, по 50пмолей затравок MBC1HVS2 і MBC1HVR2, 2,5 одиниці TaKaRa Ex Taq і 0,25мМ dNTP в буфері. Виконують 30 циклів полімеразної реакції синтезу ланцюга в наступних умовах: 94°С протягом 1 хвилини, 55°С протягом 1 хвилини і 72°С протягом 1 хвилини. Ампліфікований таким чином фрагмент ДНК виділяють електрофорезом в агарозному гелі з використанням 3% агарози Nu Sieve GTG (EMC Bio. Products). Вирізають дільницю гелю, що містить фрагмент ДНК довжиною 456 пар основ, і очищають вказаний фрагмент від гелю за допомогою набору GENECLEANII (ΒΙΟ 101) відповідно до прикладених до нього інструкцій. Очищений фрагмент ДНК осаджують етанолом і розчиняють в 20мкл розчину, що містить 10мМ трис-НСІ (рН 7,4) і 1мМ EDTA. Реакційну суміш, отриману внаслідок здійснення полімеразної реакції синтезу ланцюга, використовують для субклонування фрагмента ДНК в плазміді pUC19, яка була приготована шляхом розщеплення EcoRI і Smal, після чого отриману плазміду секвенують. У результаті отримують плазміду, що містить ДНК, що кодує V-область Н-ланцюга миші, виділену з гібридоми №23-57137-1, і маючу EcoRI- і HindIII-впізнаючі послідовності, послідовність Козака в 5'-кінцевій області і АраІ- і Smal-впізнаючі послідовності в 3'-кінцевій області, яка названа "hMBC1Hv/pUC19". (2) Конструювання експресуючого вектора для Н-ланцюга олюдненого антитіла Плазміду RVh-PMlf-кДНК, що містить послідовність кДНК Н-ланцюга антитіла hPMl, розщеплюють АраІ і ВатНІ з отриманням фрагмента ДНК, що містить ДНК, кодуючу С-область Н-ланцюга. Цей фрагмент ДНК вводять в плазміду hMBC1Hv/pUC19, яка була приготування шляхом розщеплення АраІ і ВатНІ. Отримана плазміда названа "hMBC1HкДHK/puC19". Ця плазміда містить ДНК, що кодує V-область Η-ланцюга олюдненого антитіла №23-57-137-1, і ДНК, що кодує Сg1 С-області Η-ланцюга людини, має EcoRI- і HindIIIвпізнаючі послідовності в 5'-кінцевій області і BamHI-впізнаючу послідовність в 3'-кінцевій області. Нуклеотидна послідовність і відповідна амінокислотна послідовність олюдненого Η-ланцюга варіанту "а", hМВС1НкДНК/рUС19, що є в плазміді, показані відповідно в SEQ ID №58 і SEQ ID №56. Плазміду hМВС1НкДНК/рuС19 розщеплюють EcoRI і ВатНІ з отриманням фрагмента ДНК, що містить ДНК, кодуючу Н-ланцюг. Цей фрагмент ДНК вводять в експресуючу плазміду pCOS1, яка була приготована шляхом розщеплення EcoRI і ВатНІ. У результаті отримують експресуючу плазміду для олюдненого антитіла, яка названа "hМВС1НкДНК/pCOS1". Щоб отримати плазміду для експресії в клітці СНО, плазміду hМВС1НкДНК/рuС19 розщеплюють EcoRI і ВатНІ з отриманням фрагмента ДНК, що містить ДНК, кодучу Н-ланцюг. Цей фрагмент ДНК вводять в експресуючий вектор рСНОІ, який був приготований шляхом розщеплення EcoRI і ВатНІ. У результаті отримують експресуючу плазміду для олюдненого антитіла, яка названа "hМВС1НкДНК/рСНО1". (3) Конструювання гібридної V-області L-ланцюга (і) Отримання гібридного антитіла FR1,2/FR3, 4 Конструюють ген для гібридного L-ланцюга каркасної області, що містить як каркасні області з олюдненого антитіла, так і каркасні області з (химерного) антитіла миші, і оцінюють вказані області відносно їх придатності для олюднення. На цьому етапі отримують гібридне антитіло, що містить FR1 і FR2, виділені з антитіла людини, і FR3 і FR4, виділені з антитіла миші, використовуючи сайт рестрикції Aflll, розташований в CDR2. Плазміди МВС1L(l)/nео і hMBC1L(l)/nео (по 10мкг кожної) окремо розщеплюють в 100мкл реакційного розчину, що містить 10мМ трис-НСІ (рН 7,5), 10мМ МgСl2, 1мМ DTT, 50мМ NaCl, 0,01% (у відношенні ваги до об'єму) бичачого сироваткового альбуміну і 10 одиниць Aflll (Takara Shuzo Co., Ltd.), при температурі 37°С протягом 1 години. Реакційні розчини піддають електрофорезу в 2% низькоплавкому агарозному гелі з отриманням фрагментів ДНК довжиною 6282 пари основ (визначаються як "с1") і довжиною 1022 пари основ (визначаються як "с2") з плазміди MBC1L(l)/nео або фрагменти ДНК довжиною 6282 пари основ, (визначаються як "h1") і 1022 пари основ (визначаються як "h2") з плазміди hMBC1L(l)/nео. Ці фрагменти ДНК збирають і очищають від гелю за допомогою набору GENECLEANII (BIO101). Всі фрагменти с1 і h1 (1мкг) обробляють лужною фосфатазою бактерій (ВАР). Фрагмент ДНК екстрагують фенолом і хлороформом, осаджують етанолом і розчиняють в 10мкл розчину, що містить 10мМ трис-НСІ (рН 7,4) і 1мМ EDTA. Фрагменти ДНК с1 і h1 (по 1мкл кожного), оброблені лужною фосфатазою бактерій, лігують відповідно з фрагментами ДНК h2 і с2 (по 4мкл кожного) (при температурі 4°С протягом ночі). Всі продукти літування вводять в компетентну клітку Е. соlі, JM109, для утворення тарнсформанту. Трансформант культивують в 2мл середовища 2xYT, що містить 50мкг/мл ампіциліну. Виділену з клітинної фракції плазміду очищають за допомогою набору для очищення плазмід QIAprep (QIAGEN). Очищену плазміду розщеплюють в 20мкл реакційного розчину, що містить 10мМ трис-НСІ (рН 7,5), 10мМ МgСl2, 1мМ DTT, і або 2 одиниці ApaLI (Takara Shuzo Co., Ltd.) або 8 одиниць BamHI (Takara Shuzo Co., Ltd,) і Hindlll (Takara Shuzo Co., Ltd.), при температурі 37°С протягом 1 години. Якщо фрагмент cl-h2 був лігований правильно, внаслідок цієї реакції розщеплення повинні бути отримані фрагменти довжиною 5560/1246/498 пар основ (розщеплення ApaLI) або фрагменти довжиною 7134/269 пар основ (розщеплення BamHI/Hindlll). На основі цього припущення ідентифікують необхідні плазміди. Експресуючий вектор, що кодує L-ланцюг гібридного антитіла людини FRl,2миші FR3, 4, названий "h/mMBC1L(l)/neo". З іншого боку, не можна отримати клон для h1-c1. Тому проводять рекомбінацію на векторі pUC і отриманий рекомбінантний продукт клонують у векторі HEF. В якості матриць використовують плазмі ду hMBC1Lal/pUC19, яка містить ДНК, що кодує V-область L-ланцюга олюдненого антитіла без заміни амінокислот, і плазміду hMBC1Ldl/pUC19, яка містить ДНК, що кодує V-область L-ланцюга олюдненого антитіла із заміною амінокислоти в положенні 91 каркасної області FR3, тирозину (амінокислота №87 відповідно до визначення Кабата), ізолейцином. Плазміди MBC1L(l)/pUC19, hMBC1Lal/pUC19 і hMBC1Ldl/pUC19 (по 10мкл кожної) окремо розщеплюють в 30мкл реакційного розчину, що містить 10мМ трис-НСІ (рН 7,5), 10мМ МgСl2, 1мМ DTT, 50мМ NaCl, 0,01% (у відношенні ваги до об'єму) бичачого сироваткового альбуміну, 16 одиниць Hindlll і 4 одиниці Aflll, при температурі 37°С протягом 1 години. Реакційні розчини по окремості піддають електрофорезу в 2% низькоплавкому агарозному гелі з отриманням фрагмента ДНК довжиною 215 пар основ з плазміди MBC1L(l)/pUC19 (визначається як "с2'") і фрагмента ДНК довжиною 3218 пар основ з кожної з плазмід hMBC1Lal/pUC19 і hMBC1Ldl/pUC19 (визначаються відповідно як "hal'" і "hdl'"). Ці фрагменти ДНК збирають і очищають за допомогою набору GENECLEANII (BI0101). Фрагменти hal' і hdl' лігують з фрагментом с2' і вводять в компетентну клітку Е. соlі, JM109, для утворення тарнсформанту. Трансформант культивують в 2мл середовища 2xYT, що містить 50мкг/мл ампіциліну. Виділену з клітинної фракції плазміду очищають за допомогою набору для очищення плазмід QIAprep (QIAGEN). Плазміда, що містить фрагмент hal', названа "m/hMBC1Lal/pUC19", і плазміда, що містить фрагмент hdl', названа "m/hMBC1Ldl/pUC19". Плазміди m/hMBC1Lal/pUC19 і m/hMBC1Ldl/pUC19 розщеплюють EcoRI. Фрагмент ДНК довжиною 743 пари основ обробляють електрофорезом в 2% низькоплавкому агарозному гелі, збирають і очищають від гелю за допомогою набору GENECLEANII (BIO101). Отриманий фрагмент ДНК розчиняють в 20мкл розчину, що містить 10мМ трис-НСІ (рН 7,4) і 1мМ EDTA. Фрагменти ДНК (по 4мкл кожного) лігують з вищезгаданим вектором HEF (1мкл), обробленим лужною фосфа тазою бактерій. Продукт літування вводять в компетентну клітку Е. соlі, JM109, для утворення тарнсформанту. Трансформант культивують в 2мл середовища 2xYT, що містить 50мкг/мл ампіциліну. Виділену з клітинної фракції плазміду очищають за допомогою набору для очищення плазмід QIAprep (QIAGEN). Кожну з очищених плазмід розщеплюють в 20мкл реакційного розчину, що містить 20мМ трис-НСІ (рН 8,5), 10мМ МgСl2, 1мМ DTT, 100мМ KCl, 8 одиниць Hindlll (Takara Shuzo Co., Ltd.) і 2 одиниці Pvul (Takara Shuzo Co., Ltd.), при температурі 37°С протягом 1 години. Плазмідну ДНК ідентифікують, виходячи з припущення про те, що, якщо фрагмент ДНК введений в плазміду з правильною орієнтацією, то внаслідок розщеплення буде отриманий розщеплений фрагмент довжиною 5104/2195 пар основ, і якщо фрагмент ДНК введений в плазміду із зворотною орієнтацією, то внаслідок розщеплення буде отриманий розщеплений фрагмент довжиною 4378/2926 пар основ. Отримані таким чином плазміди є експресуючими векторами, що кодують L-ланцюг гібридного антитіла миші РМ,2/людини FR3, 4, отримані експресуючі вектори були викликані відповідно "m/hMBC1Lal/neo" і "m/hMBC1Ldl/neo". (іі) Отримання гібридного антитіла FR1/FR2 Гібридне антитіло FR1/FR2 отримують так само, як описано вище, використовуючи сайт рестрикції SnaBI, розташований в CDR1. Плазміди MBC1L(l)/nео і h/mMBC1L(l)/neo (no 10мкг кожні) окремо розщеплюють в 20мкл реакційного розчину, що містить 10мМ трис-НСІ (рН 7,9), 10мМ МgСl2, 1мМ DTT, 50мМ NaCl, 0,01% (у відношенні ваги до об'єму) бичачого сироваткового альбуміну і 6 одиниць SnaBI (Takara Shuzo Co., Ltd.), при температурі 37°С протягом 1 години. Отримані реакційні розчини далі розщеплюють в 50мкл реакційного розчину, що містить 20мМ трис-НСІ (рН 8,5), 10мМ МgСl2, 1мМ DTT, 100мМ КСІ, 0,01% (у відношенні ваги до об'єму) бичачого сироваткового альбуміну і 6 одиниць Pvul, при температурі 37°С протягом 1 години. Отримані реакційні розчини по окремості піддають електрофорезу в 1,5% низькоплавкому агарозному гелі, внаслідок чого отримують фрагменти ДНК довжиною 4955 пар основ (m1) і 2349 пар основ (m2) з плазміди MBClL(l)/neo і фрагментами ДНК довжиною 4955 пар основ (hml) і 2349 пар основ (hm2) з плазміди h/mMBC1L(l)/nео. Ці фрагменти ДНК збирають і очищають від гелів за допомогою набору GENECLEANII (BI0101). Всі отримані фрагменти ДНК розчиняють в 40мкл розчину, що містить 10мМ трисНСІ (рН 7,4) і 1мМ EDTA. Фрагменти ml і hm1 (по 1мкл кожні) лігують відповідно з фрагментами hm2 і m2 (по 4мкл кожні). Отримані продукти літування вводять в компетентну клітку Е. coli, JM109, для утворення тарнсформанту. Отриманий трансформант культивують в 2мл середовища 2xYT, що містить 50мкг/мл ампіциліну. Виділену з клітинної фракції плазміду очищають за допомогою набору для очищення плазмід QIAprep (QIAGEN). Усі очищені плазміди розщеплюють в 20мкл реакційного розчину, що містить 10мМ трис-НСІ (рН 7,5), 10мМ MgCl2, 1мМ DTT і 8 одиниць Apal (Takara Shuzo Co., Ltd.) або 2 одиниці ApaLI (Takara Shuzo Co., Ltd.), при температурі 37°С протягом 1 години. Якщо фрагменти ліговані правильно, то внаслідок розщеплення повинен бути отриманий фрагмент довжиною 7304 пари основ (розщеплення АраІ) або фрагменти довжиною 5560/1246/498 пар основ (розщеплення ApaLI) для m1-hm2, і отримані фрагменти довжиною 6538/766 пар основ (розщеплення АраІ) або фрагменти довжиною 3535/2025/1246/498 пар основ (розщеплення ApaLI) для hml-m2. Плазміди ідентифіковані на основі цього припущення. У результаті отримують експресуючий вектор, що кодує Lланцюг гібридного антитіла людини FRl/миші FR2, 3, 4 (названий "hmmMBC1L(l)/neo"), і експресуючий вектор, що кодує L-ланцюг гібридного антитіла миші FR1/людини FR2/миші FR3, 4 (названий "mhmMBC1L(l)/neo"). (4) Конструювання L-ланцюга олюдненого антитіла L-ланцюг олюдненого антитіла №23-57-137-1 отримують шляхом трансплантації гіперваріабельної дільниці за способом PCR. Для отримання L-ланцюга олюдненого антитіла №23-57-137-1 (варіант "а"), який містить області FR1, FR2 і FR3, виділені з антитіла людини HSU03868 (GEN-BANK, Deftos, Μ. et al., Scand. J. ImiaunoІ, 39, 95-103, 1994), і область FR4, виділену з антитіла людини S25755 (NBRF-PDB), використовують шість затравок для PCR. Цими шістьма затравками є: затравки для трансплантації гіперваріабельних дільниць MBC1LGP1 (SEQ ID №29) і MBC1LGP3 (SEQ ID №30), що містять смислову послідовність ДНК, затравки для трансплантації гіперваріабельних дільниць MBC1LGP2 (SEQ ID №31) і MBC1LGP4 (SEQ ID №32), що містять антисмислову послідовність ДНК, які мають з обох кінців комплементарну послідовність довжиною 15-21 пара основ; і зовнішні затравки MBC1LVS1 (SEQ ID №33) і MBC1LVR1 (SEQ ID №34), які гомологічні затравкам для трансплантації гіперваріабельних дільниць MBC1LGP1 і MBC1LGP4 відповідно. Затравки для трансплантації гіперваріабельних дільниць MBC1LGP1, MBC1LGP2, MBC1LGP3 і MBC1LGP4 виділяють за допомогою денатурованого сечовиною поліакриламідного гелю (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 198 9) і екстрагують способом подрібнення і вимочування (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Всі затравки для трансплантації гіперваріабельних дільниць (1нмоль) виділяють за допомогою 6% денатурованого поліакриламідного гелю. Фрагменти, ДНК необхідної довжини ідентифікують на тонкій пластині силікагелю, що опромінюється ультрафіолетом. Необхідний фрагмент ДНК збирають з гелю способом подрібнення і вимочування. Зібраний фрагмент ДНК розчиняють в 20мкл розчину, що містить 10мМ трис-НСІ (рН 7,4) і 1мМ EDTA. Полімеразну реакцію синтезу ланцюга здійснюють, використовуючи TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo Co., Ltd.) і відповідний буфер. Реакційний розчин для полімеразної реакції синтезу ланцюга (на 100мкл) містить по 1мкл затравок для трансплантації гіперваріабельних дільниць MBC1LGP1, MBC1LGP2, MBC1LGP3 і MBC1LGP4, 0,25мМ dNTP і 2,5 одиниці TaKaRa Ex Taq в буфері. Виконують 5 циклів полімеразної реакції синтезу ланцюга в наступних умовах: 94°С протягом 1 хвилини, 55°С протягом 1 хвилини і 72°С протягом 1 хвилини. У отриману реакційну суміш додають по 50пмолей зовнішніх затравок MBC1LVS1 і MBC1LVR1. Використовуючи цю реакційну суміш, виконують ще 30 циклів полімеразної реакції синтезу ланцюга в тих же умовах. Ампліфікований фрагмент ДНК виділяють електрофорезом в агарозному гелі з використанням 3% агарози Nu Sieve GTG (FMC Bio. Products). Вирізають дільницю агарози, що містить фрагмент ДНК довжиною 421 пари основ, і очищають вказаний фрагмент ДНК за допомогою набору GENECLEANII (BI0101) відповідно до прикладених до нього інструкцій. Отриману таким чином реакційну суміш для полімеразної реакції синтезу ланцюга використовують для субклонування цього фрагмента ДНК в плазміді pUC19, яка була приготована" шляхом розщеплення ВатНІ і Hindlll. Отриману плазміду секвенують. Вказана плазміда названа "hMBCL/pUC19". Однак в цій плазміді амінокислота в положенні 104 (амінокислота №96 відповідно до визначення Кабата) гіперваріабельної дільниці CDR4 замінена аргініном. Щоб замінити цю амінокислоту тирозином, конструюють і синтезують коректуючий затравку MBC1LGP10R (SEQ ID №35). Потім здійснюють полімеразну реакцію синтезу ланцюга, використовуючи TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo Co., Ltd.) і відповідний буфер. Реакційний розчин для полімеразної реакції синтезу ланцюга (на 100мкл) містить 0,6мкг плазміди hMBCL/pUC19 в якості матричної ДНК, по 50пмолей затравок MBC1LVS1 і MBC1LGP10R, 2,5 одиниці TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo Co., Ltd.) і 0,25мМ dNTP в буфері, понад якого вміщують шар мінерального масла (50мкл). Виконують 30 циклів полімеразної реакції синтезу ланцюга в наступних умовах: 94°С протягом 1 хвилини, 55°С протягом 1 хвилини і 72 °С протягом 1 хвилини. Ампліфікований фрагмент ДНК виділяють електрофорезом в агарозному гелі, використовуючи 3% агарозу Nu Sieve GTG (FMC Bio, Products). Вирізають дільницю гелю, що містить фрагмент ДНК довжиною 421 пара основ, і очищають цей фрагмент від гелю за допомогою набору GENECLEANII (BI0101) відповідно до прикладених до нього інструкцій. Отриману реакційну суміш для полімеразної реакції синтезу ланцюга використовують для субклонування фрагмента ДНК в плазміду pUC19, яка була приготована шляхом розщеплення ВатНІ і Hindlll. Плазміду секвенують, використовуючи затравки М13 Primer М4 і М13 Primer RV. Отримані результати підтверджують, що плазміда має правильну послідовність. Цю плазміду розщеплюють Hindlll і ВInІ і виділяють фрагмент ДНК довжиною 416 пар основ електрофорезом в 1% агарозному гелі. Цей фрагмент ДНК очищають за допомогою набору GENECLEANII (BI0101) відповідно до прикладених до нього інструкцій і вводять в плазміду Cl/pUC, яка була приготована шляхом розщеплення Hindlll і ВІnІ. Отримана плазміда названа "hMBC1Lal/pUC19". Цю плазміду розщеплюють EcoRI з отриманням фрагмента ДНК, що кодує олюднений L-ланцюг. Отриманий фрагмент ДНК вводять в плазміду pCOS1 так, щоб ініціюючий кодон олюдненого L-ланцюга розташовувався внизу від промотору EF1a. Отримана таким чином плазміда названа "hMBC1Lal/pCOS1". Послідовність ДНК (включаючи відповідну амінокислотну послідовність) олюдненого L-ланцюга (варіант "а") показана в SEQ ID №66. Амінокислотна послідовність варіанту "а" показана також в SEQ ID №47. Олюднений L-ланцюг варіанту "b" отримують мутагенезом за способом PCR. Варіант "b" конструюють таким чином, щоб замінити амінокислоту в положенні 43, гліцин (амінокислота №43 відповідно до визначення Кабата), проліном і амінокислоту в положенні 49, лізин (амінокислота №49 відповідно до визначення Кабата), аспарагіновою кислотою у варіанті "а". Полімеразну реакцію синтезу ланцюга здійснюють з використанням плазміди hMBC1Lal/pUC19 в якості матриці, мутагенної затравки MBC1LGP5R (SEQ ID №36) і затравки MBC1LVS1. Отриманий фрагмент ДНК розщеплюють BamHI і Hindlll і розщеплений фрагмент субклонують в сайті BamHI-Hindlll плазміди pUC19. Плазміду секвенують і розщеплюють Hindlll і Aflll, після чого отриманий розщеплений фрагмент лігують з плазмі дою hMBC1Lal/pUC19, яка була приготована шляхом розщеплення Hindlll і Aflll. Отримана плазміда названа "hMBC1Lbl/pUC19". Цю плазміду розщеплюють EcoRI з отриманням фрагмента ДНК, що містить ДНК, кодуючу олюднений L-ланцюг. Вказаний фрагмент ДНК вводять в плазміду pCOS1 так, щоб ініціюючий кодон олюдненого L-ланцюга знаходився внизу від промотору EF1a. Отримана таким чином плазміда названа "hMBC1Lbl/pCOS1". Олюднений L-ланцюг. варіанту "с" отримують мутагенезом за способом PCR. Варіант "с" конструюють таким чином, щоб замінити амінокислоту в положенні 84, серії (амінокислота №80 відповідно до визначення Кабата), проліном. Полімеразну реакцію синтезу ланцюга здійснюють з використанням плазміди hMBC1Lal/pUC19 в якості матриці, мутагенної затравки MBC1LGP6S (SEQ ID №37) і затравки М13 Primer RV. Отриманий фрагмент ДНК розщеплюють ВатНІ і HindiII і субклонують в плазмі ді pUC19, яка була приготована шляхом розщеплення ВатНІ і Hindlll. Після секвенування плазміду розщеплюють BstPI і Аоr51НІ і отриманий фрагмент ДНК лігують з плазмідою hMBC1Lal/pUC19, яка була приготована шляхом розщеплення BstPI і Аоr51НІ. Отримана плазміда названа "hMBC1Lcl/pUC19". Цю плазміду розщеплюють EcoRI з отриманням фрагмента ДНК, що містить ДНК, кодуючий олюднений L-ланцюг. Цей фрагмент вводять в сайт EcoRI плазміди pCOS1 так, щоб ініціюючий кодон олюдненого L-ланцюга знаходився внизу від промотору EF1a. Отримана таким чином плазміда названа "hMBC1Lcl/pCOS1". Олюднений L-ланцюг варіантів "d", "e" і "f" також отримують мутагенезом за способом PCR. Варіанти "d", "e" і "f" конструюють шляхом заміни відповідно у варіантах "а", "b" і "с" амінокислоти в положенні 91, тирозину (амінокислота №87 відповідно до визначення Кабата), ізолейцином. Для отримання варіантів "d", "e" і "f" полімеразну реакцію синтезу ланцюга здійснюють з використанням в якості матриці відповідно плазмід hMBC1Lal/pCOS1 (для варіанту "d"), h MBC1Lbl/pCOS1 (для варіанту "e") і hMBC1Lcl/pCOS1 (для варіанту "f"), мутагенної затравки MBC1LGP11R (SEQ ID №38) і затравки M-Sl (SEQ ID №44). Отриманий фрагмент ДНК розщеплюють ВатНІ і Hindlll і субклонують в плазміді pUC19, яка була приготована шляхом розщеплення ВатНІ і Hindlll. Після секвенування цю плазміду розщеплюють Hindlll і ВlnІ і розщеплений фрагмент лігують з плазмідою Cl/pUC19, яка була приготована шляхом розщеплення Hindlll і ВlnІ. Отримані плазміди відповідно названі "hMBC1Ldl/pUC19" (для варіанту "d"), " hMBC1Lel/pUC19" (для варіанту "e") і " hMBC1Lfl/pUC19" (для варіанту "f"). Всі ці плазміди розщеплюють EcoRI з отриманням фрагмента ДНК, що містить ДНК, кодуючу олюднений L-ланцюг. Цей фрагмент ДНК вводять в сайт EcoRI плазміди pCOS1 так, щоб ініціюючий кодон олюдненого L-ланцюга знаходився внизу від протомора EF1a плазміди. Отримані таким чином плазміди названі "hMBC1Ldl/pCOS1" (для варіанту "d"), "hMBC1Lel/pCOS1" (для варіанту "e") і "hMBC1Lfl/pCOS1" (для варіанту "f"). Олюднений L-ланцюг варіантів "g" і "h" також отримують мутагенезом за способом PCR. Варіанти "g" і "h" конструюють шляхом заміни відповідно у варіантах "а" і "d" амінокислоти в положенні 36, гістидину (амінокислота №36 відповідно до визначення Кабата), тирозином. Полімеразну реакцію синтезу ланцюга здійснюють з використанням мутагенної затравки MBC1LGP9R (SEQ ID №39), затравки M13 Primer RV і плазміди hMBC1Lal/pUC19 в якості матриці. Виконують ще одну полімеразну реакцію синтезу ланцюга, використовуючи о триманий таким чином продукт PCR, затравку M13 Primer M4 і плазміду hMBC1Lal/pUC19 в якості матриці. Отриманий фрагмент ДНК розщеплюють Hindlll і ВlnІ і субклонують в плазміді Cl/pUC19, яка була приготована шляхом розщеплення Hindlll і ВlnІ. Використовуючи цю плазміду в якості матриці, здійснюють полімеразну реакцію синтезу ланцюга із затравками MBC1LGP13R (SEQ ID №40) і MBC1LVS1. Отриманий фрагмент полімеразної реакції синтезу ланцюга розщеплюють АраІ і Hindlll і вводять в плазміди hMBC1Lal/pUC19 і hMBC1Ldl/pUC19, які були приготовані шляхом розщеплення АраІ і Hindlll. Отримані плазміди секвенують. Плазміди, в яких була підтверджена наявність правильної послідовності, названі "hMBC1Lgl/pUC19" (для варіанту "g") і " h MBC1Lhl/pUC19" (для варіанту "h"). Ці плазміди розщеплюють EcoRI з отриманням фрагмента ДНК, що містить ДНК, кодучу олюднений L-ланцюг. Цей фрагмент ДНК вводять в сайт EcoRI плазміди pCOS1 так, щоб ініціюючий кодон олюдненого L-ланцюга знаходився внизу від промотору EF1a. Отримані плазміди названі відповідно "hMBC1Lgl/pCOS1" (для варіанту "g") і " hMBC1Lhl/pCOS1" (для варіанту "h"). Олюднений L-ланцюг варіантів "і", "j", "k", "I", "m", "n" і "о" також отримують мутагенезом за способом PCR. Полімеразну реакцію синтезу ланцюга здійснюють, використовуючи плазміду hMBC1Lal/pUC19 в якості матриці з мутагенною затравкою MBC1LGP14S (SEQ ID №41) і затравкою V1RV(l) (SEQ ID №43). Отриманий фрагмент ДНК розщеплюють АраІ і BInl і субклонують в плазміді hMBC1Lgl/pUC19, яка була приготована шляхом розщеплення АраІ і ВlnІ. Отриману плазміду секвенують і вибирають клон з мутацією, відповідною кожному з вказаних варіантів. Отримана таким чином плазміда названа "hMBC1Lxl/pUC19 (x=і, j, к, 1, m, n або о)". Цю плазміду розщеплюють EcoRI з отриманням фрагмента ДНК, що містить ДНК, кодучу олюднений L-ланцюг. Фрагмент ДНК вводять в сайт EcoRI плазміди pCOS1 так, щоб ініціюючий кодон олюдненого L-ланцюга знаходився внизу від промотору EF1a. Отримана таким чином плазміда названа "hMBC1Lxl/pCOS1" (x=і, j, k, l, m, n або о). Послідовності ДНК (включаючи відповідні амінокислотні послідовності) варіантів "j", "I", "m" і "о" показані відповідно в SEQ ID №№ 67, 68, 69 і 70. Амінокислотні послідовності цих варіантів показані відповідно в SEQ ID № 48, 49, 50 і 51. Олюднений L-ланцюг варіантів "p", "q", "r", "s" i "t" конструюють шляхом заміни амінокислоти в положенні 87 (тирозину) ізолейцином відповідно у варіантах "і", "j", "m", "l" і "о". Ці варіанти отримують, використовуючи сайт рестрикції Аоr51МІ області FR3, який замінюють у варіантах "і", "j", "m", "l" або "о" сайтом варіанту "h". Для чого з експресуючої плазміди hMBC1Lxl/pCOS1 (x=і, j, m, 1 або о) видаляють рестрикційний фрагмент Аоr51НІ (514 пар основ), що містить CDR3, частину області FR3 і всю область FR4. Рестрикційний фрагмент Аоr51НІ (514 пар основ) в експресуючій плазміді hMBC1Lhl/pCOS, що містить CDR3, частину області FR3 і всю область FR4, лігують з видаленим сайтом так, щоб замінити амінокислоту в положенні 91, тирозин (амінокислота №87 відповідно до визначення Кабата), ізолейцином. Отриману плазміду секвенують. Далі вибирають клон варіантів "і", "j", "m", "l" і "о", в якому амінокислота в положенні 91, тирозин (амінокислота №87 відповідно до визначення Кабата), замінена ізолейцином. Ці модифіковані варіанти, відповідні варіантам "і", "j", "m", "l" і "о", названі відповідно варіантами "р", "q", "s", "r" і "t". Отримана плазміда названа "hMBC1Lxl/pCOS1" (x=p, q, s, r або t). Послідовності ДНК (включаючи відповідні амінокислоти) варіантів "q", "r", "s" і "t" показані відповідно в SEQ ID № 71, 72, 73 і 74. Амінокислотні послідовності цих варіантів також показані відповідно в SEQ ID № 52, 53, 54 і 55. Плазміду hMBC1Lql/pCOS1 розщеплюють Hindlll і EcoRI і субклонують в плазміді pUC19, яка була приготована шляхом розщеплення Hindlll і EcoRI. Отримана таким чином плазміда названа "hMBC1Lql/pUC19". Положення замінених амінокислот в окремих варіантах олюдненого L-ланцюга показано в нижченаведеній таблиці 2. Таблиця 2 Положення заміненої амінокислоти в списках послідовностей (номер амінокислоти відповідно до визначення Кабата) Варіанти а b с d е f g h і j k 36 43 45 47 Ρ 49 80 87 D Ρ Ρ D Ρ Υ Υ Υ Υ Υ Ι Ι Ι Ι К К К D V І m n о p q r s t Υ Υ Υ Υ Υ Υ Υ Υ Υ К V D D V V D V V D D D D К К К Ι Ι Ι Ι Ι У таблиці 2 заголовними буквами позначені наступні амінокислоти: Y-тирозин; Р-пролін; К-лізин; Vвалін; D-аспарагінова кислота і І-ізолейцин. Штами Е. соlі, що містять плазміди hMBC1НкДНК/pUC19 і hMBC1Lql/pUC19, названі відповідно "Escherichia coli JM109 (hMBC1НкДНК/pUC19)" і "Escherichia coli JM109 (hMBC1Lql/pUC19)" і депоновані відповідно до положень Будапештського договору від 15 серпня 1996р. в колекції Національного інституту біонауки і людської технології, агентство промислової науки і технології, Японія (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki, Японія) під номером доступу FER M BP-5629 для Escherichia coli JM109 (hMBC1НкДНК/pUC19) і FERM ВР-5630 для Escherichia coli JM109 (hMBC1Lql/pUC19). (5) Трансфекція в клітці COS-7 Щоб визначити антигенз'вязуючу і нейтралізуючу активність гібридних антитіл і олюднених антитіл №23-57-137-1, отримані вище експресуючі плазміди тимчасово експресують в клітках COS-7. Для тимчасової експресії L-ланцюга гібридних антитіл нижченаведені комбінації плазмід котрансфеціюють в клітці COS-7 шляхом електропорації з використанням електроімпульсного пристрою Gene Pulser (Bio Rad): hMBC1НкДНК/pCOS1 і h/mMBC1L(l)/neo; hMBC1НкДНК/pCOS1 і m/hMBC1Lal/neo; hMBC1НкДНК/pCOS1 і m/hMBC1Ldl/neo; hMBC1НкДНК/pCOS1 і hmmМВС1L(l)/nео; і hMBC1НкДНК/pCOS1 і hmmMBC1L(l)/neo. До суспензії кліток COS-7 (0,8мл) в PBS(-) (1´104кліток/мл) додають всі комбінації плазмідних ДНК (по 10мкг кожної). Отриманий розчин піддають впливу імпульсів при електростатичній місткості 1500В і сиді струму 25мкф. Електропоровані клітки витримують протягом 10 хвилин при кімнатній температурі, суспендують в модифікованому за способом Дульбекко середовищі Голка, що містить 2% фетальну телячу сироватку з ультранизьким вмістом IgG (GiBCO), і культивують в 10см чашці в інкубаторі з СО2. Клітки культивують протягом 72 годин, після чого культуральний супернатант збирають і центрифугують для видалення клітинного дебрису. Отримані розчини використовують для виконання твердофазного імуноферментного аналізу (ELISA). Для тимчасової експресії олюднених антитіл №23-57-137-1 комбінацію плазмід hMBC1НкДНК/pCOS1 і hMBC1Lxl/pCOS1 (x=a-t) котрансфеціюють в клітки COS-7 за допомогою електроімпульсного пристрою Gene Pulser (Bio Rad) аналогічно процедурі, описаній вище для гібридних анитіл. Культуральні супернатанти отримують і використовують для виконання твердофазного імуноферментного аналізу (ELISA). Гібридні або олюднені антитіла очищають від культуральних супернатантів кліток COS-7 за допомогою набору AffiGel Protein A MAPSII (Bio Rad) відповідно до прикладених до нього інструкцій. (6) Твердофазний імуноферментний аналіз (ELISA) (і) Визначення концентрації антитіл Планшет для ELISA, призначений для визначення концентрації антитіл, готують таким чином. Всі ямки 96-ямкового планшета для ELISA (Ma xisorp, NUNC) покриває 100мкл буфера для сенсибілізації поверхонь (0,1Μрозчин NaHCO3, 0,02% NaH3), що містить 1мкг/мл антитіла кози проти IgG людини (TAGO), і блокують 200мкл буфера для розведення [50мМ трис-НСІ, 1мМ МgСl2, 0,1Μ NaCl, 0,05% твину-20, 0,02% NaN3, 1% бичачого сироваткового альбуміну (BSA); рН 7,2]. У всі ямки додають серійні титри культурального супернатанту кліток COS, в яких були експресовані гібридні і олюднені антитіла, або додають серійні титри гібридних і олюднених антитіл в очищеному вигляді. Вміст ямки інкубують при кімнатній температурі протягом 1 години і промивають сумішшю PBS і твину-20. Потім в кожну ямку додають 100мкл антитіла кози проти IgG людини (TAGO), кон'югованого з лужною фосфатазою. Вміст планшета інкубують при кімнатній температурі протягом 1 години, промивають сумішшю PBS і твин у-20. Потім в кожну ямку додають 1мг/мл розчину субстрату ("Sigma 104", п-нітрофенілфосфорна кислота, SIGMA). Для визначення концентрації антитіл у розчину в кожній ямці вимірюють оптичну щільність при 405нм, використовуючи апарат для прочитання мікропланшетів (Bio Rad). Як еталон при здійсненні цього вимірювання використовують очищений Hu IgG 1l (сайт зв'язування). (іі) Визначення антигензв'язуючої здатності Планшет для ELISA, призначений для визначення антигензв'язуючої здатності, готують таким чином. Всі ямки 96-ямкового планшета для ELISA (Ma xisorp, NUNC) покриває 100мкл буфера для сенсибілізації поверхонь, що містить 1мкг/мл РТНrР людини (1-34), і блокують 200мкл буфера для розведення. Потім у всі ямки додають серійні титри культурального супернатанту кліток COS-7, в яких були експресовані гібридні і олюднені антитіла, або серійні титри гібридних і олюднених антитіл в очи щеному вигляді. Вміст планшета інкубують при кімнатній температурі і промивають сумішшю PBS і твину-20. Потім в кожну ямку додають 100мкл антитіла кози проти IgG людини (TAGO), кон'югованого з лужною фосфатазою. Вміст планшета інкубують при кімнатній температурі і промивають сумішшю PBS і твин у-20. У кожну ямку додають 1мг/мл розчину субстрату ("Sigma104", п-нітрофенілфосфорна кислота, SIGMA). У отриманого розчину вимірюють оптичну щільність при 405нм, використовуючи апарат для прочитання мікропланшетів (Bio Rad). (7) Підтвердження активності (і) Оцінка олюдненого Н-ланцюга Встановлено, що антитіло, яке містить олюднений Н-ланцюг варіанту "а" і химерний L-ланцюг, характеризується таким же рівнем РТНrР-зв'язуючої активності, що і химерне антитіло (див. Фіг.6). Цей результат дозволяє передбачити, що у варіанті "а" V-область Η-ланцюга олюднена в такій мірі, що можна зробити оцінку олюднення. Тому олюднений Н-ланцюг варіанту "а" використаний як Н-ланцюг олюдненого антитіла в наступних експериментах. (іі) Активність гібридних антитіл (іі-а) Гібридне антитіло FR1,2/FR3, 4 Коли L-ланцюг має структур у h/mMBC1L(l), антигензв'язуюча активність відсутня. На відміну від цього, коли L-ланцюг має структуру m/hМВСlLal, або m/hMBC1Ldl, спостерігається такий же рівень антигензв'язуючої активності, що і у химерного антитіла №23-57-137-1 (Фіг.7). Ці результати дозволяють припустити, що області FR3 і FR4 не викликають ніяких проблем, а в областях FR1 і FR2 є один або декілька амінокислотних залишків, які необхідно замінити, щоб отримати олюднене антитіло. (іі-b) Гібридне антитіло FR1/FR2 Коли L-ланцюг має структур у mhmMBC1L(l), антигензв'язуюча активність відсутня. На відміну від цього, коли L-ланцюг має структур у hmmMBC1L(l), спостерігається такий же рівень антигензв'язуючої активності, що і у химерного антитіла №23-57-137-1 (Фіг.8). Ці результати дозволяють припустити, що область FR1 не викликає ніяких проблем, а в області FR2 є один або декілька амінокислотних залишків, які необхідно замінити, щоб отримати олюднене антитіло. (ііі) Активність олюднених антитіл Антигензв'язуючу активність визначають у олюднених антитіл, що мають L-ланцюг варіантів "а"-"t". Отримані результати показують, що олюднені антитіла, що мають L-ланцюг варіантів "j", "I", "m", "о", "q", "r", "s" і "t", характеризуються таким же рівнем PTHrP-зв'язуючої активності, що і химерне антитіло (Фіг.9-12). (8) Створення лінії кліток СНО, здатної стабільно продукувати антитіло Щоб створити лінію кліток, здатну стабільно продукувати олюднені антитіла, отримані вище експресуючі плазміди вводять в клітку СНО (DXB11). Лінію кліток, здатну стабільно продукувати олюднене антитіло, отримують, використовуючи нижченаведені комбінації плазмід в якості експресуючих векторів для клітки СНО: hMBC1НкДНК/рСНО1 і hMBC1Lml/pCOS1; hMBC1НкДНК/pCOS1 і hMBC1Lql/pCOS1; hMBC1НкДНК/pCHO1 і hMBC1Lrl/pCOS1. Ці плазміди котрансфецюють в клітці СНО шляхом електропорації з використанням електроімпульсного пристрою Gene Pulser (Bio Rad). Потім експресуючі вектори по окремо розщеплюють рестрикційним ферментом Pvul зотриманням лінійних фрагментів ДНК. Отримані фрагменти ДНК екстрагують фенолом і хлороформом і осаджують етанолом. Після чого отримані таким шляхом фрагменти ДНК піддають електропорації. Для цього фрагменти плазмідної ДНК (по 10мкг кожної) додають до 0,8мл суспензії кліток СНО в PBS(-) (1´107кліток/мл). Отриманий розчин піддають впливу імпульсів при електростатичній ємності 1500В і силі струму 25мкф. Оброблені клітки витримують при кімнатній температурі протягом 10 хвилин, суспендують в середовищі MEM-a(GIBCO), що містить 10% плідну телячу сироватку (GIBCO), і культивують на 96-ямкових планшетах (Falcon) в інкубаторі з СО2. Наступного дня після початку культивування середу замінюють селективною середою MEM-a без рибонуклеозиду або дезоксирибонуклеозиду, що містить 10% плодову телячу сироватку (GIBCO) і 500мг/мл GENETICIN (G418Sulfate; GIBCO). З культурального середовища відбирають клітки, в які введений ген антитіла. Культуральне середовище замінюють свіжим середовищем. Приблизно через два тижні після заміни середовища клітки досліджують під мікроскопом. У клітках, що характеризуються задовільним ростом, визначають кількість продукованих антитіл способом ELISA, який звичайно використовують для вимірювання концентрації антитіл, як це описувалося вище. Вивчають, збирають клітки, які продукують найбільшу кількість антитіл. Підвищення рівня культури отриманої лінії кліток, здатної стабільно продукувати антитіла, проводять у флаконі, що обертається, з використанням мінімального підтримуючого середовища MEM-a без рибонуклеозиду або дезоксирибонуклеозиду, що містить 2% плодову телячу сироватку з ультранизьким змістом IgG. На 3-ій і 4-ий день культивування культуральний супернатант збирають і фільтрують через фільтр з . розміром пор 0,2мкм (Millipore) для видалення клітинного дебрису. Олюднені антитіла очищають від культурального супернатанту кліток СНО в колонці POROS, заповненій білком А (PerSeptive Biosystems), на ConSep LC100 (Miliipore) відповідно до прикладених інструкцій. Олюднені антитіла використовують для визначення нейтралізуючої активності і дослідження фармакологічної ефективності на тваринних моделях гіперкальціємії. Концентрацію і антигензв'язуючу активність очищених олюднених антитіл визначають за допомогою вищеописаної системи ELISA. [Посилальний приклад 5] Визначення нейтралізуючої активності Нейтралізуючу активність антитіл миші, химерних і олюднених антитіл визначають з використанням лінії мієломних кліток пацюків ROS 17/2.8-5. Клітки ROS 17/2.8-5 культивують в середовищі F-12 Хема (GIBCO), що містить 10% плодову телячу сироватку (GIBCO), в інкубаторі з СО2. Клітки ROS 17/2.8-5 висівають у всі ямки 96-ямкового. планшета в кількості 104кліток/100мкл/ямку і культивують протягом 1 дня. Після закінчення культивування культуральне середовище замінюють середовищем F-12 Хема (GIBCO), що містить 4мМ гідрокортизону і 10% плодову телячу сироватку. Клітки культивують протягом трьох-чотирьох днів, промивають 260мкл середовища F-12 Хема (GIBCO) і додають 80мкл середовища F-12 Хема, що містить 1мМ ізобутил-1-метилксантину (ІВМХ, SIGMA) у 10% плодову телячу сироватку і 10мМ HEPES. Отриману суміш інкубують при температурі 37°С протягом 30 хвилин. Культуральні середовища, що містять антитіла миші, химерні і олюднені антитіла, призначені для випробування нейтралізуючої активності, заздалегідь поетапно розводять з отриманням наступних груп: [10мкг/мл, 3,3мкг/мл, 1,1мкг/мл і 0,37мкг/мл], [10мкг/мл, 2мкг/мл, 0,5мкг/мл і 0,01мкг/мл] і [10мкг/мл, 5мкг/мл, 1,25мкг/мл, 0,63мкг/мл і 0,31мкг/мл]. Кожний розчин зразка розведеного антитіла змішують з еквівалентною кількістю 4нг/мл РТНгР (1-34). У кожну ямку вводять 80мкл отриманого змішаного розчину. Кінцева концентрація кожного антитіла в ямці дорівнює четвертій частині початкової концентрації вищезгаданого антитіла, тому концентрація РТНrР (1-34) становить 1нг/мл. Після обробки протягом десяти хвилин при кімнатній температурі,. культуральний супернатант видаляють і залишок тричі промивають PBS. Циклічний аденозинмонофосфат (сАМР) в клітках екстрагують 100мкл 0,3% НСl - 95% етанолу і випаровують за допомогою аспіратора, що вприскує воду, для видалення НСІ-етанолу. Залишок розчиняють в 120мкл буфера для імуноферментного аналізу (ЕІА), що входить в набір для імуноферментного аналізу сАМР (CAYMAN CHEMIC AL'S), щоб екстрагувати сАМР. Рівень сАМР визначають за допомогою вищезгаданого набору (CAYMAN CHEMICAL'S) відповідно до прикладених до нього інструкцій. Отримані результати показують, що серед олюднених антитіл, що характеризуються таким же рівнем антигензв'язуючої активності, що і химерне антитіло, олюднені антитіла, що мають L-ланцюг варіантів "q", "r", "s" і "t" (в яких тирозин в положенні 91 замінений ізолейцином), володіють нейтралізуючою активністю, яка в найбільшій мірі відповідає аналогічній активності химерного антитіла, і олюднені антитіла, що мають L-ланцюг варіанту "q", володіють найсильнішою нейтралізуючою активністю (Фіг.13-15). Як описувалося вище, даний винахід відноситься до терапевтичного агента при кахексії, що містить в якості активного інгредієнта речовину, яка здатна інгібувати скріплення між РТНrР і його рецептором. У випробуваннях фармакологічної ефективності з використанням тваринної моделі кахексії така речовина дозволяє запобігти втраті у вазі і збільшити час виживання випробуваних тварин в порівнянні з контрольними тваринами. Тому ця речовина є корисною для лікування кахексії. (2) Інформація для SEQ ID №1: (і) Характеристики послідовності: (A) До вжина: 20 пар основ (B) Тип: нуклеїнова кислота (C) Структура ланцюга: одноланцюжковий (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис:/опис = "синтетична ДНК" (хі) Опис послідовності: SEQ ID №1 (2) Інформація для SEQ ID №2: (і) Характеристики послідовності: (A) До вжина: 38 пар основ (B) Тип: нуклеїнова кислота (C) Структура ланцюга: одноланцюжкова (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис:/опис = "синтетична ДНК" (хі) Опис послідовності: SEQ ID №2 (2) Інформація для SEQ ID №3: (і) Характеристики послідовності: (A) До вжина: 28 пар основ (B) Тип: нуклеїнова кислота (C) Структура ланцюга: одноланцюжкова (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис:/опис = "синтетична ДНК" (хі) Опис послідовності: SEQ ID №3 (2) Інформація для SEQ ID №4: (і) Характеристики послідовності: (А) До вжина: 29 пар основ (B) Тип: нуклеїнова кислота (C) Структура ланцюга: одноланцюжкова (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис:/опис = "синтетична ДНК" (хі) Опис послідовності: SEQ ID №4 (2) Інформація для SEQ ID №5: (і) Характеристики послідовності: (A) До вжина: 17 пар основ (B) Тип: нуклеїнова кислота (C) Структура ланцюга: одноланцюжкова (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис:/опис = "синтетична ДНК" (хі) Опис послідовності: SEQ ID №5 (2) Інформація для SEQ ID №6: (і) Характеристики послідовності: (A) До вжина: 17 пар основ (B) Тип: нуклеїнова кислота (C) Структура ланцюга: одноланцюжкова (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис:/опис = "синтетична ДНК" (хі) Опис послідовності: SEQ ID №6 (2) Інформація для SEQ ID №7: (і) Характеристики послідовності: (A) До вжина: 31 пара основ (B) Тип: нуклеїнова кислота (C) Структура ланцюга: одноланцюжкова (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис:/опис = "синтетична ДНК" (хі) Опис послідовності: SEQ ID №7 (2) Інформація для SEQ ID №8: (і) Характеристики послідовності: (A) До вжина: 30 пар основ (B) Тип: нуклеїнова кислота (C) Структура ланцюга: одноланцюжкова (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис:/опис = "синтетична ДНК" (хі) Опис послідовності: SEQ ID №8 (2) Інформація для SEQ ID №9: (і) Характеристики послідовності: (A) До вжина: 36 пар основ (B) Тип: нуклеїнова кислота (C) Структура ланцюга: одноланцюжкова (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис/опис = "синтетична ДНК" (хі) Опис послідовності: SEQ ID №9 (2) Інформація для SEQ ID №10: (і) Характеристики послідовності: (A) До вжина: 41 пара основ (B) Тип: нуклеїнова кислота (C) Структура ланцюга: одноланцюжкова (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис:/опис = "синтетична ДНК" (хі) Опис послідовності: SEQ ID №10 (2) Інформація для SEQ ID №11: (і) Характеристики послідовності: (A) До вжина: 109 пар основ (B) Тип: нуклеїнова кислота (C) Структура ланцюга: одноланцюжкова (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис:/опис = "синтетична ДНК" (хі) Опис послідовності: SEQ ID № 11 (2) Інформація для SEQ ID №12: (і) Характеристики послідовності: (A) До вжина: 110 пар основ (B) Тип: нуклеїнова кислота (C) Структура ланцюга: одноланцюжкова (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис:/опис = "синтетична ДНК" (хі) Опис послідовності: SEQ ID №12 (2) Інформація для SEQ ID ns 13: (і) Характеристики послідовності: (A) До вжина: 98 пар основ (B) Тип: нуклеїнова кислота (C) Структура ланцюга: одноланцюжкова (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис:/опис = "синтетична ДНК" (хі) Опис послідовності: SEQ ID №13 (2) Інформація для SEQ ID №14: (і) Характеристики послідовності: (A) До вжина: 106 пар основ (B) Тип: нуклеїнова кислота (C) Структура ланцюга: одноланцюжкова (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис:/опис = "синтетична ДНК" (хі) Опис послідовності: SEQ ID №14 (2) Інформація для SEQ ID №15: (і) Характеристики послідовності: (A) До вжина: 43 пари основ (B) Тип: нуклеїнова кислота (C) Структура ланцюга: одноланцюжкова (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис:/опис = "синтетична ДНК" (хі) Опис послідовності: SEQ ID №15 (2) Інформація для SEQ ID №16: (і) Характеристики послідовності: (A) До вжина: 20 пар основ (B) Тип: нуклеїнова кислота (C) Структура ланцюга: одноланцюжкова (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис:/опис = "синтетична ДНК" (хі) Опис послідовності: SEQ ID №16 (2) Інформація для SEQ ID №17: (і) Характеристики послідовності: (А) До вжина: 39 пар основ (B) Тип: нуклеїнова кислота (C) Структура ланцюга: одноланцюжкова (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис:/опис = "синтетична ДНК" (хі) Опис послідовності: SEQ ID №17 (2) Інформація для SEQ ID №18: (і) Характеристики послідовності: (A) До вжина: 39 пар основ (B) Тип: нуклеїнова кислота (C) Структура ланцюга: одноланцюжкова (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис:/опис = "синтетична ДНК" (хі) Опис послідовності: SEQ ID №18 (2) Інформація для SEQ ID №19: (і) Характеристики послідовності: (A) До вжина: 46 пар основ (B) Тип: нуклеїнова кислота (C) Структура ланцюга: одноланцюжкова (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис:/опис = "синтетична ДНК" (хі) Опис послідовності: SEQ ID №19 (2) Інформація для SEQ ID №20: (і) Характеристики послідовності: (A) До вжина: 34 пари основ (B) Тип: нуклеїнова кислота (C) Структура ланцюга: одноланцюжкова (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис:/опис = "синтетична ДНК" (хі) Опис послідовності: SEQ ID №20 (2) Інформація для SEQ ID №21: (і) Характеристики послідовності: (A) До вжина: 35 пар основ (B) Тип: нуклеїнова кислота (C) Структура ланцюга: одноланцюжкова (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис:/опис = "синтетична ДНК" (хі) Опис послідовності: SEQ ID №21 (2) Інформація для SEQ ID №22: (і) Характеристики послідовності: (A) До вжина: 48 пар основ (B) Тип: нуклеїнова кислота (C) Структура ланцюга: одноланцюжкова (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис:/опис = "синтетична ДНК" (хі) Опис послідовності: SEQ ID №22 (2) Інформація для SEQ ID №23: (і) Характеристики послідовності: (A) До вжина: 128 пар основ (B) Тип: нуклеїнова кислота (C) Структура ланцюга: одноланцюжкова (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А)Опис:/опис = "синтетична ДНК" (хі) Опис послідовності: SEQ ID №23 (хі) Опис послідовності: SEQ ID №23 (2)Інформація для SEQ ID №24: (і) Характеристики послідовності: (A) До вжина: 125 пар основ (B) Тип: нуклеїнова кислота (C) Структура ланцюга: одноланцюжкова (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис:/опис = "синтетична ДНК" (хі) Опис послідовності: SEQ ID №24 (2) Інформація для SEQ ID №25: (і) Характеристики послідовності: (A) До вжина: 132 пари основ (B) Тип: нуклеїнова кислота (C) Структура ланцюга: одноланцюжкова (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис:/опис = "синтетична ДНК" (хі) Опис послідовності: SEQ ID №25 (2) Інформація для SEQ ID №26: (і) Характеристики послідовності: (A) До вжина: 110 пар основ (B) Тип: нуклеїнова кислота (C) Структура ланцюга: одноланцюжкова (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис:/опис = "синтетична ДНК" (хі) Опис послідовності: SEQ ID №26 (2) Інформація для SEQ ID №27: (і) Характеристики послідовності: (A) До вжина: 30 пар основ (B) Тип: нуклеїнова кислота (C) Структура ланцюга: одноланцюжкова (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис:/опис = "синтетична ДНК" (хі) Опис послідовності: SEQ ID №27 (2) Інформація для SEQ ID №28: (і) Характеристики послідовності: (A) До вжина: 30 пар основ (B) Тип: нуклеїнова кислота (C) Структура ланцюга: одноланцюжкова (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис:/опис = "синтетична ДНК" (хі) Опис послідовності: SEQ ID №28 (2) Інформація для SEQ ID №29: (і) Характеристики послідовності: (A) До вжина: 133 пари основ (B) Тип: нуклеїнова кислота (C) Структура ланцюга: одноланцюжкова (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис:/опис = "синтетична ДНК" (хі) Опис послідовності: SEQ ID №29 (2) Інформація для SEQ ID №30: (і) Характеристики послідовності: (A) До вжина: 118 пар основ (B) Тип: нуклеїнова кислота (C) Структура ланцюга: одноланцюжкова (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис:/опис = "синтетична ДНК" (хі) Опис послідовності: SEQ ID №30 (2) Інформація для SEQ ID №31: (і) Характеристики послідовності: (A) До вжина: 128 пар основ (B) Тип: нуклеїнова кислота (C) Структура ланцюга: одноланцюжкова (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис:/опис = "синтетична ДНК" (хі) Опис послідовності: SEQ ID №31 (2) Інформація для SEQ ID №32: (і) Характеристики послідовності: (A) До вжина: 114 пар основ (B) Тип: нуклеїнова кислота (C) Структура ланцюга: одноланцюжкова (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис:/опис = "синтетична ДНК" (хі) Опис послідовності: SEQ ID №32 (2) Інформація для SEQ ID №33: (і) Характеристики послідовності: (A) До вжина: 17 пар основ (B) Тип: нуклеїнова кислота (C) Структура ланцюга: одноланцюжкова (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис:/опис = "синтетична ДНК" (хі) Опис послідовності: SEQ ID №33 (2) Інформація для SEQ ID №34: (і) Характеристики послідовності: (A) До вжина: 19 пар основ (B) Тип: нуклеїнова кислота (C) Структура ланцюга: одноланцюжкова (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис:/опис = "синтетична ДНК" (хі) Опис послідовності: SEQ ID №34 (2) Інформація для SEQ ID №35: (і) Характеристики послідовності: (A) До вжина: 75 пар основ (B) Тип: нуклеїнова кислота (C) Структура ланцюга: одноланцюжкова (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис:/опис = "синтетична ДНК" (хі) Опис послідовності: SEQ ID №35 (2) Інформація для SEQ ID №36: (і) Характеристики послідовності: (A) До вжина: 43 пари основ (B) Тип: нуклеїнова кислота (C) Структура ланцюга: одноланцюжкова (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис:/опис = "синтетична ДНК" (хі) Опис послідовності: SEQ ID №36 (2) Інформація для SEQ ID №37: (і) Характеристики послідовності: (A) До вжина: 46 пар основ (B) Тип: нуклеїнова кислота (C) Структура ланцюга: одноланцюжкова (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис:/опис = "синтетична ДНК" (хі) Опис послідовності: SEQ ID №37 (2) Інформація для SEQ ID №38: (і) Характеристики послідовності: (A) До вжина: 111 пар основ (B) Тип: нуклеїнова кислота (C) Структура ланцюга: одноланцюжкова (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис:/опис = "синтетична ДНК" (хі) Опис послідовності: SEQ ID №38 (2) Інформація для SEQ ID №39: (і) Характеристики послідовності: (A) До вжина: 42 пари основ (B) Тип: нуклеїнова кислота (C) Структура ланцюга: одноланцюжкова (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис:/опис = "синтетична ДНК" (хі) Опис послідовності: SEQ ID №39 (2) Інформація для SEQ ID №40: (і) Характеристики послідовності: (A) До вжина: 26 пар основ (B) Тип: нуклеїнова кислота (C) Структура ланцюга: одноланцюжкова (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис:/опис = "синтетична ДНК" (хі) Опис послідовності: SEQ ID №40 (2) Інформація для SEQ ID №41: (і) Характеристики послідовності: (A) До вжина: 35 пар основ (B) Тип: нуклеїнова кислота (C) Структура ланцюга: одноланцюжкова (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис:/опис = "синтетична ДНК" (хі) Опис послідовності: SEQ ID №41 (2) інформація для SEQ ID №42: (і) Характеристики послідовності: (A) До вжина: 35 пар основ (B) Тип: нуклеїнова кислота (C) Структура ланцюга: одноланцюжкова (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис:/опис = "синтетична ДНК" (хі) Опис послідовності: SEQ ID №42 (2) Інформація для SEQ ID №43: (і) Характеристики послідовності: (A) До вжина: 18 пар основ (B) Тип: нуклеїнова кислота (C) Структура ланцюга: одноланцюжкова (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис:/опис = "синтетична ДНК" (хі) Опис послідовності: SEQ ID №43 (2) Інформація для SEQ ID №44: (і) Характеристики послідовності: (A) До вжина: 20 пар основ (B) Тип: нуклеїнова кислота (C) Структура ланцюга: одноланцюжкова (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис:/опис = "синтетична ДНК" (хі) Опис послідовності: SEQ ID №44 (2) Інформація для SEQ ID №45: