Рекомбінантна молекула днк, що кодує молекулу адгезії icam-3, молекула адгезії icam-3, антитіло, здатне зв’язуватись з такою молекулою, фармацевтична композиція

1 Рекомбинантная молекула ДНК, кодирую щая молекулу адгезии ІСАМ-3 или ее функцио нальное производное такое как фрагмент или ва риант ІСАМ 3, причем указанная молекула ДНК включает, по крайней мере, один фрагмент вы бранный из группы состоящей из следующих по следовательностей нуклеотидов GTG AGT TGC Val Ser Cys 10 CCG GCC GCG Pro Ala Ala 25 GAG AGT GAC Glu Ser Asp GTG CTC TCT Val Leu Ser GCT 46 Ala 15 GAG 94 Glu CCC AGC TCT Pro Ser Ser 30 GTG GCC AGT GGC 142 Val Ala Ser Gly 45 152 ATG GCT GGG GGT Met Ala Gly Ala 15 GCC CCG GGG CAG Ala Pro Gly Gin 30 GAC GGA CGC AGC Asp Gly Arg Ser 45 CAC GGC CAG TTC TTG CAG AG His Gly Gin Phe Leu Gin 60 TTA CTG ACC CTG GGC GTG GTG Leu Leu Thr Leu Gly Val Val 10 15 TTC AGG GAG CAC CAA CGG AGC Phe Arg Glu His Gin Arg Sei 30 46 94 142 189 CM *о~ ~ О r— CO CO h CM 48 Z3 en 96 нального производного, такого как фрагмент или вариант, в клетке 27763 3. Молекула адгезии ІСАМ-3 или ее функциональное производное, такое как фрагмент или вариант, по существу свободное от природных контаминатов, получаемое путем экспрессии рекомбинантной молекулы ДНК по п. 2 в клетке Glu 1 Giy Phe Leu Leu Ser Leu Не Ala Leu 35 Phe 20 Glu Gly Pro 1 Val Trp 50 Leu Arg Gly Gin Val Ala Gin Phe Cys 50 Leu Leu 35 Ser Thr 20 Gin Thr 1 Thr He Gly Ser 4. Молекула адгезии ІСАМ-3 или ее функциональное производное по п. 3, отличающееся тем, что функциональное производное представляет собой фрагмент 1САМ-3, выбранный из группы, состоящей из следующих последовательностей аминокислот: Arg Val 5 Val Asn Glu Pro Gin Asn Pro 10 Asp Cys Val Leu Ser Cys Ser Thr Ser Leu Ser 40 Thr 25 Lys Pro Ser Giu Leu Val Ala 45 Ser 30 Ser Ser Thr 5 Leu Asp Val Thr Val Ser Cys 10 Ala Ala Met Ala Gly Gly Val Leu Asn Ala Ala Thr Leu Ser Pro Val Leu 20 His Val Phe 5 Ala Leu Glu 55 Val Thr 40 Val Pro 25 Glu Ala Pro Ser Asp Asp His Glu Gin Ala Val Leu Gly Tyr Val 25 Leu Leu 10 Phe Arg Phe 60 Thr Gly 45 Leu Gly 30 Arg Met Glu His Gin 30 Tyr Val 35 5. Молекула адгезии ICAM-3 или ее функциональ ное производное по п. 3, отличающееся тем, что функциональное производное представляет собой химическое производное или токсинпроизводное ІСАМ-3. 6. Антитело или фрагмент антитела, способные связываться с молекулой, выбранной из группы, состоящей из ІСАМ-3 и функционального произ водного ІСАМ-3. 7. Антитело по п. 6, отличающееся тем, что свя зывание указанного антитела с указанной молеку лой придает способность указанной молекуле свя зываться с рецепторной молекулой. 8. Антитело по п. 7, отличающееся тем, что ука занным рецептором является LFA-1 9. Антитело по п. 7, отличающееся тем, что ука занным рецептором является МАС-1. 10. Антитело по п. 7, отличающееся тем, что ука занным рецептором является р150,95. 11. Фармацевтическая композиция, отличающая ся тем, что содержит агент, модулирующий ІСАМ3, выбранный из группы, состоящей из антитела, Рассматриваемая заявка является частичным продолжением патентной заявки США № 07/712879 (поданной 11 июня 1991 г.) и является родственной с патентной заявкой США № 07/045963 (поданной 4 мая 1987 г.), 07/ІІ5798 (поданной 2 ноября 1987 г.), 07/155943 (поданной 16 февраля І988 г.), 07/І898І5 (поданной 3 мая І988 г.) и 07/250446 (поданной 28 сентября 1988г.), 07/454294 (поданной 22 декабря 1989 г) и РСТ заявкой № PCT/US 91/02942 и PCT/US 91/02946 Ala Gly 15 Gfu Lys Gly Met Ala Arg 15 Gin Pro Ser Phe Gin Val Val 15 Arg Ser способного связываться с ІСАМ-3, фрагмента указанного антитела, причем указанный фрагмент способен связываться с ІСАМ-3; ІСАМ-3, функционального производного ІСАМ-3, и неиммуноглобулинового антагониста ІСАМ-3, отличного от ІСАМ-1, ІСАМ-2 или члена CD-18 семейства. 12. Фармацевтическая композиция по п. 11, отли чающаяся тем, что дополнительно содержит иммуносупрессорный агент. 13. Фармацевтическая композиция по п. 11, отли чающаяся тем, что содержит ІСАМ-3 модули рующий агент в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем. 14. Фармацевтическая композиция по п. 13, отли чающаяся тем, что адаптирована для использо вания с, по крайней мере, одним иммуносупрессорным агентом. 15. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 11-14, отличающаяся тем, что адаптирована для введения энтерально, парентерально, местно, путем ингаляции или интраназально. (поданной в приемную комиссию США 27 апреля 1991 г.), причем эти заявки включены сюда по ссылке Настоящее изобретение относится к открытию новой адгезионной молекулы, обозначенной ІСАМ-3, которая вовлечена в процесс, за счет которого популяция лейкоцитов распознает и прикрепляется к клеточному субстрату. ІСАМ-3 является посредником в клеточных взаимодействиях с другими лимфоцитами, макрофагами и нейтрофи 27763 лами в участках воспалений и участках иммунных реакций Далее настоящее изобретение относится к использованию ІСАМ-3 отдельно или в сочетании с ЮАМ-1 и/или ІСАМ-2, для ингибирования межклеточной адгезии клеток гранулоцитов, лимфоцитов или макрофагов Использование таких молекул обеспечивает способы лечения специфических и неспецифических воспалений Настоящее изобретение относится к терапевтическим и профилактическим способам супрессии инфицирования лейкоцитов HIV и, особенно, HIV-1, у индивидуумов, подверженных HIV или инфицированных HIV за счет введения ІСАМ-3 одной или в сочетании с ІСАМ-1 и/или ІСАМ-2 Оно предлагает лечение таких заболеваний, как AIDS (СПИД - синдром приобретенного иммунодефицита), которые вызываются вирусом HIV Настоящее изобретение относится к терапевтическим способам супрессии миграции инфицированных HIV-1 клеток из циркуляторной системы за счет использования ICAM-3, одной, или в сочетании с ICAM-1 и/или ICAM-2 Поэтому оно предлагает лечение таких заболеваний, как AIDS (СПИД - синдром приобретенного иммунодефицита), которое вызывается вирусом HIV Настоящее изобретение относится также к способам супрессии гибели Т-клеток и образования «синцитий» у индивидуумов, инфицированных HIV , за счет использования ICAM-3, одного или в сочетании с ICAM-1 и/или ICAM-2 Поэтому оно обеспечивает лечение таких заболеваний, как AIDS (СПИД - синдром приобретенного иммунодефицита), которое вызывается вирусом HJV Настоящее изобретение относится к использованию ICAM-3, одной или в сочетании с ICAM-1 и/или ICAM-2, при лечении астмы Настоящее изобретение дополнительно относится к молекулам, способным связывать ICAM-3 (здесь и далее анти-ЮАМ-3) Связывание антиICAM-3 молекул с ICAM-3 предназначено для модуляции биологических функций, связанных с ICAM-3 Связывающие молекулы настоящего изобретения могут быть антителами, пептидами, или углеводородами, которые способны связываться с ICAM-3 Такие связывающие молекулы пригодны для модулирования биологических функций ICAM3 Настоящее изобретение относится также к использованию анти-ЮАМ-3, одной или в сочетании с анти-ЮАМ-1 и/или анти-ІСАМ-2, или ингибирования межклеточной адгезии клеток гранулоцитов, лимфоцитов или макрофагов Использование таких молекул предлагает способ лечения специфических и неспецифических воспалений Настоящее изобретение относится также к терапевтическим и профилактическим способам супрессии инфицирования лейкоцитов HIV и, особенно, HIV-1 у индивидуумов, которые подвержены HIV или инфицированы HIV, за счет введения анти-ЮАМ-3 одной, или в сочетании с анти-ІСАМ1 и/или анти-ЮАМ-2 Поэтому, настоящее изобретение предлагает лечение таких заболеваний как AIDS (СПИД - синдром приобретенного иммунодефицита), которые вызываются вирусом HIV Настоящее изобретение относится к терапевтическим способам супрессии миграции HIV-1 инфицированных клеток из циркуляторной системы используя анти-ЮАМ-3 агент один или в сочетании с анти-ЮАМ-1 и/или анти-ІСАМ-2 агентами Поэтому оно предлагает лечение таких заболеваний как AIDS (СПИД - синдром приобретенного иммунодефицита), который вызывается вирусом HIV-I Далее настоящее изобретение относится к использованию анти-ЮАМ-3 агента, одного, или в сочетании с анти-1САМ-1 и/или анти-ІСАМ-2, при лечении астмы А Прикрепление лейкоцитов и функции Лейкоциты должны быть способны присоеди няться к клеточному субстрату или соответствующей защиты хозяина против чужеродного вторжения бактерий или вирусов, см Eisen,H W (в Microbiology, 3d Ed , Harper and Row, Phyladelphia, P A, 1980, pp 290-295 и 381-418) для обзора этих функций Лейкоциты должны быть способны при крепляться к эндотелиальным клеткам таким образом, чтобы они могли мигрировать из циркуляторной системы к участкам воспаления Более того, они должны прикрепляться к представляющим антиген клеткам таким образом, чтобы могла осуществляться нормальная специфическая иммунная реакция, и наконец, они должны прикрепляться к соответствующим мишеневым клеткам таким образом, чтобы мог происходить лизис инфицированных вирусом или опухолевых клеток Недавно молекулы поверхности лейкоцитов, вовлеченные в вышеуказанные функции присоединения, были идентифицированы с использованием гибридомной технологии Короче, моноклональные антитела, направленные против Т-клеток человека (Davignon, D, et al, Proc Natl Acad Sci USA, 78 4535-5439 (1981)) и клеток селезенки мышей (Springer, I Et al, Eur J Immunol , 9 310306 (1979)) были идентифицированы, известно, что они связаны с лейкоцитными поверхностями и ингибируют присоединения описанных ранее род ственных функций (Springer, I Et al, Fed Proc 44 2660-2663 (1985)) Молекулы, идентифицированные такими антителами, были названы Мас-1 и Антигеном-1, связанным с лимфоцитной функцией (LFA-1) Мас-1 является гетеродимером, который найден на макрофагах, гранулоцитах и крупных гранулярных лимфоцитах LFA-1 является гетеродимером, найденным на большинстве лимфоцитов (Springer, I A Eta! Immunol Rev 68 111-135 (1982)) Эти две молекулы плюс третья молекула, р 150-95 (которая имеет распределение ткани аналогичное Мас-1) играют роль в клеточной адгезии (Keiser G et al , Eur J Immunol 15 11421147(1985)) Было обнаружено, что вышеуказанные молекулы лейкоцитов являются членами родственного семейства гликопротеинов (Sanches-Madnd F Et al , J Exper Med 158 1785-1803/, Keiser G D et al, Eur J Immunol 15 1142-1147 (1985)) называемого "СД-18 семейством" гликопротеинов Это семейство гликопротеинов состоит из гетеродимеров, содержащих одну альфа-цепь и одну бетацепь Хотя альфа-цепь каждого из антигенов отличается от другой, было обнаружено что бетацепи являются высококонсервативными (Sanches 27763 Madrid, F. Et al., J. Exper. Med. 158.1735-1803 (1983)). Бета-цепь гликопротеинового семейства (иногда называемого как «СД18») как было найдено, имеет молекулярный вес 95 кд, тогда как альфа-цепи имеют молекулярный вес от 150 мд до 180 кд (Springer, I. Fed Proc. 44:2660-2663 (1985)) Хотя альфа-субъединицы протеинов мембраны не обладают высокой гомологичностью, присущей бета-субъединицам, тщательный анализ альфасубъединиц гликопротеинов показал, что между ними имеется существенное сходство. Обзор аналогий между альфа- и бета-субъединицами LFA-1 родственных гликопротеинов представлен Sanches-Madrid, F Et al. ( J Exper Med. 158- 586602 (1983)); J. Exper. Med. 158.1785-1803 (1983)). Была идентифицирована группа индивидуумов, которые оказались неспособными экспрессировать нормальные количества ни одного из адгезионных протеинов этого семейства на поверхности клеток их лейкоцитов (Anderson, D.C., et al., Fed. Proc. 44:2671-2677 (1985); Anderson, D.C., et al, J Infect. Dis. 152: 668-689 (1985)). Эти индивидуумы страдают от «болезни дефицита адгезивности лейкоцитов ("LAD" Anderson, D.C., et ai., Fed. Proc, 44:2671-2677 (1985); Anderson, D.C., et al., J. Infect Dis , 152:668-689 (1985)) Характерные особенности больных LAD включают язвы с некротическими мягкими тканями, недостаточное образование гноя и плохое заживление ран, а также ненормальные, зависящие от адгезии, функции нейкоцитов in vitro и подверженность хроническим и повторным бактериальным инфекциям. Гранулоциты таких LAD пациентов ведут себя несколько дефективно in vitro no сравнению с нормальными образцами в присутствии анти-СД18 моноклональных антител. То есть, они не способны осуществлять такие функции, связанные с адгезией, как аггрегация или прикрепление к эндотелиальным клеткам. Однако более важным наблюдением является то, что эти пациенты не способны вырабатывать нормальную воспалительную реакцию из-за неспособности их гранулоцитов прикрепляться к клеточным субстратам. Наиболее значительным является тот факт, что гранулоциты этих LAD пациентов не способны достичь участков воспаления, таких как кожные инфекции, из-за их неспособности прикрепляться к эндотелиальным клеткам в кровеносных сосудах вблизи воспаленных участков. Такое прикрепление является необходимым шагом для транссудации. Лимфоциты этих пациентов демонстрируют in vitro дефекты, аналогичные нормальным лимфоцитам, у которых СД-18 семейство молекул было антагонизировано антителами. Более того, эти индивидуумы не способны вырабатывать нормальную иммунную реакцию из-за неспособности их клеток прикрепляться к клеточным субстратам (Anderson, D.C., Fed. Proc, 44:2671-2677 (1985); Anderson, D.C., et al., J. Infect. Dis , 152:668-689 (1986)). Эти данные показывают, что иммунные реакции ослабляются, если лимфоциты не способны нормальным образом прикрепляться из-за недостаточной функции адгезионных молекул СД18 семейства. Таким образом, способность лейкоцитов поддерживать здоровье и жизнеспособность живот ных требует, чтобы они были способны прикрепляться к другим клеткам (например, эндотелиальным клеткам) Как было показано, такое прикрепление требует контакта "клетка-клетка", который включает специфические рецепторы молекул, имеющиеся на клеточной поверхности лейкоцитов. Эти рецепторы дают возможность лейкоцитам прикрепляться к другим лейкоцитам, к эндотелиальным клеткам и к другим несосудистым клеткам. Было найдено, что клеточные поверхности рецепторных молекул, LFA-1, Мас-1 и р15095 очень похожи друг на друга. У тех людей, лейкоциты которых не имеют на поверхности клеток рецепторных молекул, наблюдаются хронические и повторные инфекции, а также другие клинические симптомы, включая дефективные реакции антител. Кроме того, так как адгезия лейкоцитов включена в процесс, в результате которого идентифицируются и отторгаются чужеродные ткани, понимание этого процесса имеет существенное значение в области трансплантации таких твердых органов, как почки, трансплантации таких нетвердых органов, как костный мозг, при трансплантации тканей, при аллергии и в онкологии. В Инфицирование HIV HIV инфекция является причиной AIDS Описано множество вариантов HIV двумя основными являются HIV-1 и HIV-2 В Северной Америке и Европе преобладает HIV-1, a HIV-2 преобладает только в Африке. Эти вирусы имеют аналогичные структуры, и кодируют протеины с аналогичными функциями. Предполагают, что HIV инфекция происходит в результате связывания протеина вируса (именуемого «др120») с рецепторной молекулой (именуемой "СД4"), присутствующей на поверхности Т4 "«Тхелпер»" лимфоцитов (Schnittman, S.M., et al., J Immunol., 141:4181-4186 (1988), включено сюда по ссылке). После связывания с этим рецептором вирус проникает в клетку и реплицируется, и в этом процессе убивает Тклетки. Таким образом, разрушение Т4 популяции у индивидуумов и является прямым результатом HIV инфекции. Разрушение Т- клеток приводит к ослаблению способности инфицированного пациента бороться против инфекций. Хотя у индивидуумов, пораженных AIDS, часто развиваются раковые заболевания, связь между этими раковыми заболеваниями и HIV инфекцией в большинстве случаев неопределена. Хотя сам факт репликации вируса HIV является летальным для инфицированных клеток, обычно такая репликация детектируется лишь в небольшой части Т4 клеток инфицированного индивидуума. Полученные недавно результаты позволяют предположить, что наблюдается гораздо большая виромия, нежели предполагавшаяся ранее, и что инфицирование Т-клеток часто достигает 1%. Некоторые направления исследований разрабатывают другие механизмы, за счет которых HIV вирус осуществляет деструкцию Т4 популяции. Помимо HIV репликации, HIV инфицированные клетки могут быть разрушены за счет действия цитотоксичных, киллерных клеток. Киллерные клетки обычно присутствуют у людей и служат для контроля за хозяином, и разрушения любых чуже 27763 родных клеток (как, например, при переливании неподходящей крови или при трансплантации органов, и т д) при их появлении После инфицирования HIV, клетки Т4 выдвигают молекулы др120 на свою клеточную поверхность Киллерные клетки распознают такие Т4 клетки как чужеродные (а не нативные), и соответственно, осуществляют их разрушение HIV инфекция может также привести к разрушению неинфицированных, здоровых клеток Инфицированные клетки могут секретировать др120 протеины в кровеносную систему Свободные др120 молекулы могут затем связываться с СД4 рецепторами здоровых, неинфицированных клеток Такое связывание заставляет эти клетки принимать вид HIV инфицированных клеток Цитотоксичные, киллерные клетки распознают др120, связанные с неинфицированными Т4 клетками, принимают их за чужеродные и осуществляют деструкцию клеток Дополнительным механизмом, и одним из наиболее интересных для настоящего изобретения, по которому HIV является причиной гибели Т4 клеток, является механизм, осуществляемый за счет образования "синцитий" Синцитий является гигантской многоядерной клеткой, образующейся при слиянии такого количества, как несколько сотен Т4 клеток Инфицирование HIV вызывает у инфицированных клеток способность сливаться с другими Т4 клетками, независимо от того, являются ли они инфицированными HIV или здоровыми клетками Такие синцитии не могут функционировать и вскоре гибнут Эта гибель сопровождается деструкцией как HIV инфицированных, так и HIV неинфицированных Т- клеток Этот процесс представляет особый интерес для настоящего изобретения, так как включает непосредственный контакт клетка-клетка Т4 клеток Способность HIV инфицированных клеток образовывать синцитии указывает на то, что такие клетки приобретают средства для слияния со здоровыми клетками HIV инфекция и особенно HIV-1 инфекция, повидимому, влияет на экспрессию клеточной поверхностью интегринов лейкоцитов и реакции клеточной адгезии, осуществляемые этими гетеродимерами (Petit, A J , et al, J Clin Invest, 79 188 (1987), Hildreth, J E K , et al, Science, 244 1075 (1989), Valentin, A , et al, J Immunology, 144 934937 (1990), Rossen, P D et al , Trans Assoc American Physicians, 102 117-130 (1989), причем все ссылки включены сюда по ссылке После инфицирования HIV-1 возрастает гомотипическая аггрегация U 937 клеток, а также экспрессия клеточной поверхностью СД18 и СД11в (Petit, A J , et al, J Clin Invest, 79 188 (1987)) Инфицированные HIV-1 клетки U 937 прикрепляются к JL-1 стимулированному эндотелию гораздо чаще, нежели неинфицированные U 937 клетки, такое поведение можно подавить, обрабатывая инфицированные клетки анти-СД18 или анти-СД11 моноклональными антителами, или обрабатывая эндотелиальные субстраты анти-ІСАМ-І антителами (Rossen, P D et al, Trans Assoc American Physicians, 102 117130 (1989)) Моноклональные антитела к СД18 или СД11, как было обнаружено, также способны ингибировать образование синцитий, включающих фитогемагглютинином (РНА)-стимулированные лимфобластоидные клетки и конститутивно инфицированные, СД4-негативные Т- клетки (Hildreth, J Е К , et al , Science, 244 1075 (1989)) Как было показано, обработка инфицированных вирусом клеток только анти-СД18 или анти-СД11а моноклональными антителами оказывает слабое воздействие на образование синцитий, что предполагает что эти антитела принципиально защищают неинфицированные мишеневые клетки от инфекции (Hildreth, J E K , et al, Science, 244 1075 (1989), Valent, H A , et al, J Immunology 144 934937 (1990)) Valentin et al, (Valent H A, et al, J Immunology, 144 934-937 (1990)) недавно подтвердил эти наблюдения, продемонстрировав то, что моноклональные антитела, специфические для СД18, ингибируют синцитии, образующиеся в случае, когда непрерывные Т-клеточные линии культивируют совместно с HIV-1 инфицированными U 937 клетками Хотя механизм, за счет которого монокло нальные антитела, специфические для СД18 или СД11а, защищают подтверженные клетки от слияния с HIV инфицированными клетками, остается неизвестным, и это исследование вовсе не обязательно для целей настоящего изобретения, исследования с радиомеченными др120 позволяют предположить, что гетеродимеры, содержащие СД18, не предоставляют сайтов связывания для вируса ( Valentin, A , et al , J Immunology 144 934937 (1990)) Таким образом, HIV инфекция включает взаимодействие "клетка-клетка" и/или взаимодействие "вирус-клетка", которые имитируют такие взаимодействия, как "клетка-клетка" Взаимодействия типа "клетка-клетка" могут привести к транспорту клеток, не содержащих вируса, или инфицированных вирусом клеток через эндотелиальные барьеры Взаимодействия типа "вирусклетка", которые имитируют взаимодействия "клетка-клетка", могут облегчить или обеспечить присоединение свободного вируса к здоровым клеткам и/или инфицировать здоровые клетки Таким образом, настоящее изобретение возникло, частично, из наблюдения того, что HIV инфекция, и особенно HIV-1 инфекция, приводит к повышению экспрессии СД11а/СД18 гетеродимера и связывающего его лиганда Такое повышение экспрессии отличается тем, что оно повышает способность HIV-инфицированных Т- клеток прикрепляться или аггрегировать друг с другом (то есть, претерпевают «гомотипическую аггрегацию») Так как такая гомотипическая аггрегация не наблюдается между покоящимися нормальными лейкоцитами, это открытие означает, что экспрессия СД11/СД18 рецепторов и/или лигандов, таких как ICAM-1, необходима для такой аггрегации LFA-1 должен связаться с ICAM-1 для того, чтобы могла произойти гомотипическая аггрегация Как здесь было указано, ICAM-3 является единственным членом семейства ICAM молекул, которые с высокой степенью экспрессируются на покоящихся Т-клетках Только анти-ЮАМ-3 антитела способны блокировать адгезию Т-клеток к LF А-1 если Т-клетки не «активированы» Поэтому антиICAM-3 антитела можно использовать для супрессии аггрегации Т-клеток 27763 Дополнительно, анти-1САМ-3 антитела можно использовать для блокирования процессов адгезии инфицированных Т-клеток, которые позволяют осуществлять передачу HIV-1 с инфицированных клеток на здоровые клетки индивидуума, и также обеспечивают или облегчают инфицирование здоровых клеток свободным вирусом С. Миграция клеток, инфицированных HIV. Миграция и распространение лейкоцитов является важным фактором для защиты индивидуумов от последствий болезней. Однако, эти процессы являются также ответственными за миграцию и распространение инфицированных вирусом лейкоцитов. Наибольший интерес представляет миграция и распространение лейкоцитов, инфицированных HIV. Миграция таких клеток приводит к образованию экстраваскулярного фокуса, и может вызвать опухоли и другие нарушения. Гистологические исследования поврежденных органов выявляют фокальные экстраваскулярные мононуклеарные клеточные инфильтраты. Попытки идентифицировать инфицированные вирусом клетки в таких инфильтратах в центральной нервной системе выявили наличие HIV-1 инфицированных клеток. Эти исследования показали, что вирус HIV-1 находится, преимущественно в моноцитах и макрофагах, и других клетках этого направления (R.T. Johnson et al., FASEB, 2:2970 (1988); M.H. Stoler et al., J. Amer. Med. Assn., 256:2360 (1986); S. Garther et al., Science, 233:215 (I986)). Механизмы, которые стимулируют образование экстраваскулярных инфильтратов HIV-1инфицированных моноцитоидных клеток, ранее не были определены. Эти механизмы могут включать либо транспорт клеток, свободных от вируса, либо транспорт вируса через эндотелиальные барьеры внутри цитоплазмы инфицированных моноядерных клеток. Так как инфицирование HIV-1 стимулирует экспрессию клеточной поверхностью молекул, которые облегчают прикрепление лейкоцитов к эндотелиальным клеткам сосудов и трансляцию лейкоцитов из крови к участкам экстраваскулярных тканей, (C.W. Smith et al., J. Clin. Invest, 82: 1746 (1988)), включено по ссылке), было предложено использовать антитела, которые ингибируют клеточную миграцию для предотвращения распространения HIV-инфицированных клеток (WO 90/13316). Д. Астма: Клинические характеристики Астма является гетерогенным семейством заболеваний. Она характеризуется гиперреактивностью трахеобронхов на стимулы (Кау, А.В. Allergy and Inflammation, Academic Press, NY (1987); которая включена сюда по ссылке). Клинически астма проявляется сильным сужением трахеобронхов, густыми выделениями, спазмами, одышкой (dyspnea), кашлем и насморком. Хотя относительный вклад каждого из этих состояний неизвестен, общим результатом является возрастание сопротивления воздушных путей, гиперинфляции легких и грудной клетки, и ненормальное распределение вентиляции и потока крови в легких. Заболевание выражается в эпизодических периодах острых симптомов, прорывающих спокойные периоды. Острые приступы приводят к ги поксии и могут быть фатальными. Приблизительно 3% всего населения мира страдает от астмы. Были описаны два типа астмы: аллергическая астма и идиосинкразическая астма. Аллергическая астма обычно связана с наследственными аллергическими заболеваниями, такими как риниты, крапивница, экзема и т.д. Эти условия характеризуются положительными реакциями покраснения и появления волдырей на подкожные инъекции витающих в воздухе антигенов (таких как пыльца, загрязнители окружающей среды или среды обитания и т.д), и повышением уровней JgE в сыворотке. Развитие аллергической астмы, по-видимому, тесно связано с наличием JgE антител у многих пациентов. Больные астмой, у которых не обнаруживаются вышеуказанные признаки, рассматриваются как больные идиосинкразической астмой. Считают, что аллергическая астма зависит от JgE реакции, контролируемой Т и В лимфоцитами и активируется взаимодействием существующих в воздухе антигенов со связанными с мастоцитами заранее образовавшимися JgE молекулами. Отпор антигенов должен происходить при концентрациях, достаточных для доведения JgE продуцирования в течение достаточно продолжительного промежутка времени для сенсибилизации индивидуумов. Будучи однажды сенсибилизированным, больной астмой может демонстрировать симптомы в ответ на чрезвычайно низкие уровни антигена. Симптомы астмы могут усиливаться за счет присутствия и количества антигенов-триггеров, факторов окружающей среды, мест обитания, физических выделений и эмоциональных стрессов. Астму можно лечить метилксантинами (такими как теофиллин), бета-адренергическими агонистами (такими как катехоламины, резорцинолы, салигенины и эфедрин), глюкокортикоидами (такими как гидрокортизон), ингибиторами дегрануляции мастоцитов (например, такими хромонами как хромолиннатрий) и антихолинэргинами (например, атропином). Считают, что астма включает приток эозинофилов («эозинефилия») в ткани легких (Frigas, E J., Allergy Clin. Immunol. 77:527-537 (1986), включено по ссылке). Взгляд на иммунологические основы астмы был брошен в результате исследования бронхеоальвеолярного лаважа (Godard, P., et al., J. Allergy Clin. Immunol., 70:88 (1882)), и исследований тканей гладкой респираторной мускулатуры со снятым эпителием (Flavahan, N. A., et al., J. Appl. Physiol., 58:834 (1985); Barnes, P. J. et al., Br. J. Pharmacol., 86:685 (1985)). Хотя эти исследования и не привели к выяснению механизма, лежащего в основе иммунологии астмы, они привели к развитию общепринятой гипотезы, относящейся к иммунологической этиологии заболевания (см. Frigas, Е. Et al.. J. Allergy Clm. Immunol , 77 527-537 (1986)). Критериями патологии астмы являются массивная инфильтрация легочной паренхимы эозинофилами и разрушение функций мерцательного эпителия. "Эозинофильная гипотеза" предполагает, что эозинофиты прикреплены к бронхам для нейтра 27763 лизации вредных медиаторов, высвобождаемых тучными клетками легких (мастоїдитами). В соответствии с этой гипотезой эозинофилы притягиваются к бронхам, где они дегранулируют с высвобождением цитотоксических молекул. После дегрануляции эозинофилы высвобождают такие энзимы как гистамин, арилсульфатазу и фосфолипазу Д, которые энзиматически нейтрализуют вредные медиаторы мастоцитов Однако, эти молекулы промотируют также деструкцию мерцательного аппарата, что предотвращает очищение от бронхиальной секции и вносит вклад в повреждения легких, характерные для астмы. Так как астма включает миграцию клеток, было предложено использовать антитела, которые ингибируют такую миграцию для уменьшения действия аллергенов на субъектах (WO 90/10453). Настоящее изобретение основано на открытии новой клеточной адгезионной молекулы, названной Межклеточной адгезионной молекулой-3 (ІСАМ-3). Настоящее изобретение дополнительноотносится к функциональным производным ІСАМ3, анти-ІСАМ-3 антителам, фрагментам указанных антител, гуманизированным анти-ІСАМ-3 антителам, и к другим молекулам, способным связываться с ІСАМ-3 и ингибировать биологические функции ІСАМ-3. Кроме того, настоящее изобретение включает диагностическое и терапевтическое использование для всех вышеуказанных молекул. Более конкретно, настоящее изобретение включает ІСАМ-3, или его функциональное производное, практически не содержащее природных примесей. В настоящем изобретении предложен способ получения рекомбинантных или синтетических ДНК молекул, способных кодировать или экспрессировать ІСАМ-3, или его функциональные производные. Дополнительно настоящее изобретение предлагает антитела, и особенно моноклональные антитела, способные связываться с молекулами, выбранными из группы, состоящей из ІСАМ-3, и функциональных производных ІСАМ-3. Настоящее изобретение предлагает гибридомные клетки, способные продуцировать вышеуказанные моноклональные антитела. Настоящее изобретение включает способы получения целевых гибридомных клеток, которые продуцируют антитела, которые способны связываться с ІСАМ-3, или их функциональными производными, который включает стадии: (а) иммунизации животного иммуногеном, выбранным из группы, состоящей из: практически чистых ІСАМ-3; клеток, экспрессирующих ІСАМ-3; мембраны клеток, экспрессирующих ІСАМ-3; ІСАМ-3, связанных с носителем; пептидных фрагментов ІСАМ-3; или пептидных фрагментов ІСАМ3, связанных с носителем; (в) слияния клеток селезенки, выделенных из указанного животного, с миеломной клеточной линией; (с) предоставления возможности слитым селезеночным и миеломным клеткам образовывать антитела, способные секретировать гибридомные клетки; и (d) скринирования гибридомных клеток на предмет гибридомных клеток, способных продуцировать анти-ІСАМ-3 антитела В настоящем изобретении предложен также способ модулирования осуществляемых ІСАМ-3 биологических функций клеток, причем указанный способ включает введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества ІСАМ-3 модулирующего агента, причем указанным ІСАМ-3 модулирующий агент выбирают из группы, состоящей из антитела, способного связываться с ІСАМ-3, фрагмента указанного антитела, причем указанный фрагмент способен связываться с ІСАМ-3; ІСАМ-3; функционального производного ІСАМ-3; и неиммуноглобулинового антагониста ІСАМ-3, отличного от ІСАМ-1, ІСАМ-2 или членов СД-18 семейства молекул. В настоящем способе предложен также способ лечения специфических воспалений у людей и других млекопитающих, отличающийся тем, что указанный способ включает введение нуждающемуся в лечении субъекту такого количества противовоспалительного агента, которого достаточно для подавления воспаления, где противовоспалительный агент выбирают из группы, состоящей из антител, способных связываться с ІСАМ-3; фрагмента указанного антитела; причем указанный фрагмент способен связываться с ІСАМ-3; практически чистого ІСАМ-3; функционального производного ІСАМ-3; или неиммуноглобулинового антагониста ІСАМ-3, причем указанное воспаление является результатом трансплантации твердого органа (например, почки), трансплантации нетвердого органа (например, костного мозга) или пересадки тканей. В настоящем изобретении предложен также способ печения неспецифических воспалений у людей и других млекопитающих, отличающийся тем, что указанный способ включает введение нуждающемуся в лечении субъекту такого количества противовоспалительного агента, которого достаточно для подавления воспаления, причем противовоспалительный агент выбирают из группы, состоящей из: антител, способных связываться с JCAM-3; фрагментов указанных антител, причем указанный фрагмент способен связываться с ІСАМ-3; практически чистого ІСАМ-3; функциональных производных ІСАМ-3, или неиммуноглобулинового антагониста ІСАМ-3. Далее настоящее изобретение включает способ лечения воспалений, где воспаление связано с болезненными состояниями, выбранными из группы, состоящей из: синдрома расстройства дыхательной системы у взрослых, синдрома множественного поражения органов вторичного после сепсиса, кровотечения или травмы; поражений при переливании тканей миокарда или других тканей, острых гломерулонефритов; реактивных артритов, дерматозов с острыми воспалительными компонентами; острых пурулентных менингитов или других воспалительных заболеваний центральной нервной системы, например, ударов, ожогов, гемодиализа, лейкафереза, язвенных колитов, болезни Крона, некротирующих энтероколитов, синдромов, связанных с трансфузией гранулоцитов, и токсичности, вызванной цитокинами. 27763 Настоящее изобретение включает также способ подавления метастазов кроветворных опухолевых клеток, клеток, использующих члены СД-18 (особенно LFA-1) для миграции, где указанный способ включает введение пациенту, нуждающемуся в лечении, такого количества агента, которого достаточно для подавления метастазов, причем указанный агент выбирают из группы, состоящей из антител, способных связываться с ICAM-3; токсин-производных указанных антитела; фрагментов указанного антитела, причем указанный фрагмент способен связываться с ICAM-3; токсинпроизводного указанного фрагмента; практически чистого ICAM-3; токсин-производного ICAM-3; функционального производного ICAM-3, токсинпроизводного ICAM-3, или неиммуноглобулинового антагониста ICAM-3, отличного от члена СД-18 семейства молекул. Настоящее изобретение включает также способ подавления роста ICAM-3-экспрессирующих опухолевых клеток, причем способ включает введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, такого количества агента, которого достаточно для подавления роста, причем указанный агент выбирают из группы, состоящей из антител, способных связываться с ICAM-3, токсинпроизводного указанного антитела; фрагментов указанного антитела, причем указанный фрагмент способен связываться с ICAM-3; токсинпроизводного указанного фрагмента; токсинпроизводного члена семейства СД-18 молекул; или токсин-производного, функционального производного членов семейства молекул СД-18. В настоящем изобретении предложен также способ детектирования наличия клеток, экспрессирующих ICAM-3, причем указанный способ включает: (a) инкубирование клеток или экстракта клеток в присутствии молекул нуклеиновой кислоты, при чем молекулы нуклеиновой кислоты способны гибридизоваться в ICAM-3 MRNA; и (b) определение наличия гибридизации моле кул нуклеиновой кислоты с комплементарными нуклеиновой кислоте молекулами, присутствую щими в указанных клетках или в указанном экс тракте указанных клеток. В настоящем изобретении предложен способ определения наличия ICAM-3 в образцах биологических жидкостей, причем указанный способ включает: (a) инкубирование указанного образца с анти телами или их фрагментами, которые способны связываться с ICAM-3; и (b) детектирование наличия или отсутствия связывания антитела с указанным образом. В настоящем изобретении предложена также фармацевтическая композиция, содержащая" (а) агент, выбранный из группы, состоящей из1 антитела, способного связываться с ICAM-3; фрагмента указанного антитела, причем указанный фрагмент способен связываться с ICAM-3; практически чистого ICAM-3; функционального производного ICAM-3, или неиммуноглобулинового антагониста ICAM-3, отличного от членов СД-18 семейства молекул иммуносуппрессивного агента. Краткое описание чертежей Фиг.1-. Адгезия клеточных линий к очищенным LFA-1. Адгезия клеточной линии (А) и лимфоцитов (В) к очищенным LFA-1 объясняется ІСАМ-1, ICAM-2 и ICAM-3 Связывание BCECF меченых клеток на LFA-1 - покрытых микротитровальных ячейках в присутствии блокирующих МАЬ специфических для LFA-1, ІСАМ-1, ІСАМ-2 и ICAM-3. Контрольные ячейки были покрыты без LFA-1. Фиг.2.- Цитометрический анализ в потоке клеточной экспрессии ІСАМ-1 ІСАМ-2 и ICAM-3. (А) Лимфобластоидные клеточные линии были мечены насыщающими количествами либо МАЬ RR1 (1) анти-ІСАМ-1, МАЬ СВ-ІС2/1 (антиІСАМ-2), МАЬ CBR-IC3/1 (анти-ЮАМ-3) либо несвязывающим контролем МАЬ Х63 (тонкие линии), и затем с последующим FITC-антимышиным иммуноглобулином. (В) Покоящиеся человеческие лейкоциты и трехдневные РНА-активированные лимфоциты анализировали на предмет ІСАМ экспрессии, как указано ранее. Фиг.З.- Иммуноосаждение ІСАМ-3 (A) Лизаты l-меченных клеток иммуноосажденные любым из несвязывающихся контрольных Х63 МАЬ СВ-ІСЗ/1 (анти-ІСАМ-3) (B) 1251-меченые SKW3 клеточные лизаты, об работанные (+) или (-) N-гликаназой, и иммуноосажденные любым из несвязывающихся кон трольных МАЬ Х63, МАЬ W6/32 (анти-HLA-A, В, С), МАЬ RR 1/1 (анти-ЮАМ-1), МАЬ CBR-IC2/1 (антиІСАМ-2), либо МАЬ СВ-ІСВ/1 (анти-ЮАМ-3). Фиг.4.- Иммуноосаждение ІСАМ-3 из различных источников ІСАМ-3 иммуноосаждают из меченых лимфоцитных и нейтрофильных лизатов, используя МАЬсоединенную сефарозу. Иммуноосаждение ЮАМ3 разрешают, используя электрофорез на полиакриламидном геле. Остальные МАЬ используют для иммуноосаждения других молекул клеточной поверхности. Человеческий Ig сефаразы (контрольные полоски), CBR-IC2/1 (ICAM-2), CBRIC3/1 (ICAM-3), TS 2/4 (LFA-1), LM2/1 (МАС-1). Фиг.5.- Влияние РМА на SKW3 связывание с ICAM-1 и ICAM-3 Способность SKW3 клеток связываться с очищенными ICAM-1 и ICAM-3, и влияние РМА стимуляции этого связывания тестируют описанным ранее способом (Dustin et al., Nature, 341:619 (1989); Marlin et al., Cell, 51:813-819 (1987)). Один из представительных экспериментов представлен, а прямоугольники ошибок показывают стандартное отклонение (SD). Фиг.6.- Антитела, блокирующие РМА стимулированную клеточную адгезию Были тестированы различные антитела по их способности блокировать РМА стимулированные SKW3 клетки связывания с очищенными ICAM-I или ICAM-3, как было указано ранее (Dustin et al., Nature, 341:619 (1989); Marlin et al., Cell, 51:813819 (1987)). Один представительный эксперимент представлен, а прямоугольники ошибок показывают БД. Фиг.7.- Связывание COS клеточных трансфектантов с очищенными ICAM COS - клетки трансфектируют LFA-1 вектором экспрессии как было указано ранее (-de Fougerolles et al , I Exp Med , I75 I85-I90 (1992)) 27763 Эти трансфектированные клетки тестируют на предмет их способности связываться с иммобилизованными ICAM-1 и ICAM-3 в присутствии (или без) анти-LFA-i антител (TSI/22). Представлен один представительный пример, а прямоугольники ошибок указывают ЭД. Фиг 8.- Температурная зависимость РМА стимулированного SKW3 связывания с ICAM РМА стимулированную SKW3 клеточную способность связываться с очищенным ICAM-1 и ICAM-3 тестируют при 4, 16, 22 и 37°С, как указано ранее (Marlin et al., Cell, 51:813-819 (1987)). Анализ проведен в присутствии или без LFA-1 МАЬ (TSI/22). Представлен один представительный пример, а прямоугольник ошибок указывает SD. Фиг.Э.-Блокирование антителами РНАстимулированного деления Т- клеток Тестировали различные антитела по их способности блокировать РНА-стимулированное деление Т- клеток, как указано ранее (Krensky et al., J. Immunol., 131 616 (1983)). Фиг. 10.- Влияние анти-ІСАМ антител на смешанные лимфоцитные реакции Различные антитела тестировали по их способности блокировать смешанные лимфоцитные реакции, как указано ранее (Krensky et al, J. Immunol, 131:616(1983)). Фиг. 11 - Газохроматографический анализ пептидных фрагментов ICAM-3 ICAM-3 очищают и переваривают Lys-C Пептидные фрагменты разделяют, используя высокоэффективную жидкостную хроматографию. Фиг. 12.- Диаграммное представление клона 11.2 Схематическое представление клона 11.2. Показаны положения NK-10 и NK-17 пептидов, различные ДНК-последовательности, полученные таким образом, и трансмембранные участки. Фиг. 13.- Последовательное сравнение NK-1T примированной последовательности с ICAM-1 человека GAP- программу использовали для идентификации гомологичности последовательности NK-10 примированной последовательности и протеина ICAM-1 человека. Фиг.14.-.Сравнение последовательности RM13 примированной последовательности с ICAM-1 человека GAP-программа была использована для идентификации гомологичности последовательности для RM13 примированной последовательности и ICAM-1 человека. Фиг. 15.-Сравнение последовательностей RM13 примированной последовательности с ICAM-2 человека GAP- программу используют для идентификации гомологичности последовательности RMI3 примированной последовательности и ICAM-2 человека. Фиг. 16.- Сравнение последовательностей Т7 примированной последовательности с ICAM-1 человека. GAP- программу использовали для идентификации гомологичности последовательности Т7 примированной последовательности и ICAM-1 человека. Фиг. 17.- Сравнение последовательностей Т7 примированной последовательности с ICAM-2 человека GAP- программу использовали для идентификации гомологичности последовательностей Т7 примированной последовательности и ICAM-2 человека. Фиг. 18.-Частичная последовательность ICAM3 ДНК последовательность клона 11.2 определяют, используя стандартную процедуру. A. Последовательности, полученные с 5 клона ICAM-3. Эти последовательности получают, примируя клон 11.2 Т7 праймером. B. Последовательности, полученные внутри ICAM-3 гена. Эти последовательности были полу чены при примировании клона 11.2 NK-10 зондом C. Последовательности, полученные с 3 конца ICAM-3. Эти последовательности были получены при примировании клона 11.2 обратным RM13 праймером. Описание предпочтительных вариантов Настоящее изобретение основано на открытии ранее неидентифицированного связывающего лиганда с LFA-I. Такие молекулы, как молекулы семейства СД-18, которые включены в процесс клеточной адгезии называются далее «адгезионными молекулами». I. LFA-1 Лейкоцитная адгезионная молекула LFA-1 осуществляет взаимодействия широкого круга лимфоцитов, моноцитов, нативных коллерных клеток и гранулоцитов с другими клетками в иммунных реакциях и при воспалительных процессах (Springer, T.A. et al., Ann. Rev. Immunol. 5:223252 (1987)). LFA-1 является рецептором для ICAM-1, ICAM-2 и вновь идентифицированного ICAM-3 (раскрытого здесь) Эти молекулы поверхностей, в основном, экспрессируются на некоторых тканях и индуцируются на других в воспалительных процессах (Marlin, D. et al., Cell, 51:813-819 (1987), Dustin, M.L. et al., Immunol., 137:245-254 (1986); Dustin, M.L et al., Immunol. Today, 9:213-215 (1988); патентная заявка США № 07/019440, поданная 26 февраля 1987 г. и патентная заявка США № 07/250446, поданная 28 сентября 1988 (обе включены сюда по ссылке). LFA-1 функции как в антиген-специфических, так и в антигенезависимых Т цитотоксических, Т хелперных, природных киллерах гранулоцитах и моноцитах взаимодействует с другими типами клеток (Springer, T.A., et al., Ann. Rev. Immunol, 5:223-252 (1987); Kishimoto, Т.К., et al., Adv. Immunol., (1988 в печати). II. ICAM-1 ICAM-1 представляет собой однонитевой гликопротеин, меняющийся по массе на различных типах клеток от 76 до 114 кД, и является членом Jg суперсемейства с пятью С-подобными доменами (Dustin, M. L Et al., Immunol. Today, 9:213-215 (1988); Stannton, D. b., et al., Cell., 52:925-933 (1988); Simmons, D., et al., Nature, 331.624-627 (1988)). ICAM-1 сильно индуцируется цитокинами, включая lFN-g, TNF и IL-1 на широком круге типов клеток (Dustin, M. L, et al., Immunol. Today, 9:213215 (1988)). Индуцирование ICAM-1 на эпители 27763 альных клетках, эндотелиальных клетках и фибробластах вызывает LFA-1 зависимую адгезию лимфоцитов (Dustin, М. L, et al., J. Immunol., 137245-254 (1986); Dustin, М. Ц. et al., J. Cell Biol., 107:321-331 (1988); Dustin, M. L, et al., J. Exp. Med., 167:1323-1340 (1988)). Адгезия блокируется за счет предварительной обработки лимфоцитов LFA-1 Mab или предварительной обработки других клеток ICAM-1 МАЬ (Dustin, М. L, et al., J. Immunol., 137:245-254 (1986); Dustin, M. L, et al., J. Cell Biol., 107:321-331 (1988); Dustin, M. L, et al., J. Exp. Med., 167:1323-1340 (1988)). Идентичные результаты с очищенным ІСАМ-1 в искусственных мембранах или чашках Петри демонстрируют, что LFA-1 и ICAM-1 являются рецепторами друг для друга (Martin, S. D. Et al., Cell, 51:813-819 (I987); Makgoba, M. W., et al., Nature, 331:86-88 (1988)). Для ясности здесь их будем называть «рецепторы» и «лиганды» соответственно. Дальнейшие описания ICAM-1 приведены в патентной заявке США № 07/045963, 07/115798, 07/155943, 07/189815 или 07/250446 (все эти заявки включены сюда по ссылке). III. ICAM-2 Другие LFA-1 лиганды, отличные от ICAM-1, были постулированы (Rothlein, R. et al., J. Immunol., 137:1270-1274 (1986); Makgoba, M. W. et al., Eur. J. Immun., 18:637-640 (1988); Dustin, M. L, et al. J. Cell Biol., 107:321-331 (1988)). Второй идентифицированный LFA-1 лиганд обозначен "ICAM-211. ICAM-2 отличается от ICAM-1 клеточным распределением и отсутствием индукции цитокина. ICAM-2 является интегральным мембранным протеином с двумя Jg-подобными доменами, тогда как ICAM-1 имеет 5 Jg-подобных доменов (Stannton, D. Е., et al., Cell, 52:925-333 (1988); Simmons, D., et al., Nature, 331:624-627 (1988). Замечательно, что ICAM-2 гораздо более тесно связан с двумя наибольшими N-терминальными доменами ICAM-1 (34% идентичности), нежели ICAM-1 или ICAM-2 близки другим членам суперсемейства Jg, что демонстрирует суб-семейство Jg-подобных лигандов, которые связывают тот же рецептор семейства интегринов. Следующее описание ICAM-2 приводится в патентной заявке США № 07/454294 (включенной сюда по ссылке). IV. ICAM-3 Настоящее изобретение относится к открытию третьего LFA-1 лиганда, обозначенного «ICAM-3». Развитие МАЬ до ICAM-2 позволило проанализировать несколько LFA-1-зависимых ICAM-1независимых явлений, и предположить, что существует третий лиганд для LFI-1. Связывание нескольких типов клеток, таких как эпителиальные и эндотелиальные клетки, с очищенным LFA-1 можно полностью блокировать сочетанием ICAM-1 и ICAM-2 МАЬ , тогда как ICAM-1, ICAM-2 независимые пути адгезии к LFA-1 существовали для многих лимфоидных клеточных линий, включая Т клеточную лимфомную линию клеток, SKW3 (фиг.1). Для характеристики такого хода адгезии МАЬ довели до SKW3 и, вместе с анти-1САМ-1 и антиICAM-2 МАЬ , скринировали на предмет способности ингибировать, связывать эту клеточную линию с очищенным LFA-1. Один МАЬ, CBR-IC3/1, выбирают, так как он полностью ингибирует этот новый путь адгезии (фиг.1). SKW3 адгезия с очищенным LFA-1 только слегка ингибируется комбинацией блокирующих анти-1САМ-1 и анти-ІСАМ-2 МАЬ Если анти-ІСАМ-3 МАЬ, СВ-ІСЗ/1, добавляют отдельно, она значительно ингибирует адгезию, и это ингибирование оказывается полным, если объединена с блокирующей ІСАМ-1 МАЬ. Так, адгезия SKW3 к очищенным LFA-1 в значительной степени осуществляется за счет ІСАМ-3, а также, частично, за счет ІСАМ-2. При адгезии и LFA-1, каждая из четырех клеточных линий использует три ІСАМ в различной степени, на что указывают различные картины МАЬ ингибирования. Адгезия В лимфобластоидной клеточной линии, У, происходит, главным образом, за счет ІСАМ-1 и за счет небольшого вклада за счет ІСАМ-2 и ІСАМ-3. Другая В лимфобластоидная клеточная линия, SLA, использует как ІСАМ-1, так и ІСАМ-3, так как адгезия не ингибируется ни ІСАМ-1, ни ІСАМ-3 МАЬ отдельно, и почти полностью этими МАЬ вместе. Тимомная клеточная линия, Jurkat, использует как ICAM-2, так и ICAM-3 пути адгезии с небольшим вкладом ICAM-1. Адгезия, как покоящихся Т лимфоцитов, так и активированных фитогемагглютинином (РНА), также была исследована (фиг.1 В). Как показано ранее, покоящиеся лимфоциты эффективно связываются с очищенными LFA-1 (Dustin et al., Nature 341:619-624 (1989)), и таким образом, было найдено, что такое связывание в значительной степени зависит от ICAM-3. После активации РНА, ICAM-1 экспрессию индуцируют, и адгезия к LFA-1 наблюдается, главным образом, за счет ICAM-1 и, частично, за счет ICAM-3. ICAM-2 компонента адгезии как в покоящихся, так и в активированных Тклетках, была детектируема, хотя и маскировалась наличием ICAM-1 и ICAM-3. Существует значительный излишек в использовании ICAM, так как для каждой клетки МАЬ к, по крайней мере, двум ICAM необходимы для достижения существенного ингибирования. Заметным исключением является адгезия покоящихся лимфоцитов к LFA-1, что в значительной степени происходит за счет ICAM-3 Во всех случаях комбинация всех трех анти-ЮАММАЬ исключает связывание с LFA-1 до уровней, сравнимых с теми, которые наблюдаются в присутствии анти-LFA-i МАЬ. Относительное сродство трех ICAM к LFA-1 можно исследовать, сравнивая их вклады в связывание LFA-1, как определено ранее для их экспрессии клеточной поверхностью по данным иммунофлуоресценции цитометрии в потоке (фиг.2) Сравнение поверхностной экспрессии ICAM и их вклад в LFA-1 адгезию показывает, что ICAM-1 обладает высоким сродством к LFA-1, и что ICAM2 и ICAM-3 обладают аналогичным, но более низким сродством. Так, например, Jurkat клетки экспрессируют ICAM-2 и ICAM-3 в аналогичных количествах, и каждый вносит вклад в связывание с LFA-1. Там где ICAM-2 экспрессия больше, чем экспрессия ICAM-3, как например, для клеток JY, путь ICAM-2 LFA-1 адгезии превалирует над ICAM3. Напротив, SLA и SKW3 экспрессируют в 3-5 раз больше ICAM-3, нежели ICAM-2 и, что не удивительно, ICAM-3 адгезию преимущественно по сравнению с ICAM-2 направлением Для покоящихся Т лимфоцитов, где ІСАМ-3 хорошо экспрес 10 27763 Существование трех LFA-1 лигандов предполагает специализацию для различных аспектов LFA-1-зависимых взаимодействий лейкоцитов ICAM-1, в основном, экспрессируется на эндотелиальных и многих эпителиальных типах клеток, и сильно индуцируется при воспалениях и иммун ных заболеваниях, когда он регулирует клеточную локализацию и облегчает распознавание специфических антигенов (Wawryk et al, Immunol Rev , 108 135-161 (1989)) Так как ICAM-2 является преимущественно LFA-1 лигандом на покоящихся эндотелиальных клетках, его тип адгезии может иметь важные последствия для нормальной рециркуляции LFA-1-несущих лимфоцитах за счет тканей эндотелия (Hamann et al J Immunol 140 693-699 (1988), Mackay et al, J Exp Med, 1 7 18 1 0-8 1 7 (1 99 0), Pals et al , J I mm un ol, 140 1851-1853 (1988) и (Nuroi et al, Hum Path , 19 753-759 (1988)) В настоящее время функции ICAM-3 на нейтрофилах остаются неясными, так как гомотипичная аггрегация нейтрофилов, повидимому, в первую очередь зависит от Мас-1, независимо от присутствия LFA-1 (Anderson et al , J Immunol, 137 15-27 (1986), Patarroyo et al Scand J Immunol, 22 619-631 (1985)) Обнаружение того факта, что адгезия покоящихся Т лимфоцитов к LFA-1 происходит, прежде всего, за счет ЮАМ-З, наряду с тем фактом, что ICAM-3 гораздо лучше экспрессируется, нежели другие LFA-1 лиганды на моноцитах и покоящихся лимфоцитах играет важную роль в инициировании иммунной реакции Действительно, адгезия Т- клеток к антиген-представляющим клеткам требует LFA-1 ICAM взаимодействий (Dransfield et al, Imm Rev , 114 29-44 (1990), Makgova et al, Immunol Today, 10 417-422 (1989)) и как таковая, ICAM-3 может играть роль, особенно на покоящихся Т лимфоцитах, где ни ICAM-1, ни ICAM-2 не экспрессируются достаточно хорошо Действительно, роль, предложенная для LFA-1 лиганда (лигандов) отличается от роли ICAM-1 как в аллогенных, так и в автологусных смешанных лимфоцитных реакциях (Bagnasco et al, Cell Immunol , 128 362-369 (1990)) Более того, ICAM-3, как можно предвидеть, играет важную роль в антиген-специфических взаимодействиях между Т и В лимфоцитами, где одна из этих клеток еще не активирована ICAM-3 может также играть важную роль в лизисе некоторых мишеней Т- клетками, то есть, зависеть от LFA-1, но не ICAM-1 (Makgova et al , Eur J Immunol , 18 637-640(1988) Существование множества ICAM играет важную роль для клинического лечения МАЬ до ЮАМ или ЮАМ аналогами ICAM-1 МАЬ является эффективными in vivo для продления службы почечных (Cosimi et al , J Immunol, 144 4604-4612 (1990)) и сердечных (Flavin et al , Transplant Proc 23 533-534 (1991)) аллотрансплантатов ICAM-3 Mab ингибирует ряд определенных иммунных реакций in vivo, так как они ингибируют LFA-1-зависящие адгезивные взаимодействия, отличающихся субнаборов типов клеток V кДНК клонирование ЮАМ-З Для клонирования гена ЮАМ-З можно использовать любую из множества процедур Один из таких способов включает анализ шаттл-векторной библиотеки кДНК вставок (полученных из клеток, сируется, а 1САМ-1 отсутствует, адгезия к LFA-1 осуществляется, главным образом, за счет ICAM3 Если ICAM-1 хорошо экспрессируется, а также в случае с SLA, jy и РНА-активированными Т- клетками, это представляет основной путь адгезии Характер распределения ICAM-3 отличается от ICAM-1 и ICAM-2 несколькими путями В отличие от ICAM-1 и ІСАМ-2, ІСАМ-3 не экспрессируется ни на покоящихся, ни на стимулированных поверхностях эндотелия (не показано) Это находится в согласии с тем фактом, что LFA-1- зависимое связывание клеток как с покоящимися, так и со стимулированными клетками эндотелия, оказывается ICAM-1 и ICAM-2 - зависимым явлением ICAM-3 ограничен линией кроветворения, и в значительных количествах экспрессируется на лимфоидных и моноцитных клеточных линиях, за редким исключением Однако, во всех случаях экспрессия ICAM-3 на клеточных линиях координирует с LFA-1- зависимым, ICAM-1, ICAM-2независимым характером адгезии Клеточные линии (HUVEC, Raji), связывающие LFA-1 исключительно за счет ICAM-1 и ICAM-2, не демонстрируют ICAM-3 экспрессии, хотя клеточные линии (jy, U937, Sup T), которые демонстрируют слабое связывание за счет третьего типа адгезии, обладают, соответственно, слабой ICAM-3 поверхностной экспрессией (данные не представлены) ICAM-3 заметно отличается от ICAM-1 и ICAM2 по экспрессии лейкоцитов (фиг 2В) ICAM-3 экспрессируется с высокими уровнями на покоящихся лимфоцитах, моноцитах и нейтрофилах, тогда как ICAM-1 и ICAM-2 экспрессируются в гораздо меньшей степени или вовсе отсутствуют Для сравнения, ICAM-1 и ICAM-2 слабо экспрессировались на моноцитах, и только ICAM-2 присутствовали на покоящихся лимфоцитах Ни ICAM-1, ни ICAM-2 не были экспрессированы на нейтрофилах После активации лимфоцитов PHA, ЮАМ-З экспрессия повышается в 2-3 раза, тогда как экспрессия ICAM-1 заметно снижается (Dustin, et al , J Immunol , 137 245-254 (1986)) (Фиг 2В) Иммуноосажденные ICAM-3 из различных 125J меченых клеточных линий выявляют резкую линию 124000 Мг в восстанавливающих условиях лишь с легким повышением подвижности в невосстанавливающих условиях (фиг ЗА) Обработка Nгликаназой приводит к уменьшению ICAM-3 полосы до Мг 87000, что указывает, на то, что ICAM-3, подобно ICAM-1 и ICAM-2, является сильно гликозилированным протеином (фигЗВ) Биохимические характеристики, типы экспрессии и функциональные характеристики ICAM-3 отличаются от ранее описанных адгезионных молекул, включая хоминг-рецептор человека АМ-1 (Tedder et al, J Immunol , 144 532-540(1990)), индуцируемую эндотелиальную адгезионную молекулу VACAM-1 (Rice et al , J Exp Med , 171 1369-1374 (1990), Carlos et al , Blood в печати (I990), Osborn et al , Cell, 59 1203-1211 (1989)) и VLA семейство матричных рецепторов (Hember, M E, Ann Rev Immunol, 8 365-400 (1990)), и не было обнаружено МАЬ с аналогичным распределением клеток в четырех работах по данным о лейкоцитах (Gilks, W R et al, Leukocyte Typmo Data Base IV, Oxford University Press, Oxford, England, (1990)) 11 27763 тидный зонд создают на основе кодона, предпоч тительно, предоставляемого организмом, либо дегенеративный зонд создают на основании всех возможных комбинаций кодонов, или комбинаций предпочтительных кодонов, гомологичных с известными последовательностями ICAM-1 или ICAM-2 ДНК, и дегенеративный кодон используют для конструирования зондов. Затем такой зонд использует для окринирования либо геномной, либо кДНК библиотеки для последовательностей, которые гибридизуются с зондом. Описанные выше методики, либо их аналоги, успешно обеспечивают клонирование генов альдегиддегидрогеназы человека (Hsu, L. С. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., США 82:3771-3775 (1985)), фибронектина (Suruki, S et al, Eur. Mo! Biol Organ. J., 4:2519-2524 (1985)), ген рецептора эстрогена человека (Walter, P. et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 82:7889-7893 (I985)) и плазминогенный активатор типа тканей (Penuica, D et al, Nature, 301214-221 (1983)) В еще одном альтернативном способе клонирования ICAM-3 гена, приготавливают экспрессионную библиотеку путем клонирования геномной ДНК или, более предпочтительно, кДНК, из клеток, которые экспрессируют ICAM-3. Затем эту библиотеку скринируют на предмет членов, способных экспрессировать протеин, который связывается с анти-ІСАМ-3 антителами. Клонирование ICAM-3 гена, полученного за счет использования любого из описанных ранее способов, можно операбельно связать с вектором экспрессии, и ввести в бактериальные или эукариотные клетки для продуцирования ICAM-3 протеина. Способы таких манипуляций раскрыты у Maniatis, Т. et al., ранее, и хорошо известны специалистам. В альтернативном способе, в котором используют PCR для клонирования в ICAM-3 ген, сделали предположение, что ICAM-3 гомологичен ICAM1 и/или ICAM-2 Дегенеративные олигонуклеотидные праймеры, основанные на последовательностях, заключенных между ICAM-1 и ICAM-2, используют для амплификации полимеразной цепной реакцией кДНК или мРНК, из клеток, которые, как известно, экспрессируют ICAM-3 протеин, таких как SKW3 или миндалины (de Fougerolles et al, J. Exp. Med., 175:185-190 (1992). Клоны секвенируют, и те, которые отличаются от ICAM-1 и ICAM2, используют для получения клонов кДНК полной длины. В любом из описанных ранее способов, аутентичность клонов можно подтвердить, экспрессируя клоны полной длины, например, в COS клетках, и тестируя по поводу реакционной способности ICAM-3 МАЬ. VI. Агенты настоящего изобретения: ICAM-3 и их функциональные производные, агонисты и антагонисты. Далее настоящее изобретение направлено на ICAM-3, его «функциональные производные», его «агонисты» и «антагонисты» А. Функциональные производные ICAM-3 «Функциональным производным» ICAM-3 является соединение, которое обладает биологической активностью (либо функциональной, либо структурной), то есть практически аналогично экспрессирующих ІСАМ-3) на присутствие вставки, которая содержит ICAM-3 ген Такой анализ можно провести, трансфектируя клетки вектором, а затем анализируя на экспрессию ICAM-3. ICAM-3 кДНК, предпочтительно, идентифицируют, используя модифицированный способ Aruffo и Seed (Seed, В. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., США 84:3365-3369 (1987)) для идентификации лигандов адгезионных молекул. В этом способе кДНК библиотеку получают из клеток, которые экспрессируют ICAM-3 (таких как SLA, Jurkat или SKW3 лимфобластоидных клеточных линий) Предпочтительно получать кДНК библиотеку из Т-клеток. Эту библиотеку используют для трансфекции клеток, которые нормально не экспрессируют ICAM-3 (например, CoS или HeZa клетки). Трансфектированные клетки вводят в чашки Петри, которые до этого были покрыты либо LFA-1, либо анти-)САМ-3 антителами. Трансфектированные клетки, содержащие ICAM-3 кодирующие последовательности, которые экспрессируют этот лиганд на их поверхностях, будут прикрепляться к LFA-1 или антиICAM-3 антителам на поверхности чашек Петри. Не прикрепившиеся клетки смывают, а прикрепившиеся клетки удаляют затем из чашек Петри и культивируют. Рекомбинантные ICAM-3 экспрессирующие последовательности в этих клетках затем удаляют и секвенируют. Если для покрытия пластин Петри используют LFA-1, в них добавляют анти-ЮАМ-1 и анти-ІСАМ2 специфические антитела для предотвращения адгезии ІСАМ-1 или ІСАМ-2 экспрессирующих клеток. Таким образом, адгезию ІСАМ-1+ или ІСАМ2+ трансфектантов к покрытым LFA-1 пластинам можно ингибировать такими антителами, как RR1/1 и анти-ЮАМ-1 МАЬ и CBR-IC2/2, и антиІСАМ-2 МАЬ. Связывание ІСАМ-3 трансфектированных клеток с LFA-1 покрытыми чашками Петри ингибируется ЕДТА и анти-LFA-i МАЬ, но не ингибируется анти-1САМ-1 или анти-ІСАМ-2 МАЬ. Поэтому, ІСАМ-1 или ІСАМ-2 экспрессирующие клетки не способны к адгезии на чашках Петри, и поэтому в большинстве своем смываются вместе со всеми другими неадгезивными клетками. Это увеличивает содержание клеток, экспрессирующих ІСАМ-3. Другим альтернативным способом получения последовательностей генов, кодирующих ІСАМ-3, является способ хорошо известный специалистам, который легко адаптировать для получения целевого гена. Одним из таких способов получения генной последовательности, кодирующей ІСАМ-3, является использование олигонуклеотидного зонда для скринирования кДНК или геномной ДНК библиотеки. В этом способе ІСАМ-3 протеин очищают, предпочтительно, используя иммуноочищающие процедуры, известные специалистам, и терминальную аминокислотную последовательность определяют, используя один из известных специалистам способов. В другом варианте, ІСАМ-3 энзимативно очищают так, что очищают пептиды Lys-C или трипсином, и определяют аминокислотную последовательность одного из внутренних фрагментов. После того, как частичная аминокислотная последовательность определена, либо олигонуклео 12 27763 биологической активности ICAM-3. Термин «функциональное производное» включает «фрагменты», «варианты» и «химические производные» родственных ICAM-3 молекул. Термин «фрагмент» ICAM-3 означает любой полипептидный субсет молекулы. Фрагмент ICAM3, который обладает ICAM-3 активностью, и который растворим (то есть, не связан с мембраной), наиболее предпочтителен. Растворимый фрагмент, предпочтительно, создают в результате делеции участка мембраны родственной молекулы или за счет делеции или замены гидрофильных аминокислотных остатков на гидрофобные остатки. Идентификация таких остатков хорошо известна специалистам. Фрагменты, содержащие любое число полных Jg-подобных доменов предпочтительны, например, домен 1(Д1), Д1 и Д2, Д1-3, Д1-4 и Д1-5. Под «вариантом» ЮАМ-3 подразумевают практически аналогичную по структуре и функциям либо целой молекуле, либо ее фрагменту. Говорят, что молекула «практически аналогична» другой молекуле, если обе молекулы имеют практически аналогичную структуру или обе молекулы обладают аналогичной биологической активностью. Таким образом, при условии, что две молекулы обладают аналогичной активностью, их называют "вариантами", в том смысле, как используют этот термин здесь, даже, если одна из этих молекул обладает структурой, которой нет в другой молекуле, или если последовательности аминокислотных остатков не идентичны Как здесь использовано, говорят, что молекула является «химическим производным» другой молекулы, если она содержит дополнительные химические фрагменты, которые не являются обычно частью нативных молекул. Такие фрагменты могут усовершенствовать растворимость молекул, абсорбцию, биологический срок полужизни и т.д. Фрагменты могут альтернативно снижать токсичность молекул или исключать или ослаблять любые нежелательные побочные эффекты молекул. Фрагменты, способные осуществлять такие эффекты, раскрыты в Remington's Pharmaceutical Science (1980). «Токсин-производные» молекулы составляют специальный класс «химических производных». «Токсин-производные» молекулы (такие как ICAM3 или анти-ЮАМ-3 антитела), которые ковалентно связаны с фрагментом токсина. Процедура присоединения таких фрагментов к молекуле хорошо известна специалистам. Связывание таких молекул с клеткой приводит фрагмент токсина в тесную близость к клетке и в результате приводит к гибели клеток. Можно использовать любой подходящий фрагмент токсина, однако, предпочтительно, использовать токсин сам по себе, например, токсин рицина, токсин холеры, токсин дифтерии, радиоизотопные токсины или токсины, образующие каналы в мембранах. Функциональные производные ІСАМ-3, содержащие вплоть до около 100 остатков, можно легко получить в результате in vitro синтеза. При ' желании такие фрагменты можно модифицировать, используя известные специалистам способы, подвергая взаимодействию мишеневые аминокислотные остатки очищенных или неочищен ных протеинов с органическими агентами дериватизации, которые способны реагировать с выбранными боковыми цепями или концевыми остатками. Полученные ковалентные производные можно использовать для идентификации остатков важных для биологической активности. Многие способы можно использовать для создания и выделения фрагментов ICAM-3. В результате дериватизации бифункциональными агентами можно получить ICAM-3, сшитые с нерастворимой в воде матрицей носителя В другом варианте такие реакционноспособные матрицы, как цианогенбромидом активированные углеводороды и реакционноспособные субстраты, описанные в патентах США 3969287, 3691016, 4195128, 4247642, 4229537 и 4330440, используют для иммобилизации протеина. Функциональные производные ICAM-3, имеющие чередующиеся аминокислотные последовательности также можно получить в результате мутаций ДНК, кодирующих ICAM-3. Такие функциональные производные включают, например, делеции, вставки или замены аминокислотных остатков внутри аминокислотной последовательности ICAM-3. Любые сочетания делеций, вставок и замен можно использовать для создания окончательной конструкции, при условии, что конечная структура обладает нужной активностью. Очевидно, что мутации, которые могут быть осуществлены в ДНК, кодирующей функциональное производное, не должны выводить последовательность из считывающей рамки, и, предпочтительно, не должны создавать комплементарные участки, которые могут продуцировать вторичные мРНК структуры (см. ЕР патентную заявку 75444) На генетическом уровне функциональные производные можно получить направленным мутагенезом ДНК кодирующей ICAM-3, получая, таким образом, ДНК, кодирующую функциональное производное, после чего экспрессируя ДНК в рекомбинантной клеточной культуре. Хотя место введения вариации в аминокислотную последовательность заранее известно, мутации per Se не обязательно известны заранее. Так, например, для оптимизации характера мутации в указанном месте, статистический мутагенез, например, линкерный сканирующий мутагенез, можно проводить по целевому кодону или целевому участку для создания большого числа производных, которые можно затем экспрессировать и скринировать для оптимальной комбинации целевой активности. Способы создания мутаций в заранее определенном участке ДНК известной последовательности хорошо известны, например, таким способом является направленный мутагенез. Препараты функциональных производных ICAM-3, в соответствии с изложенным, предпочтительно получают в результате направленного мутагенеза ДНК, которая кодирует ICAM-3, или ранее полученного функционального производного ICAM-3 Способы такого сайт-специфического мутагенеза хорошо известны специалистам и изложены, например, в таких публикациях как Maniatis, Т. Et al., 1 Н: Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Coldspring Harbor NY (1982), раскрытие которой включено по ссылке. Направленный мута 13 27763 ляют, выбирая заместителя, которые менее консервативны нежели те, которые приведены в таблице 1, то есть выбирая остатки, которые отличаются более заметно по их влиянию на сохранение (а) структуры полипептидной основной цепи в области замещения, например, как плоской или спиральной конформации (Ь) заряда или гидрофобности молекулы в мишеневом участке, или (с) объема боковой цепи. Замещения, которые вообще менее консервативны, представляют собой те, в которых (а) глицин и/или пролин замещен другой аминокислотой, или исключен или вставлен; (Ь) гидрофильный остаток замещен на гидрофобный остаток; (с) цистеиновый остаток замещен на другой остаток; (d) остаток, содержащий электроположительную боковую цепь, замещен на остаток, имеющий электроотрицательный заряд, или (е) остаток, имеющий объемную боковую цепь, замещен таким, у которого нет такой боковой цепи Более предпочтительными являются замещения, которые влияют на растворимость ICAM-3. Такие наиболее предпочтительно создаются за счет замены гидрофобных аминокислот на гидрофильные аминокислоты. Мутации, предназначенные для повышения сродства ICAM-3 можно осуществить за счет введения аминокислотных остатков, которые представляют гомологичные положения в ICAM-1 или ICAM-2. Аналогично, такие мутанты ICAM-3 молекул можно получить без N-связанного СНО в гомологическом положении в ICAM-1 или ICAM-2. Трудно предсказать точно, какое действие, какое-либо конкретное замещение, делеция или вставка окажут на биологическую активность ICAM-3 прежде, чем это будет проделано. Однако, специалистам должно быть ясно, что этот эффект можно оценить в рутинном анализе скринирования Так, например, обычно производное получают линкерным сканированием сайт-направленного мутагенеза ДНК, кодирующей нативную ICAM-3 молекулу. Затем производное экспрессируют в рекомбинантного хозяина, и, необязательно выделяют из клеточной культуры, например, с помощью иммуноаффинной хроматографии. Затем активности клеточного лизата или очищенного производного скринируют в подходящем анализе скринирования по целевым характеристикам. Так, например, изменение иммунологического характера функционального производного, например, аффинности данного антитела, определяют с помощью конкурирующего типа иммуноанализа. Изменения в иммуномодуляторной активности определяют соответствующим анализом. Модификации таких протеиновых характеристик, как окисление-восстановление или термостабильность, биологический срок полужизни, гидрофобность, подверженность протеолитическому разложению или тенденция к аггрегации с носителями или в мультимеры анализируют способами, известными специалистам Б. Агонисты и антагонисты ICAM-3 «Агонистом» ICAM-3 является соединение, которое повышает или понижает способность ICAM3 выполнять какую-либо из его биологических функций. Примером такого агониста является агент, который повышает способность ICAM-3 связываться с клеточным рецептором. генез позволяет получать ICAM-3 функциональные производные за счет использования специфических олигонуклеотидных последовательностей, которые кодируют ДНК последовательность целевой мутации Можно осуществить аминокислотные делеции, доставки или замены, используя сайтнаправленный мутагенез. Делеции аминокислотных последовательностей обычно охватывают от 1 до 30 остатков, более предпочтительно, от 1 до 10 остатков, которые обычно бывают соседними. Наиболее предпочтительными делециями являются такие, которые осуществляют для создания растворимых форм ICAM-3 Растворимые формы ICAM-3 наиболее предпочтительно создаются за счет делеции либо мембранного участка ICAM-3, либо гидрофобных остатков внутри ICAM-3. Аминокислотные вставки включают вставки единичных или множественных остатков внутри ICAM-3 кодирующих последовательностей, а также терминальных слияний с полипептидами практически неограниченной длины. Вставки внутри последовательности (то есть, вставки внутри полной последовательности молекулы ICAM-3) могут составлять обычно от около 1 до 10 остатков, более предпочтительно от 1 до 5. Примеры терминальных вставок включают слияние сигнальной последовательности (независимо гетерологической или гомологической) с клеткой хозяина, с Nконцом молекулы для облегчения секреции производного из рекомбинантного хозяина. Третью группу функциональных производных представляют те, в которых по одному, или более, из аминокислотных остатков в молекуле ICAM-3 удалено, и различные остатки вставлены на их место. Такие замены, предпочтительно, осуществляют в соответствии со следующей таблицей, если необходимо слегка изменить характеристики молекулы ICAM-3. Исходный остаток А1а Arg Asn Asp Cys Gin Glu Gly His Ile Leu Lys Met Phe Ser Thr Trp Tyr Val Таблица 1 Пример замещения gly; ser lys gin; his glu ser asn asp ala; pro asn; gin leu; val ile; val arg; gin; glu leu; tyr; ile met; leu; tyr thr ser tyr trp; phe Ile; leu Замещения, изменяющие функциональные или иммунологические идентичности осуществ 14 27763 "Антагонистом" ICAM-3 является соединение, которое уменьшает или предотвращает способность ICAM-3 осуществлять какую-либо из его биологических функций Примеры таких антагонистов включают ICAM-1 и ICAM-2, функциональные производные ICAM-1 и ІСАМ-2, анти-ІСАМ-3 антитела, анти-LFA-i антитела и т д Клеточный аггрегационный анализ, описанный в патентных заявках США № 07/045963, 07/115798, 07/155943, 07/189915 или 07/250446 (причем все заявки включены по ссылке), способен определять LFA-1 зависимую аггрегацию, и таким образом может быть использован для идентификации агентов, которые влияют на степень ICAM-3/LFA-I аггрегации Таким образом, такой анализ может быть использован для идентификации агонистов и антагонистов ICAM-3 Антагонисты могут действовать придавая способность LFA-1 или ICAM-3 реализовывать аггрегацию Кроме того, могут быть исследованы и неиммуноглобулиновые (то есть химические) агенты с применением вышеуказанного анализа для определения того факта, являются ли они агонистами или антагонистами ICAM-3/LFA-1 осуществляющими аггрегацию Такой аггрегационный анализ обычно осуществляют, используя периферические Т-клетки, стимулированные РМА Так связывание периферических кровяных клеток с LFA-1 используют для анализа ICAM-3 осуществляющих аггрегацию С Анти-ІСАМ-3 антитела Предпочтительный иммуноглобулиновый антагонист настоящего изобретения представляет антитела к ІСАМ-3, например, CBR-JC3/1 раскрытые здесь, другие подходящие анти-ІСАМ-3 антитела можно получить любым из известных способов Антитела к ІСАМ-3 (или функциональные производные ІСАМ-3) могут быть либо поликлональными, либо моноклональными Кроме того, антитела рассматриваемой заявки могут быть гуманизированы с помощью процедур, известных специалистам, или процедур, описанных в РСТ заявках PCT/US 91/02942 и PCT/US 91/02946, поданных в приемный офис США 22 апреля 1991 г Анти-ІСАМ-3 антитела можно получить, вводя ІСАМ-3 или его пептидные фрагменты соответствующим животным Иммунизованные животные продуцируют поликлональные антитела в ответ на иммунизацию Использование пептидных фрагментов ІСАМ-3 позволяет получать участки специфических антител, которые реактивны только с эпитопом (зпитопами) содержащимися в пептидных фрагментах, использованных при иммунизации животных В других вариантах, анти-ІСАМ-3 антитела можно получить, используя ІСАМ-3, которая нативно экспрессирована на поверхности лимфоцитов Интродукция таких клеток в соответствующие животные, например, внутрибрюшинной инъекцией, приводит к продуцированию антител, способных связываться с ІСАМ-3 или членами СД-18 семейства молекул При желании сыворотку таких животных можно отобрать и использовать в качестве источника поликлональных антител, способных связывать эти молекулы В другом варианте, анти-ІСАМ-3 антитела можно продуцировать, адаптируя способ Selden R F (Европейская патентная заявка № 289034) или Selden R F et al (Science 236 714-718 (1987)) Более конкретно, клетки подходящего животного (например, мыши) трансфектируют вектором, способным экспрессировать либо интактную ICAM-3 молекулу, либо ее фрагмент Продуцирование ICAM-3 в трансфектированных клетках животного вызывает иммунную реак цию у животного и приводит к выработке антиІСАМ-3 антител этим животным Предпочтительно, однако, удалять спленоциты из животных иммунизованных любым из опи санных выше способов, для создания моноклональных антител, способных связывать ІСАМ-3 Гибридомные клетки, полученные описанным выше способом, можно скринировать различными способами для идентификации гибридомных кле ток, которые секретируют антитела, способные связываться с ІСАМ-3 В предпочтительном анализе скринирования такие молекулы идентифицируют по их способности ингибировать аггрегацию ICAM-3-экспрессирующих, ІСАМ-І и ІСАМ-2 неэкспрессирующих клеток Антитела, способные ингибировать такую аггрегацию затем скринируют для определения того, могут ли они ингибировать такую аггрегацию за счет связывания с ІСАМ-3 или с членами СД-18 семейства молекул Для такого скринирования можно использовать любые средства, способные различить ІСАМ-3 от семейства молекул СД-18 Так, например, антиген, связанный с антителом, можно проанализировать как иммуноосаждением, так и полиакриламидным гельэлектрофорезом Имеется возможность провести различие между теми антителами, которые связываются с членами СД-18 семейства молекул и теми, которые связывают ІСАМ-3 за счет скринирования способности антител связываться с клетками, которые экспрессируют LFA-1 но не ІСАМ-3 (или наоборот) Способность антител связываться с клетками, экспрессирующими LFA-1, но не ІСАМ-3, можно определить за счет обычно используемых специалистами способов Такие средства включают иммуноанализ (особенно те в которых используют иммунофлуоресценцию) клеточную агглютинацию, исследования связывания фильтра, осаждение антител и т д В предпочтительном варианте антитела выбирают по их способности связываться с клетками, экспрессирующими ІСАМ-3, но не с клетками, которые не экспрессируют ІСАМ-3 В дополнение к вышеописанным агонистам и антагонистам ІСАМ-3, можно использовать и другие агенты в соответствии со способом настоящего изобретения для лечения воспалений HIV инф ек ц и я , а с т м а и т д в к л ю ч а ю т а н т и идиопатические антитела к анти-ІСАМ-3 антителам, и рецепторные молекулы или фрагменты таких молекул, которые способны связываться с ІСАМ-3 Анти-идиопатические антитела, представляющие интерес для настоящего изобретения способны конкурентно связываться с ІСАМ-3 (или исключительно с ними) Такие антитела можно получить, например вырабатывая антитела к антиІСАМ-3 антителам а затем скринируя антитела по их способности связываться с ІСАМ-3 природ 15 27763 А Супрессия воспалительных процессов Один из аспектов настоящего изобретения проистекает из способности ЮАМ-3 и их функциональных производных взаимодействовать с рецепторами СД-18 семейства молекул, особенно LFA-1 За счет способности ICAM-3 взаимодействовать с членами семейства СД-18 гликопротеинов, их можно использовать для супрессии (то есть для предотвращения или ослабления) воспалений Термин «воспаление» в том смысле, как здесь использован, означает индуцирование как реакций специфической защитной системы, так и реакций неспецифической защитной системы В том смысле, как здесь использован термин «специфическая защитная система», он относится к той компоненте иммунной системы, которая реагирует на присутствие антигенов Говорят, что воспаление возникает как реакция специфической защитной системы, если воспаление вызвано опосредствовано или связано с реакцией специфической защитной системы Примеры воспалений, являющихся результатом реакций специфической защитной системы включают реакции на такие антигены, как вирус краснухи, автоиммунные заболевания и замедленного типа реакция гиперчувствительности, связанная с Т-клетками (что видно, например у индивидуумов с «положительным» тестом Манту) Хронические воспалительные заболевания и отторжение твердых трансплантированных тканей и органов, например, почек и трансплантатов костного мозга, это дальнейшие примеры воспалительных реакций специфической защитной системы Как использовано здесь, реакция «неспецифической защитной системы» должна означать реакцию, осуществляемую за счет лейкоцитов, которые не способны к иммунологической памяти Такие клетки включают гранулоциты и макрофаги Как здесь использовано, говорят, что воспаление является результатом реакции неспецифической защитной системы, если воспаление вызвано или опосредствовано, или связано с реакцией неспецифической защитной системы Примеры воспалений, которые происходят в результате, по крайней мере, частично, за счет реакции неспецифической защитной системы, включают воспаления, связанные с такими состояниями, как синдром расстройства респираторной системы у взрослых (ARDS), или синдромы множественного пораже ния органов, вторичные после сепсиса, травм или кровотечений, реперфузионные поражения тканей миокарда или других тканей, острый гломерулонефрит, реактивные артриты, дерматозы с острыми воспалительными компонентами, острые пурулентные менингиты или другие воспалительные расстройства центральной нервной системы, например, удар, ожог, гемодиализ, лейкаферез, язвенные колиты, болезнь Крона, некротизация энтероколитов, синдром, связанный с трансфузией гранулоцитов, токсикоз, вызванный цитокином Как обсуждалось ранее, связывание ІСАМ-3 молекул с мембранами СД-18 семейства молекул играет главную роль в клеточной адгезии За счет процесса адгезии лимфоциты способны непрерывно контролировать животное на предмет присутствия чужеродных антигенов Хотя ными связывающими лигандами Так как молекулы семейства СД-18 способны связываться с ICAM-3, введение таких молекул (например, гетеродимеров, содержащих как альфа, так и бета субъединицы, или молекул, состоящих только из альфа или бета субъединиц, или молекул, содержащих фрагменты либо одного типа, либо обоих типов субъединиц) будут конкурировать с клетками для связывания с ЮАМ-3, присутствующими на клетке Анти-аггрегационные антитела настоящего изобретения можно идентифицировать и титровать любым из множества способов Так, например, можно измерять способность антител к дифференциальному связыванию с клетками, которые экспрессируют ICAM-3 (например, Т-клетки), и по их неспособности связываться с клетками, которые не могут экспрессировать ICAM-3 Подходящие анализы клеточной аггрегации описаны в патентных заявках США № 07/045963, 07/115798, 07/155943, 07/189815 или 07/250446 (все они включены сюда по ссылке) В другом варианте, можно измерять способность антител связываться с ICAM-3 или пептидным фрагментом ICAM-3 Как хорошо понятно специалистам, вышеуказанные анализы можно модифицировать или осуществлять в другом порядке, для получения различных потенциальных анализов скринирования, каждый из которых способен идентифицировать и проводить различия между антителами, способными связываться с ICAM-3 и членами СД-18 семейства молекул Д Получение агентов настоящего изобретения Агенты настоящего изобретения можно получить в природных процессах (например, включающих животных, растения, грибки, бактерии и тд для получения неиммуноглобулинового антагониста ICAM-3, или индуцируя животных для продуцирования поликлональных антител, способных связываться с ICAM-3), синтетическими способами (например, синтезируя ICAM-3, функциональные производные ICAM-3, или протеиновые антагонисты ICAM-3 (либо иммуноглобулин, либо не-иммуноглобулин), с помощью гибридомной технологии (например, для получения моноклональных антител, способных связываться с ICAM-3), или с помощью рекомбинантной технологии (например, для получения агентов настоящего изобретения в различных хозяевах, например, в дрожжах, бактериях, грибках, культивируемых клетках млекопитающих и тд), используя рекомбинантные плазмиды или вирусные векторы Выбор используемого способа зависит от таких факторов, как удобство, желательный выход и тд Однако нет необходимости использовать только один из вышеописанных способов, процессов или технологий для продуцирования конкретного противовоспалительного агента, вышеуказанные процессы, способы и технологии можно сочетать для получения конкретного агента VI! Применение ICAM-3 и их функциональных производных агонистов и антагонистов Агенты настоящего изобретения можно использовать для осуществления различных биологических функций, которые осуществляются с помощью ЮАМ-3 16 27763 эти процессы обычно желательны, они также вызывают отторжение трансплантатов твердых органов (например, почек), отторжение трансплантатов нетвердых органов (например, костного мозга), отторжение трансплантатов тканей и многие автоиммунные заболевания Следовательно, любые средства, которые способны ослабить или ингибировать клеточную адгезию, были бы весьма желательны для пациентов с трансплантатами твердых органов (особенно трансплантатами почек), трансплантатами нетвердых органов (особенно с трансплантатами костного мозга), трансплантатами тканей, или для пациентов с автоиммунными заболеваниями Моноклональные антитела к членам СД-18 семейства ингибируют многие функции, зависящие от адгезии лейкоцитов, включая связывание с э н д о т ел и ем ( H a s k a r d, D et a l , J I mm u n o l, 137 2901-2906 (1988)), гомотипические адгезии (Rothlein, R, et al, J Exp Med , 163 1132-1149 (1986)), индуцируемую антигеном и митогеном пролиферацию лимфоцитов (Davignon, D , et al, Proc Natl Acad Sci , USA, 78 4535-4539 (1981)), образование антител (Fischer, A, et al, J Immunol, 136 3198-3203 (1986)), и эффекторные функции всех лейкоцитов, такие как литическая активность питотоксических Т- клеток (Krensky, A М et al, J Immunol , 132 2180-2182 (1984)), макр о ф а г о в ( S t r a s sm a n , G , et a l , J I mm u n o l , 136 4328-4333 (1986)) и всех клеток, вовлеченных в зависящие от антител клеточные цитотоксические реакции (Kohl, S et al , J Immunol , 133 2972 2978 (1984)) Во всех вышеуказанных функциях антитела ингибируют способность лейкоцитов к адгезии к соответствующему клеточному субстрату, что, в свою очередь, ингибирует биологические функции, связанные со связыванием Такие функции, в той степени, в которойони включают ICAM3/LFA-1 взаимодействия, могут быть подавлены анти-ЮАМ-3 антителами Таким образом, моноклональные антитела, способные связываться с ICAM-3, можно использовать в качестве противовоспалительных агентов для млекопитающих Существенно, что такие агенты отличаются от обычных противовоспалительных агентов тем, что они способны селективно ингибировать адгезию и не вызывают другие побочные эффекты, такие, как нефротоксичность, которые сопровождают обычные агенты Так как ICAM, особенно в растворимой форме, способны действовать таким же образом, как и антитела к членам семейства СД-18, их можно использовать для супрессии воспалений Более того, функциональные производные и антагонисты ICAM-3 можно также использовать для подавления воспалительных процессов 1 Супрессия реакций гиперчувствительности замедленного типа ICAM-3 осуществляет, частично, адгезионные акты, необходимые для создания воспалительных реакций, таких как реакции гиперчувствительности замедленного типа Так, антитела (особенно моноклональные антитела) способные связываться с ICAM-3 обладают терапевтическим потенциалом по ослаблению или исключению таких реакций В другом варианте, так как ICAM-3 является антагонистом взаимодействия ICAM-3/LFA-1, ICAM-3 (особенно в растворимой форме) или его функциональные производные можно использовать для супрессии реакций гиперчувствительности замедленного типа Такие потенциальные терапевтические применения можно использовать двояким образом Во-первых, композиции, содержащие анти-ІСАМ-3 моноклональные антитела или растворимые производные ICAM-3, можно вводить пациентам с реакциями гиперчувствительности замедленного типа Так, например, такие композиции можно предоставить пациентам, которые были в контакте с такими антигенами, как сумах укореняющийся, и тд В другом варианте моноклональные антитела способные связываться с ICAM-3, вводят пациенту вместе с антигеном для предотвращения последующей воспалительной реакции Так дополнительное введение антигена с анти-ІСАМ-3 антителами может способствовать временной толерантности пациента до последующего представления антигена 2 Лечение хронических воспалительных заболеваний Так как у l_AD пациентов из-за отсутствия LFA1 не возникает воспалительной реакции, как считают, антагонизм LFA-1 природных лигандов будет также ингибировать воспалительную реакцию Способность антител против ICAM-3 ингибировать воспаление обеспечивает основу для терапевтического применения при лечении хронических воспалительных заболеваний и автоиммунных заболеваний таких как крапивница, автоиммунные тироидиты, экспериментальные аллергические энцефаломиелиты (ЕАЕ), множественные склерозы, некоторые формы диабетов, синдром Рейнауда, ревматоидные артриты и тд Такие антитела можно также использовать в качестве терапевтических агентов при лечении псориазов Вообще, анти-ІСАМ-3 антитела настоящего ч изобретения можно вводить отдельно или в сочетании с анти-1САМ-1 и/или анти-ЮАМ-2 антителами при лечении таких заболеваний, которые в настоящее время лечат стероидными препаратами В соответствии с настоящим изобретением такие воспалительные и иммунные реакции отторжения можно подавить (например, либо предотвратить, либо ослабить) за счет введения нуждающемуся в таком лечении субъекту такого ко личества противовоспалительного агента, которого достаточно для подавления указанного воспаления Подходящие противовоспалительные агенты включают антитела, способные связываться с ІСАМ-3, фрагменты указанных антител, причем указанные фрагменты способны связываться с ІСАМ-3, практически чистый ІСАМ-3, функциональные производные ІСАМ-3, неиммуноглобулиновые антагонисты ІСАМ-3 или неиммуноглобулиновые антагонисты ІСАМ-3, отличные от LFA-1 Наиболее предпочтительны противовоспалительные агенты, состоящие из растворимых функциональных производных ІСАМ-3 Такое противовоспалительное лечение может также включать дополнительное введение агентов, выбранных из группы, состоящей из антител, способных связываться с LFA-1, неиммуноглобулиновых антагонистов LFA-1, практически чистого 1САМ-1 и/или ІСАМ-2, или производных, или анти-1САМ-1 и/или 17 27763 ние моноклональных антител, способных распознавать ІСАМ-3, может позволить осуществлять трансплантацию органов даже от индивидуумов с HLA несовместимостью С Добавление к интродукции антигенных материалов, вводимых для терапевтических или диагностических целей Иммунные реакции на терапевтические или диагностические агенты, такие, как например, бычий инсулин, интерферон, тканевого типа плазминогенный активатор или мышиные моноклональные антитела, существенно придают терапевтическую или диагностическую ценность таким агентам, и, в некоторых случаях, вызывают такие заболевания как сывороточная болезнь Такие ситуации можно исправить, используя антитела настоящего изобретения В этом варианте настоящего изобретения анти-ІСАМ-3 антитела следует вводить в сочетании с терапевтическим и диагностическим агентом Такое дополнение к антителам предотвращает распознавание агента реципиен том, и поэтому предотвращает инициирование иммунной реакции реципиента против них Отсутствие такой иммунной реакции приводит к способности пациента получать дополнительные введения терапевтического или диагностического агента ІСАМ-3 (особенно в растворимой форме) или его функциональные производные можно использовать отдельно или в сочетании с ІСАМ-1 или ІСАМ-2, или с антителами, способными связываться с LFA-1 при лечении заболеваний Так, в солюбилизированной форме, такие молекулы можно использовать для ингибирования отторжения органа или трансплантата ІСАМ-3 или его функциональные производные можно использовать таким же образом, что и анти-ІСАМ-3 антитела для снижения иммуногеничности терапевтических или диагностических агентов Д Супрессоры опухолевых метастазов Агенты настоящего изобретения можно также использовать для супрессии метастазов крове творных опухолевых клеток, которые требуют функционального члена СД-18 семейства для миграции В соответствии с этим вариантом настоящего изобретения, пациенту, нуждающемуся в та ком лечении, предоставляют такое количество агента (например, антител, способных связываться с ІСАМ-3, токсин-производных указанного антитела, фрагментов антител, причем указанные фрагменты способны связываться с ІСАМ-3, токсин-производные указанного фрагмента, практически чистого ІСАМ-3, функциональных производных ІСАМ-3, или неиммуноглобулиновых антагонистов ІСАМ-3, отличных от ІСАМ-1 или ІСАМ-2), которого достаточно для супрессии указанных метастазов В следующем варианте настоящего изобретения предложен способ супрессии поста ІСАМ-3 экспрессирующих опухолевых клеток Конкретно, указанный способ включает предоставление пациенту, нуждающемуся в лечении, такого количества агента которого достаточно для супрессии указанного роста Подходящие агенты включают антитела, способные связываться с ІСАМ-3; токсин-производными указанного антитела, фрагменты антитела, причем указанные фрагменты спо анти-ІСАМ-2 антител, или их фрагментов Далее настоящее изобретение включает вышеуказанные способы супрессии воспалительных реакций специфической защитной системы, где иммуносупрессор дополнительно вводят субъекту Такие агенты, предпочтительно, вводят в дозах, которые ниже (то есть, в суб-оптимальных дозах) нежели те, которые необходимы обычно Использование суб-оптимальных доз возможно благодаря синергическому действию агентов настоящего изобретения Примеры подходящих иммуносупрессоров включают (но не ограничиваются ими) дексаметазон, азатиоприн, ІСАМ-1, ІСАМ-2 или пиклоспорин А 3 Терапия неспецифических воспалений Многие воспалительные реакции связаны с реакциями "неспецифической защитной системы" и осуществляются за счет лейкоцитов, которые не способны к иммунологической памяти Такие клетки включат гранулоциты и макрофаги Как здесь использовано, говорят, что воспаления являются результатом реакции неспецифической защитной системы, если воспаление вызывается, осуществляется за счет, или связано с реакцией неспецифической защитной системы Примеры воспалений, которые приводят, по крайней мере, частично, к реакции неспецифической защитной системы, включают воспаления, связанные с такими состояниями, как синдром расстройства распираторной системы у взрослых (АРД ) или синдромы множественного поражения органов, вторичные после сепсисов, травм и кровотечений, реперфузионных поражений тканей миокарда и других, острые гломерулонефриты, реактивные артриты, дерматозы с острыми воспалительными компонентами, острые пурулентные менингиты или другие воспалительные расстройства центральной нервной системы, такие как удар, ожог, гомодиализ, лейкаферез язвенные колиты, болезнь Крона, некротизирующие энтероколиты, синдром, связанный с трансфузией гранулоцитов, и токсичность вызванная цитокином Противовоспалительные агенты настоящего изобретения являются соединениями, способными специфически антагонизировать взаимодействие СД-18 комплекса на гранулоцитах с эндотелиальными клетками Такие антагонисты включают ІСАМ-3, функциональные производные ЮАМ-3, неиммуноглобулиновые антагонисты ІСАМ-3, отличные от ІСАМ-1, ІСАМ-2 или членов СД-18 семейства молекул В Супрессоры отторжения органов и тканей Так как ІСАМ-3, особенно в растворимой форме, способны действовать таким же образом, что и антитела к членам семейства СД-18, их можно использовать для супрессии отторжения органов или тканей, вызываемого любой из функций, зависящей от клеточной адгезии Более того, антиІСАМ-3 антитела, функциональные производные ІСАМ-3 и антагонисты ІСАМ-3 можно использовать для супрессии таких отторжений ІСАМ-3 и анти-ЮАМ-3 антитела можно использовать для предотвращения отторжения твердых органов или тканей, например, почек, отторжения нетвердых органов, например, костного мозга, или модифицированных автоиммунных реакций у млекопитающих Важно, что использова 18 27763 быть предложены пациентам, которые экспонированы или подвержены HIV инфекции Агенты настоящего изобретения могут быть либо "профилактическими", либо "терапевтическими" при лечении HIV инфекций Если предполагается профилактика агент предоставляют до того, как появляются симптомы вирусного заболевания (например, до, во время, или сразу после времени такой инфекции, но до появления симптомов такой инфекции) Профилактическое введение агента служит для предотвращения или ослабления любой последующей HIV инфекции Если агент используют в терапевтических целях, его предоставляют при определении (или сразу после) инфицированных вирусом клеток Терапевтическое введение агент служит для ослабления любой дополнительной HIV инфекции Агенты настоящего изобретения могут, таким образом, быть введены либо до установления вирусной инфекции (для того, чтобы подавить нежелательную HIV инфекцию) или после реального определения таких инфицированных вирусом клеток (для подавления дальнейшей инфекции) В следующем варианте настоящее изобретение предлагает улучшенную терапию для AIDS, и улучшает средства для подавления HIV инфекции, и особенно HIV-1 инфекции которая включает со вместное введение (I) ICAM-3, растворимого производного ICAM3, СД11 (либо СД11а, СД11Ь, или СД11с), раство римого производного СД11, СД18, растворимого производного СД18 или СД11/СД18 гетеродимера, или растворимого производного СД11/СД18 гете родимера и/или (II) антитела, способного связываться с ICAMЗс (III) клетками или частицами, связанными с СД4 или растворимым производным СД4 и/или (IV) молекулами (предпочтительно, антитела ми или фрагментами антител), способными свя зываться с СД4 В следующем варианте настоящего изобретения предложен способ супрессии миграции HIVинфицированных клеток Более конкретно, указанный способ включает введение эффективного количества анти-миграционного агента HIVинфицированному субъекту Анти-миграционные агенты настоящего изо бретения включают ЮАМ-З, фрагмент ЮАМ-З функциональное производное ЮАМ-З, или антиICAM-3 антитела, которые способны придавать способность инфицированным HIV Т-клеткам связываться с LFA-1 лигандом Антитела, которые связываются с ЮАМ-З будут подавлять миграцию, придавая способность ЮАМ-З экспрессированным HIV - инфицированным Т-клеткам способность связываться с клетками, экспрессирующими СД11/СД18 рецептор Для придания способности клеткам связываться с СД11/СД18 рецепторам имеется возможность использовать антитела, способные связываться с ЮАМ-З Агенты настоящего изобретения предназначены для придания реципиентам агентов в количестве, достаточном для супрессии миграции HIV (или других вирусов) - инфицированных Т- клеток Говорят, что количество достаточно для супрессии миграции Т- клеток, если дозы способы вве собны связываться с ЮАМ-З, токсин-производные указанного фрагмента, токсин-производные члена СД-18 семейства молекул, или токсинпроизводные функционального производного члена СД-18 семейства молекул В следующем варианте настоящего изобретения предложен способ супрессии роста LFA-1 экспрессирующих опухолевых клеток Конкретно, указанный способ включает обеспечение пациента, нуждающегося в таком лечении, таким количеством токсина, которого достаточно для супрессии указанного роста Подходящие токсины включают токсин-производные ЮАМ-З, или токсинпроизводные функционального производного ICAM-3 Е Супрессия HIV инфекции и предотвращение распространения HIV инфицированных клеток В следующем варианте настоящего изобретения предложен способ супрессии инфекции HIV Конкретно, указанный способ включает введение HIV-инфицированному субъекту эффективного количества агента супрессии HIV инфекции Хотя настоящее изобретение конкретно касается способа супрессии HIV-1 инфекции, следует учитывать, что этот способ можно применить к любому HIV варианту (например, HIV-2), который может инфицировать клетки таким способом, который может быть супрессирован агентами настоящего изобретения Такие варианты являются эквивалентами HIV-1 для целей настоящего изобретения Один из аспектов настоящего изобретения проистекает из понимания того факта, что экспрессия LFA-1 и, в некоторых случаях, LFA-1 связывающих лигандов, стимулированных HiV инфекцией, промотирует реакции адгезии "клеткаклетка", которые могут повысить время контакта инфицированных и неинфицированных клеток, облегчая перенос вируса от инфицированных к неинфицированным клеткам Так, агенты настоящего изобретения, которые способны модулировать LFA-1/лиганд взаимодействие, способны подавлять инфекцию HIV, и, в частности, HIV-1 Следует понять, за счет каких молекул, ингибирующих взаимодействия LFA-1/лиганд, модно подавить HIV инфекцию, за счет придания способности LFA-1/лиганду, экспрессируемому HIVинфицированными клетками связываться с СД11/СД18 рецепторами здоровых Т- клеток В другом варианте молекулы, которые ингибируют LFA-1/лиганд взаимодействия могут придавать способность СД11/СД18 рецепторам, экспрессированным HIV-инфицированными клетками, связываться с LFA-1 здоровых Т- клеток Для придания способности клеткам связываться с СД11а/Сд18 рецептором, или LFA-1 связывающего лиганда, имеется возможность использовать ICAM-3, фрагмент ICAM-3, функциональное производное ЮАМ-З или анти-ІСАМ-3 антитела Агенты настоящего изобретения предназначены для того, чтобы обеспечить реципиентов агентами в количествах, достаточных для достижения супрессии HIV инфекции Говорят, что количество достаточное для супрессии HIVинфекции, если дозы, способ введения, и т д , агента достаточны для ослабления или предотвращения такой HIV инфекции Агенты должны 19 27763 дения и тд агента достаточны для ослабления или предотвращения такой миграции Введение такого соединения (соединений) может быть либо с "профилактическими", либо с "терапевтическими" целями Если предусматривается профилактика, агенты настоящего изобретения вводят до появления каких-либо симптомов вирусной инфекции (например, до, во время или сразу после момента такой инфекции, но до проявления каких-либо симптомов такой инфекции) Профилактическое введение агентов служит для предотвращения или ослабления любой последующей миграции инфицированных вирусом Тклеток Терапевтическое введение агента служит для ослабления любой дополнительной миграции таких Т- клеток Агенты настоящего изобретения могут, таким образом, быть предоставлены либо до установления вирусной инфекции (для подавления нежелательной миграции инфицированных Т- клеток), или после реального определения таких инфицированных вирусом клеток F Лечение астмы В следующем варианте настоящего изобретения, агент, способный модулировать LFA-1/ICAM-3 взаимодействия, используют при лечении астмы Конкретно, указанный способ включает введение эффективного количества анти-астматического агента индивидууму, нуждающемуся в таком лечении Анти-астматические агенты настоящего изобретения включают ICAM-3, фрагмент ICAM-3, функциональное производное ICAM-3, или ICAM-3 антитела, которые способны придавать способность клеткам связываться с LFA-1 Антитела, которые связываются с ICAM-3 будут подавлять миграцию эозинофилов путем придания способности ICAM-3 экспрессированным на этих клетках, свя зываться с клетками, экспрессирующими СД11/СД18 рецептор Анти-астматические агенты настоящего изобретения предназначены для предоставления реципиенту агента в количестве, достаточном для снижения или ослабления серьезности, степени или длительности симптомов астмы Для терапевтических целей агент предоставляют во время (или сразу после) проявления симптомов астмы Терапевтическое введение агента служит для ослабления любых острых приступов астмы Таким образом, агенты настоящего изобретения могут вводиться либо до нежелательного приступа астмы (для ослабления серьезности приступа, длительности или степени приступа) или после начала приступа С Диагностические и прогностические применения Моноклональные антитела, способные связываться с ICAM-3 можно использовать как средства изображения или визуализации сайтов ICAM-3 экспрессии и воспалений у пациента При таком использовании анти-ЮАМ-3 моноклональные антитела метят детектируемым образом, например, используя радиоизотопы, метки сродства (например, биотин, авидин и т д), флуоресцентные метки или парамагнитные атомы Процедуры введения таких меток хорошо известны специалистам Меченые антитела можно затем использовать в получении диагностических изображений Клиническое применение антител для получения диагностических изображений описано в обзоре Grossman, H В Urol Clin North Amer, 13 465-474 (1986), Under, E С , et al, Invest Radiol, 20 693-700 (1985), и Khaw, В A , et al , Science, 209 195-197 (1980) Наличие ICAM-3-экспрессии можно также де тектировать за счет использования зондов гибридизации, таких как мРНК, кДНК геномная ДНК, или синтетического олигонуклеотидного зонда, который связывается с ІСАМ-3 геномной последовательностью, или с ІСАМ-3 мРНК последовательностью, присутствующими в клетках, которые экспрессируют ІСАМ-3 Методики осуществления такого гибридизационного анализа раскрыты Maniatis T et al, Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Coldpnng Harbor NY (1982) и Haymes В D et al , Nucleis Acid Hybridisation, a Practical Approach, JRL Press, Washington, DC (1985) (которые включены сюда по ссылке) Определение очага ICAM-3 экспрессии с помощью использования меченых антител или зондов нуклеиновых кислот можно использовать для диагностики развития опухолей В одном из диагностических вариантов образцы тканей или крови отбирают у субъекта и инкубируют в присутствии антител, которые детектируемо помечены, или которые могут быть детектируемо помечены В предпочтительном варианте такую методику осуществляют неинвазивным способом, используя магнитные изображения, флюорографию и тд Такие диагностические тесты можно использовать для контроля за реципиентами с трансплантированными органами, например, почкой, для определения ранних сигналов возможного отторжения тканей Такой анализ можно проводить в попытках определить предрасположенность индивидуумов к ревматоидным артритам или другим хроническим воспалительным заболеваниям Так например, пометив радиоактивно антиЮАМ-3 антитела или фрагменты антител, можно детектировать антигены, используя радиоиммунологический анализ Хорошее описание радиоиммунологического анализа (RIA) можно найти в Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology by Work T S et al, North Holland Publishing Company, NY (1978) и, преимущественно, в главе озаглавленной «Введение в радиоиммунологический анализ и связанные с ним методики» Chard Т (включено сюда по ссылке) В другом варианте, антитела можно метить флуоресцирующим соединением, энзимом или другими подходящими метками, известными специалистам В дополнение к локализации сайтов воспаления, антитела, которые могут связываться с ICAM3, можно использовать для анализа биологических жидкостей на предмет присутствия циркулирующих ICAM-3, используя любую из обычно ис пользуемых сред для анализа жидкостей Наличие циркулирующих ICAM-3 в образце жидкости является показателем воспалительной реакции или других биологических функций, осуществляемых за счет ICAM-3 Кроме того, наличие ЮАМ-3 в аминотических жидкостях связано с осложнениями, возникающими при беременности Для анализа могут быть использованы любые биологические 20 27763 тически эффективная доза может быть снижена, если анти-ЮАМ-3 антитела вводят вместе с антиІСАМ-1 антителами, анти-1САМ-1 антителами и/или анти-ЮАМ-2 антителами В том смысле как здесь использовано, говорят, что соединение вводится дополнительно с другим соединением, если введение этих двух соединений настолько близко по времени, что их можно одновременно детектировать в сыворотке пациента Оба антитела, способные связываться с ІСАМ-3 и сами ІСАМ-3 можно вводить пациенту внутривенно, внутримышечно, подкожно, энтерально, поверхностно или парентерально При введении антител или ІСАМ-3 с помощью инъекций, такое введение может быть непрерывной инъекцией или единичной или множественными дозами Агенты настоящего изобретения предназначены для введения реципиенту в количестве достаточном для того, чтобы быть «физиологически эффективными» Говорят, что количество «физиологически эффективно», если доза, способ введения агента, и т п , достаточны для ослабления или предотвращения физиологических эффектов связанных с ІСАМ-3 Так например один из агентов настоящего изобретения вводят паци енту с целью подавления воспаления, и говорят что он физиологически эффективен, если его вводят в дозе, достаточной для подавления воспаления Кроме того, анти-ІСАМ-3 антитела или фрагменты можно вводить либо отдельно либо в сочетании с одним или более из дополнительных иммуносуппрессорных агентов (особенно, пациентам с трансплантатами органов или тканей) Введение таких соединений (или соединения) может биїть как с целью "профилактики", так и с "терапевтическими" целями В случае профилактики иммуносупрессорные соединения вводят до проявления каких-либо воспалительных реакций или симптомов (например, до, во время, или сразу после момента трансплантации органа или ткани, но до появления каких-либо симптомов отторжения тканей или органа) Профилактическое введение соединения (соединений) служит для предотвращения или ослабления любых последующих воспалительных реакций (например отторжения трансплантированных органов или тканей и т д) При терапевтическом введении соединения / соединений вводят во время или сразу после установления симптома острого воспаления (например отторжения органа или ткани) Терапевтическое введение соединения / соединений служит для ослабления любых острых воспалений (например, отторжения трансплантированных твердых органов или тканей, например, почки, или нетвердых органов, например костного мозга) Таким образом, противовоспалительные агенты настоящего изобретения можно вводить либо до установления воспаления (например для супрессии нежелательного воспаления), либо после начала воспаления Говорят, что композиция "фармакологически приемлема", если пациент переносит ее введение Когда говорят, что агент вводят в "терапевтически эффективном количестве", подразумевают, что это количество физиологически значило жидкости Однако, предпочтительными биологическими жидкостями являются кровь, сыворотка, плазма, синовиальная жидкость, спинномозговая жидкость или моча VIII Введение композиций настоящего изобретения Терапевтический эффект ICAM-3 может быть достигнут при введении пациенту полной ICAM-3 молекулы, при ее терапевтически активного пептидного фрагмента Особый интерес представляют терапевтически активные пептидные фрагменты ІСАМ-3, которые растворимы ICAM-3 и его функциональные производные можно получить синтетически, за счет использования рекомбинантной ДНК технологии, протеолизом или сочетанием этих способов Терапевтические преимущества ICAM-3 можно усилить за счет использования функциональных производных ICAM-3 обладающих дополнительными аминокислотными остатками, которые добавляют, чтобы повысить способность присоединяться к носителю или повысить активность ICAM-3 В объем настоящего изобретения входят такие функциональные производные ICAM-3, в которых отсутствуют определенные аминокислотные остатки или которые содержат измененные аминокислотные остатки, при условии, что такие производные обладают или осуществляют биологические или фармакологические функции ICAM-3 Говорят что как антитела настоящего изобретения, так и раскрытые здесь молекулы ICAM-3, «практически не содержат природных примесей», если препараты, которые их содержат, практически свободны от материалов, с которыми эти продукты обычно и природно находятся Настоящее изобретение относится также к антителам и их биологически активным фрагментам (как поликлональным, так и моноклональным), которые способны связываться с ІСАМ-3 Такие антитела можно получить либо из животных, либо на культурах тканей, либо с помощью рекомбинантных ДНК Введение ІСАМ-3 или молекул, полученных из ІСАМ-3, можно осуществить отдельно или в сочетании с ІСАМ-1 и/или ІСАМ-2 Введение антиІСАМ-3 антител, или других молекул способных связываться с ІСАМ-3 или с молекулами полученными из ІСАМ-3, можно осуществить отдельно или в сочетании с анти-ІСАМ-І антителами и/или анти-ЮАМ-2 антителами При введении пациенту антител или фрагментов антител способных связываться с ІСАМ-3, или вводя ІСАМ-3 (или фрагмент, вариант или их производные) пациенту, дозы вводимого агента должны меняться в зависимости от таких факторов как возраст пациента, вес, рост, секс общее состояние здоровья, медицинская предыстория и тд Обычно желательно вводить реципиенту дозы антител, которые находятся в интервале от около 1 мг/кг до 10 мг/кг (веса пациента), хотя можно вводить и более низкие или более высокие дозы При введении пациенту ІСАМ-3 молекул или их функциональных производных, предпочтительно вводить такие молекулы в дозах, которые также находятся в интервале от около 1 мг/кг до 10 мг/кг (веса пациента), хотя возможно вводить и более низкие и более высокие дозы Как будет обсуждаться далее терапев 21 27763 Агент является физиологически значимым, если его присутствие приводит к детектируемым изменениям физиологии реципиента-пациента. Антитела и ICAM-3 молекулы настоящего изобретения можно сформулировать в соответствии с известными способами приготовления фармацевтически полезных композиций, где такие материалы или их функциональные производные объединяют с фармацевтически приемлемым носителем. Подходящие носители и их композиции, включая другие протеины человека, например, альбумин сыворотки человека, описаны, например, в Remington's Pharmaceufical Science (16th ed. Osol, A. Ed. Mack, Easton PA (1980)). Для получения фармацевтически приемлемой композиции для эффективного введения, такие композиции будут содержать эффективное количество агента настоящего изобретения вместе с подходящим количеством носителя. Кроме того, антитела настоящего изобретения можно гуманизировать, за счет химеризации или CDR трансплантатов, чтобы они стали более "фармакологически приемлемы" пациентами. Такие способы химеризации антител, особенно анти-1САМ-1 антител описаны в патентной заявке Великобритании № 9009548.0, 9009549.8 и в РСТ заявках № PCTUS 91/02942 и PCT/US 91/02946, поданных в приемный офис США 27 апреля 1991 г. (включено сюда по ссылке). Дополнительные фармацевтические способы можно использовать для контроля длительности действия. Препараты с контролируемым высвобождением можно получить за счет использования полимеров, которые образуют комплексы или абсорбируют агенты настоящего изобретения. Скорость и длительность контролируемого высвобождения можно регулировать в некоторой степени за счет выбора соответствующих макромолекулярных матриц, изменяя концентрации включенных макромолекул, а также за счет способов включени. Другим возможным способом контроля длительности действия за счет контролируемого высвобождения препаратов является включение агентов настоящего изобретения в частицы полимерного материала, например, в полиэфиры, полиаминокислоты, гидрогели, полимеры молочной кислоты или сополимеры этилена и винилацетата. В другом варианте вместо включения этих агентов в полимерные частицы, можно заключить эти материалы в микрокапсулы, полученные, например, в результате коацервации, или в результате межфазной полимеризации, микрокапсулированием в желатине или поли (метилметакрилате), или в системе постановки коллоидных лекарств, например, липосом, микросфер альбумина, микроэмульсий, наночастиц и нанокапсул или в макроэмульсиях. Далее изобретение включает фармацевтическую композицию, содержащую: а) противовоспалительный агент (например, антитела, способные связываться с ІСАМ-3; фрагмент указанных антител, способных связываться с ІСАМ-3; ІСАМ-3; функциональное производное ІСАМ-3; или неиммуноглобулиновый антагонист ІСАМ-3, отличный от ІСАМ-1 и ІСАМ-2, и в) по крайней мере, один иммуносупрессорный агент. Примеры подходящих иммуносупрессорных агентов включают дексаме тазон, азатиоприн и циклоспорин А. После того, как были в общем описаны изобретение, агенты и способы их получения, изобретение будет легче понять со ссылкой на следующие примеры, которые приведены лишь с целью иллюстрации, и не должны лимитировать настоящее изобретение, если только нет специальных указаний. Пример 1. Характеристика ІСАМ-3, нового адгезионного лиганда для LFA-1 Адгезию клеточных линий и лимфоцитов (Dustin et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant Biol., 54:753-765 (1989)) к пластинам, покрытым LFA-1 осуществляют в соответствии с описанием. LFA-1, очищенные от YV лизатов, абсорбируют на микротитровальные пластины с 96 ячейками (Linbrotitertek) в количестве 1100 сайтов/мкм2. Неспецифические связывающие сайты блокируют 1 % BSA и промывают PBS (5% FBS/2 мм MgCI2 / 0,5% HSAy среда анализа). Специфического ингибирования LFA-1 достигают за счет инкубирования в течение 30 минут при комнатной температуре микротитровальных пластин с 1/200 разбавлениями TS/22 (анти-LFA-i) асцитами. Покоящиеся Тклетки выделяют из целой крови за счет прилипания к пластику и фильтрации на нейлоновой вате, и составили 91% СД2+, тогда как РНА-бласты генерируют за счет культивирования клеток в присутствии 10 мкг/мл фитогемагглютинина (РНА). Клетки метят флуорохромом BCECF (Molecular Probes Juc), промывают и снова суспендируют в среде анализа. МАЬ предварительная обработка клеток состоит в инкубировании с 1/200 разбавлениями для асцитов в течение 45 минут при 4°С, после чего 105 клеток переносят в каждую ячейку. Клеточные линии прилипают к твердой фазе LFA1 в течение 1 часа при 37°С, а не прилипшие клетки удаляют, 6 раз отсасывая (23 gauge иглой), тогда как лимфоциты осаждают при ЗОхд в течение 5 минут, и инкубируют при 37°С в течение 30 минут. Несвязанные лимфоциты, которые удаляют, стряхивая среду с пластин 8 раз, добавляя по 100Y между каждыми промывками Стряхивание более эффективно для тщательного удаления несвязанных Т лимфоцитов, которые более трудно удалять из-за их малого размера. Флуоресценцию непосредственно количественно определяют из 96 ячеечных пластин, используя флуоресцентный концентрационный анализатор (Baxte). Все Mab используют при насыщающих концентрациях (1/200 разбавлений асцитов), и включают TS 1/22 (анти-СД11а, Ig G1) (Sanches-Madrid et al., Proc Natl Acad. Sci. USA 79:7489-7493 (1982)), PR1/1 (анти-ІСАМ-1, Ig G1) (Rothlein et al., J. Immunol., 1371270-1274 (1986), CBP-102/2 (анти-ІСАМ-2, Ig G1a) (de Fouderolles et al., J. Exp. Med. (1991) в печати)) и CBR-IC3/1 (анти-ІСАМ-3, Ig G1) CBRIC3/1 получают при слиянии мышиной миеломы РЗХ63Ад8,653 с клетками селезенки из SKW3инъектированных Balb/c мышей (Gefter et al., Som. Cell Gen., 3.231-236 (1977)) и 600 гибридом скринируют по их способности ингибировать SKW3 связывание с очищенными LFA-1. CRB-IC3/1, как было показано, не реагируют ни с очищенным LFA-1, ни с COS клетками трансфектированными либо ІСАМ-1, ІСАМ-2 или LFA-1 кДНК (данные не представлены). Один из четырех представитель 22 27763 моноцитанами и Т-клеткам, специфичным МАЬ. Прилипание к пластику используют для обогащения лимфоцитами из РВМС, и клетки культивируют в присутствии 10 мкг/мл фитогемагглютинина (РНА) Образцы анализируют, используя EPICS цитомерт в потоке, и количественно определяют, используя EPICS Immune-Britte флуоресцентные шарики (Coulter) для калибровки цитометра. Экспрессия ICAM-3 на покоящихся лимфоцитах в 2-3 раза больше, нежели СДЗ или LFA-1, тогда как моноциты экспрессируют в 3-4 раза больше ICAM3, нежели LFA-1. Уровни экспрессии ICAM-3 на нейтрофилах эквивалентны экспрессии Мас-1 (СД11/СД18). Обработка слеток фосфолипазой С выявила отсутствие РІ-связанной формы ICAM-3 ных экспериментов представлен, а прямоугольники ошибок указывают стандартные отклонения Пример II. Цитометрический анализ в потоке клеточной экспрессии ICAM-1, ICAM-2 и ICAM-3 Все использованные клеточные линии были ранее описаны (Hibbs et al., J. Clm. Invest 85.674681 (1990)). Периферические одноядерные клетки крови (РВМС) были получены при седиментации декстрана и Ficoll-Hypaque (1,077) центрифугированием, как описано (Dustin et al., J. Cell Biol. 107:321-331 (1988)). Нейтрофилы удаляют из клеточного осадка, а примесные эритроциты удаляют гипотоническим лизисом. Лимфоциты и моноциты разделяют цитометрическим анализом, используя взаимноперпендикулярное светорассеяние, и подтверждают Таблица 2 Относительная антигенная поверхностная экспрессия ICAM-3 по данным иммунофлуоресцентной цитометрии в потоке Клеточная линия/тип Покоящиеся лимфоциты 1 день РНА бласты 3 день РНА бласты 5 день РНА бласты Моноциты Нейтрофилы Т лимфобластоиды SKW3 Jurkat SupT Molt4 Специфическая линейная интенсивность флуоресценции а1САМ-1 (RR1/1) oclCAM-2 (CBRсхЮАМ-3 (CBRIC3/1) IC2/1) 4 22 22 106 85 18 78 25 42 205 13 1 45 223 39 0 224 213 02 98 73 10 1 166 161 113 19 242 117 В лимфобластоиды JY SLA Ramos Raji 154 224 132 266 119 113 136 88 47 306 112 0 Моноциты U937 HL60 62 17 67 43 37 203 896 475 3 0 0 0 293 143 0 . 31 1526 1082 0 409 0 494 41 900 ооо ооо Меланомы ВК RPMI 7591 Эритролейкемия К562 Примесные HUVEC HepG2 HeLa RD3/5 FS1.2.3 А172 точные линии включают: эндотелиальные клетки умбиликальной вены человека, huvec; карциномы груди человека, Hep G2; клеточную линию эпителоидной карциномы человека Неіа, рабдомиосаркомы человека, RD3/5; фибросаркомы человека и FS1,2,3; глиобластомы человека. Пример III Иммуноосаждение ICAM-3 Введение меток 125J на поверхности клеток осуществляют используя иодоген как указано Примечания к таблице II. * Мембранная экспрессия, определенная иммунофлуоресцентным анализом в потоке в соответствии с указанными материалами и способами. Величины являются результатом, по крайней мере, двух экспериментов Для калибровки цитометра используют флуоресцентные шарики таким образом, что каждая единица соответствует приблизительно 103 эквивалентам флуоресцина (Coulte Diagnostics, Hialeach, FL). "Незначительные" кле 23 27763 тидной цепи. МНС класс 1 содержит N-связанный углеводород, тогда как 1САМ-2/Мг 60000, 6 Nсвязанных сайтов, основная цепь Мг 28383) сильно гликозилирована. Пример IV Распределение ICAM-3 Анти-ЮАМ-3 антитела настоящего изобретения используют для дальнейшей оценки тканевого распределения ICAM-3 протеина с использованием цитометрии в потоке. В таблице 3 представлены суммарно типы клеток, которые демонстрируют поверхностную экспрессию ICAM-3. Экспрессия ICAM-3, по-видимому, ограничена кроветворными клетками. Данные цитометрии в потоке подтверждаются в процессе иммуногистохимического окрашивания ткани с использованием меченых антиICAM-3 антител (данные не представлены) Что касается данных цитометрии в потоке, иммуногистохимические исследования показывают, что ICAM-3 экспрессия, по-видимому, ограничена кроветворными клетками. (Kishimoto et al., J. Biol. Chem., 264.3588-3595 (1989)). Клетки лизируют тритоном Х-100 (1%). Лизаты предварительно очищают бычьим JgG на сефарозе, а затем инкубируют с соответствующей MAb-связанной сефарозой в течение 2 часов. Шарики промывают и кипятят в образце буфера, содержащем 50 мМ Tris, 1% SDS и 1% 2меркаптоэтанола. Невосстановленные образцы кипятят в буфере без 2-меркаптоэтанола, и обрабатывают 20 мМ иодоацетамида. Образцы анализируют на 7% полиакриламида. Образцы анализируют на 7% полиакриламидном геле в виде вертикальных столбиков, как было указано ранее (Laemmlin, U. К. Nature, 227:680-685 (1970)) и протеины визуализируют авторадиографией. Обработка образцов N-Гликанозой (Genzyme) как было описано ранее (Tarenfino et al., Biochemistry, 24.4665-4671 (1985)), с использованием концентрации 10 ед/мл при 37°С в течение 18 часов, как было показано, приводит к оптимальному отщеплению всех N-связанных олигосахаридов от пеп Таблица 3 Относительная поверхностная антигенная экспрессия ICAM-3 по данным иммунофлуоресцентной цитометрии в потоке Клеточная линия/тип Покоящиеся лимфоциты 1 день РНА бласты 3 день РНА бласты 5 день РНА бласты Моноциты Нейтрофилы Т лимфобластоиды SKW3 Jurkat SupT Molt 4 Специфическая линейная интенсивность флуоресценции alCAM-1 (RR1/1) alCAM-2(CBR-IC2/1) alCAM-3(CBR-IC3/1) 4 22 22 106 85 18 78 25 42 205 13 1 45 223 39 0 224 213 02 273 98 10 161 166 1 19 113 117 242 154 224 132 266 119 113 136 88 47 308 112 0 Моноциты U937 HL60 62 17 67 43 37 203 Меланомы ВК RPMI 7591 Эритролейкемия К562 Примесные HUVEC HepG2 HeLa RD3/5 FS1.2.3 А172 896 475 3 0 0 0 293 143 0 31 1526 1082 0 409 0 494 41 0 900 Примечания к таблице 3: * Мембранную экспрессию определяют иммунофлуоресцентной цитометрией в потоке, как указано в материалах и способах. Указанные значения представляют собой среднее из, по крайней мере, двух экспериментов. Для калибровки цито ооо ооо В лимфобластоиды JY SLA Ramos Raji метра используют флуоресцентные шарики таким образом, что одна единица составляет приблизительно 103 эквивалентов флуоресцина (Coulte Diagnostics, Hialeah, F. L). * Незначительные клеточные линии включают. Эндотелиальные клетки умбиликальной вены че 24 27763 обычными для членов семейства (САМ гликопротеинов. ICAM-1 демонстрирует аналогичные вариации молекулярного веса среди различного типа клеток. Такие вариации молекулярного веса, видные для ICAM-1, как было показано, вызываются различиями в степени гликозилирования. Поэтому вариации в молекулярных весах ICAM-3 наиболее вероятно связаны с различиями в гликозилировании. Специалисты могут легко подтвердить это, выделяя ICAM-3 из нейтрофилов различными гликозидазами и другими энзиматическими обработками, и наблюдая за их влиянием на молекулярные веса. Как было показано, различные степени гликозилирования ICAM-1 влияют на МАС1/СД11/СД18/связывание. Поэтому, меняя степень гликозилирования ICAM-3, можно создавать производные ICAM-3, которые обладают модифицированными афинностями для связывания с различными лигандами ICAM-3, например, членами СД11/СД18 семейства гликопротеинов. Пример VII Антитела ICAM-3 Мышам вводят инъекцией комбинацию адьюванта и ICAM-3 протеина, предварительно очищенного от SKW3 или клеток миндалин, как описано ранее. Моноклональные антитела иммунизованных животных получают, используя известные специалистам способы. В таблице 4 представлены различные полученные анти-ЮАМ-3 антитела. Различные антитела были идентифицированы на основании их способности реагировать с очищенными иммобилизованными ICAM-3 с помощью ELISA. Затем положительные МАЬ скринируют на различных клеточных линиях, которые, как известно, являются ICAM-3 положительными, а затем иммуноосаждают из радиомеченых ICAM-3 положительных клеточных лизатов. Затем МАЬ тестируют по их способности блокировать РМАиндуцированную SKW3 клеточную аггрегацию в присутствии анти-1САМ-1 и анти-ЮАМ-2 антител. В другом варианте, анти-ЮАМ-3 антитела можно идентифицировать по их способности ингибировать связывание SKW3 клеток с иммобилизованными очищенными ІСАМ-3 Одним из доказательств того, что существует третий лиганд LFA-I, является наличие ІСАМ1/ЮАМ-2 независимого пути для аггрегации SKW3 клеток, стимулированной РМА Авторы смогли блокировать эту аггрегацию либо мышиной антиЮАМ-3 поликлональной антисывороткой, либо комбинацией CBR-JC3/1 и CBR-IC3/2 ловека, HUVEC; карциномы груди человека, Hep G2; клеточную линию эпителоидной карциномы человека HeLa; рабдомиосаркомы человека, RD3/5; фибросаркомы человека и FS1,2,3; глиобластомы человека. Пример V Очистка ICAM-3 ICAM-3 очищают, используя иммуноафинную хроматографию, где анти-ЮАМ-3 антитела СВРICAM-3/1 иммобилизуют на матрицах, используя известные специалистам способы. В качестве исходных материалов для выделения ICAM-3 были использованы многочисленные источники. Они включают, хотя и не ограничиваются ими, SKW3, клеточную линию тимомы человека, и миндалины человека. Способы, которые используют для очистки ICAM-3, соответствуют тем, которые описаны de Fougerolles et al., b J. Exp Med., 175185-190 (1992) Специалистам известны режимы промывки и элюирования (реагенты варьируются слегка для каждого антигена, подлежащего очистке, и для каждого антитела, которое используют в иммуноафинной хроматографии). Как было указано ранее, ICAM-3, очищенные от SKW3 клеток или клеток миндалин человека, по-видимому, имеют молекулярный вес от около 120 до 124 кД, тогда как ICAM-3, выделенный из нейтрофильных лизатов, приводит к широкой полосе, соответствующей молекулярным весам от около 120 до 150 кД. Было показано, что ICAM-3, очищенный таким образом, сохраняет свою способность связывать анти-ЮАМ-3 антитела, и LFA-1 на различных клетках (фиг. 6 и 7): Пример VI Идентификация различных молекулярных весов ICAM-3 Иммуноосаждение и анализ с помощью электрофореза на полиакриламидном геле используют для определения молекулярных весов ICAM-3, на клетках различных типов. Молекулярный вес ICAM-3, иммуноосажденных с нейтрофилов, как было обнаружено, отличается от молекулярного веса ICAM-3, иммуноосажденного с лимфоцитов. ICAM-3, выделенные из лимфоцитных и лимфоидных клеточных линий, проявляются как полоса с молекулярным весом от около 120 до 124 кД. Молекулярный вес ICAM-3, выделенных с нейтрофилов, несколько выше того, который имеют ICAM-3, экспрессированные лимфоидными клетками, и проявляются как диффузная полоса от около 120 до 150кД Фиг. 4. Такие вариации в размерах не являются не Таблица 4 ICAM-3 mAbs mAb CBR-IC3/2 CBR-IC3/3 CBR-IC3/4 CBR-IC3/5 CBR-1C3/6 1САМ-3 антисыворотка изотип Индуцировано РМА Alone +IC1+2mAb lgG2a, k lgG2a, к 3 IgM, к lgG2a, к ND. 25 2 4 4 2 5 3 3 3 2 5 0 Аггрегация +IC1+2+IC3/1 mAb 0 2 2-3 0-1 5 0 27763 mAb CBR-IC3/1 HP2/19** Продолжение таблицы 4 Индуцировано РМА Аггрегация Alone +IC1+2mAb +IC1+2+IC3/1 mAb 5 4 1 изотип lgG1,k клеток, стимулированное РНА. Однако, комбинация (І) анти-ІСАМ-1, ІСАМ-2, и анти-ЮАМ-3 антител, (2) двух анти-ЮАМ-3 антител (ЮЗ/1 и ЮЗ/2) и (3) анти-ЮАМ-1 и анти-ЮАМ-3 антител оказывается эффективной при блокировании РНА стимулированного деления клеток Пример IX Смешанная лимфоцитная реакция Для определения иммунологической реакции используют MLR анализ. Этот анализ, в основном включает добавление химически фиксированных чужеродных клеток (стимуляторных клеток) к раствору, содержащему PBL от различных индивидуумов (клетки репондеров) и определение уровня реакции, используя пролиферацию клеток репондеров как индекс, как было указано ранее (Krensky et al., J. Immunol. 131:611-616 (1983)). Этот анализ представляет собой первый шаг по идентификации композиций, пригодных для предотвращения отторжения трансплантатов. Влияние различных антител и комбинаций антител на MLR реакции представлено на фиг. 10. В сумме, отдельно анти-ЮАМ-3 демонстрирует малое влияние. Однако, было обнаружено, что более высокий уровень эффективности блокирования MLR наблюдается для комбинаций антиЮАМ-1 и анти-ЮАМ-3 антител. Наиболее сильную реакцию наблюдают для комбинации анти-ЮАМ-1, анти-ЮАМ-2 и анти-ЮАМ-3 антител. Пример X Пептидные последовательности ICAM-3 ЮАМ-З очищают от клеток миндалин человека иммуноафинной хроматографией, как указано в примере 5. Очищенные ЮАМ-З энзиматически переваривают с помощью Lys-C энзима, используя известные способы, и пептидные фрагменты разделяют с помощью ВЖХ. Фиг. 11 представляет газовую хроматограмму различных пиков протеинов, которые наблюдаются при типичном переваривании. Пики 10 и 17 были идентифицированы как содержащие пептидные фрагменты достаточного размера и структуры, которые следует секвенировать (здесь и далее NK-10 и NK-17 пептиды, соответственно). Аминокислотные последовательности NK-17 и NK-10 пептидов определяют стандартными способами. Было найдено, что последовательность NK10 протеина представляет собой KJDRATCRQHLK (последовательность ID № 1). Было предположено, что первый остаток лизина (К), изображенный в последовательности, существует, так как Lys-C отщепляет протеины после лизинового остатка. Последовательность NK-17 пептида была представлена как K1ALETSLSK (последовательность ID №2). Как и в случае NK-10 протеина, первый лизиновый остаток был предположен, а позднее его присутствие было подтверждено с помощью анализа последовательности ДНК. Сравнение последовательностей NK-10 и NK Примечания к таблице 4: ^Относится к шкале аггрегации в J. Exp. Med., 1991 О = нет аггрегации ** Другой ICAM-3 MAb из лаборатории из Испании (F. Sanches-Madrid). После представления наших результатов, они напомнили им о MAb, который они получили, но никогда не характеризовали. Оказалось, что это ICAM-3. CBR-JC3/2, 3/3, 3/5 иммуноосаждают ту же полосу 120 кД, что и CBR-JC3/1. Проверка мАЬ по их способности к вестерн блотту. Пример VIII Иммунологический анализ с анти-ЮАМ-3 антителами Анти-ІСАМ-1 антитела (RR1/1) и анти-ЮАМ-2 антитела (CBR-IC2/2) и анти-ЮАМ-3 антитела (комбинация CBR-IC3/1 и CBR-IC3/2) тестируют по их способности блокировать адгезию клеток SKW3, стимулированную (I) РМА/, к очищенным ІСАМ; (2) клеточное деление стимулированное фитогемагглютином (РНА), и (3) смешанную реакцию лимфоцитов (MLR). Ранее было показано, что РМА может активировать LFA-1, повышая тем самым их способность связываться с ІСАМ-1 (Dustin et al., Nature, 341:619 (1989)). На фиг.5 показано, что аналогичный механизм активации присутствует в LFA-1/ICAM-3 связывании. Способность различных антител блокировать связывание SKW3 клеток стимулированных РМА, с очищенными ICAM-1 и ЮАМ-З была исследована. Фиг.6. Антитела CBR-JC3/1 и CBR-JC3/2, если они присутствуют индивидуально, не блокируют эффективно связывание стимулированных РМА SKW3 клеток с очищенными ICAM-3. Однако, связывание стимулированных РМА SKW3 клеток с ICAM-3 можно блокировать, используя комбинацию этих двух антител. Как было отмечено de Fougerolles в J. Exp. Med., CBR-IC3/1 моноклональные антитела сами способны блокировать связывание ICAM-3 с очищенными LFA-1. Далее проводили анализ связывания РМА стимулированных SKW3 клеток с ICAM-3 для определения того, существует ли температурная зависимость и зависимость от катиона. Было показано, что существует как температурная (фиг. 8) зависимость, так и зависимость от катиона (данные не представлены) для ICAM-1, ICAM-3/LFA-1 связывания. На фиг.9 представлены суммарный эффект различных антител на РНА стимуляцию клеточного деления. Как было указано ранее (Krensky et al., J. Immunol., 131: 611-616 (1983). РНА стимулирует клеточную пролиферацию таким способом, что ее можно ингибировать анти-LFA-i и анти-1САМ-1 антителами, анти-ЮАМ-2 антителами, или комбинацией анти-ІСАМ-І и анти-ЮАМ-2 антител, и они оказывают незначительное влияние на деление 26 27763 следовательностях Нуклеотидные последовательности зонда на основании аминокислотной последовательности NK-17 NK-IO протеинов выглядят следующим образом: довательностей пептидов. Далее зонды были сконструированы для включения ранее идентифицированного кодона, предпочтительно наблюдавшегося в ICAM-1 и ICAM-2 нуклеотидных по5 G 5' - AAN - GAN - GTC (последовательность 1Д № 3) NK-17 Зонд. Олигомер 23 5' TTN - AGA - TGTT (последовательность 1Д № 4) ТСС с А AGG 24-кратной TGN А GCT Т АТС дегенеративностью, А GGG CAN ТТ 3' содержащий GTN GCN 2N (инозин) З1 вторых, последовательность, полученная с 5' конца клона 11.2, по-видимому, близка к 5' концу природного гена, что следует из гомологичности последовательностей, которые существуют между ICAM-1, ICAM-2 и ICAM-3. Пример XII Гомологичность последовательностей между различными молекулами ICAM Нуклеотидные и аминокислотные последовательности NK-10 и NK-17 пептидов так же, как и полученные ранее нуклеотидные последовательности, сравнивали с известными последовательностями ICAM-1 и ICAM-2 (фиг.13-17). Полученные результаты показывают, что ICAM-3 демонстрируют высокий уровень гомологичности как ICAM-I, так и ICAM-2. Гомологичности между ICAM-1 и JCAM-3 наблюдаются внутри первого (фиг. 16) и четвертого/пятого доменов ICAM-1, а также трансмембранного домена и части цитоплазмического домена ICAM-1 (фиг. 13 и 14) Дополнительные рассмотрения банка данных не выявили другой последовательности, которая была бы идентична или аналогична последовательности, полученной для ICAM-3 Значительная гомологичность наблюдалась также для ICAM-3 и первых доменов ICAM-2 (фиг. 17) Клон 11.2 использовали для дальнейшего скринирования библиотек. Были обнаружены дополнительные клоны для получения кДНК вставок от около 2 до 2,4 кД. По всей видимости, они представляют клоны кДНК полной длины, так как ничего не было обнаружено большого размера. NK-10 зонд. Олигомер 25 с 8-кратной дегенеративностью, содержащий 5 N (инозин) Была создана кДНК экспрессионная библиотека, созданная из РНК миндалин в соответствии с описанным ранее (Wong et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 7711-7716 (1985)). Эту библиотеку скринируют, используя NK-17 зонд, и бляшки, демонстрирующие положительную гибридизацию, повторно скринируют, используя NK-10 зонд. Один клон, клон 112, как было обнаружено, имеет вставку от около 1,6 до 1,8 кб длиной. На фиг. 12 представлено схематическое изображение клона 11.2 и положение NK-10 и NK17 пептидов. Концы вставки были секвенированы в соответствии с известными специалистам способами; и используя праймеры, полученные из прилегающего вектора, тогда как NK-10 зонд используют в качестве внутреннего секвенирующего праймера Таким образом, получают последовательности, которые считывались только по одной нити. Специалисты легко поймут, что такая последовательность может быть получена обычными способами. Резюме полученных последовательностей представлено на фиг. 18. По этому поводу следует заметить следующее. Во-первых, была идентифицирована последовательность с высокой степенью гомологичности с трансмембранным участком ICAM-1. Поэтому, если нужно получить растворимые фрагменты ICAM-3 - нужно исключить все последовательности после начала трансмембранного участка, отмеченные на фиг. 12. Во 27 VlZ-ІИф Z+klAIVOI Є-ІЛІУОІ ениэы* t$BHquodiHO>| г-іліуоі 1.-I/MVOI 62СЮ ноілі эинэУэаа еоняиаіисіеі >ioi8Lf>i ьинваїчЕьао o/n 001, 09 зУэби Й о 09 1\Л1ЫПГ VIS W//////////////////////77. шшшшх 99ZZ3 ЛГ 27763 l ко Sf О 2 mі « : Шx 5 і ro ^ CT CQ CD if Й 2 0 % связывания клеток Предварительное введение монАТ CD29 ICAM-1+3 ICAM-1 ICAM-2+3 ICAM-2 ICAM-3 rtt ICAM-1+2+3 Контрольная ячейка (без LFA-1) ICAM-1+2 Фиг.1В 29