Рекомбінантна молекула днк, яка може бути використана для одержання рослини з чоловічою стерильністю, спосіб одержання рослин із чоловічою стерильністю, спосіб одержання самозаплідненого насіння рослин з чолові

1. Рекомбинантная молекула ДНК, которая может быть использована для получения растения с мужской стерильностью и которая содержит ингибиторный ген, способный ингибировать экспрессию гена-мишени, присутствующего в указанном растении и кодирующего фермент пути биосинтеза халкона, и промотор, который является активным в клетках тапетума пыльников указанного растения и который оперативно сшит с указанным ингибиторным геном в целях осуществления экспрессии этого ингибиторного гена в клетках тапетума пыльников указанного растения. 2. Молекула ДНК по п. 1, отличающаяся тем, что указанный ген-мишень кодирует фермент, выбранный из группы, состоящей из циннамат-4гидроксилазы (С4Н; Е.С. 1.14.13.11), 4-кумароилКоА-лигазы (4CL; Е.С. 6.2.1.12) и халконсинтазы (CHS; Е.С. 2.3.1.74). 3. Молекула ДНК по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что ингибиторным геном является антисмысловой ген. 4. Молекула ДНК по п. 3, отличающаяся тем, что промотор, являющийся активным в клетках тапетума пыльников указанного растения, содержит фрагмент высокопродуктивного промотора и пыльниковый бокс, имеющий последовательность: способе получения растения с мужской стерильностью. 5. Молекула ДНК по любому из пп. 1-4, отличающаяся тем, что высокопродуктивный промотор содержит фрагмент промотора CaMV 35S и пыльниковый бокс, имеющий последовательность: (19) (21) 93004455 (22) 15.04.1992 (24) 15.06.2001 (31) 91200910.7 (32) 16.04.1991 (33) EP (86) PCT/NL92/00075, 15.04.1992 (46) 15.06.2001, Бюл. № 5, 2001 р. (72) Ван Тунен Адріанус Йоханес, NL, Ван Дер Мер Інгрід Марія, NL, Мол Йозефус Ніколас Марія (73) МОГЕН ІНТЕРНЕШНЛ Н.В., NL (56) WO 89/10396. 39169 где указанные переменные могут принимать следующие значения: X1= A, G, С или Т, Х2 = А или Т, Х3= А или С, Х4 = А или G, X5 = A, G или Т, Х6 = А или G, Х7= А или Т, Х8 = А или Т (SEQ ID NO: 1), X1= A, X2 = Т, Х3= С, Х4 = A, X5= G, X6 = A, X7=A, X8= T (SEQ ID NO: 2), X1= A, X2= T, Х3= C, Х4 = A, X5= A, Х6 = A, X7 = A, X8 = Т (SEQ ID NO: 3), X1= A, G, С или Т, Х2 = Т, Х3 = С, X4= A, X5= A, X6= =G, X7= А, Х8 = Т (SEQ ID NO: 4), X1 = A, X2 = A, Х3 = A, Х4 =G, X5= T, X6 = A, X7 = T, X8= A (SEQ ID NO: 5), для использования в способе получения растения с мужской стерильностью или восстановления фертильности в указанном растении с мужской стерильностью. ____________________ Настоя щее изобретение относится к рекомбинантной ДНК, предназначенной, в частности, для использования в ге нети ческом конструи рова нии расте ний. Кро ме того, настоящее изобретение относится к расте ниям, обла дающим н уклеарно кодиро ванной мужской стерильностью, обусловленной экспрессией указанной рекомбинантной ДНК; а также к частям указанных растений, ко торые являются репродуци руемыми либо путем полового размножения, либо путем бесполового разм ножения, либо тем и другим спо собом. Уже давно известно, что се мена, полученные в результа те перекрестного опыления различных сортов растений одного ви да, дают потомство, приспособляемости к внешним условиям, и сопротивляемости к болезням по сравнению с семенами, получен ными в результате самоопыления. Это явление обычно называют гетерозисом. Поэтому, целью промышленного производства семян обычно является получе ние гибридных семян многих сельскохозяйственных и садовых к ультур, поскольку такие семена имеют более высокую коммерческую ценность. Однако, к сожалению, многие культурные расте ния имеют мужские и женские репродуктивные органы на одной и той же особи, в которых в значительной степени превалирует самоопыление по сравнению с перекрестным опылением. Поэтому, для получе ния семян от перекрестного опыления, желательно получить та кие акцепторные расте ния, которые были бы неспособны к самоопылению вследствие отсутствия у них (правильно функционирующей) пыльцы. Такие растения, обладающие мужской стерильностью, или материнские особи затем подвергаются перекрестному оплодотворению с использованием растения-донора с мужской фертильностью в целях продуци рования гибридных семян. Для получения гибридных семян в больших количествах, обычно, расте ния, имеющие мужскую стерильность, и растения с мужской фертильностью выращивают вместе на полях в це лях стимуляции перекрестного опыления, после чего проводят селекцию гибридных семян. В зависимости от типа расте ний с мужской стерильностью, используе мых для перекрестного опыления, селекцию или отделение гибридных семян проводят либо до сбора урожая, т.е., путем уничтожения или удаления растений-доноров с мужской фертильностью, продук цирующих не гибридные семена: либо после сбора урожая, например, на основании маркера, такого, как цвет у кукурузы, или на основании др уго го ле гко обнаруживае мого феноти па. До урожайная селекция может бы ть проведе на в том случае, когда особи с мужской стерильностью и особи с мужской фертиль ностью являются легко отличимыми друг от др уга , а поэтом у особь с м ужской фер тиль ностью может быть удале на или уничто жена. Альтер нативно, если локус м ужской стерильности присоединить непосредствен но к селекти руемо му маркеру (такому, как резистентность к гер бициду), то растения с мужской стерильностью, дающие гибридные семена, смогут успешно конкурирова ть с расте ниями, имеющими мужскую фер тильность, посредством соответствующего да вления отбора. В качестве материнской линии, имеющей мужскую сте рильность, используют, например, расте ния, у которых бы ли фи зически удалены несозревшие пестики, либо натуральные расте ниямутанты с цитоплазматически или нуклеарно кодированной мужской стерильностью. Однако, указанные натурально стерилизованные расте ния имеют свои недостатки, которые заключаются в трудоемкости их по луче ния, наличии дополнительных нежелательных свойств, тр удности в их выращивании и размножении, непредсказуемости наследственности, или ограниченной возможности получе ния натуральных мутантов с мужской стерильностью для коммерчески ценных культур ных расте ний. Лишь недавно стало известно, что ге нетически сконструированные растения с нуклеарно кодированной мужской стерильностью могут быть использованы для получе ния гибридных семян, и что эти растения не имеют, по крайней мере, некоторых из вышеуказанных недостатков большинства натуральных мутантов с мужской стерильностью. В Международной патентной заявке WO 90/08830 ICI предлагаются способы получе ния воспроизводимых растений, заключающие ся, главным образом, в экспрессии а) либо гена, кодирующего ин гибитор белка, либо b) так называемого летального гена, который, при экспрессии его в мужских цветках, вызывает гибель клеток пыльника и ассоциированных с ним тканей. Например, указанные летальные гены, после их экспрессии, оказывают воздействие на метаболизм митохондрий. В Международной патентной заявке WO 90/08831 ICI, раскрывается ингибирование клеточного дыхания путем экспрессии летального гена, которое осуществляют в целях ингибирования ми 2 39169 тохондриальной функции, что, в свою очередь, приводит к гибели клеток, в которых экспрессируются указанные гены. Предпочти тельными белками гена-дезинтегратора являются: а) несвязывающийся белок (UCP) млекопитающего; b) мутированная форма гена, кодирующая b-1-субъединицу F1-ATP-азы, так, что имеющие ся мутации вызывают неспособность этих субъединиц к сборке в функциональную АТР-син тазу; с) мутированная синтетическая форма гена oli1, кодирующего субъединицу 9 F 0-ATP-а зы; d) мутированные формы митохондриального транзитного пептида для ингибирования транспорта белка в мито хондрии; е) генные конструкции, включая гибриды между дрожжевым геном b-субъединицы (АТР-а зы) и геном b-галактозидазы от Е. coli, экспрессия которых приводит к продуцированию разрушающи хся гибридных белков. Предпочтительно, если указанная экспрессия в соответствии с описанием вышеуказанной заявки, будет осуществляться под контролем тапетум- или пыльце-специфического промотора. В Международной патентной заявке WO 89/10396 PGS, предлагаются способы, которые, в общих чертах, относятся к получе нию растений, обладающи х мужской стерильностью, путем трансфор мации нуклеарного генома растения с помощью так называемой ДНК с мужской стерильностью, которая, как считается, кодирует РНК или полипептид, способный ингибировать правильный метаболизм, функционирование, и/или разви тие любой клетки тычинки, в которой экспрессируется указанная ДНК с мужской стерильностью, что приводит к гибели любой такой клетки тычинки. Примерами таких ДНК с мужской стерильностью являются ДНК, кодирующие ДНК-азы, РНК-азы, протеазы, или ферменты, ответственные за фитогормональный синтез, например, такие, как цитокин. Альтернативно, предлагается отбор ДНК с мужской стерильностью из антисмысловых ДНК, "которые кодируют нить ДНК, комплементарную нити ДНК, естественно транскрибированной в клетках тычинки расте ния". За исключением гена ТА29, ТА26 и ТА13, все та петум-специфические гены, происходящие от та бака, не дали какого-либо ключа к разгадке того, что конкретно эти гены означают. В статье Колтунова и др., (1990) (Koltunow et al.), клоны ТА13 и ТА29 были иденти фицированы как гены, кодирующие так называемые глицинобогащенные белки, тогда как клон ТА26 соответствуе т кДНК пока еще неизвестной природы. В Европейской патентной заявке ЕР-А-0 329 308 Palladin Hybrids, предлагается способ получения растений с мужской стерильностью, который заключается в продуци ровании генетически трансформированной материнской особи, в основном, путем вве дения в ге ном указанного растения рекомбинантных ДНК-последовательностей, включающи х в се бя антисмысловую ДНК, которая блокирует продуци рование функциональных пыльцевых зерен, либо способствует развитию пыльцевых зерен, восприимчивых к определенному химическому агенту или фи зиологическому стрессу, который блокирует продуцирование функциональных пыльцевых зерен. Предпочтительно, если указанные антисмысловые гены экспрессируются под контролем пыльце-специфического промото ра. В соответствии с описанием указанной заявки, гены, являвшиеся критическими в отношении продуци рования функциональных пыльцевых зерен, могут быть выбраны из генов, специфически экспрессированных в микроспорах, предпочти тельно в предмеиотической стадии. Примерами микроспороспецифических клонов являются L4 и L19, происходящие от Brassica napus. Кроме общих упоминаний о предмеиотических генах и вскользь названных клонах, никаких указаний на природу генов, экспрессия которых должна быть блокирована, в этой заявке не приводится. В заявке ЕР-А 0 335 451 под названием "Vereniging voor Christelijk Wetenschappelijk Onderwijs" указывается, что ингибирование экспрессии гена (наринген) халконсинтезы у цветущи х растений с использованием антисмыслового сконструированного гена приводит к изменению пигментации цветка. В этом эксперименте, этот антисмысловой ген находился под контролем промотора вируса мозаики цветной капусты (CaMV) 35S. Растения с измененной пигментацией цветков были, однако, способными продуцировать фертильную пыльцу. Халконсинтеза является основным фрагментом, ответственным за биосинтез флавоноида. Этот фермент катализирует поста дийную конденсацию трех ацетатных остатков из малонил-СоА и одного остатка из 4-коумароил-СоА с образованием нарингенинхалкона (Heller и Hahlbrock, 1980). Изомеризация и последующее замещение этих центральных интермедиатов приводят, в конечном счете, к продуци рованию флавоноидов. Флавоноиды являются вторичными метаболитами, которые, как известно, играют ключевую роль в пигментации цветков и плодов. Кроме того, флавоноиды, по всей вероятности, участвуют в защите растения против фи топатогенов (Lamb и др., 1989), и против воздействия Уф-излучения (Schmelzer и др., 1988), а также в индуцировании уз лообразования (Long и др., 1989). Флавоноиды также участвуют в ре гули ровании транспорта ауксина (Jacabs и Rubery, 1988) и резистентности к насекомым (Hedin и Waage, 1986). Такая многофункциональность флавоноидов требует соответствующей сложной регуляции генов, кодирующи х различные ферменты пути метаболизма. Например, экспрессия генов биосинтеза антоцианина является цветко-специфи ческой, светозависимой, и эволюционно регулируе мой (van Tunen и др., 1988; Koes и др., 1989а). Однако, экспрессия этих ге нов в други х тканях может быть индуцирована УФ-излучением, что приводит к повреждениям ткани и грибковой атаке (Dixon, 1986; Koes и др. 1989а; Lamb и др. 1989). Сравнение промотора CHS-A с другими промоторами от генов синтеза флавоноидов, которые являются активными в незрелой ткани пыльника, например, CHS-J, DFR-A и CHI-B, выявило наличие в них строго консервативной области, названной "пыльниковым блоком" (van Tunen и др., 1989). Делекционный анализ промотора CHS-A позволяет предположить, что пыльниковый блок сам по себе не является ответственным за пыльник-специфическую экспрессию, но он может участвовать в регуляции пыльник-специфической экспрессии вместе с др угими последовательнос 3 39169 тями, присутствующими в промоторе CHS-A (van der Meer и др., 1990). В 1981 году Сое и др. обнаружили, что полноценная на вид белая пыльца не осуществляет свою нормальную функцию в кукурузе, и этот факт позволяет предположить, что синтез или отложение пигмента является жизненно важным для нормальной функции пыльцы. Однако в этой статье не делается каких-либо выводов об участии фла воноидов в образовании пыльцы, если вообще этот факт не подвергается сомнению, поскольку в последующие го ды, как известно, никаких сообщений, свидетельствующи х об участии флавоноидов в образовании жизнеспособной пыльцы, зарегистрировано не было. Пояснения к терминологии Пыльниковый блок: нуклеотидная последовательность, которая является идентичной, или, по крайней мере, в высокой степени гомологичной любой из последовательностей, изображенных на рис. 1. Ан тисмысловой ген: ген, или нуклеотидная последовательность, происхо дящая от этого ге на, и имеющая гомологию более чем на 50%, а предпочти тельно более чем на 80%, с геном-мишенью, определенном ниже; причем, указанный ген сцеплен с промотором в ориентации, обратной ориентации 5'-3' по отношению к гену-мишени. Ген: нуклеотидная последовательность, которая может быть экспрессирована в виде РНКмолекулы и/или полипептида. Гибридный промотор: промотор, состоящий из нуклеотидных последовательностей, или отдельных нуклеотидов, которые в природе не ассоциируются друг с др угом, или не располагаются в данном порядке. Ингибиторный ген: ген или антисмысловой ген, экспрессия которого приводит, в конечном счете, к ингибированию экспрессии гена-мишени, определенного ниже. Промотор: нуклеотидная последовательность, которая способна стимулировать экспрессию гена или антисмыслового ге на; либо нуклеотидные последовательности, происхо дящие от нее; причем, указанная экспрессия осуществляется в ви де РНК-молекулы и/или полипептида. Восстановительный ген: ген, предпочтительно гибридный ген, включающий в себя, по крайней мере, какую-либо нуклеотидную последовательность, которая является достаточно идентичной, аналогичной или гомологичной части гена-мишени, определенного ниже, и способной, после экспрессии, к комплементарной ассоциации с транскриптом, продуци рованным ингибиторным геном, определенным выше. Ген-мишень: ген, экспрессия которого ингибируется надлежащей экспрессией соответствующего ингибиторного ге на, определенного вы ше. В целях настоящего изобретения, все указания положений оснований даются по отношению к предлагаемому сайту инициации транскрипции соответствующего ге на, находящего ся под его контролем. Целью настоящего изобретения является получе ние растений, которые имеют мужскую стерильность, и которые могут быть надежно использованы для продуци рования гибридных семян. Кроме того, еще одной целью настоящего изобретения является получение растений с мужской стерильностью, которые могут быть продуци рованы в гомозиготной форме с последующим их использованием для продуцирования экономически выгодных гетерозиготных растений с мужской стерильностью в крупных масшта бах. Настоящее изобретение относится к рекомбинантным полинуклеотидам, которые могут быть использованы для получе ния растений с мужской стерильностью, и которые, в основном, включают в себя: (a) ингибиторный ген, способный ингибировать экспрессию гена-мишени в указанном растении, кодирующего фер мент участвующий в биосинтезе халкона; и (b) промотор, который является активным в пыльниках указанного растения, и который при правильном присоединении к указанному ингибиторному гену способствует его экспрессии в пыльниках указанного растения. В соответствии с настоящим изобретением, предпочтительный ген-мишень кодирует фермент, выбранный из группы, включающей в себя: циннамат 4-гидроксилазу (С4Н; Е.С. 1.14.13.11), 4-кумароил-СоА-лигазу (4CL; Е.С. 6.2.1.12), и халконсинта зу (CHS; Е.С. 2.3.1.74). Особенно предпочтительным геном-мишенью является ген, кодирующий халконсинтазу (CHS) в растении. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, ингибиторным геном является антисмысловой ген, направленный против ге на-мишени. В другом предпочти тельном варианте осуществления настоящего изобретения, промотор, который является активным в пыльниках растения, включает в себя фрагмент промотора высокого уровня и пыльниковый блок, получаемый из области промотора группы генов, состоящей из гена chs-A, гена chi-B, гена chs-J и гена dfrA от Petunia. В особенно предпочти тельном варианте осуществления настоящего изобретения, промотор высокого уровня включает в се бя фрагмент промотора CaMV 35S и пыльниковый блок, имеющий последовательность TAGAGGTGAC AGAAAT (SEQIDNO: 2), вставленную в этот фрагмент в положении -90 по отношению к сайту инициации транскрипции. Настоя щее изобретение также относится к способу получе ния расте ния с мужской стерильностью, включающему в се бя следующие стадии: (a) перенос рекомбинантного полинуклеотида настоящего изобретения в клетки растения с мужской фертильностыо; (b) генерирование целиком новых растений из клеток, содержащих вве денный указанный рекомбинантный полинуклеотид, и (c) отбор растений, имеющих мужскую стерильность. В еще одном варианте своего осуществления, настоящее изобретение относится к рекомбинантному геному растения, который содержит введенный в него рекомбинантный полинуклеотид настоящего изобретения. 4 39169 Другим предметом настоящего изобретения является нуклеотидная последовательность, а именно: лен в промотор 35S (CaMV). Ниже представлены другие пыльниковые блоки, происхо дящие от различных генов биосинтеза флавоноида. Цифры в скобках обозначают относительное положение пыльникового блока по отношению к сайту инициации транскрипции гена инициации репликации. На фиг. 2 показана диаграмма различных стадий клонирования, используемых для получения химерных GUS-конструкций или химерных антисмысловых CHS-конструкций. На фиг. 3 схематически показан способ получе ния гибридных се мян с мужской стерильностью; причем, эти гибридные семена могут быть использованы для выращивания сельскохозяйственных культур, от которых не требуется получение семян или плодов; Х-материнская особь; Y-мужская родительская линия; CaMV-промотор вируса мозаики цветной капусты, 35S; АВ-пыльниковый блок, вставленный в промотор 35S; СНS-антисмысловой ген халконсинтазы. На фиг. 4 схематически показан способ получе ния гибридных семян с мужской фертильностью; причем, эти гибридные семена могут быть использованы для выращивания сельскохозяйственных культур, от которых необходимо получить семена или плоды; СНS-смысловой (нормальный) ген халконсинтазы; все остальные обозначения определены выше (см. фиг. 3). На фиг. 5 схематически показан способ получе ния гибридных семян с мужской фертильностью; причем эти гибридные семена могут быть использованы для выращивания культур ных растений, от которых необхо димо получить семена или плоды; GUS-ген b-глюкуронидазы Е. coli; CUS и ген СНS-азы были физически объединены в виде гибридного гена; все остальные обозначения определены выше (см. фиг.3). На фиг. 6 схематически показан способ получе ния гибридных семян, которые индуцируют мужскую фер тильность; причем эти гибридные семена могут быть использованы для выращивания культур ных расте ний, от которых необходимо получить семена или плоды; все обозначения определены выше. На фиг. 7 схематически показан способ получе ния гибридных семян, которые индуцируют мужскую фер тильность; причем эти гибридные семена могут быть использованы для выращивания культур ных расте ний, от которых необходимо получить се мена или плоды; NSP = неспецифическая часть восста новительного гена, предназначенная для устранения косуппрессивного действия CHS-части восстановительного гена; все остальные обозначения определены выше. Неожиданно было обнаружено, что экспрессия гена-"репортера" бактериальной b-глюкуронидазы (GUS) в трансгенных растениях Petunia hibrida, осуществляемая под контролем гибридного промотора, содержащего пыльниковый блок, происходящий от промотора из Petunia hibrida, сшитого с промотором 35S CaMV (да лее этот гибридный промотор будет обозначаться промотором AB/Ca MV 35S), протекает на значительно более высоком уровне в пыльниках по сравнению с тканями венчика, чем GUS-экспрессия, осуществляемая CaMV-промотором. Кроме того, было отмечено изменение клеточной специфичности, пос TNGAGGWGAМRDARWW (SEQIDNO: 1), где N = A, G, С или Т; W = А или Т; М = А или С; R = А или G и D = А, G, или Т, предназначенная для использования в способе получе ния расте ния с мужской стерильностью. В еще более предпочтительном своем варианте, настоящее изобретение относится к олигонуклеотидной последовательности, выбранной из следующей груп пы последовательностей: (a) (b) (c) (d) TAGAGGTGAC AGAAAT TAGAGGTGAC AAAAAT TNGAGGTGACAAAGAT TAGAGGAGAAGTAATA (SEQIDNO: 2) (SEQIDNO: 3) (SEQIDNO: 4) (SEQIDNO: 5) где N = A, G, С или Т, и предназначенной для использования в способе получе ния растения с мужской стерильностью. Настоящее изобретение относится также к способу получения оплодотворенных самоопылением семян растений с мужской стерильностью, содержащих введенный в них рекомбинантный полинуклеотид настоящего изобретения; при этом, указанный способ включает в себя следующие стадии: (a) контактирование пестика растения, имеющего мужскую сте рильность, с пыльцой от того же самого стерильного растения в присутствии соответствующего фла воноидного соединения, и (b) прорастание пыльцы на указанном пестике и оплодотворение расте ния с мужской стерильностью, и (c) получение семян от этого растения. В указанном способе, особенно предпочтительным флавоноидным соединением является соединение, выбранное из группы, содержащей мирицетин, кварцетин и кемпферол, предпочтительно в концентрации порядка от 100 нм до 3 мкМ. В еще одном предпочтительном варианте своего осуществления, настоящее изобретение относится к высокоэффективному в коммерческом отношении продуцированию гибридных семян путем использования больших количеств ге терозиготных растений с мужской стерильностью, которые были получе ны путем скрещивания гомозиготных растений нужного сорта, имеющи х мужскую сте рильность, с растениями того же сорта, имеющими мужскую фер тильность. Кроме того, настоящее изобретение относится к гибридным семенам, полученным в результате скрещивания или самоопыления любых расте ний настоящего изобретения. Другие предпочтительные варианты настоящего изобретения относятся к плазмидам рТS 20, pTS 21 и pTS 22. Преимущества и область применения настоящего изобретения будут легко оценены, исхо дя из представленного ниже подробного описания изобретения. На фиг. 1 показана последовательность пыльникового блока CHS-A, который был встав 5 39169 кольку экспрессия также наблюдалась в клеточном слое тапетума. При использовании промотора 35S, не содержащего пыльниковый блок, указанное изменение не наблюдалось. Очевидно, пыльниковый блок обладает способностью стимулировать пыльник-специфическую экспрессию, не требуя присутствия дополнительных цис-образующи х элементов, которые имеются в гене CHS-A, как ранее предполагалось. Гибридный промотор не является пыльник-специфичным, поскольку экспрессия также наблюдается и в других тканях. Пыльниковый блок обладает способностью к стимулированию экспрессии также в клеточном слое тапетума. В аналогичном эксперименте, описанном для GUS-гена-репортера, антисмысловой ген CHS (кДНК), происходящий от Petunia помещали под контроль промотора AB/CaMV 35S, и получен ную конструкцию использовали для трансформации гибрида Petunia VR, цве тущей п урпурными цветками. После отбора трансформированных растений, в которых была экспрессирована указанная конструкция, и после цветения этих растений, было обнаружено, что пыльники некоторых из этих растений были белыми вместо пурпур ных. Такие белые пыльники ни разу не были получе ны в более ранних экспериментах, в которых антисмысловой ген CHS-A был присоединен к нормальному промотору 35S, контролирующему экспрессию антисмыслового CHS-гена, хотя антисмысловой ген фактически экспрессировался в пыльниках. Отсюда можно сделать вывод, что блок пыльника, определенный выше, обладает способностью стимулировать экспрессию в клеточном слое тапетума гена (или антисмыслового гена) в тканях пыльника, если этот блок вставлен в сильный промотор, происхождения которого не имеет решающего значения. Более того, было даже установлено, что уровень экспрессии ингибиторного гена в тканях пыльника является достаточно высоким для ингибирования экспрессии гена-мишени в тканях пыльника. Затем, после попытки осуществления самоопыления трансгенных растений Petunia hibrida, имеющих белые пыльники, было неожиданно установлено, что эти растения обладают абсолютной мужской стерильностью. Существуют природные мутантные линии Petunia, в которых отсутствуе т функциональная халконизомераза. Халконизомераза участвует в превращении халконов в фла вононы, т.е., в одной из стадий пути биосинтеза флавоноида. Известно, что эти растения имеют мужскую фертильность. Отсюда можно сделать вывод, что для того, что бы получить расте ния с мужской стерильностью в соответствии с предлагаемым методом, ингибиторный ген должен быть выбран из группы генов, кодирующих ферменты, которые участвуют в пути биосинтеза, приводящего к образованию халкона, поскольку ингибирование этих ге нов не является летальным для растения в целом. В других экспериментах, в которых антисмысловой ген CHS-A Petunia помещали под контроль нормального промотора 35S CaMV, бы ло установлено, что антисмысловая СНS-конструкция может быть использована в качестве ингибиторного гена в целях ингибирования экспрессии генов мишеней также в венчиках табака и картофеля. Это свидетельствует о том, что метод с использованием антисмысловой, конструкции также работает в ге терологичных системах, и имеются серьезные основания предполагать, что посредством трансфор мирования антисмысловым СНS-геном от петунии под контролем АВ/35S промотора могут быть получены растения различных видов, обладающие мужской стерильностью. Поэтому, но вые способы настоящего изобретения предусматривают получение растений с нуклеарно кодированной мужской стерильностью, которые могут быть затем использованы для получе ния гибридных се мян. Для этих це лей, растения выбранного сорта генетически трансформируют путем введения в клетки указанных растений одного или нескольких рекомбинантных полинуклеотидов, содержащи х один или несколько ингибиторных ге нов, которые при надлежащей экспрессии в тканях пыльников растения, способны ингибировать экспрессию одного или нескольких ферментов, участвующих в био синтезе халкона. В основном, растения с мужской стерильностью получают путем ингибирования экспрессии соответствующего ге на-мишени, кодирующего фермент, ответственный за биосинтез халкона; причем указанное ингибирование осуществляют путем правильной экспрессии инги бированного гена, направленного против указанного гена-мишени. Такими генами-мишенями могут быть любые гены, которые кодируют фер менты, участвующие в биосинтезе халконов, или их промежуточных предшественников, поскольку ингибирование генов указанной группы не оказывает неблагоприятного воздействия на другие желательные характеристики растений данного сорта. В основном, гены-мишени могут быть выбраны из генов, кодирующи х ферменты, которые участвуют в конверсии предшественников халкона, например, такие, как циннамат 4-гидроксилаза (С4Н; Е.С. 1.14.13.11), предпочтительно 4-кумароил-СоА-лигаза (4CL; Е.С. 6.2.1.12), а наиболее предпочтительно халконсинтаза (Е.С. 2.3.1.74), которая способствуе т непосредственному превращению своего субстрата в халкон. Ингибиторные гены могут быть выбраны из ряда альтернативных генов, включая смысловые и антисмысловые гены, которые более подробно описаны ниже. Подходящие смысловые ингибиторные гены могут, например, кодировать рибозимы, направленные против РНК-продукта ге на-мишени; либо моноклональные антитела, направленные против продук та гена-мишени; либо селективные белковые ингибиторы фермента-мишени, если он присутствует. Альтернативно, ингибиторным геном может быть смысловой ген, который в основном, идентичен гену-мишени, и который при надлежащей экспрессии способен ингибировать ген-мишень в соответствии с еще неизвестным механизмом, называемым sense-sense-ингибированием или косуппрессией (Международная патентная заявка W090/11682, DNA Plant Technology inc.). Предпочти тельным ингибиторным геном является антисмысловой ген, направленный против гена-мишени. Ан тисмысловой ген необязательно должен быть полностью комплементарным гену 6 39169 мишени, поскольку его длина и гомология являются достаточными для осуществления довольно высокой степени ингибирования. Так, например, антисмысловой ген может быть (частично) комплементарным 5'-концу соответствующего гена-мишени, его 3'-концу, или срединной части, либо он может быть (частично) комплементарным целому гену-мишени. Понятие "частично комплементарный" означает, что данный антисмысловой ген является не полностью гомологичным гену-мишени, что может быть обусловлено, например, тем, что данный антисмысловой ген является гетерологичным (т.е., полученным из другого источника) по отношению гену-мишени и т.п. Ан тисмысловой ген может быть также целиком синтетическим. Выбор антисмыслового ге на не является решающим для настоящего изобретения, поскольку уровень гомологии и/или степень комплементарности этого гена являются достаточными для инги бирования экспрессии гена-мишени. Надлежащая экспрессия ингибиторного гена настоящего изобретения может быть осуществлена путем помещения инги биторного гена под контроль гибридного промотора, который состоит, по крайней, из промотора, являющего ся функциональным в растениях, и предпочтительно происходящего от промотора высокого уровня, например, РНК 35S CaMV (и ли его производных), и пыльникового блока, происхо дящего от гена, экспрессированного в незрелых тканях пыльников растений. Подхо дящие представители пыльниковых блоков могут быть получены, inter alia, из CHS-A-гена, CHS-J-гена, CHI-B-гена, или DFR-A-ге на, и т. п. Предпочти тельно, если указанный пыльниковый блок вводят в область промотора между -2000 и +1, более предпочтительно между -1000 и +1, а наиболее предпочтительно между -150 и -50. В особенно предпочти тельном варианте осуществления изобретения, пыльниковый блок вводят в промотор CaMV 35S, в по ложение -90. Выбор растения-источника, из которого получают пыльниковый блок, не является решающим фактором, поскольку этот пыльниковый блок будет нормально функционировать в конечном трансгенном хозяине. При этом, предпочтительно, чтобы используемый пыльниковый блок имел как можно более высокую гомологию с блоками, которые, как известно, в более высокой степени экспрессируются в пыльниках растения-хозяина. Такой пыльниковый блок может быть соответствующим образом синтезирован из известной последовательности пыльникового блока, присутствующего в конечном хозяйском растении, или любом другом расте нии, происходящем от другого растительного источника, либо полученном другими путями. Обычно, но необязательно, генетический материал, на котором располагается ингибиторный ген, присоединенный к гибридному промотору согласно настоящему изобретению, в виде либо рекoмбинантной ДНК, либо РНК, вводят в растение после рекомбинантного полинуклеотида, либо ДНК, либо РНК, непосредственно связанного с селектируемым или скринируемым признаком, таким, как резистентность к гербициду или антибиотику, в целях возможности осуществления ранней селекции или распознавания трансформирован ных клеток. Использование такого маркера, однако, является необязательным, поскольку присутствие и экспрессия ингибиторного ге на настоящего изобретения могут быть зафиксированы непосредственно при цветении трансгенных растений. Рекомбинантные полинуклеотиды поддерживают или амплифицируют в бактериях в ви де плазмид или других репликонов (например, инсертированных в вирусную ДНК или РНК). Альтернативно, рекомбинантные полинуклеотиды могут быть амплифицированы in vitro, например, с помощью полимеразно-цепной реакции (PCR), хо рошо известной специалистам в данной области. Однако, конкретный способ, используемый для этих целей, не играет решающего значения в настоящем изобретении. Введение рекомбинантных полинуклеотидов в расти тельный материал может быть осуществлено различными методами, хорошо известными специалистами в области биотехнологии растений. Способ введения генетического материала в клетки растения-хозяина не имеет большого значения, если только этот способ дает основание ожидать хорошего и предсказуемого результата. При этом необязательно, чтобы этот способ полностью исключал некоторую се лекцию при получении конечного результата. Та кая селекция неизменно имеет место в практике генной инженерии расте ний, однако, имеющие ся в распоряжении специалистов конкретные методы избавляют их от ненужного экспериментирования. В качестве иллюстрации может служить, например, трансформация протопластов методами с использованием кальция/полиэтиленгликоля (Krens и др., 1982; Negrutiu и др., 1987), электропорации (Shillito и др., 1985), микроинъекций (Crossway и др., 1966), бомбардировки частицами (покрытыми ДНК или РНК) (Klein и др., 1987), инфицирование вирусами и т.п. Предпочти тельной системой для переноса ДНК является бакте риальная система типа Agrobacterium. При осуществлении Agrobacterium технологии предпочтительно использовать систему так называемых бинарных векторов (Bevan и др., 1984). Использование подхо дящего бактериального фо на для переноса ДНК в расти тельные клетки и выбор векторов, соответствующи х се лективных маркеров, условий инкубирования, культуральных сред, и необхо димой техники клонирования ДНК могут быть с успехом осуществлены любым специалистом. После селекции и/или скрининга трансфор мированного растительного материала, из этого трансформированного материала генерируют целые расте ния, используя методы, широко описанные в литературе (см., например, Horsch и др., 1985). В эти х целях могут быть использованы любые растения, которые подтверждены трансформации и регенерации. Сам по себе метод трансфор мации и/или регенерации расте ний не имеет решающего значения для настоящего изобретения, если только он обеспечивает введение генетического материала в клетку растения и стабильную интеграцию генетического материала в ге номе клетки растения, а также регенерацию растительного материала с образованием побегов и последующим ускорением (или прививкой) и получе нием целого но 7 39169 вого растения. Выбор способа регенерации зависит от ти па используемого расти тельного материала, и/или конкретных целей исследователя. После получе ния трансформированных растений, они могут быть оценены на наличие нужных свойств и/или на степень выраженности нужных свойств. Сначала может быть проведена оценка уровня экспрессии ингибиторного ге на, и степени мужской стерильности трансгенных растений. Затем может быть проведена селекция трансгенных растений на стабильное и/или предсказуемое наследование признака мужской стерильности, и т.п. После этого, (гетерозиготные) растения с мужской стерильностью могут быть непосредственно использованы для продуцирования гибридных семян, или альтернативно, они могут быть подвергнуты самоопылению сохраненной пыльцой в целях получения гомозиготных растений с мужской стерильностью. Альтернативно, гомозиготные расте ния с мужской стерильностью могут быть получе ны путем самоопыления растений с мужской стерильностью жизнеспособной, но стерильной пыльцой (а) путем осуществления контактирования пестика растения, имеющего мужскую стерильность, с пыльцой того же самого стерильного расте ния в присутствии соответствующего флавоноидного соединения, и (b) проращивания пыльцы на пести ке, и оплодотворения растения с мужской стерильностью, и (c) получе ния семян растения. Перед самоопылением материнского растения с мужской стерильностью, незрелая пыльца может быть доведена до созревания в присутствии халконов. Особенно предпочтительными флавоноидными соединениями являются керцетин, кемпферол и мирицетин. Флавоноидное соединение может быть добавлено в соответствующую среду для пыльцы, та кую, как "ВК-среда", в конечной концентрации от около 10 нм до 10 мкМ, а предпочти тельно от около 100 нМ до 3 мкМ. Оптимальная концентрация может варьироваться в зависимости от соединения и вида, и вероятно даже от степени ингибирования продуцирования эндогенных фла воноидных соединений в растении с мужской стерильностью. Однако, исходя из указаний, приведенных в данном описании, подхо дящие концентрации флавоноидов могут быть определены для разных ситуаций без излишнего экспериментирования. Очевидно, что преимущество получе ния нескольких гомозиготных растений с муж ской стерильностью заключается в том, что это дает возможность быстро получа ть большие количества гетерозиготных семян с мужской стерильностью, которые могут быть непосредственно использованы для крупномасштабного продуцирования гибридных семян. Настоящее изобретение может быть применено к любому растению способному к самоопылению, и представляющему ин терес в отношении продуцирования гибридных семян. Второй вариант настоящего изобретения относится к способу получе ния гомозиготных растений с мужской стерильностью путем самоопыления гетерозиготных растений настоящего изобретения пыльцой, развитие которой было "спасено" благодаря временному присутствию халкона в незрелых пыльниках расте ния, в результате чего было предотвращено ингибирование in vivo синтеза халкона. В одном из осуществлений рассматриваемого варианта настоящего изобретения, предусматривается введение халконов для компенсации их нехватки в результате ингибирования экспрессии гена. Эта компенсация может быть осуществлена несколько иначе, а именно, путем временного сти мулирования in vivo продуцирования халконов. Это может быть достигнуто путем введения в дополнение к ингибиторному гену восстановительного гена под контролем индуцибельного промотора для осуществления контроля экспрессии восстановительного ге на извне посредством добавления соответствующего индуктора. Предпочти тельно, что бы этим восста новительным геном был, например, гибридный ген, содержащий, по крайней мере, часть гена-мишени, и способный, после его экспрессии, ингибировать действие экспрессии антисмыслового гена путем комплементарного связывания с антисмысловым транскриптом (см., напр., Robert и др., 1990). Как было вкратце показано выше, индуцибельное восстановление фертильности является также необхо димым в гибридных культур ных расте ниях, в которых коммерческую ценность представляют семена или плоды. Очевидно, что их мужская стерильность должна быть возвращена для осуществления опыления на полях в целях получе ния семян или плодов. Такое восстановление может быть, например, стимулировано путем введения индуктора в растение, возделываемое на полях, что приведет к доста точно высокой экспрессии восстановительного ге на и тем самым к нейтрализации антисмыслового транскрипта. В противоположность многим ранее разработанным способам получения растений с нуклеарно кодированной мужской стерильностью, способ настоящего изобретения не предусматривает экспрессию генов, кодирующих продук ты, которые являются токсичными по отношению к соматическим клеткам, например, ДНКазы, РНКазы или протеазы. Поэтому, в данном способе нет необхо димости в строго эволюционной или тканеспецифи ческой экспрессии, если эта экспрессия происходит в пыльниках. Растения с мужской стерильностью в соответствии с настоящим изобретением являются в высокой степени стерильными и обладают полной женской фертильностью. Кроме того, при крупномасштабном производстве гибридных се мян на полях или в оранжереях, расте ния с мужской фертильностью, т.е., предполагаемые самоопылители, могут быть идентифицированы от растений с мужской стерильностью, которые продуци руют гибридные семена, на основании измененной пигментации их пыльников. После этого, самоопылители могут быть отделены или уничтожены, если это необходимо, а их негибридные семена могут быть собраны отдельно. Другое преимущество способа настоящего изобретения заключается в том, что он позволяет получа ть гомозиготные расте ния, имеющие мужскую стерильность, что открывает большие возможности в сохранении и размножении гетеро 8 39169 зиготной материнской линии, имеющей мужскую стерильность. Поскольку для целей настоящего изобретения необходимо получи ть лишь несколько гомозиготных растений, то это ограниченное количество культи вировано in vitro с использованием стандартной техники. Гомозиготную линию с мужской стерильностью подвергают перекрестному опылению с использование родительской линии, обладающей мужской фертильностью, после чего получен ные гетерозиготные семена с мужской стерильностью используют для круп номасштабного продук цирования на полях гибридных культур ных растений. Из получен ных гибридных семян, 50% будут иметь мужскую стерильность, а 50% мужскую фер тильность. В случае если это отношение окажется недостаточным для получе ния высоких урожаев коммерческих культур (например, семян или плодов) путем самоопыления, то это соотношение может быть улучшено путем частичного восста новления мужской стерильности путем введения индук тора для активации экспрессии восстановительного ге на. Экспериментальная часть ДНК-методология Выделение ДНК, субклонирование, рестрикционный анализ и секувентирование осуществляли с использованием стандартных процедур, хорошо известных специалистам (см., например, Маниатис и др., 1982). Выделение ДНК из отдельных трансформантов петунии и анализ ДНК методом блоттинга в ге ле осуществляли в соответствии с описанием Коеs и др., 1987. Экстракция GUS и флуо рометрический и гистохимический анализы GUS От трансгенных растений собирали свежий материал и использовали для GUS-анализа. Экстракции GUS осуществляли в соответствии с описанием Jefferson и др., (1987), при этом, ткань измельчали с жидким N2 и Dowex-1 (Sigma). Флуорометрические измерения активности GUS проводили согласно описанию Jefferson и др., (1987). В величины, полученные в результате измерения, вносили поправку за гашение флуо ресценции экстракта путем измерения увеличения флуо ресценции после добавления известного количества 4метилумбеллиферила. Концентрацию белков определяли с помощью анализа белка Bio-Rad, используя в качестве стандарта альбумин бычьей сыворотки. Гистохимическую локализацию GUS-активности определяли в соответствии с описанием Koes и др., (1990). Перед окрашиванием, пыльники разрезали надвое острием бритвы. Для устранения фоновой GUS-активности в пыльниках использовали окрашивающий раствор X-gluc (pH 8,0). Для исключения артефактов, которые могут возникнуть вследствие разницы размеров клеток, проникновения субстрата в ткань и фоновой активности фермента, гистохимический анализ осуществляли повторно на пыльниках трансгенных и нетрансформированных растений. Для анализа на уровнях одиночных клеток, X-gluc-окрашенные ткани фиксировали и заливали в па рафин в соответствии с описанием Koes и др. (1990). Используя микротом, получа ли срезы с толщиной 7 мкм, и фотографировали эти срезы с помощью автоматического оптического микроскопа. Обнаружение флавоноидов Пыльники от десяти бутонов инкубировали в 1 мл 2 М НСl в течение 16 часов, и после гидролиза (20 минут при 100°С), флавоноиды экстрагировали в малом объеме изоамилового спирта и отделяли на TCL-чашках с целлюлозой, используя в качестве элюента смесь уксусной кислоты, соляной кислоты и воды (30:3:10). Выделение РНК и защита РНКазы Пыльники от 5-7 бутонов (размером 40-50 мм) использовали для выделения РНК в соответствии с описанием Коеs и др., (1989). Эндогенную мРНК CHS обнаруживали с помощью анализа на защиту РН Казы, который проводили в соответствии с описанием Tunen и др., (1988), используя полную кДНК CHS(А), клонированную в pTZ18U в качестве зонда (Коеs и др., 1989). Прораста ние пыльцы in vitro Растения выращивали при 18-22°С в стандартных условиях теплицы. Пыльцу со бирали с цветков и проращивали на отвержденной среде, содержащей 3 мМ Н3ВО3, 1,7 мМ Са(NО3)2, 10% сахарозу, 0,7% агар, рН 5,8. После этого пыльцу инкубировали 2 часа при 24°С в темном помещении и окрашива ли 1% ацетокармином в соответствии с описанием Bino и др., (1987). Примеры I. Конструирование химерных GUS-ге нов Хи мерные GUS-конструкции получа ли путем клонирования GUS-кодирующей области pRAJ 275 (Jefferson и др., 1987) в качестве EcoR/HindIII-фрагмента, затуп ленного полимеразой Кленова, в SmaI-сайте VIP122, который содержит CHS(А)-конец (van der Meer и др., 1990), с получением в результате pTS18. Клон pTS18 лигировали в плазмиду pTZ18R (Promega) в качестве SalI/HindIII-фрагмента, в ре зульта те чего получа ли pTS19. CaMV 35S промотор от VIP102 (van der Krol и др., 1988), переваренный EcoRI и BamHI, вставляли в pTS19, разрезанную EcoRI и BamHI, и получали в результате pTS23 (см., также фиг. 2). Олигонуклеотиды 5 '-GAGC TC TAGAGGTGAC AG AAATC TGC AG-3 ' (SEQIDNO:6) и 5 '-C TGC AGATT TC TGTC AC C TC TAGAGC TC -3 ' (SEQIDNO:7) гибридизировали друг с др угом, 5'-фосфорилировали с использованием киназы Т4, клонировали в pTS23, переваренную EcoRV, и получа ли pTS24. Ориентацию инсертированного пыльникового блока определяли путем частичного переваривания одного из двух рестрикационных сайтов, фланкирующих пыльниковый блок, с последующим исследованием меченных по концам фрагментов на секвенирующем геле. Все химерные GUS-конструкции были инвертированы в качестве EcoRI/HindIII в бинарный вектор Bin 19 (Bevan, 1984). II. Конструирование химерных антисмысловых генов CHS Аналогичный синтетический пыльниковый блок также клонировали в EcoRV-сайт в промоторе CaMV VIP102, со держащем конструкцию CaMVantisense-CHS(A)-nos; van der Krol и др., 1988. Ориентацию и число клонированных пыльниковых блоков определяли в соответствии с описанием, приведенным в примере I. В растения петуньи были введены следующие конструкции аntisenseCHS(A): pTS20 (с одним пыльниковым блоком в 9 39169 нормальной ориентации), pTS21 (с двумя копиями пыльникового блока в обратной ориентации) и pTS22 (с восьмью копиями пыльникового блока в нормальной ориентации). Все хи мерные antisenseCHS(А)-конструкции были инвертированы в качестве EcoRI/HindIII-фрагментов в бинарный вектор Bin 19 (Bevan, 1984). III. Трансформация растений Petunia Бинарные векторы, содержащие GUS-конструкции (рТS23, содержащую нормальный промотор CaMV 35S; pTS24, содержащую гибридный AB-CaMV 35S промотор) или antisense-CHS(А)конструкции (pTS20, pTS21, pTS22) переносили из JM83 Е. coli (Messing, 1978) в штамм LBA 4404 Agrobacterium tumefaciens (Hoekema и др., 1983) путем скрещива ния трех родителей (Rogers и др., 1986), используя штамм, содержащий плазмиду pRK2013 (Ditta и др., 1980). Для трансформации дисков листьев Petunia hybrida использовали эксконъюганты в соответствии с описанием Horsch и др. (1985.). Диски листьев получа ли из верхних листьев молодых нецветущих растений. В экспериментах по трансформации с GUS-консрукциями использовали Petunia hybrida, сорт W115, antisense-CHS(А)-конструкциями использовали гибрид петун ьи VR. После индукции стебля и корней на канамицин-содержащей среде, расте ния высаживали в почву и переносили в теплицу. Растения, регенерированные (на среде, не содержащей канамицин) из дисков листьев, обработанных штаммом LBA4404 не содержащим бинарного вектора, использовали в качестве контрольных. IV. Анализ трансгенных растений, экспрессирующи х GUS-конструкции Для излучения влияния пыльникового блока на регуляцию экспрессии гена, трансгенные растения, несущие GUS-конструкции, анализировали на ха рактер экспрессии в соответствии с методом, описанным в Экспериментальной части. Было проанализировано около 25 независимых трансгенных расте ний петунии, содержащи х AB/Ca MV 35S-GUS-конструкцию и для контроля 25 растений петунии, содержащих CaMV-GUSконструкцию. Поскольку уровень экспрессии введенного гена может быть разным у независимых трансфор мантов благодаря так называемому эффекту положения (Weising и др., 1988), то при измерении активности, обнаруживаемой в пыльниках, для каждого отдельного трансформанта, использовали в качестве внутреннего стандарта GUS-активность экзогенного гена в венчиках. Среднее отношение (т.е., от всех растений вместе взяты х) для растений, содержащи х конструкцию гибридного промотора, было выше, чем среднее отношение для контрольной промоторной конструкции. Для проверки значимости получен ного результата, все отдельные измерения были проанализированы с помощью рангового критерия Wilcoxon. При a