Застосування рідкої мінеральної композиції для поліпшення адаптивної реакції рослин на зміну умов навколишнього середовища

Реферат: Винахід належить до області композицій удобрюючих речовин, що дозволяють зберігати або поліпшувати санітарний стан рослин, які використовують у сільському господарстві. Об'єктом винаходу є застосування концентрованої рідкої мінеральної композиції для обприскування листів формули (І) наступного складу: загальний аміачний азот N 0,08-2%, калій, виражений в K2О 3-6%, магній, виражений в MgO 0,4-0,8%, натрій, виражений в Na2O 1-2%, кальцій, виражений у СаО не більше 0,5%, загальні сульфати, виражені в SO 3 3-6%, хлориди Сl 1-2%, бікарбонати (в % НСО3) 1,2-3,0%, бор 0,1-0,2%, мідь 0,018-0,03%, марганець 0,000050,006%, йод 0,02-0,04%, цинк 0,00005-0,006%, залізо в мг/кг, 0,0002-0,003%, вода в кількості, достатній для 100 %, при цьому процентний вміст виражений у масових відсотках щодо загальної маси композиції, для поліпшення адаптивної реакції рослин на зміну умов навколишнього середовища. UA 105514 C2 (12) UA 105514 C2 UA 105514 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Область техніки, до якої відноситься винахід Цей винахід відноситься до області композицій удобрюючих речовин, що дозволяють зберігати або поліпшувати санітарний стан рослин, використовуваних у сільському господарстві, садівництві, лісівництві або в області лугових пасовищ. Зокрема, він відноситься до області композицій, що сприяють поліпшенню систем захисту рослин від зовнішніх біотичних або абіотичних агресивних впливів. Рівень техніки Показники рослин з точки зору росту, розвитку, нагромадження і виходу біомаси залежать, зокрема, від їхньої здатності адаптуватися до змін умов їхнього навколишнього середовища, які включають в себе фізичні, хімічні і біологічні агресивні явища. Наприклад, спостереження показали, що агресивні явища, такі як водний, осмотичний або термічний стреси являють собою фактори, що обмежують ріст рослин і, отже, рівень продуктивності в областях сільського господарства, садівництва, лісівництва або лугових пасовищ. Рослини, що зазнають впливу жари або посушливих умов, звичайно показують низький вихід біомаси, насінь, фруктів або інших продуктів, призначених для харчування людей або тварин, у тому числі худоби. Зниження врожайності, у тому числі втрати у виході споживаного рослинного матеріалу, наприклад, у виробництві рису, кукурудзи або пшениці, викликані стресовими подіями, приводять до нестачі продуктів харчування в деяких країнах, що розвивати. Агресивні явища активують у рослинах фізіологічні захисні механізми, які мобілізують ресурси для забезпечення виживання рослини і збереження її санітарного стану на шкоду ресурсам, використовуваним для збереження первісного рівня виходу необхідного рослинного матеріалу. У цілому з попереднього рівня техніки відомі самі різні рішення біологічного або хімічного характеру, призначені, щонайменше, для часткового захисту рослин від наслідків зовнішніх агресивних явищ. Зокрема, можна згадати технології генетичної модифікації рослин, призначені для забезпечення виробництва трансгенних рослин, що володіють переданою здатністю опору стресам, що описані, наприклад, у міжнародних заявках WO2007/125531, WO2007/060514, WO2008/050350 і WO2008/145675. Однак у цьому випадку мова йде про специфічні, тривалі і дорогі рішення, які необхідно відновляти для кожного рослинного різновиду, що генетично трансформується. Крім того, у цей час у багатьох країнах існують загальні або майже загальні регламентні заборони, що йдуть врозріз з стрімким розвитком виробництва генетично модифікованих рослин. Іншими шляхами вирішення проблеми стійкості рослин до стресових подій сьогодні є органічні або органомінеральні удобрюючі композиції, що випускаються на ринок, зокрема, рідкі композиції, які мають загальні або специфічні властивості, що дозволяють здолати дефіцит живильних елементів. Відомі також композиції, призначені для стимулювання у рослин природніх захисних реакцій проти агресивних впливів з боку патогенних біологічних організмів, наприклад, композиції, що містять такі речовини, як екстраговані з рослин молекули, агрополімерні гідролізати, екстракти мікроорганізмів, натуральні або модифіковані полісахариди, фітогормони, пептиди або білки, а також агоністичні або антагоністичні субстанції рослинних білків, відомі своєю участю в захисному механізмі рослин. Вищезгадані композиції можуть давати задовільні результати, зокрема, для боротьби з дефіцитом живильних елементів або для стимулювання захисних механізмів рослин проти патогенних біологічних організмів, таких як віруси, мікроорганізми або комахи. Однак, наскільки відомо заявникові, у цей час не існує чисто мінеральної композиції, здатної захищати або стимулювати рослини проти агресивних явищ типу абіотичних, таких як умови водного, осмотичного або термічного стресу, або одночасно сприяти реакції рослини стосовно агресивних видів з високим змістом хітину, таким як грибки. У всіх випадках, враховуючи економічне значення і роль у забезпеченні харчування людини або тварин, важливо мати рослини з гарним санітарним станом, зокрема, рослини, що характеризуються гарною продуктивністю в областях сільського господарства, садівництва, лісівництва або лугових пасовищ, тому існує потреба в широкому доступі до недорогих альтернативних композицій або композицій, удосконалених у порівнянні з відомими композиціями. Сутність винаходу Цей винахід стосується використання рідкої мінеральної композиції формули (I), детально представленої надалі в тексті цього опису, для поліпшення адаптивної реакції рослин стосовно зміни умов навколишнього середовища. 1 UA 105514 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Рідка мінеральна композиція формули (I) являє собою концентровану композицію, яку при застосуванні для обприскування листів використовують у розведеному виді у воді або водомісткій рідині. Зокрема, винахід стосується використання рідкої мінеральної композиції описаної нижче формули (I) для поліпшення адаптивної реакції рослини на біотичні або абіотичні стресові події. Абіотичні стресові події включають в себе, зокрема, водний стрес, осмотичний стрес, термічний стрес або дефіцит живильних речовин. Біотичні стресові події включають в себе, зокрема, контакт або зараження біологічними організмами, у тому числі патогенними мікроорганізмами, що містять хітин, а також речовинами, виробленими цими різними біологічними організмами або, що є їх похідними, включаючи в тому числі хітин. Опис фігур Фіг. 1А і 1В - криві кальцієвої реакції у сходів Arabidopsis thaliana десятиденного віку, що з'явилася в результаті обробки зростаючою кількістю композиції формули (I). На осі абсцис: час, 2+ виражений в секундах. На осі ординат: концентрація іонів Са у цитозолі, виражена в мікромолях (мкмоль). Фіг. 2А і 2В - криві кальцієвої реакції у сходів Arabidopsis thaliana десятиденного віку, що з'явилася в результаті холодного термічного шоку через 24 години після попередньої обробки рослин у присутності або під час відсутності композиції формули (I). На фіг. 2А і 2В показані результати двох серій ідентичних випробувань. На осі абсцис: час, виражений в секундах. На 2+ осі ординат: концентрація іонів Са у цитозолі, виражена в мікромолях (мкмоль). Фіг. 3 - криві утворення пероксида водню (Н2О2) у сходів Arabidopsis thaliana десятиденного віку в результаті осмотичного шоку через 24 години після попередньої обробки рослин у присутності або під час відсутності композиції формули (I). На осі абсцис: час, виражений в секундах. На осі ординат: довільні одиниці люмінесценції (RLU). Фіг. 4 - криві утворення пероксида водню (Н2О2) у сходів Arabidopsis thaliana десятиденного віку в результаті елісіторного шоку через 24 години після попередньої обробки рослин у присутності або під час відсутності композиції формули (I). На осі абсцис: час, виражений в секундах. На осі ординат: довільні одиниці люмінесценції (RLU). Фіг. 5 - довготривалі ефекти композиції формули (I) на розвиток сходів Arabidopsis thaliana, попередньо підданих впливу різних стресових впливів. На осі ординат: вимір росту сходів, виражений в сантиметрах кореневого росту, протягом двох тижнів перебування в стресових умовах. Гістограми на осі абсцис: (а) контрольні сходи, не оброблені і не піддані умові стресу; (b) неопрацьовані контрольні сходи, піддані водному стресу від NaCl; (с) неопрацьовані контрольні сходи, піддані осмотичному стресу від манітола; (d) сходи, оброблені композицією формули (I) і не піддані умові стресу; (е) сходи, оброблені композицією формули (I) і піддані водному стресу від NaСl; (f) сходи, оброблені композицією формули (I) і піддані осмотичному стресу від манітола. Докладний опис винаходу Після довгих досліджень заявник розробив рідку мінеральну композицію і довів, що вона має властивість поліпшення адаптивної реакції рослин на зміну умов навколишнього середовища. Зокрема, він показав, що рідка мінеральна композиція формули (I), представленої нижче в цьому описі, має при використанні після відповідного розведення властивість поліпшувати адаптивну реакцію рослин у відповідь на зміну різних умов навколишнього середовища, включаючи водний шок, осмотичний шок, і реакцію на контакт із деякими речовинами, що належать до біологічних організмів, таким як грибки. Цей винахід стосується також використання рідкої мінеральної композиції для обприскування листів формули (I) наступного складу: - загальний аміачний азот N (%) 0,08 %-2 % - калій, виражений в K2O (%) 3 %-6 % - магній, виражений в MgO (%) 0,4 %-0,8 % - натрій, виражений в Na2O (%) 1 %-2 % - кальцій, виражений у СаО (%) 0 %-0,5 % - загальні сульфати, виражені в SO3 (%) 3 %-6 % - загальний фосфор, виражений у Р2О5 (%) 0 % - хлориди Cl (%) 1 %-2 % - бікарбонати (в % НСО3) 1,2 %-3,0 % - бор (%) 0,1 %-0,2 % - мідь (%) 0,018 %-0,03 % - марганець (%) 0,00005 %-0,006 % 2 UA 105514 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 - йод (%) 0,02 %-0,04 % - цинк (%) 0,00005 %-0,006 % - залізо (мг/кг) 0,0002 %-0,003 % - вода решта, достатня для 100 % при цьому процентний вміст виражений у масових відсотках щодо загальної маси композиції, для поліпшення адаптивної реакції рослин на зміну умов навколишнього середовища. Мінеральна композиція формули (I) являє собою мінеральну композицію в концентрованому виді. Для її використання за допомогою обприскування листів мінеральну композицію формули (I) розбавляють відповідним чином у воді або у водомісткій рідині. Щоб перевірити, що композиція має якісні і кількісні характеристики по мінеральних елементах композиції вищевказаної формули (I), фахівець може звернутися до добре відомих методів кількісного аналізу для композицій цього типу. Наприклад, фахівець може застосовувати наступні методи аналізу композиції: (i) для кількісного аналізу аміачного азоту використовують метод, описаний Conway (Директива Європейського Союзу № 71/393, змінена європейськими директивами № 73/47 і № 81/681), (ii) для кількісного аналізу калію використовують метод кількісного аналізу К 2О згідно із французьким стандартом № NF U 44-140 і метод атомно-емісійної спектроскопії, (iii) для кількісного аналізу магнію використовують метод кількісного аналізу, описаний у французькому стандарті № NF U 44-140 і № NF U 44-146, і метод атомно-абсорбційної спектроскопії, (iv) для кількісного аналізу натрію Na2O використовують метод кількісного аналізу, описаний у французькому стандарті № NF U 44-140, і метод фотометрії, (v) для кількісного аналізу кальцію використовують метод атомно-абсорбційної спектроскопії, визначений у французькому стандарті № NF U 44-140, (vi) для кількісного аналізу загальних сульфатів використовують метод, визначений європейським стандартом № СЕЕ 8.1 і метод гравіметрії, (vii) для кількісного аналізу загального фосфору, вираженого у відсотках (маса/маса) Р2О5, застосовують метод, визначений стандартами NF U 42-241 (CEE 3.1) і NF U 42-246 (спектрометрія), (viii) для кількісного аналізу хлоридів застосовують метод, визначений французьким стандартом № NF U 42-371, (ix) для кількісного аналізу бікарбонатів використовують метод кількісного аналізу іонів гідрогенокарбоната згідно з технологією, описаною в стандарті № NF EN ISO 9963-1 (T 90-036), (x) для кількісного аналізу бору застосовують метод кількісного аналізу, визначений у європейському стандарті № СЕЕ 9-1 і № СЕЕ 9-5, якщо кінцева концентрація менше 10 % (маса/маса), або в європейському стандарті № СЕЕ 10-1 і № СЕЕ 10-5, якщо кінцева концентрація більше 10 % (маса/маса), (xi) для кількісного аналізу міді застосовують метод, визначений європейським стандартом № СЕЕ 9-1 і № СЕЕ 9-7, і метод атомно-абсорбційної спектроскопії, (xii) для кількісного аналізу марганцю використовують метод кількісного аналізу, визначений стандартом № ICP NF EN ISO 11885, (xiii) для кількісного аналізу йоду застосовують наступний метод: пробу подрібнюють у порошок згідно з підготовчим методом Гроті-Крекелера (у невеликі порцелянові ванночки занурюють кварцову трубку - стандарт DIN 53 474). Газоподібний йод абсорбується в каустичній соді, потім роблять фотометрію згідно з методом Санделла-Колтхоффа (з каталітичним впливом окисно-відновної пари Рє(IV)/As(III) на 436 нм). (xiv) для кількісного аналізу цинку застосовують метод кількісного аналізу, визначений стандартом ICP NF EN ISO 11885, і (xv) для кількісного аналізу заліза застосовують метод кількісного аналізу, визначений стандартом ICP NF EN ISO 11885. У переважних варіантах виконання композиція формули (I) являє собою композицію, що містить винятково мінеральні елементи або сполуки. У цих варіантах виконання композиція формули (I) являє собою чисто або винятково мінеральну композицію і, отже, не містить ніякого органічного елемента або сполуки, тобто ніякої вуглеводневої сполуки. Наприклад, композиція формули (I) не містить вітамінів, амінокислот, цукрів, органічних кислот або основ і т.д. Відповідно іншим відмітним ознакам, композиція формули (I) являє собою композицію в концентрованому виді, яку, як правило, розбавляють перед застосуванням на рослинах. Для одержання композиції вищевказаної формули (I) фахівець переважно може звернутися 3 UA 105514 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 до технічного змісту цього опису, включаючи приклади. Під "рослиною" у рамках цього винаходу слід розуміти однодольні рослини і дводольні рослини. Рослини в рамках цього винаходу включають в себе рослини, використовувані в областях сільського господарства, садівництва, лісівництва або лугових пасовищ. Сюди входять, зокрема, злакові культури, плодові дерева і квіти. Рослини включають в себе, зокрема, пшеницю, ячмінь, рапс, кукурудзу і рис і садові види, такі як яблуні, груші, сливи, персики, абрикоси і т.д. Дводольні рослини включають в себе наступні види і сімейства: Nymphaeaceae, Ceratophyllaceae, Ranunculaceae, Paraveraceae, Fumariaceae, Ulmaceae, Cannabinaceae, Urticaceae, Myricaceae, Fagaceae, Betulaceae, Aizoaceae, Chenopodiaceae, Portulacaceae, Caryophyllaceae, Polygonaceae, Plumbaginaceae, Elatinaceae, Guttiferae / Hypericaceae / Clusiaceae, Malvaceae, Malvaceae, Droseraceae, Violaceae, Cucurbitaceae, Salicaceae, Cruciferae / Brassicaceae, Resedaceae, Empetraceae, Ericaceae, Pyrolaceae, Monotopaceae, Primulaceae, Grossulariaceae, Crassulaceae, Saxifragaceae, Rosaceae, Lehuminosae / Fabaceae, Eleagnaceae, Halogaraceae, Lythraceae, Onagraceae, Viscaceae, Celastraceae, Aguitofoliaceae, Euphorbiaceae, Rhamnaceae, Linaceae, Polygalaceae, Aceraceae, Oxalidaceae, Geraniaceae, Balsaminaceae, Araliaceae, Umbelliferae / Apiaceae, Gentianaceae, Apocynaceae, Solanaceae, Convolvulaceae, Cuscutaceae, Menyanthaceae, Boraginaceae, Lamiaceae, Hippuridaceae, Callitrichaceae, Plantaginaceae, Buddlejaceae, Oleaceae, Scrophulariaceae, Orobanchaceae, Lentibulariaceae, Campanulaceae, Rubiaceae, Caprifoliaceae, Adoxaceae, Valerianaceae, Dipsacaceae і Compositae / Asteraceae. Під "адаптивною реакцією" рослини слід розуміти будь-яку фізіологічну зміну рослини, що виявляється, внаслідок впливу на зазначену рослину швидкої зміни умов навколишнього середовища. Фізіологічні зміни, що виявляються, охоплюють будь-яку зміну кількості або концентрації одного або декількох тканинних, у тому числі внутрішньоклітинних метаболітів або будь-яку якісну або кількісну зміну, що виявляється, ферментативної(их) дії(й) зазначеної рослини, або будь-яку зміну, що виявляється, морфології зазначеної рослини. Адаптивні реакції рослин приводять, зокрема, до виробництва клітками рослин метаболітів, називаних "вторинними сигналізаторами". Вторинні сигналізатори містять у собі іони кальцію і реактивні кисневі агенти (ROS). "Умови навколишнього середовища" охоплюють водні умови, солоність, осмотичні умови, окисні умови і термічні умови. Швидка зміна умов навколишнього середовища рослини в рамках цього винаходу буде називатися також "шоком" або "стресом". Умови навколишнього середовища містять у собі (i) "біотичні" умови, які створюються біологічним оточенням рослини, і (ii) "абіотичні" умови, що виникають у результаті зміни фізико-хімічного оточення рослини. Зміни умов навколишнього середовища, що представляють собою абіотичний стрес або шок, охоплюють стреси або шоки солоності, осмотичні, окисні, термічні шоки і шоки, викликані при контакті рослини з токсичними речовинами, такими як деякі метали або деякі органічні синтетичні токсичні хімічні речовини або деякі натуральні або синтетичні мінеральні хімічні речовини. Вони включають в себе також вплив іонізуючого або не іонізуючого випромінювання і недостатність або надмірність живильних речовин. Стрес або шок солоності може виникнути, коли рослина росте на ґрунті з високим вмістом хлориду натрію, наприклад, на полях або лугах, розташованих поблизу морського берега. Стрес солоності приводить, зокрема, до порушення регулювання гомеостазу або іонного розподілу в рослинних тканинах, наслідком чого є погіршення проростання насінь і росту рослини. Осмотичний стрес або шок може бути викликаний штучно культурою або субстратом з високим вмістом манітола. Осмотичний стрес викликає, зокрема, порушення регулювання гомеостазу або іонного розподілу в рослинних тканинах, наслідком чого є погіршення проростання насінь і росту рослини. Окисний стрес або шок може бути викликаний штучно культурою на метил-віологені. Зокрема, окисний стрес приводить до утворення реактивних кисневих агентів (ROS), до денатурації білків і до розкладання хлорофілу, що викликає знебарвлення рослини і може привести до її загибелі. Термічний стрес або шок включає в себе стрес, викликаний жарою, і стрес, викликаний холодом. Стрес культури від високої температури приводить, зокрема, до денатурації білків, що викликає погіршення вегетативного росту. Стрес культури від холоду приводить до утворення реактивних кисневих агентів, до руйнування клітинних мембран і, як наслідок, до погіршення вегетативного росту. Водний стрес культури може відбутися в сухих умовах. Зокрема, водний стрес пригнічує 4 UA 105514 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 клітинний ріст і фотосинтез, що приводить до погіршення вегетативного росту. Зміни умов навколишнього середовища, що є біотичним стресом або шоком, включають в себе стреси або шоки в результаті контакту рослини з одноклітинними або багатоклітинними організмами, наприклад, бактеріями, вірусами, грибками, фітофагами, комахами або патогенними організмами, або стреси або шоки в результаті контакту рослини з речовинами, що виділяються одноклітинними або багатоклітинними організмами. Біотичний стрес може бути викликаний бактеріями, вірусами або грибками або їх частинами або речовинами бактеріального, вірусного або грибкового походження. Композиція формули (I) відповідно до цього винаходу має властивість прямого створення фізіологічного каналу, що бере участь в адаптивній реакції рослин на зміну умов навколишнього середовища, у цьому випадку створення каналу кальцієвої сигналізації, яке показане в +2 прикладах у вигляді впливу підвищення концентрації іонів Са . Так, композиція формули (I) приводить у цитозолі клітин до кальцієвих змін, рівень яких залежить від кількості композиції формули (I), що вводиться в контакт із рослиною. При цьому показано також, що композиція формули (I) приводить до змін реакції рослин на абіотичний стрес, такий як термічний шок від холоду. Результати, представлені в прикладах, показують також, що композиція формули (I) відповідно до цього винаходу може стимулювати прискорення утворення пероксиду водню (Н2О2) при реакції на осмотичний стрес. Таким чином, згідно з деякими з аспектів, поліпшення адаптивної реакції рослин, викликане композицією формули (I), у рамках цього опису включає в себе: (i) властивість виявляємого посилення кальцієвої реакції рослини на абіотичний або біотичний стрес, при цьому посилення кальцієвої реакції виявляють за допомогою виміру +2 концентрації іонів кальцію Са у рослинних тканинах і, зокрема, у цитозолі рослинних клітин; і (ii) властивість виявляємого прискорення утворення пероксиду водню в рослинних тканинах у відповідь на абіотичний або біотичний стрес. Той факт, що композиція формули (I) відповідно до цього винаходу має властивість посилення кальцієвої реакції рослини у відповідь на біотичний або абіотичний стрес, є дуже важливим, те як іони кальцію, що утворюються в момент кальцієвої реакції, відомі як сполуки, що називаються "вторинними сигналізаторами" у каналах сигналізації, метаболічно і хронологічно виникаючих набагато раніше каскадного процесу, які приводять до наведення адаптивних реакцій у рослини, підданої впливу біотичного або абіотичного стресу. Відомо, що підвищення концентрації іонів кальцію приводить до активації білків, що володіють спорідненістю до іонів, таких як кальцієві білки. Потім активовані кальцієві білки активують, у свою чергу, інші білки, що володіють ферментативною активністю, такі як кінази, або активують інші білки, що не є ферментами, такі як білки типу "насоса" (Sanders, D., Brownlee, C., and Harper, J.F. (1999). Communicating with calcium. Plant Cell 11, 691-706. Shapiro, A.D. (2005). Nitric oxide signaling in plants. Plant Hormones VOL 72, 339-398; Brownlee, C. (2003). Plant signaling: Calcium first and second. Current Biology 13, R923-R924., Heitherington, A.M., and Brwonlee, C. +2 (2004). The generation of Са signals in plants. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 55, 401-427.; +2 Harper, J.F., Breton, G., and Harmon, A. (2004). Decoding Са( ) signals through plant protein kinases. Annu Rev Plant Biol 55, 263-288.; Mori, I.C., Murata, Y., Yang, Y.Z., Munemasa, S., Wang, Y.F., Andreoli, S., Tiriac, H., Alonso, J.M., Harper, J.F., Ecker, J.R., Kwak, J.M., and Schroeder, J.I. +2(2006). Cdpks CPK6 and CPK3 finction in ABA regulation of guard cell S-type anion-and Са permeable channels and stomatal closure-art. no e327. Plos Biology 4, 1749-1762.; George, L., +2 Romanowsky, S.M., Harper, J.F., and Sharrock, R.A. (2007). The ACA10 Са Atpase Regulates Adult Vegetative Development and Inflorescence Architecture in Arabidopsis. Plant Physiol.). Ці каскадні процеси сприяють встановленню специфічних адаптивних реакцій рослини у відповідь на первісний стрес. У якості адаптивної реакції рослин можна вказати, наприклад, закривання устячок, яке забезпечує обмеження втрати води під час періодів водного стресу, утворення осмотичних захисних елементів у відповідь на термічний або осмотичний стрес і утворення ендогенних токсичних сполук, в результаті чого відбувається обмеження наступу патогенних організмів. Дуже важливим є те, що композиція формули (I) відповідно до цього винаходу має властивість підсилювати окисну реакцію, зокрема, утворення реактивних кисневих агентів у відповідь на подію біотичного або абіотичного стресу. Зокрема, дуже важливо, що композиція формули (I) відповідно до цього винаходу сприяє, зокрема, утворенню пероксиду водню, який є найбільш стійким реактивним кисневим агентом і, отже, може в якості сполуки "вторинного сигналізатора" індукувати на відстані клітинні реакції, необхідні для реалізації адаптивної реакції рослини. Слід нагадати, що утворення реактивних кисневих агентів сприяє запуску 5 UA 105514 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 більшості адаптивних реакцій рослин у відповідь на абіотичний стрес. Слід також уточнити, що адаптивні реакції рослин на подію біотичного або абіотичного стресу, що приводять до утворення реактивних кисневих агентів, включають в себе: теплове розсіювання надлишкової енергії, фотохімічне розсіювання енергії з використанням кисню як акцептора електронної схеми переносу, використання цілого ряду ферментів і молекул-антиоксидантів для детоксикації вироблених ROS, залучення ферментів-антиоксидантів (супероксид дисмутаза, каталаза, глутатіон пероксидаза, аскорбат пероксидаза, пари тіоредоксін/тіоредоксін редуктаза, білки теплового шоку), залучення білків-переносників заліза і міді (трансферин, ферритин), залучення малорозмірних молекул-антиоксидантів: глутатіона, каротіноїдів, вітамінів А, С (аскорбінова кислота), Е (токоферол), убіхінона, флавоноїдів, білірубіну, і залучення олігоелементів (мідь, цинк, селищ), необхідних у якості кофакторів для діяльності ферментів-антиоксидантів. Таким чином, відповідно одному із цих аспектів, використання композиції формули (I) відрізняється тим, що поліпшує адаптивну реакцію рослин на біотичний або абіотичний стрес. У деяких варіантах реалізації використання композиції формули (I) відрізняється тим, що абіотичний стрес вибирають із групи, у яку входять водний стрес, осмотичний стрес, термічний стрес і дефіцит живильних речовин. Дефіцит живильних речовин включає в себе дефіцит мінеральних речовин, у тому числі дефіцит олігоелементів. Згідно з деякими варіантами реалізації, використання композиції формули (I) відрізняється тим, що біотичний стрес включає в себе, зокрема, контакт або зараження біологічними організмами, у тому числі патогенними мікроорганізмами, що містять хітин, а також речовинами, виробленими або похідними від цих біологічних організмів, включаючи хітин. Крім того, згідно з винаходом, композиція формули (I) має, зокрема, при обприскуванні листів, властивість стимулювати кореневий ріст рослин, причому як рослин у нормальних умовах вирощування, так і рослин, підданих, щонайменше, одній умові абіотичного або біотичного стресу. Так, згідно з іншими аспектами, використання відповідно до цього винаходу відрізняється тим, що композиція формули (I) сприяє також поліпшенню кореневого розвитку рослин. Поліпшення кореневого розвитку можна спостерігати візуально при збільшенні швидкості росту коріння шляхом виміру їх середньої довжини. Таким чином, композиція формули (I) комбінує (i) ефект посилення адаптивної реакції рослин на зміну умов навколишнього середовища й (ii) фізіостимулюючий ефект, що візуально виражається в прискоренні кореневого розвитку. Таким чином, доведено, що композиція формули (I) відповідно до цього винаходу при її нанесенні на рослини переважно шляхом обприскування листів забезпечує наступні технічні результати: - посилення кальцієвої реакції рослин на водний, осмотичний і термічний стреси, - посилення реакції на еліситацію захисних механізмів із залученням хітинового елісітора, - поліпшення окисного стану рослинних клітин за допомогою стимуляції утворення реактивних кисневих агентів, включаючи пероксид водню (Н2О2), - збільшення швидкості росту коріння молодих рослин, і - підвищення опору молодих рослин до посухи. Зокрема, у прикладах показані наступні ефекти композиції формули (I): А. на рівні вторинних сигналізаторів реакції рослин на біотичні/ абіотичні агресивні прояви +2 (Са і Н2О2), залучених у канали сигналізації: а) Композиція формули (I) сприймається рослиною як екзогенний стимул і наводить канали сигналізації, приводячи до цитозольних кальцієвих змін у клітках сходів Arabidopsis thaliana. Обробка композицією формули (I) приводить до змін у здатності рослини реагувати на стреси. b) Утворення реактивних кисневих агентів, таких як (Н2О2), у відповідь на хітиновий елісітор у сходів, попередньо оброблених композицією формули (I), перевищує ступінь утворення, обмірювану у сходів, що обприскуються водою. Цей результат вказує на посилення захисних реакцій рослин, попередньо оброблених композицією формули (I), у відповідь на елісітори, вироблені патогенними агентами. В. на рівні росту і розвитку сходів: а) Композиція формули (I) суттєво прискорює кореневий ріст сходів Arabidopsis thaliana у нормальних умовах або в умовах стресу (осмотичного або сольового). b) Поновлення розвитку сходів підданих сильному водному стресу, відбувається швидше при попередній обробці композицією формули (I). Результати прикладів показують, що композиція формули (I) впливає благотворно на ріст і розвиток сходів як у нормальних умовах вирощування, так і в умовах стресу. У деяких переважних варіантах виконання композиція відповідно до цього винаходу має 6 UA 105514 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 наступну формулу (II), яка перебуває в інтервалі формули (I): - загальний аміачний азот N (%) 0,08 %-1 % - калій, виражений в K2O (%) 3,5 %-4,5 % - магній, виражений в MgO (%) 0,4 %-0,5 % - натрій, виражений в Na2O (%) 1,2 %-1,6 % - кальцій, виражений у СаО (%) 0 %-0,1 % - загальні сульфати, виражені в SO3 (%) 3 %-5 % - загальний фосфор, виражений у Р2О5 (%) 0 % - хлориди Cl (%) 1 %-2 % - бікарбонати (в % НСО3) 1,5 %-1,9 % - бор (%) 0,1 %-0,15 % - мідь (%) 0,020 %-0,026 % - марганець (%) 0,00005 %-0,0002 % - йод (%) 0,025 %-0,031 % - цинк (%) 0,00005 %-0,0002 % - залізо (мг/кг) 0,0002 %-0,001 % - вода Кількість, достатня для 100 % при цьому процентний вміст виражений у масових відсотках щодо загальної маси композиції. В інших переважних варіантах виконання композиція відповідно до цього винаходу має наступну формулу (III), яка перебуває в інтервалах формул (I) і (II): - загальний аміачний азот N (%) 0,09 % - калій, виражений в K2O (%) 4 % - магній, виражений в MgO (%) 0,45 % - натрій, виражений в Na2O (%) 1,40 % - кальцій, виражений у СаО (%) 0,05 % - загальні сульфати, виражені в SO3 (%) 3,85 % - загальний фосфор, виражений у Р2О5 (%) 0 % - хлориди Cl (%) 1,40 % - бікарбонати (в % НСО3) 1,7 % - бор (%) 0,12 % - мідь (%) 0,023 % - марганець (%) 0,00005 % - йод (%) 0,028 % - цинк (%) 0,00005 % - залізо (мг/кг) 0,0003 % - вода Кількість, достатня для 100 % при цьому процентний вміст виражений у масових відсотках щодо загальної маси композиції. Об'єктом цього винаходу є також кожна з композицій, розкритих у цьому описі, в тому числі в прикладах і, зокрема, композиції формул (I), (II) і (III). У деяких варіантах виконання композицію формули (I) можна одержати відповідно до протоколу, деталізованого в наведеній нижче таблиці. - водопровідна вода Кількість, достатня для 100 % - йодид калію 0,030-0,050 % - хлорид натрію 0,8-1,2 % - борна кислота 0,6-1,0 % - карбонат натрію 2,0-4,0 % - сульфат калію 7,0-1,10 % - п'ятиводневий сульфат міді 0,05-0,15 % - сульфат амонію 1,5-3,5 % Вищевказані значення вмісту дані в масових відсотках для кожного інгредієнта щодо загальної маси рідкої композиції. Різні вищевказані інгредієнти додають у водопровідну воду при навколишній температурі, потім розчин ретельно перемішують до одержання стабільної рідкої композиції. Після цього рідку композицію фільтрують для видалення твердих речовин, що не розчинилися, щоб одержати готову до використання прозору композицію формули (I). Переважно композиція формули (I), включаючи її конкретний приклад формули (II), являє собою рідку сполуку в концентрованому виді, яку розбавляють у певному об'ємі води для одержання готової до використання розведеної композиції. 7 UA 105514 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Таким чином, винахід стосується також використання рідкої мінеральної композиції для обприскування листів, що представляє собою концентровану композицію формули (I), включаючи композицію формули (II), яку розбавляють в об'ємі води, 50-10000-кратному її об'єму, переважно 100-5000-кратному її об'єму, наприклад, 100-1000-кратному або 400-600кратному її об'єму, для посилення адаптивної реакції рослин на зміну умов навколишнього середовища. Винахід стосується також використання концентрованої мінеральної композиції формули (I), що відрізняється тим, що перед обприскуванням листів композицію формули (I) розбавляють у воді або у водомісткій рідині в пропорції Композиція (I):вода або водомістка рідина в межах від 0,1:500 (об'єм/об'єм) до 10:500 (об'єм/об'єм), переважно від 0,5:500 (об'єм/об'єм) до 2:500 (об'єм/об'єм). На практиці вищевказану розведену композицію наносять на рослини за допомогою розсіювання на верхніх частинах, переважно за допомогою обприскування листів. У деяких варіантах виконання вищевказану розведену композицію наносять на рослини за допомогою розсіювання на верхніх частинах у кількостях від 0,5 л до 20 л на гектар оброблюваної площі посівів, переважно від 0,5 л до 20 л на гектар оброблюваної площі посівів з періодичністю один раз у рік в один або кілька підходів. Наступні приклади, які не носять обмежувального характеру, ілюструють цей винахід. Приклади А. Матеріали і методологія прикладів А.1. Рослинний матеріал 10-денні сходи Arabidopsis thaliana екотипу Col 0 (дикоростучі) або екотипу No0 (трансгенні, що виражають індикатор кальцію екворин). Сходи вирощують або in vitro у чашках Петрі на здобреному агаром живильному середовищі (середовище MS, що випускається компанією Murashige et Skoog), або на перегної в горщику або в GiFi. При вирощуванні сходів in vitro попередньо стерилізовані насіння Arabidopsis thaliana висаджують рядками приблизно по 100 насінь. А.2. Вимір кальцієвої реакції сходів Arabidopsis thaliana Напередодні вимірів 50 паростків приблизно 10-денного віку відібрали від культури in vitro і розподілили в чашках Петрі партіями по три в 500 мкл води, що містить 2 мкл коелентеразіну, потім залишили на інкубацію в темряві при навколишній температурі на ніч, наступного дня зробили виміри за допомогою люмінометра, перемістивши партію із трьох паростків у чашку Петрі, що містить 1 мол розчину композиції формули (III) обраної концентрації, і записали сигнал, випромінюваний екворином після введення рослин у контакт (шляхом занурення) із продуктом. Після запису сигналу протягом 15 хв екворин розряджають шляхом упорскування розчину для лізису, що містить 100 мілімоль CaCl2, для калібрування сигналу. А.3. Вимір утворення Н2О2 у сходах Arabidopsis thaliana Зробили кількісний аналіз утворення Н2О2 в 10-денних сходах Arabidopsis thaliana за допомогою виміру люмінесценції, що з'являється при окисненні люмінола. Партії по три паростки помістили в чашках Петрі в люмінометр, потім вимірювали люмінесенцію протягом 10 хвилин після введення реакційного середовища (люмінол 20 мікромоль, пероксидаза 4 одиниці, Tris-hcl 5 мілімоль при рН 7.8) з додаванням або манітола 350 мілімоль, або хітину 10 мкг/мол, використовуваного в цьому випадку в якості засобу позитивного контролю, що сприяє утворення Н2О2. А.4. Вимір кореневого росту сходів, вирощених in vitro і попередньо оброблених композицією формули (I) Для кожного досліду рядок 10-денних сходів обробили за допомогою обприскування 2 %ною композицією формули (III), потім перемістили або на нормальне середовище, або на стресове середовище (Nacl 100 мфлфмоль або манфтол 350 мфлфмоль). Після цього щодня відслідковували ріст коріння. А.5. Спостереження розвитку сходів Arabidopsis thaliana в умовах стресу після попередньої обробки композицією формули (I) Насіння Arabidopsis thaliana висадили в горщику на перегної, потім вирощували в умовах спостереження за допомогою фітотрона (t=22/20C, фотоперіод 9/15, вологість 70 %) протягом 10 днів (A.thalianа). Потім молоді сходи обробили шляхом обприскування листів водою (контрольні зразки) або композицією формули (III) з концентрацією 2 % у воді, після чого помістили в умови стресу: осмотичного стресу (щоденний полив манітолом 350 мілімоль), сольового стресу (полив NaCl 100 мілімоль), водного стресу (без поливу). 8 UA 105514 C2 5 10 15 20 Потім розвиток сходів відслідковували щодня за допомогою фотографування. Приклад 1. Одержання композиції формули (I) Приготували композицію формули (I) що має наступну формулу (III): - загальний аміачний азот N (%) 0,09 % - калій, виражений в K2O (%) 4 % - магній, виражений в MgО (%) 0,45 % - натрій, виражений в Na2O (%) 1,40 % - кальцій, виражений у СаО (%) 0,05 % - загальні сульфати, виражені в SO3 (%) 3,85 % - загальний фосфор, виражений у Р2О5 (%) 0 % - хлориди Cl (%) 1,40 % - бікарбонати (в % НСО3) 1,7 % - бор (%) 0,12 % - мідь (%) 0,023 % - марганець (%) 0,00005 % - йод (%) 0,028 % - цинк (%) 0,00005 % - залізо (мг/кг) 0,0003 % - вода Кількість, достатня для 100 % при цьому процентний вміст виражений у масових відсотках щодо загальної маси композиції. Композицію формули (III) готували згідно із протоколом, представленим у нижченаведеній таблиці. Інгредієнти водопровідна вода Kl NaCl H3BO3 NaHCO3 MgCl2 K2SO4 CuSO4, 5H2O (NH4)2SO4 ВСЬОГО Кількість солі (г) Кінцева концентрація доданої солі (г/л) 2 500,00 1,00 24,00 20,00 72,50 65,00 247,50 2,50 62,50 0,40 9,60 8,00 29,00 26,00 99,00 1,00 25,00 495,00 198,00 25 30 35 40 45 Різні інгредієнти додали у водопровідну воду, потім розчин ретельно перемішали, щоб одержати рідину стабільної розчинної композиції. Потім рідину профільтрували для одержання готової до застосування прозорої і стабільної розчинної композиції формули (III). Для фільтрації можна використовувати ніздрюватий паперовий беззольний фільтр PRAT DUMAS® з розміром гнізда від 7 до 10 мікрометрів. У нижченаведених прикладах композицію формули (III) використовували з різними ступенями розведення від 0,01 % до 8,00 % (об'єм/об'єм) у водопровідній воді і отриману розведену композиції використовували для обприскування листів. Приклад 2. Вимір кальцієвої реакції сходів Arabidopsis thaliana при обприскуванні листів композицією формули (I) Було встановлено, що застосування композиції формули (III) сприяє кальцієвим змінам у клітинах, що доводить, що рослини сприймають композицію формули (III) як засіб стимулювання адаптивних реакцій у рослини. Результати показані на фіг. 1А и 1В у вигляді кальцієвих змін в 10-денних сходах Arabidopsis thaliana у результаті застосування композиції формули (III) різної концентрації (стрілка = момент введення до контакту сходів із продуктом). Для цього використовували сходи Arabidopsis thaliana, що виражають ген екворина в цитозолі. Були зроблені досліди з композицієюформули (III), розведеної від 0,01 до 8 % (об'єм/об'єм) у воді, і контрольний дослід з водою. У момент введення рослин у контакт із розчином спостерігається швидка зміна сигналу, зв'язана безпосередньо з маніпуляцією (механічні струси) і не залежне від концентрації продукту (це ж спостерігають і при контролі з водою). 9 UA 105514 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Результати показали, що композиція формули (III) активує дозозалежну бімодальну реакцію, максимум якої перебуває між 30 секундами і однієї хвилиною після введення рослин у контакт із продуктом, після якого слідує фаза поступового повернення до базового рівня при розведенні менш 2 % (об'єм/об'єм) або тривала горизонтальна ділянка при розведенні вище 2 % (об'єм/об'єм). Слід зазначити, що при концентрації композиції формули (III) вище 2 % (об'єм/об'єм) кальцієва реакція є швидкою, інтенсивною і сильно зашумленою. Таким чином, на підставі цих дослідів можна зробити наступний висновок: 1) Композиція формули (III) навіть при сильному розведенні 0,01 % (об'єм/об'єм) виявляє дію стимулювання кальцієвої реакції у рослин. Продукт викликає в цитозолі клітин кальцієві зміни, які міняються залежно від концентрації і, отже, від кількості композиції формули (III), яку наносять на листи. 2) При концентрації вище 2 % (об'єм/об'єм) ця кальцієва реакція має характеристики, що відрізняються від реакції, отриманої при концентрації менш 2 %. Зокрема, при концентрації вище 2 % (об'єм/об'єм) кальцієва реакція характеризується стійкою фазою горизонтальної 2+ ділянки (дельта [Ca ]>0/5 %), що може привести до інших кінцевих біологічних реакцій у відповідь на ці кальцієві сигнали "вторинної сигналізації". Приклад 3. Дослідження довготривалого впливу обприскування листів композицією формули (I) на кальцієву реакцію сходів Arabidopsis thaliana при термічному шоці від холоду Для визначення ефекту попередньої обробки сходів Arabidopsis thaliana композицією формули (III) на кальцієву реакцію, що індукується термічним шоком від холоду, 10-денні сходи обприскали напередодні вимірів 2 %-вим розчином композиції формули (III) або води (контрольний тест). Приблизно через три години після обробки відібрали зразки цих сходів і помістили для інкубації в коелентеразін на ніч, як було описано в розділі "Матеріали і методи". Наступного дня зареєстрували кальцієві реакції в цих сходах при термічній обробці (холодний шок). Як відомо, холодний шок при зануренні сходів у воду при 4С приводить до швидкої, інтенсивної і короткострокової кальцієвої реакції. На фіг. 2А і 2В показані середні результати, отримані в ході двох незалежних троєкратних серій дослідів через 24 години і 48 годин після попередньої обробки композицією формули (III). Після 24 годин спостерігають істотну відмінність в інтенсивності реакції, що індукується стресом, залежно від попередньої обробки (композицією формули (III) або водою). Було встановлено, що обробка композицією формули (III) значно підсилює реакцію на холод. У другій серії дослідів обробка композицією формули (I) привела до значної втрати чутливості до холоду в порівнянні з рослинами, обробленими водою. Таким чином, залежно від розглянутого випробування композиція формули (III) виявляє або посилюючу дію, або блокує реакцію, що не дозволяє зробити остаточний висновок про її ефект. Після 48 годин на двох серіях випробувань виявилося, що обробка PRP уже не відрізняється від обробки водою (контрольні випробування). Таким чином, результати прикладу 3 показують, що попередня обробка композицією формули (III) з концентрацією 2 % (об'єм/об'єм) приводить до зміни поведінки рослин під час кальцієвої реакції на холодний шок, якщо цей шок застосовують у період максимум до 24 годин. Приклад 4. Дослідження довготривалого впливу композиції формули (I) на утворення Н 2О2 у сходів Arabidopsis thaliana у відповідь на осмотичний шок або на елісіторну обробку речовиною, виробленою патогенним організмом. У прикладі 4 було поставлено завдання визначення ефекту попередньої обробки сходів Arabidopsis thaliana композицією формули (III) на реакцію Н 2О2, що викликана осмотичним шоком або елісіторною речовиною, виробленою грибковим мікроорганізмом, а саме хітином. У цьому випадку хітин використовують як позитивний контрольний індикатор, відомий своєю здатністю індукувати утворення Н2О2, для імітації агресивного впливу від патогенних агентів, здатних викликати захисні реакції, одним з показників яких є утворення Н 2О2. Для цього десятиденні сходи напередодні вимірів обприскали 2 %-вим розчином композиції формули (III) або водою (контроль). Наступного дня на цих сходах зробили виміри утворення Н2О2 у відповідь на вплив або осмотичним шоком (фіг. 3), або хітином (фіг. 4), як було описано в розділі "Матеріали і методи". Результати показані на фіг. 3 і 4. Фіг. 3 і 4 ілюструють утворення Н 2О2 у відповідь на осмотичний шок (фіг. 3) або на хітин (фіг. 4) у сходів Arabidopsis thaliana, попередньо за 24 години оброблених водою або композицією формули (III) з концентрацією 2 % (об'єм/об'єм). У відповідь на манітол, який у цьому випадку імітує водний стрес, інтенсивність спостережуваних реакцій є самою різною. Обмірюваний рівень інтенсивності у сходів, 10 UA 105514 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 попередньо оброблених композицією формули (III), нижче, чим у сходів, попередньо оброблених водою. З іншого боку, манітол не викликає утворення Н 2О2, що суттєво відрізняється від утворення, отриманого при попередній обробці сходів водою (контрольна Н 2О) або обприскуванні композицією формули (III) (PRP). Що стосується утворення Н2О2 при впливі хітином, можна відзначити, що у сходів, попередньо оброблених композицією формули (III), хітин викликає утворення Н 2О2 в 4-5 раз більше, ніж у сходів, попередньо оброблених композицією формули (III), але витриманих в умовах інкубації в присутності води (PRP). У випадку сходів, попередньо оброблених водою і стимульованих хітином, утворення Н 2О2 суттєво не відрізняється від стимулювання цих же сходів водою (контрольна Н 2О). Таким чином, результати прикладу 4 показують стимулюючий ефект на утворення Н 2О2 у відповідь на вплив хітином при попередній обробці сходів композицією формули (III). Це доводить, що сходи, попередньо оброблені композицією формули (III), мають здатність підсилювати свої захисні реакції у відповідь на можливе зараження патогенним агентом, що містять або виробляють хітин, таким як грибки. Приклад 5. Довготривалий вплив композиції формули (I) на кореневий ріст сходів Arabidopsis thaliana, вирощуваних in vitro. У прикладі 5 сходи Arabidopsis thaliana, вирощувані в чашках із середовищем, здобреним агаром, обприскали або композицією формули (III) з концентрацією 2 % (об'єм/об'єм), або водою. Наступного дня ці сходи перемістили в нові чашки або на нормальне середовище, або на стресове середовище, що містить 100 мілімоль NaCl або 350 мілімоль маннитола. Після цього щодня заміряли довжину основного кореня. На фіг. 5 показаний результат вимірів, зроблених через 24 години після переміщення на 2030 сходах однієї партії. Незважаючи на досить значний розкид довжин, спостерігається дуже істотний загальний ефект продукту PRP-EPV на кореневий ріст (p