Розчин хлориду натрію для відновлення вологовмісту композиції ліофілізованого фактора ix

1. Спосіб одержання композиції Фактора IX для внутрішньовенної ін'єкції, який включає додавання від приблизно 25 мМ до 150 мМ розчину хлориду натрію до композиції ліофілізованого Фактора IX з одержанням композиції, готової для внутрішньовенної ін'єкції, причому одержана композиція є приблизно ізотонічною щодо плазми або є дещо гіпотонічною або дещо гіпертонічною щодо плазми, та одержана композиція має достатню іонну силу для запобігання аглютинації еритроцитів при внутрішньовенній ін'єкції. 2. Спосіб за п. 1, де одержана композиція є приблизно ізотонічною щодо плазми і має осмолярність, яка становить від приблизно 270 мОсм/л до приблизно 330 мОсм/л. 3. Спосіб за п. 1, де одержана композиція є дещо гіпотонічною щодо плазми і має осмолярність, яка становить від приблизно 220 мОсм/л до приблизно 270 мОсм/л. 4. Спосіб за п. 1, одержана композиція є дещо гіпертонічною щодо плазми і має осмолярність, яка становить від приблизно 330 мОсм/л до приблизно 600 мОсм/л. 5. Спосіб за будь-яким з пп. 1-4, де одержана композиція має іонну силу, яка становить щонаймен+ ше приблизно 25 мекв/л іонів Na та Сl . 2 (19) 1 3 97234 4 ліофілізованого Фактора IX включає гістидин, гліцин, цукрозу та полісорбат. 19. Спосіб за будь-яким з пп. 1-18, у якому перед додаванням розчину хлориду натрію, композиція ліофілізованого Фактора IX включає гістидин, гліцин, цукрозу, полісорбат та терапевтичний білок. 20. Спосіб за будь-яким з пп. 1-19, у якому перед додаванням розчину хлориду натрію композиція ліофілізованого Фактора IX, якщо відновлюється у воді, включає: (a) від приблизно 5 мМ до приблизно 30 мМ гістидину; (b) від приблизно 0,1 М до приблизно 0,3 М гліцину; (c) від приблизно 0,5 до приблизно 2 відсотків цукрози; та (d) від приблизно 0,001 до приблизно 0,05 відсотка полісорбату. 21. Спосіб за п. 20, у якому перед додаванням розчину хлориду натрію композиція ліофілізованого Фактора IX, якщо відновлюється у воді, додатково включає: (e) від приблизно 50 IU/мл до приблизно 2000 IU/мл Фактора IX. 22. Застосування від приблизно 25 мМ до 150 мМ розчину хлориду натрію у відновленні вологовмісту композиції ліофілізованого Фактора IX для запобігання аглютинації еритроцитів при внутрішньовенній ін'єкції. Ця заявка заявляє пріоритет заявки США №60/732,221, поданої 1 листопада 2005 p., яка є включеною авторами шляхом посилання у повному обсязі. Усі наведені авторами патенти, патентні заявки та публікації є включеними шляхом посилання в їх повному обсязі. Описи цих публікацій у повному обсязі є включеними шляхом посилання до цієї заявки для більш повного опису існуючого рівня техніки, відомого спеціалістам на час здійснення описаного й заявленого авторами винаходу. Частина опису цього патентного документа містить матеріал, який є захищеним авторським правом. Власник авторського права не має заперечень щодо факсимільного відтворення будьякою стороною патентного документа або патентного опису в тому вигляді, в якому вони зберігаються серед документів та записів Бюро США з патентів та товарних знаків, але в інших відношеннях зберігає за собою всі авторські права. Коли суцільна кров змішується з розчином медикаменту, наприклад, у крапельниці для внутрішньовенного (IV) введення медикаменту, призначеного для внутрішньовенного (IV) введення, стовпчик або агрегація еритроцитів (також називається аглютинацією еритроцитів) може виникати, якщо розчин медикаменту не має достатньої іонної сили. Агрегація еритроцитів відбувається, наприклад, з 5 % декстрози у воді (звичайний розчин для парентерального введення великого об'єму) і з багатьма фармацевтичними продуктами, які мають низьку іонну силу. Фармацевтичні продукти часто ліофілізують, і, таким чином, вони вимагають відновлення вологовмісту з застосуванням розчину перед парентеральною ін'єкцією. Однак якщо ліофілізовані продукти відновлюють за допомогою розчинів низької іонної сили, утворена в результаті композиція також може викликати агрегацію еритроцитів. Хоча відновлення вологовмісту ліофілізованого матеріалу нормальним сольовим розчином (0,9 % NaCl) на відміну від стерильної води для ін'єкцій (sWFI) забезпечує додаткову іонну силу, утворений в результаті розчин медикаменту може бути гіпертоні чним і може викликати небажані побічні ефекти після ін'єкції. Таким чином, залишається потреба у розчині, який може бути застосований для відновлення вологовмісту ліофілізованого матеріалу до розведених фармацевтичних розчинів для забезпечення в результаті композиції для ін'єкцій, яка є ізотонічною по відношенню до плазми і має достатню іонну силу і, таким чином, не викликає агрегації еритроцитів. В основі винаходу лежить виявлення того, що аглютинація еритроцитів викликається розчинами низької іонної сили, які входять у контакт з кров'ю. Таким чином, коли фармацевтичні композиції приготовляють для внутрішньовенної ін'єкції через відновлення вологовмісту або розведення у розчинах низької іонної сили, таких, як 5 % декстроза, 3 % декстран або sWFI, утворені в результаті композиції можуть мати потрібну осмолярність для того, щоб бути приблизно ізотонічними по відношенню до крові, але вони часто не мають іонної сили, достатньої для запобігання аглютинації. З іншого боку, коли фармацевтичні композиції приготовляють для внутрішньовенної ін'єкції через відновлення вологовмісту або розведення розчинами високої іонної сили, такими, як сольовий розчин (0,9 % NaCl або 154 мМ NaCl), одержана в результаті композиція може мати достатню іонну силу для запобігання аглютинації, але вона може мати осмолярність, яка є гіпертонічною по відношенню до крові, таким чином, викликаючи зневоднення червоних кров'яних клітин (RBC), венозне запалення та/або, можливо, тромбофлебіт, якщо періодичні ін'єкції є частими або хронічними. В одному аспекті винахід забезпечує спосіб одержання фармацевтичної композиції для внутрішньовенної ін'єкції, спосіб включає додавання від приблизно 25 мМ до приблизно 150 мМ розчину хлориду натрію до фармацевтичної композиції, що, таким чином, забезпечує композицію, готову для внутрішньовенної ін'єкції, причому одержана композиція є приблизно ізотонічною по відношенню до плазми або є дещо гіпотонічною або дещо гіпертонічною по відношенню до плазми, і готова композиція має достатню іонну силу для запобі 5 гання аглютинації еритроцитів (або агрегації еритроцитів). Готова композиція є приблизно ізотонічною по відношенню до плазми, наприклад, коли вона має осмолярність, яка становить від приблизно 270 мОсм/л до приблизно 330 мОсм/л. Готова композиція є дещо гіпотонічною по відношенню до плазми, наприклад, коли вона має осмолярність, яка становить від приблизно 220 мОсм/л до приблизно 270 мОсм/л. Готова композиція є дещо гіпертонічною по відношенню до плазми, наприклад, коли вона має осмолярність, яка становить від приблизно 330 мОсм/л до приблизно 600 мОсм/л. В одному аспекті готова композиція має іонну силу, яка є достатньою для запобігання аглютинації еритроцитів, коли вона має, наприклад, при+ наймні приблизно 25 мекв/л іонів Na та СІ . В іншому аспекті готова композиція має іонну силу, яка є достатньою для запобігання аглютинації еритроцитів, коли вона має, наприклад, принаймні + приблизно 40 мекв/л іонів Na та СІ . В іншому аспекті готова композиція має іонну силу, яка є достатньою для запобігання аглютинації еритроцитів, коли вона має, наприклад, принаймні приблизно + 40 мекв/л іонів Na та СІ і менше, ніж приблизно + 150 мекв/л іонів Na та СІ . В іншому аспекті готова композиція має іонну силу, яка є достатньою для запобігання аглютинації еритроцитів, коли вона має, наприклад, іонну силу, виміряну як провідність, яка становить принаймні приблизно 2,5 мС/см. В іншому аспекті готова композиція має іонну силу, яка є достатньою для запобігання аглютинації еритроцитів, коли вона має, наприклад, іонну силу, виміряну як провідність, яка становить принаймні приблизно 4,0 мС/см. Фармацевтична композиція, яка має приготовлятися для ін'єкції, може бути, наприклад, не рідкою композицією або рідиною. Нерідка композиція, таким чином, може бути відновлена до розчину за допомогою розчину хлориду натрію, який має концентрацію хлориду натрію приблизно 25-150 мМ, 25-100 мМ, 25-80 мМ, 25-40 мМ, 25-35 мМ, 25-30 мМ або приблизно 40 мМ. Композиція у формі рідини або розчину, таким чином, може бути розведена за допомогою розчину хлориду натрію, який має концентрацію хлориду натрію приблизно 25150 мМ, 25-100 мМ, 25-80 мМ, 25-40 мМ, 25-35 мМ, 25-30 мМ або приблизно 40 мМ. Нерідка композиція може бути, наприклад, ліофілізованою композицією. В одному аспекті розчин хлориду натрію, який додають, включає від приблизно 40 мМ до приблизно 150 мМ хлориду натрію. В одному аспекті розчин хлориду натрію, який додають, складається, головним чином, з від приблизно 40 мМ до приблизно 150 мМ хлориду натрію. В одному аспекті розчин хлориду натрію, який додають, включає приблизно 40 мМ хлориду натрію. В одному аспекті розчин хлориду натрію, який додають, складається, головним чином, з 40 мМ розчин хлориду натрію. В одному аспекті розчин хлориду натрію, який додають, складається, головним чином, з розчину, який містить розчин хлориду натрію, тобто, приблизно 40 мМ±10 мМ хлориду натрію. 97234 6 В одному аспекті перед додаванням розчину хлориду натрію фармацевтична композиція не містить суттєвої кількості іонізуючої солі. Суттєва кількість іонізуючої солі може бути, наприклад, кількістю, яка є більшою, ніж приблизно 5 мМ. В іншому аспекті суттєва кількість іонізуючої солі може бути, наприклад, кількістю, яка є більшою, ніж приблизно 25 мМ. Якщо фармацевтична композиція є ліофілізованою композицією, вона не містить суттєвої кількості іонізуючої солі, якщо вона не містить більше, ніж, наприклад, 5 мМ або 25 мМ іонізуючої солі, коли ліофілізовану композицію відновлюють у воді. В одному аспекті перед додаванням розчину хлориду натрію фармацевтична композиція включає гістидин, гліцин, цукрозу та полісорбат. В іншому аспекті перед додаванням розчину хлориду натрію фармацевтична композиція включає гістидин, гліцин, цукрозу, полісорбат та терапевтичний білок. У цьому разі терапевтичний білок може бути, наприклад, білком, який застосовують для лікування від порушень коагуляції або для гемостазу, включаючи, крім іншого, Фактор VII, Фактор VIII, Фактор IX, Фактор XIII, антитіла, їх відповідні аналоги та їх похідні. В іншому аспекті перед додаванням розчину хлориду натрію фармацевтична композиція включає гістидин, гліцин, цукрозу, полісорбат та Фактор IX (включаючи рекомбінантний Фактор IX (rFIX)). У даному контексті Фактор IX може включати модифіковані варіанти Фактора IX, включаючи, наприклад, пегілований Фактор IX, злиті білки, які включають Фактор IX, такі, як альбумін-Фактор IX або імуноглобулін (повністю або його домени)-Фактор IX та глікозилований Фактор IX. В одному аспекті, згідно з яким фармацевтична композиція є ліофілізованою композицією, перед додаванням розчину хлориду натрію композиція, виміряна як у разі, якби була відновлена у воді (в об'ємі, який є таким самим, що й об'єм наповнення, тобто, об'єм композиції до ліофілізації), включає: (а) від приблизно 5 мМ до приблизно 30 мМ гістидину; (b) від приблизно 0,1 Μ до приблизно 0,3 М гліцину; (с) від приблизно 0,5 до приблизно 2 відсотків цукрози; і (d) від приблизно 0,001 до приблизно 0,05 відсотка полісорбату (або від приблизно 0,005 до приблизно 0,05 відсотка). В одному аспекті композиція також може включати, виміряна як у разі, якби була відновлена у воді, (e) від приблизно 0,1 мг/мл до приблизно 100 мг/мл або більше терапевтичного білка, або від приблизно 10, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 1000, 2000 IU/мл (міжнародних одиниць/мл) або більше терапевтичного білка. В одному аспекті композиція також може включати, виміряна як у разі, якби була відновлена у воді, (є) від приблизно 0,1 мг/мл до приблизно 100 мг/мл або більше Фактора IX, або від приблизно 0,4 мг/мл до приблизно 20 мг/мл Фактора IX, або від приблизно 10, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 1000, 2000 IU/мл (міжнародних одиниць/мл) або більше Фактора IX. В одному аспекті винахід забезпечує спосіб запобігання аглютинації еритроцитів, викликаної внутрішньовенною ін'єкцією, спосіб включає відновлення вологовмісту або розведення фармацев 7 тичної композиції з використанням від приблизно 25 мМ до приблизно 150 мМ розчину хлориду натрію, таким чином, щоб відновлена або розведена фармацевтична композиція мала іонну силу, достатню для запобігання аглютинації еритроцитів, коли відновлену або розведену фармацевтичну композицію вводять суб'єктові шляхом внутрішньовенної ін'єкції. В одному аспекті винахід забезпечує спосіб приготування ліофілізованої фармацевтичної композиції для внутрішньовенної ін'єкції, спосіб включає відновлення вологовмісту ліофілізованої фармацевтичної композиції з використанням від приблизно 25 мМ до приблизно 150 мМ розчину хлориду натрію таким чином, щоб після відновлення вологовмісту композиція мала іонну силу, достатню для запобігання аглютинації еритроцитів та осмолярність, яка є приблизно ізотонічною (або дещо гіпертонічною або дещо гіпотонічною). В одному аспекті ліофілізовану композицію відновлюють розчином хлориду натрію, причому об'єм розчину хлориду натрію, який застосовують для відновлення вологовмісту, є меншим за об'єм композиції до ліофілізації (тобто, об'єм наповнення). Таким чином, винахід забезпечує спосіб зменшення об'єму композиції, яка підлягає ін'єкції. В одному аспекті ліофілізовану композицію відновлюють розчином хлориду натрію, причому об'єм розчину хлориду натрію, який застосовують для відновлення вологовмісту, є більшим за об'єм композиції до ліофілізації (тобто, об'єм наповнення). Таким чином, винахід забезпечує спосіб підтримання ізотонічності композиції, яка підлягає ін'єкції. Наприклад, а ліофілізована композиція може бути відновлена об'ємом розчину хлориду натрію, який є більшим за об'єм композиції до ліофілізації, наприклад, відновлена за допомогою 5 мл хлориду натрію, причому об'єм композиції до ліофілізації становить 4 мл. Наприклад, 4 мл ліофілізованої композиції, відновленої у 4 мл води, є ізотонічним розчином, який містить 10 мМ гістидину, 260 мМ гліцину, 1 % цукрози, 0,005 % полісорбату, що складає приблизно 300 мОсм/л. Але якщо ліофілізовану композицію відновлюють за допомогою 4 мл розчину 40 мМ NaCl (80 мОсм/л), то одержана в результаті композиція має дещо гіпертонічний розчин (300 мОсм/л+80 мОсм/л=380 мОсм/л). Але якщо ліофілізовану композицію відновлюють за допомогою 5 мл розчину 40 мМ NaCl, то одержана в результаті композиція містить приблизно 8 мМ (8 мОсм/л) гістидину, 208 мМ (208 мОсм/л) гліцину, 0,8 % (24 мОсм/л) цукрози, 0,004 % (незначна осмолярність) полісорбату та 40 мМ (80 мОсм/л) NaCl, що складає приблизно 320 мОсм/л. Таким чином, через відновлення вологовмісту композиції до ліофілізації, яка є приблизно ізотонічною з об'ємом розчину хлориду натрію, який є більшим за об'єм наповнення, винахід в результаті може забезпечувати розчин, який залишається приблизно ізотонічним. Іншими словами, відновлення вологовмісту композиції до ліофілізації до ліофілізації, яка є приблизно ізотонічною з об'ємом розчину хлориду натрію, який є меншим або є приблизно таким самим, що й об'єм наповнення, в 97234 8 результаті може давати розчин, який є дещо гіпертонічним. Для уникнення цього винахід забезпечує спосіб підтримання ізотонічності шляхом відновлення вологовмісту ліофілізованої композиції розчином хлориду натрію в об'ємі який є більшим за об'єм композиції до ліофілізації. В одному аспекті винахід забезпечує спосіб підтримання ізотонічності ліофілізованої композиції після відновлення вологовмісту, спосіб включає відновлення вологовмісту ліофілізованої композиції в об'ємі, який принаймні на 20 % є більшим за об'єм композиції до ліофілізації, причому композиція до ліофілізації є приблизно ізотонічною, таким чином, щоб відновлена композиція була приблизно ізотонічною і мала достатню іонну силу для запобігання аглютинації еритроцитів. Через відновлення вологовмісту ліофілізованої композиції в об'ємі, більшому за її об'єм до ліофілізації, сприяння осмолярності ліофілізованого матеріалу знижується прямо пропорційно збільшенню об'єму в результаті відновлення порівняно з об'ємом до ліофілізації. Наприклад, якщо композиція до ліофілізації з тонічністю 300 мОсм/л в об'ємі X, відновлюється у розчині з об'ємом Y, який є на 20 % більшим за об'єм X, 300 мОсм/л стає 240 мОсм/л в об'ємі Υ (20 % зниження осмолярності через 20 % зниження об'єму). Якщо розчин об'єму Υ є розчином хлориду натрію, то сприяння тонічності розчину хлориду натрію вдвічі перевищує концентрацію хлориду натрію у розчині. Наприклад, якщо розчин об'ємом Υ має 40 мМ, то відновлений розчин має тонічність 240 мОсм/л плюс 80 мОсм/л, яка є приблизно ізотонічною, і має достатню іонну силу для запобігання агрегації еритроцитів. В одному аспекті винахід забезпечує спосіб приготування ліофілізованої композиції Фактора IX для внутрішньовенної ін'єкції, спосіб включає додавання від приблизно 25 мМ до приблизно 150 мМ розчин хлориду натрію до ліофілізованої композиції Фактора IX, що, таким чином, забезпечує композицію, готову для внутрішньовенної ін'єкції, причому одержана композиція є приблизно ізотонічною по відношенню до плазми або є дещо гіпотонічною або дещо гіпертонічною по відношенню до плазми, і готова композиція має достатню іонну силу для запобігання аглютинації еритроцитів. В одному аспекті ліофілізована композиція Фактора IX, виміряна як у разі, якби була відновлена у воді, включає (а) від приблизно 5 мМ до приблизно 30 мМ гістидину; (b) від приблизно 0,1 М до приблизно 0,3 М гліцину; (с) від приблизно 0,5 до приблизно 2 відсотків цукрози; (d) від приблизно 0,001 до приблизно 0,05 відсотка полісорбату; і (e) від приблизно 0,4 мг/мл до приблизно 20 мг/мл Фактора IX, або від приблизно 0,1 мг/мл до приблизно 100 мг/мл або будь-яку іншу розчинну кількість Фактора IX, або від приблизно 10 IU/мл до приблизно 500 IU/мл Фактора IX, або від приблизно 10 IU/мл до приблизно 5000 IU/мл Фактора IX. В одному аспекті приблизно 40 мМ розчину хлориду натрію додають до ліофілізованої композиції Фактора IX. В одному аспекті приблизно 5 мл приблизно 40 мМ розчину хлориду натрію додають до ліофілізованої композиції Фактора IX. В одному аспекті ліофілізована композиція Фактора IX, виміряна як у разі, 9 якби була відновлена у воді, включає приблизно 10 мМ гістидину, приблизно 0,26 М гліцину, приблизно 1 % цукрози та приблизно 0,005 % полісорбату. В одному аспекті винахід забезпечує фармацевтичний комплект, який включає: (а) флакон, який містить ліофілізований матеріал, причому якщо ліофілізований матеріал відновлюють у приблизно 5 мл води, розчин має включати: (і) від приблизно 5 мМдо приблизно 30 мМ гістидину; (іі) від приблизно 0,1 М до приблизно 0,3 Μ гліцину; (ііі) від приблизно 0,5 до приблизно 2 відсотків цукрози; (iv) від приблизно 0,001 до приблизно 0,05 відсотка полісорбату; і (ν) від приблизно 0,4 мг/мл до приблизно 20 мг/мл Фактора IX, або від приблизно 0,1 мг/мл до приблизно 100 мг/мл або будьяку іншу розчинну кількість Фактора IX, або від приблизно 50 IU/мл до приблизно 500 IU/мл Фактора IX, або від приблизно 10 IU/мл до приблизно 5000 IU/мл Фактора IX; (b) приблизно від 25 мМ до 150 мМ розчину хлориду натрію; та (с) інструкції з відновлення вологовмісту ліофілізованого матеріалу розчином хлориду натрію, таким чином, що після відновлення вологовмісту утвореним в результаті розчин є приблизно ізотонічним і має достатню іонну силу для запобігання агрегації еритроцитів після внутрішньовенної ін'єкції. В одному аспекті винахід забезпечує фармацевтичний комплект, який включає: (а) флакон, який містить ліофілізований матеріал, причому якщо ліофілізований матеріал відновлюють у 4 мл води, розчин має включати: (і) приблизно 10 мМ гістидину; (іі) приблизно 0,26М гліцину; (ііі) приблизно 1 відсоток цукрози; (iv) приблизно 0,005 відсотка полісорбату 80; і (ν) від приблизно 50 IU/мл до приблизно 5000 IU/мл Фактора IX; (b) приблизно 40 мМ розчину хлориду натрію; та (с) інструкції з відновлення вологовмісту ліофілізованого матеріалу у флаконі за допомогою приблизно 5 мл приблизно 40 мМ розчину хлориду натрію, таким чином, що після відновлення вологовмісту утворений в результаті розчин включає: (і) від приблизно 7 або 8 до приблизно 10 мМ гістидину; (іі) від приблизно 200 до приблизно 210 мМ гліцину; (ііі) від приблизно 0,7 % до приблизно 0,9 %о цукрози; (iv) приблизно 0,004 % полісорбату 80; (ν) від приблизно 50 IU/мл до приблизно 5000 IU/мл Фактора IX; і (vi) приблизно 40 мМ NaCl. Фіг.1 показує результати осадження еритроцитів в експериментах, описаних у Прикладі 3. Осадження еритроцитів вимірювали через 60 хвилин, пристосовуючи видозмінений метод Вестергрена (див. Приклад 2), згідно з яким людську кров, зібрану в EDTA, змішували у співвідношенні 1:4 з випробуваними розчинами. Через 60 хвилин вимірювали відстань у мМ між нульовою позначкою та межею еритроцити:плазма. Горизонтальні смуги представляють середні значення, а вертикальні дужки - стандартне відхилення від загального показника 12 донорів. Результати комбінували з 4 незалежних експериментів, у кожному з яких оцінювали кров 3 донорів. Фіг.2 показує оцінку осадження еритроцитів у композиціях BeneFIX®, відновлених розчинами NaCl. Розчин 40 мМ NaCl є достатнім для запобі 97234 10 гання аглютинації еритроцитів при застосуванні для відновлення вологовмісту або продукту BeneFIX® серійного виробництва або нової композиції BeneFIX® (BeneFIX®-R, у якій до ліофілізації розчин для заповнення складався з 4 мл і мав концентрацію 10 мМ гістидину, 260 мМ гліцину, 1 % цукрозу, 0,005 % полісорбату 80; і після ліофілізації його відновлювали у 5 мл 40 мМ хлориду натрію, таким чином, що після відновлення вологовмісту BeneFIX®-R включає 40 мМ NaCl, 8 мМ гістидину, 208 мМ гліцину, 0,8 % цукрози та 0,004 % полісорбату). Винахід забезпечує способи приготування фармацевтичних композицій для ін'єкцій, зокрема, композицій, які приготовляють для внутрішньовенної ін'єкції), які не викликають аглютинації еритроцитів, гемолізу та/або усихання клітин. Для запобігання аглютинації фармацевтична композиція, приготовлена для ін'єкції, повинна мати достатню іонну силу. Для запобігання гемолізові або усиханню клітин фармацевтична композиція, приготовлена для ін'єкції, повинна бути приблизно ізотонічною по відношенню до плазми. Винахід забезпечує способи, які дозволяють одержувати фармацевтичні композиції для ін'єкцій, які мають достатню іонну силу для запобігання аглютинації та необхідну тонічність для запобігання значному гемолізові або зневодненню або усиханню клітини. Представлені способи включають застосування розчинів хлориду натрію, які включають від приблизно 25 мМ до приблизно 150 мМ, для відновлення вологовмісту ліофілізованих матеріалів (або інших нерідких фармацевтичних композицій) до розчину або для розведення розчинів фармацевтичної композиції. Незалежно від того, чи застосовують розчини хлориду натрію для відновлення вологовмісту чи для розведення, додавання конкретних розчинів хлориду натрію в результаті забезпечує фармацевтичну композицію для ін'єкцій, яка є приблизно ізотонічною по відношенню до плазми або крові і має достатню іонну силу для запобігання агрегації еритроцитів після ін'єкції, зокрема, після внутрішньовенної ін'єкції. Терміни Вжитий авторами термін "моляльність" розчину означає кількість молів розчиненої речовини на кілограм розчинника. Вжитий авторами термін "молярність" розчину означає кількість молів розчиненої речовини на літр розчину. Вжитий авторами термін "осмоль" означає кількість речовини, яка дає, в ідеальному розчині, кількість частинок (число Авогадро), яка має знизити точку замерзання розчинника на 1,86 К. Вжитий авторами термін "осмоляльність" розчину означає кількість осмолів розчиненої речовини на кілограм розчинника. Осмоляльність є мірою кількості частинок, присутніх у розчині, і не залежить від розміру або маси частинок. Вона може бути виміряна лише з використанням властивості розчину, яка залежить лише від концентрації частинок. Цими властивостями є зниження тиску пари, зниження точки замерзання, підвищення точки кипіння та осмотичний тиск і разом називаються колігативними властивостями. 11 Вжитий авторами термін "осмолярність" розчину означає кількість осмолів розчиненої речовини на літр розчину. Вжитий авторами термін "фармацевтична композиція", яка приготовляється або рецептується для ін'єкцій, може означати будь-який медикамент, призначений для введення суб'єктові. Наприклад, фармацевтична композиція може бути ліофілізованим матеріалом, розчином, порошком або твердою речовиною. Композицію, якщо вона не перебуває у рідкій формі, відновлюють до розчину за допомогою розчину NaCl згідно з винаходом. Якщо композиція перебуває у рідкій формі, цю композицію розводять або змішують з розчином NaCl згідно з винаходом. Іонна сила Іонна сила є характеристикою розчину електроліту (рідини з розчиненими в ній позитивно та негативно зарядженими іонами). Вона зазвичай виражається як середня електростатична взаємодія між іонами електроліту. Іонна сила електроліту є половинним значенням загального показника, отриманого шляхом множення моляльності (кількості речовини на одиницю маси розчинника) кожного іона на квадрат валентності. Іонна сила є тісно пов'язаною з концентрацією електролітів і вказує, наскільки ефективно заряд на конкретному іоні захищається або стабілізується іншими іонами (так звана іонна атмосфера) в електроліті. Головна різниця між іонною силою та концентрацією електроліту полягає в тому, що перша є вищою, якщо деякі з іонів мають вищий заряд. Наприклад, розчин повністю дисоційовано2+ 2го (розкладеного) сульфату магнію (Mg SO4 ) має у 4 рази вищу іонну силу, ніж розчин хлориду на+ трію (Na Сl ) такої самої концентрації. Інша різниця між цими двома показниками полягає в тому, що іонна сила відображає концентрацію вільних іонів, а не тільки кількість солі, яку було додано до розчину. Іноді сіль може бути розчинена, але відповідні іони залишаються зв'язаними попарно, нагадуючи незаряджені молекули у розчині. У цьому разі іонна сила є значно нижчою за концентрацію солі. Згідно з винаходом, фармацевтичні композиції приготовляють для ін'єкцій таким чином, щоб вони були не лише ізотонічними, але й мали достатню іонну силу для запобігання аглютинації RBC. Достатня іонна сила композиції, готової для ін'єкції (тобто, ліофілізованого матеріалу, який відновлюють за допомогою розчину NaCl згідно з винаходом, або розчину медикаменту, який розводять за допомогою розчину NaCl згідно з винаходом) може мати, наприклад, принаймні приблизно 25 міліек+ вівалентів на літр (мекв/л) іонів Na та Сl . В одному варіанті втілення достатня іонна сила складає принаймні приблизно 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 або принаймні приблизно 40 мекв/л іонів + Na та Сl . Іонна сила також може визначатися з точки зору провідності розчину. Провідність є здатністю матеріалу або розчину до проведення електричного струму. Принцип, за яким інструменти вимірюють провідність, є простим - дві пластини у зразку, через пластини подають потенціал (зазвичай си 97234 12 нусоїдальну напругу) і вимірюють струм. Провідність (G), величину, обернену опорові (R) визначають за значеннями напруги та струму згідно з законом Ома. G=I/R=І (ампери)/Ε (вольти). Оскільки заряд на іонах у розчині сприяє проведенню електричного струму, провідність розчину є пропорційною концентрації іонів у ньому. Щоправда, у деяких випадках провідність може прямо не корелюватися з концентрацією. Однак для розчинів хлориду натрію провідність є прямо пропорційною концентрації іонів. Основною одиницею провідності є сіменс (См), який раніше називався мо. Оскільки і. геометрична форма випробуваного зразка впливає на значення "провідності, стандартизовані вимірювання виражаються в одиницях питомої провідності (См/см) для врівноваження коливань у розмірах електрода. Питома провідність (С) є простим добутком виміряної провідності (G) та сталої елемента (L/A), де L є довжиною стовпа рідини між електродом, і А є площею електродів. С=G×(L/A). Якщо стала елемента становить 1 -1 см , то питома провідність є такою самою, що й виміряна провідність розчину. Хоча форма електрода змінюється, електрод завжди може бути завжди може бути представлений еквівалентним теоретичним елементом. Таким чином, в одному варіанті втілення достатня іонна сила композиції, готової для ін'єкцій, може мати, наприклад, провідність принаймні приблизно 4 мС/см або вищу. В іншому варіанті втілення достатня іонна сила розчину, готового для ін'єкцій, становить принаймні приблизно 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8 або принаймні приблизно 3,9 мС/см. Також може застосовуватись оперативне визначення, чи має розчин достатню іонну силу для запобігання аглютинації еритроцитів, для пояснення терміну "достатня іонна сила". Наприклад, в основу його може бути покладений експеримент з додаванням випробуваного розчину до суцільної крові та спостереження відстані осадження еритроцитів (див. Приклад 2; адаптований, модифікований метод Вестергрена). В одному варіанті втілення якщо випробуваний розчин при змішуванні з суцільною кров'ю у співвідношенні 4:1 забезпечує осадження еритроцитів за 60 хвилин, що є меншим за приблизно 10 мМ (див., наприклад, Приклад 2, Фіг.1 та 2), то випробуваний розчин має достатню іонну силу для запобігання аглютинації еритроцитів. В іншому варіанті втілення якщо випробуваний розчин при змішуванні з суцільною кров'ю у співвідношенні 4:1 забезпечує осадження еритроцитів за 60 хвилин, що є меншим за приблизно 5 мМ, то випробуваний розчин має достатню іонну силу для запобігання аглютинації еритроцитів. Осмолярність розчину Способи згідно з винаходом забезпечують фармацевтичні композиції для ін'єкцій, які є приблизно ізотонічними по відношенню до крові. Для того, щоб визначити, чи є фармацевтична композиція приблизно ізотонічною по відношенню до крові, розраховують осмолярність для всіх хімічних компонентів розчину, включаючи розріджувач. Осмолярна концентрація фармацевтичної компо 13 зиції для ін'єкцій (розчини для парентерального введення) може мати негативний вплив на клітини крові та судини людського організму. Тонічність розраховують для рідин та розчинених або розведених медикаментів і виражається у числовому значенні міліосмолів на літр рідини (мОсм/л). Це значення також є відомим як осмолярність. Осмолярність крові становить від 285 до 310 мОсм/л. Коли гіпотонічні або гіпертонічні розчини вводять у кров, рідина переміщується до клітин або з клітин, що може викликати різні негативні ефекти. Осмолярність розчину частково ґрунтується на понятті осмосу та осмотичного тиску. Осмос є дифузією розчинених речовин (розчинених частинок) або перенесення рідини через напівпроникні мембрани, такі, як кровоносні судини або клітинні мембрани. Осмотичний тиск, який сприяє перенесенню молекул через мембрани, виражається в осмолярній концентрації і називається гіпоосмотичним (гіпотонічним), ізоосмотичним (ізотонічним) або гіперосмотичним (гіпертонічним) порівняно з біологічними рідинами, такими, як кров або плазма. Терміни "тонічність" та "осмотичний тиск" часто вважаються синонімічними. Осмотичний тиск є гідростатичним (або гідравлічним) тиском, який вимагається для протидії переміщенню води крізь напівпроникну мембрану у відповідь на "осмотичний градієнт" (тобто, зміну концентрації частинок по обидва боки мембрани). Осмоляльність сироватки вимірюють за допомогою осмометра або розраховують як суму концентрації розчинених речовин, присутніх у розчині. Значення, виміряне в лабораторії, називають осмоляльністю. Значення, розраховане на основі концентрації розчинених речовин, у лабораторії називають осмолярністю. Осмолярний інтервал є різницею між цими двома значеннями. У даному описі тонічність та осмотичний тиск розглядаються як синоніми і мають розумітися в широкому значенні. Тонічність може означати ефективну осмоляльність і дорівнює сумі концентрації розчинених речовин у розчині, який здатен створювати осмотичну силу через мембрану, включаючи клітинну мембрану. У буквальному сенсі осмоляльність є властивістю конкретного розчину і не залежить від будь-якої мембрани. Тонічність є розчинністю розчину по відношенню до конкретної мембрани. Однак винахід стосується розчинів, які є ізотонічними по відношенню до біологічних розчинів, таких, як кров або плазма, і це також передбачає, що конкретний розчин є ізотонічним з кров'ю або плазмою по відношенню до клітинної мембрани клітини у крові або плазмі або іншому біологічному розчині. Оперативне визначення тонічності може застосовуватися для пояснення терміну. В основу його може бути покладений експеримент з додаванням випробуваного розчину до суцільної крові та спостереження за результатом. Якщо RBC у суцільній крові набухають і розриваються, випробуваний розчин вважають гіпотонічним порівняно з нормальною плазмою. Якщо RBC стискаються й стають зазубленими, випробуваний розчин вважають гіпертонічним порівняно з нормальною плазмою. Якщо RBC залишаються незмінними, ви 97234 14 пробуваний розчин вважають ізотонічним з плазмою. Клітинна мембрана RBC є еталонною мембраною. Наприклад, суцільна кров, поміщена у нормальний сольовий (фізіологічний) розчин (тобто, 0,9 % хлорид натрію) не набухає, а отже, нормальний сольовий розчин вважають ізотонічним. Характеристики ізотонічних розчинів Винахід забезпечує способи приготування або рецептування фармацевтичних композицій для ін'єкцій суб'єктові, згідно з якими композиції приготовляють у формі розчинів, які є (1) приблизно ізотонічними по відношенню до крові (або плазми або іншої біологічної рідини) або є гіпертонічними або гіпотонічними настільки, щоб викликати суттєвий гемоліз, тромбоз або подразнення судин, і (2) мають достатню іонну силу для запобігання агрегації еритроцитів. В одному варіанті втілення ізотонічні (по відношенню до крові) фармацевтичні композиції, готові для ін'єкції, мають тонічність або осмолярність, яка є більшою, ніж приблизно 270 мОсм/л і меншою, ніж приблизно 330 мОсм/л. В одному варіанті втілення ізотонічні фармацевтичні композиції, готові для ін'єкції, мають тонічність або осмолярність, яка є більшою, ніж приблизно 270 мОсм/л, і меншою, ніж приблизно 328 мОсм/л. Хоча розчини, такі, як 0,9 % хлорид натрію та 5 % декстроза, є ізотонічними, у випадках, коли їх застосовують для відновлення вологовмісту або розведення багатьох фармацевтичних композицій, утворений в результаті розчин може не мати достатньої іонної сили для запобігання аглютинації еритроцитів (як для 5 % декстрози) або може мати надмірну іонну силу, таким чином, що утворений в результаті розчин є гіпертонічним. Таким чином, у способах згідно з винаходом застосовують розчини для розведення або відновлення вологовмісту, які містять мінімальну концентрацію хлориду натрію для забезпечення (а) достатньої іонної сили для зменшення агрегації еритроцитів та (b) достатньої тонічності для запобігання гемолізові та максимальну концентрацію хлориду натрію для забезпечення в результаті (с) тонічності, яка не є настільки високою, щоб розчини були гіпертонічними. Крім того, у способах згідно з винаходом застосовують розчини для розведення або відновлення вологовмісту, які можуть забезпечувати достатню іонну силу та ізотонічність по відношенню до крові, з одночасним підтриманням практичного ін'єкційного об'єму для фармацевтичної композиції. Характеристики гіпотонічних розчинів Винахід забезпечує способи одержання фармацевтичних композицій для ін'єкцій суб'єктові, згідно з якими композиції приготовляють у формі розчинів, які не є гіпотонічними по відношенню до крові або не є настільки гіпотонічними (тобто, слабо гіпотонічним по відношенню до крові), щоб викликати суттєвий гемоліз. В одному варіанті втілення фармацевтичні композиції, готові для ін'єкцій, які вважаються слабо гіпотонічними по відношенню до крові, можуть мати тонічність або осмолярність, яка є меншою, ніж приблизно 270 мОсм/л, і більшою, ніж приблизно 240 мОсм/л. В одному варіанті втілення фармацевтичні компози 15 ції, готові для ін'єкцій, які вважаються слабо гіпотонічними по відношенню до крові, можуть мати тонічність або осмолярність, яка є меншою, ніж приблизно 270 мОсм/л, і більшою, ніж приблизно 220 мОсм/л. Прикладами гіпотонічних розчинів є багато фармацевтичних композицій, які приготовляють для ін'єкцій зі стерильною водою. Коли гіпотонічні розчини вводять шляхом ін'єкції, відбувається переміщення рідини, і вода переміщується в ендотеліальні клітини вени та клітини крові. Клітини, які абсорбують надмірну кількість води, можуть розриватися, і, таким чином, ін'єкція гіпотонічних розчинів може викликати подразнення вен, флебіт та гемоліз. Характеристики гіпертонічних розчинів Винахід забезпечує способи одержання фармацевтичних композицій для ін'єкцій суб'єктові, згідно з якими композиції приготовляють у формі розчинів, які не є гіпертонічними по відношенню до крові або не є настільки гіпертонічними (тобто, слабо гіпертонічними), щоб викликати суттєвий тромбоз та/або подразнення судин. В одному варіанті втілення фармацевтичні композиції, готові для ін'єкцій, які вважаються слабо гіпертонічними, можуть мати тонічність або осмолярність, яка є більшою, ніж приблизно 340 мОсм/л, і меншою, ніж приблизно 600 мОсм/л. В одному варіанті втілення фармацевтичні композиції, готові для ін'єкцій, які вважаються слабо гіпертонічними, можуть мати тонічність або осмолярність, яка є більшою, ніж приблизно 340, і меншою, ніж приблизно 375, 400, 425, 450, 475, 500 або приблизно 575 мОсм/л. Взагалі, гіпертонічні розчини мають тонічність, яка є більшою, ніж приблизно І 340 мОсм/л. Розчини з осмолярністю, яка є більшою, ніж приблизно 600 мОсм/л, при ін'єкціях мають застосовуватися з обережністю. Прикладами небажаних гіпертонічних розчинів є багато фармацевтичних композицій, які приготовляють для ін'єкцій з 10 % декстрозою, або фармацевтичні композиції, які мають багато домішок, які впливають на осмолярність. Коли гіпертонічні розчини вводять шляхом ін'єкції, відбувається переміщення рідини, і вода виводиться з ендотеліальних клітин вени та клітин крові. Клітини, які втрачають надто багато води, можуть стискатися, і, таким чином, ін'єкція гіпертонічних розчинів може викликати подразнення вен, флебіт та тромбоз. Рівень рН Рівень рН крові становить від приблизно 7,35 до приблизно 7,45, що вважається нейтральним. Фармацевтичні композиції зі значенням рН, нижчим за 7, вважаються кислотними медикаментами, і ті, які мають значення рН, нижче за 4,1, вважаються дуже кислотними. Медикаменти зі значенням рН, вищим за 7,5, вважаються основними або лужними медикаментами, а ті, які мають значення рН, вище за 9,0, вважаються дуже основними або лужними. Дуже кислотні або дуже лужні розчини медикаментів можуть викликати флебіт та тромбоз. Таким чином, в одному варіанті втілення винахід забезпечує розчини хлориду натрію для відновлення вологовмісту ліофілізованих лікарських композицій або для розведення рідких лікарських 97234 16 композицій для підготування цих композицій для внутрішньовенної ін'єкції, причому композиції, готові для ін'єкцій, (1) не мають рН, який є нижчим за 4,1 або вищим за 9,0, (2) мають достатню іонну силу для запобігання агрегації еритроцитів і (3) є приблизно ізотонічними (або слабо гіпертонічними або гіпотонічними) по відношенню до крові, таким чином, щоб не відбувалося гемолізу або зазублення RBC. Однак рівень рН розчину не враховується при визначенні достатньої іонної сили розчину для запобігання агрегації еритроцитів. Іншими словами, якщо ліофілізована композиція при відновленні вологовмісту водою має рівень рН, нижчий за 4,1, або вищий за 9,0, це не перешкоджає застосуванню розчину хлориду натрію для відновлення вологовмісту з метою запобігання аглютинації еритроцитів. Розрахунок осмолярності Осмолярність будь-якої фармацевтичної композиції розраховують, застосовуючи таку формулу: осмолярність = (маса речовини (г), ділена на молекулярну масу речовини (г/л)), помножена на кількість видів, помножену на 1000 для міліосмолярність. Термін "види" стосується кількості іонів або хімічних видів, утворених, коли відбувається дисоціація. Фармацевтичні композиції, приготовлені або рецептовані для ін'єкцій Винахід забезпечує способи відновлення вологовмісту ліофілізованих лікарських продуктів до розчину з метою одержання лікарського продукту для ін'єкцій суб'єктові. Відновлений лікарський продукт приготовляють для ін'єкції, забезпечуючи достатню іонну силу та тонічність, яка є приблизно ізотонічною по відношенню до крові. Способи згідно з винаходом також стосуються розведення розчинів медикаментів з метою приготування розчину медикаменту для ін'єкцій суб'єктові. Розведений розчин медикаменту приготовляють для ін'єкції шляхом забезпечення достатньої іонної сили та приблизної ізотонічності по відношенню до крові. В одному варіанті втілення ліофілізований або сухий лікарський продукт/композиція, якщо відновлюється у воді, має осмолярність від приблизно 100 мОсм/л до приблизно 360 мОсм/л. Оскільки винахід забезпечує способи відновлення вологовмісту з застосуванням від приблизно 25 мМ до приблизно 150 мМ розчинів хлориду натрію, спеціаліст-практик має використовувати конкретний розчин хлориду натрію на основі очікуваної комбінованої осмолярності ліофілізованого лікарського продукту, відновленого у розчині хлориду натрію. Таким чином, наприклад, якщо ліофілізований лікарський продукт, якщо відновлюється у воді, має осмолярність приблизно 300 мОсм/л, то розчин NaCl для відновлення вологовмісту повинен становити від приблизно 25 мМ до приблизно 30 мМ. В іншому прикладі якщо ліофілізований лікарський продукт, якщо відновлюється у воді, має осмолярність приблизно 100 мОсм/л, то розчин NaCl для відновлення вологовмісту повинен становити від приблизно 25 мМ до приблизно 130 мМ. В одному варіанті втілення лікарський продукт (ліофілізований або у розчині), який має приготов 17 лятися для ін'єкцій представленими способами, не містить HES (гідроксіетил крохмалю). HES-вмісні композиції, незважаючи на відновлення вологовмісту або розведення розчинами NaCl для іонної сили, можуть викликати осадження та аглютинацію еритроцитів в in vitro експериментах. В іншому варіанті втілення лікарський продукт, який приготовляють для ін'єкцій представленими способами, не містить декстранів, оскільки адаптовані модифіковані методи Вестергрена (див. Приклад 2) показують, що додавання NaCl не протидіє ефектові підвищеного осадження, який можуть викликати декстрани. В одному варіанті втілення винахід забезпечує способи одержання фармацевтичної композиції для внутрішньовенної ін'єкції, згідно з якими фармацевтична композиція є ліофілізованим матеріалом, який включає первинний наповнювач. Первинний наповнювач може бути, наприклад, здебільшого неіонізуючим. До неіонізуючих наповнювачів належать, крім інших, маніт, гліцин, цукроза, лактоза, інші дисахариди, терапевтичні білки або сам активний інгредієнт композиції, або інші наповнювачі, відомі спеціалістам у даній галузі. Концентрація неіонізуючих наповнювачів не має суттєвого впливу на достатність іонної сили розчину для запобігання аглютинації. Однак їх концентрація впливає на осмолярність, а отже, їх концентрація може мати вплив на тонічність. Концентрація гліцину, наприклад, є еквівалентною його частці в осмолярності, таким чином, 10 мМ гліцину є еквівалентними 10 мОсм/л. Білкові інгредієнти у лікарській композиції, включаючи активні інгредієнти, не мають суттєвого впливу на іонну силу розчину або осмолярність розчину. Наприклад, якщо взяти молекулярну масу 50000 для білка та 2,5 мг білка у розчині 1-2 мл, який має вводитися шляхом ін'єкції, то це є еквівалентом 0,05 мМ, і, таким чином, білок не має помітного впливу на осмолярність. Фармацевтичні композиції також часто містять поверхнево-активні речовини, такі, як полісорбат80. Полісорбат-80 та інші поверхнево-активні речовини є молекулами з високою молекулярною масою, тому кількість, яка зазвичай є присутньою у композиціях, наприклад, від 0,001 % до 0,01 %, є надто малою для помітного впливу на осмолярність або іонну силу. До інших поверхневоактивних речовин належать Brij® 35, Brij® 30, Lubrol-px™, Triton X-10, Pluronic® F127 та додецилсульфат натрію (SDS). Іншими молекулами з високою молекулярною масою, які можуть бути присутні у малій кількості у фармацевтичних композиціях і які не мають помітного впливу на осмолярність або іонність, є полімери, за умови, що вони не є солями, такими, як декстрансульфат. Прикладами полімерів є декстран, полівініловий спирт) (PVA), гідроксипропілметилцелюлоза (НРМС), желатин, поліетиленгліколь (PEG) та полівінілпіролідон (PVP). Фармацевтичні композиції також часто містять цукрозу або інші цукри або поліоли, часто у кількості 0-2, 0-5 або 0-10 % або більше. Наприклад, 510 % цукрозу застосовують, коли композиція не містить наповнювача. Як правило, якщо компози 97234 18 ція є ліофілізованою, і кількість композиції визначається як відсоток або молярність, то це стосується відсотка та молярності розчину до ліофілізації (тобто, кількості наповнення). Таким чином, якщо розчин містить 1 % цукрози, це є еквівалентом 29,2 мМ. Оскільки цукроза не виявляє помітної іонізації або дисоціації у розчині, 29 мМ цукрози є еквівалентом 29 мОсм/л. До інших цукрів або поліолів, які не мають помітної іонізації або дисоціації у розчині, належать гліцерин, ксиліт, сорбіт, маніт (також може застосовуватись як наповнювач), глюкоза, інозит, рафіноза, мальтотріоза, лактоза та трегалоза. Фармацевтичні композиції також можуть містити буферні агенти. До буферних агентів належать, наприклад, ацетат, цитрат, гліцин, гістидин, фосфат (натрію або калію), діетаноламін та Tris. До буферних агентів належать агенти, які підтримують рН розчину у прийнятному діапазоні. Буферні агенти, такі, як гліцин, гістидин та діетаноламін, здебільшого є неіонізуючими, і, таким чином, їх концентрація є еквівалентною осмолярності і має враховуватися при визначенні, чи є композиція, готова для ін'єкції, приблизно ізотонічною. Буферні агенти, такі, як ацетат та цитрат, зазвичай є солями, а отже, є іонізуючими, і їх концентрація помножується при підрахунку їх впливу на осмолярність розчину. Фармацевтичні композиції можуть включати по суті будь-який активний інгредієнт, включаючи білки, нуклеїнові кислоти, віруси та хімічні сполуки. Ці молекули здебільшого не мають помітного впливу на іонну силу або осмолярність розчину, який має вводитися шляхом ін'єкції. Якщо ці молекули є солями, оскільки низькомолекулярні сполуки часто є фармацевтичними солями, вони можуть помітно впливати на іонну силу та/або осмолярність. Деякі амінокислоти також містяться у деяких фармацевтичних композиціях і застосовуються як кріозахисні речовини, ліозахисні речовини та/або наповнювачі. Деякі амінокислоти, такі, як гістидин, здебільшого є неіонізуючими і, таким чином, концентрація амінокислоти у композиції має враховуватися лише при розрахунку осмолярності розчину, щоб композиція, готова для ін'єкції, була приблизно ізотонічною по відношенню до крові. ВеnеРІХ® BeneFIX® виробляється підданою генній інженерії клітинною лінією яєчника китайського хом'яка (СНО), яка широко характеризується і виявляється вільною від інфікуючих агентів. Зразки у банках клітин є вільними від продуктів крові або плазми продукти. Лінія клітин СНО секрету є рекомбінантний Фактор IX (rFIX) у визначене середовище клітинної культури, яке не містить будь-яких білків, що походять з тваринних або людського організмів, і рекомбінантний Фактор IX очищають за допомогою хроматографічного процесу, який не вимагає етапу моноклонального антитіла і забезпечує на виході високоочищений активний продукт. Етап мембранної фільтрації, який може утримувати молекули з середньою молекулярною масою >70,000 (такі, як великі білки та вірусні частинки), включають для додаткової вірусної безпе 19 ки. BeneFIX® зазвичай є окремим компонентом, згідно з оцінкою за допомогою електрофорезу в SDS-поліакриламідному гелі. Ефективність (у міжнародних одиницях, I.U. (IU)) визначають, застосовуючи in vitro одноетапний аналіз коагулюючої активності згідно з Міжнародним стандартом Всесвітньої організації охорони здоров'я (WHO) для концентрату Фактора IX. Одна міжнародна одиниця є кількістю активності Фактора IX, присутньою в 1 мл об'єднаної нормальної людської плазми. Питома активність BeneFIX® є більшою або дорівнює 180 IU на міліграм білка. BeneFIX® походить не з людської крові і не містить консервантів або додатків людських або тваринних компонентів. BeneFIX® рецептують як стерильну, непірогенну, ліофілізовану порошкову композицію. BeneFIX® призначається для внутрішньовенної (IV) ін'єкції. Він реалізується у флаконах для одноразового використання, які містять вказану на ярлику кількість активності Фактора IX, виражену у міжнародних одиницях (IU). Кожен флакон номінально містить, наприклад, 250, 500 або 1000 IU (або більше, до 2000 IU включно) коагулюючого Фактора IX (рекомбінантного). Після відновлення вологовмісту ліофілізованого лікарського продукту стерильною водою концентрація наповнювача у дозах 500 та 1000 IU становить 10 мМ L-гістидину, 1 % цукрози, 260 мМ гліцину, 0,005 % полісорбату 80. Концентрація після відновлення вологовмісту в дозі 250 IU становить половину від показника двох інших доз. Дози 500 та 1000 IU є ізотонічними після відновлення вологовмісту, а доза 250 IU після відновлення вологовмісту має половину тонічності інших двох доз. Усі дози після відновлення вологовмісту забезпечують прозорий, безбарвний розчин. В одному варіанті втілення винахід забезпечує способи одержання BeneFIX®, який має вводитися суб'єктові, згідно з яким BeneFIX® відновлюють до розчину в хлориді натрію, причому розчин хлориду натрію складає більше, ніж приблизно 25 мМ, і менше, ніж приблизно 150 мМ. В одному варіанті втілення розчин хлориду натрію, який застосовують для відновлення вологовмісту BeneFIX®, складає приблизно 40 мМ. В одному варіанті втілення один флакон ліофілізованого BeneFIX® відновлюють у приблизно 4-5 мл 25 мМ-150 мМ розчину хлориду натрію. Перерецептований BeneFIX® (BeneFIX®-R) Через низьку іонну силу BeneFIX®, відновленого у воді, здійснювали різні перерецептування (перерецептований BeneFIX® (BeneFIX®-R)). Мета полягала у додаванні достатньої іонної сили композиції BeneFIX® таким чином, щоб зменшити можливість аглютинації RBC. Для збільшення іонної сили BeneFIX® хлорид натрію може включатися у відновлений продукт шляхом заміни sWFI як відновлювального розчину. В альтернативному варіанті, BeneFIX® рецептують шляхом додавання NaCl до композиції до ліофілізації, таким чином, щоб відновлення вологовмісту могло досягатися з водою, але ліофілізація сольових розчинів є важчою, і більш-практичним є просте відновлення вологовмісту ліофілізованих матеріалів розчинами NaCl. Це також стосується інших ліофілізованих 97234 20 фармацевтичних композицій, які не мають достатньої іонної сили при відновленні sWFI для запобігання аглютинації. В одному варіанті втілення BeneFIX®-R ліофілізують у такій самій композиції, що й BeneFIX® (10 мМ L-гістидину, 260 мМ гліцину, 1 % цукрози, 0,005 % полісорбату 80), і відрізняється лише концентрація rFIX. Після цього насипний лікарський продукт BeneFIX®-R розфасовують, наприклад, у кількості 4 мл на флакон з 10 мМ L-гістидину, 260 мМ гліцину, 1 % цукрози, 0,005 % полісорбату 80 і ліофілізують. Коли BeneFIX®-R відновлюють до 5 мл на флакон за допомогою 25-150 мМ розчину NaCl, наприклад, 40 мМ NaCl, концентрація наповнювачів знижується на 20 % порівняно з існуючою композицією BeneFIX® до ліофілізації. Ця методика в результаті забезпечує композицію, яка є (1) ізотонічною, (2) має достатню іонну силу для зменшення можливості аглютинації RBC та (3) зменшення об'єму ін'єкції для високих доз rFIX. BeneFIX®-R може бути передбачений у дозах, наприклад, 250, 500, 1000 та 2000 IU rFIX на флакон. Таким чином, після відновлення вологовмісту за допомогою 5 мл розчину 25-150 мМ NaCl утворена в результаті композиція BeneFIX®-R може містити від приблизно 7 до приблизно 9 мМ гістидину; від приблизно 188 до приблизно 220 мМ гліцину; від приблизно 0,7 % до приблизно 0,9 % цукрози; і приблизно 0,004 % полісорбату 80. Залежно від кількості rFIX у флаконі, наприклад, 250, 500, 1000 або 2000 IU, відновлення вологовмісту у 5 мл розчину NaCl в результаті забезпечує концентрацію rFIX приблизно 50, 100, 200 або 400 IU/мл, відповідно. Осмолярність композиції BeneFIX®-R, відновленої у 5 мл розчину 40 мМ NaCl, становить приблизно 320 мОсм/л. Типові композиції, які приготовляють для ін'єкцій Рекомбінантний Фактор IX також може бути ліофілізований у композиціях, описаних у Патенті США №6,372,716, який є включеним авторами шляхом посилання в усіх відношеннях, включаючи описані в ньому композиції. Композиції, описані у патенті, можуть бути застосовані у даному винаході, причому композиції не обмежуються такими, що містять rFIX як активний інгредієнт. Таким чином, наприклад, до ліофілізованих композицій, які можуть бути відновлені за допомогою 25 мМ-150 мМ розчинів хлориду натрію для підготування їх до ін'єкцій, належать композиції, які включають гліцин, полісорбат, цукрозу, гістидин та активний інгредієнт. Активним інгредієнтом може бути по суті будь-який білок, наприклад, вірус, нуклеїнова кислота або хімічна сполука. Гліцин може мати концентрацію, наприклад, приблизно від 0,1 M до 0,3 М. Полісорбат може мати концентрацію, наприклад, від приблизно 0,001 до приблизно 0,05 %. Цукроза може мати концентрацію, наприклад, від приблизно 0,5 % до приблизно 2 %. Гістидин може мати концентрацію, наприклад, від приблизно 5 мМ до приблизно 30 мМ. В одному варіанті втілення ліофілізована композиція, яка має бути відновлена 25-150 мМ розчином хлориду натрію, включає приблизно від 0,1 до 0,3 М гліцину, приблизно від 0,5 до 2 % цукро 21 97234 зи, 0,001 до приблизно 0,05 % полісорбату, від приблизно 5 до приблизно 30 мМ гістидину і від приблизно 0,1 до приблизно 20 мг/мл активного інгредієнта. Активним інгредієнтом може бути, наприклад, rFIX. В іншому варіанті втілення ліофілізована композиція rFIX, яка підлягає відновленню 25-150 мМ розчином хлориду натрію, включає від приблизно 0,13 до приблизно 3 мг/мл rFIX або від приблизно 50 до приблизно 600 IU/мл rFIX, приблизно 0,26М гліцину, приблизно 10 мМ гістидину, приблизно 1 % цукрози та приблизно 0,005 % полісорбату. Приклади винаходу Описані нижче приклади представлено для пояснення аспектів даного винаходу і не включаються з метою обмеження винаходу. Приклад 1: Вплив антикоагулянтів та компонентів композиції на пов'язану з BeneFIX® аглютинацію RBC Існують окремі повідомлення про пов'язану з BeneFIX® аглютинацію RBC у катетерахметеликах та шприцах. Нещодавні дослідження крові собак з гемофілією продемонстрували, що 22 аглютинація відбувається за відсутності рекомбінантного людського FIX у буфері композиції. Таким чином, дане дослідження мало на меті дослідити, чи впливають стандартні антикоагулянти, різні компоненти BeneFIX® та іонна сила на явище пов'язаної з BeneFIX® аглютинації. Кров отримували з пулу анонімних добровольців і збирали у пробірки з вакуумом (Becton Dickinson, Franklin Lakes,NJ), які містять стандартний антикоагулянт, такий, як етилендіамінтетраоцтова кислота (EDTA), цитрат натрію або гепарин. Для випробування аглютинації зразки крові у пробірках з вакуумом спочатку безперервно змішували за допомогою шейкера-качалки. Кров, 12,5 мкл, розводили у 87,5 мкл випробуваного розчину у 48-лунковому планшеті для культивування клітин і інкубували при кімнатній температурі протягом 2 хвилин перед спостереженням за допомогою інвертованого фазово-контрастного мікроскопа при збільшенні 400×. Кожну лунку знімали на відео для фіксації кадрів з метою підрахунку аглютинації RBC згідно з нижчезазначеними критеріями, представленими у Таблиці 1. Таблиця 1 Ключ до тесту аглютинації RBC Показник 0 1 2 3 4 Фенотип аглютинації Без аглютинації, більшість є окремими клітинами, кількома або випадковими дублетами. Здебільшого окремі клітини, дисперговані скрізь малі агрегати. Багато малих агрегатів, з деякими окремими клітинами на фоні. Здебільшого від малих до середніх агрегатів з випадковими окремими клітинами. Великі агрегати клітин. Вплив стандартних антикоагулянтів на аглютинацію RBC: Перше дослідження включало аналіз зразків крові від трьох донорів. Кров збирали у пробірки з вакуумом з EDTA, гепарином та цитратом натрію для кожного донора. Випробувані зразки включали BeneFIX®, 100 IU/мл, відновлений у кожній з нижчезазначених концентрацій NaCl: 0 мМ (sWFI), 20 мМ, 40 мМ, 60 мМ та 77 мМ NaCl. Крім того, включали 5 % декстрозу у воді (D5W) як позитивний контроль. Зразки розводили у співвідношенні крові з BeneFIX® або крові з D5W 1:8. Робили знімки, зберігали у цифровому форматі, маскували і підраховували аглютинацію. Через дві хвилини після додавання крові до BeneFIX®. відновленого з застосуванням sWFI, спостерігалася аглютинація у зразках усіх трьох донорів, незалежно від типу застосовуваного антикоагулянта. Зі збільшенням концентрації застосовуваного NaCl аглютинація знижувалася. Помітна аглютинація спостерігалася, коли кров додавали до D5W. Вплив NaCl на аглютинацію RBC у попередньо відібраних донорів: Зразки від донорів збирали у гепаринізовані пробірки з вакуумом. Оскільки у деяких попередніх зразках спостерігалися спонтанні аглютинації, всіх донорів спочатку відбирали, застосовуючи 154 мМ NaCl. Якщо спостерігалася аглютинація, зразок виключали з подальших досліджень. Решту зразків від кожного донора розводили у співвідношенні 1:8 до однієї з двох композицій: (1) 100 IU/мл BeneFIX®, відновленого sWFI, та (2) 100 IU/мл BeneFIX®, відновленого 154 мМ NaCl. Робили знімки, зберігали у цифровому форматі, маскували і підраховували аглютинацію. Аглютинація спостерігалася для BeneFIX®, відновленого sWFI, оскільки відновлення вологовмісту з застосуванням 154 мМ NaCl знижувало або виключало аглютинацію (показники див, у Таблиці 2). 23 97234 24 Таблиця 2 Показники аглютинації Донор 7 11 8 28 41 Попередньо відібраний контроль 154 мМ NaCl 0 0 0 0 0 Вплив компонентів композиції та концентрації BeneFIX®: Кілька композицій BeneFIX® оцінювали для виявлення впливу різних компонентів на аглютинацію RBC. Приготовляли по вісім різних сумішей з 154 мМ NaCl та без нього, загалом 16 сумішей (Таблиця 3). Дванадцять донорів відбирали на спонтанну аглютинацію, і двох було виключено BeneFIX® + sWFI BeneFIX®+154 мМ NaCl 2 3 3 3 3 1 0 0 0 1 з подальшого дослідження. Зразки крові п'яти з десяти донорів, що залишилися, застосовували для перших 8 композицій (зразки з 1-А по 1-Н) а зразки інших п'яти донорів застосовували для інших 8 композицій (зразки з 2-І по 2-Р). Зразки розводили у співвідношенні 1:8, як і раніше, робили знімки і визначали показники, як описано вище. Таблиця 3 Проектна матриця композиції (+/- вказує на присутність/відсутність інгредієнта) Позначення набору/зразка 1-А, BeneFIX® 1-В, BeneFIX® 1-С, BeneFIX® 1-D, BeneFIX® 1-Е, BeneFIX® 1-F, BeneFIX® 1-G, No BeneFIX® 1-H, No BeneFIX® 2-І, BeneFIX®, No GLY 2-J, BeneFIX®, No GLY 2-K, No Цукрозу 2-L, No Цукрозу 2-М, BeneFIX®, No Tween-80 2-N, No Tween-80 2-O, BeneFIX® No HIS 2-P, BeneFIX® No HIS концентрація BeneFIX® (IU/мл) 100 100 300 300 600 600 100 100 100 100 Гліцин (GLY) 260 мМ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 100 + + 100 100 100 + + + + + + Показники аглютинації для експерименту, представленого у Таблиці 3, показано нижче у Таблицях 4А та 4В. Жоден конкретний компонент, чи то активний інгредієнт, чи наповнювач, композиції BeneFIX® не був пов'язаний з аглютинацією. Цукрозa 10 мг/мл Tween-80 (Полісорба т-80) 0,005 % + + + + + + + + + + + + Гістидин (HIS) 10 мМ + + + + + + + + + + + + NaCl 154 мМ + + + + + + + + + + + + Як і очікувалося, видалення гліцину викликало лізис RBC через гіпотонічність розчину. Однак відновлення вологовмісту з застосуванням 154 мМ NaCl знижувало або виключало in vitro аглютинацію та лізис. Таблиця 4А Показники аглютинації - різні концентрації BeneFIX® Номер донора зразка 6 14 19 40 43 Середній показник 1-А 1-В 1-С 1-D 1-Е 1-F 1-G 1-Н 4 3 4 1 3 3 1 0 1 0 0 0,4 2 2 3 2 3 2,4 1 3 0 1 1 1,2 4 3 3 2 4 3,2 1 1 1 2 0 1 3 2 3 3 3 2,8 2 4 1 1 3 2,2 25 97234 26 Таблиця 4В Показники аглютинації - вплив наповнювачів Номер донора зразка 1 11 18 34 45 Середній показник 2-І Лізис 4 Лізис Лізис Лізис Лізис 2-J 1 0 1 0 1 0,6 2-K 2 4 4 2 4 3,2 Вплив низьких концентрацій NaCl на аглютинацію RBC у попередньо відібраних донорів: Зразки донорів збирали у гепаринізовані пробірки з вакуумом. Оскільки у деяких попередніх зразках спостерігалася аглютинація, усіх донорів спочатку відбирали, застосовуючи 154 мМ NaCl. Якщо спостерігалася аглютинація, зразок виключали з подальших досліджень. Решту зразків від кожного донора розводили у співвідношенні 1:8, як і рані 2-L 0 1 1 0 1 0,6 2-М 3 3 2 4 3 2-N 1 1 2 2 3 1,8 2-О 3 2 3 3 2 2,6 2-Р 0 0 2 2 3 1,4 ше, до однієї з трьох композицій: (1) 100 IU/мл BeneFIX® з sWFI; (2) 100 IU/мл BeneFIX® з 40 мМ NaCl; або (3) 100 IU/мл BeneFIX® з 77 мМ NaCl. Робили знімки, збирали й підраховували, як і раніше. Результати представлено нижче у Таблиці 5. Аглютинація спостерігалася в усіх п'яти зразках з BeneFIX®, відновленому водою, тоді, як відновлення BeneFIX® з застосуванням 40 мМ або 77 мМ NaCl знижувало або виключало аглютинацію. Таблиця 5 Показники аглютинації Донор № 8 34 39 40 47 Середній показник 154 мМ NaCl 0 0 0 0 0 0 BeneFIX®+sWFI 3 4 3 3 3,2 Аналіз: аглютинація RBC відбувалася у крові, обробленій антикоагулянтами гепарином, EDTA або цитратом натрію, при змішуванні з BeneFIX® у співвідношенні об'ємів крові з відновленим BeneFIX® 1:8. Впливу типу антикоагулянта на аглютинацію не спостерігалося; таким чином, гепарин застосовували як антикоагулянт для подальших оцінок. У деяких зразках аглютинація відбувалася у присутності лише 0,9 % NaCl (негативний контроль для аглютинації). Таким чином, подальші оцінки здійснювали лише зі зразками, які не демонстрували аглютинації з контролем 0,9 % NaCl. Вплив трьох концентрацій BeneFIX® (100, 300 або 600 IU/мл) та кожного окремого компонента BeneFIX®, відновленого у sWFI або розчині NaCl, після цього оцінювали на аглютинацію RBC при змішуванні з обробленою антикоагулянтом гепарином кров'ю у співвідношенні об'ємів крові з BeneFIX® 1:8. Видалення будь-якого конкретного компонента, включаючи рекомбінантний людський білок FIX, не мало впливу на аглютинацію. Це вказує на широкі можливості приготування різних фармацевтичних композицій (відновлених або розведених) з розчинами NaCl для внутрішньовенної ін'єкції. Видалення гліцину в результаті призводило до лізису RBC. Однак застосування 40 мМ (0,234 % NaCl для ін'єкцій), 77 мМ (0,45 % NaCl для ін'єкцій) або 154 мМ NaCl (0,9 % NaCl для ін'є BeneFIX®+40 мМ NaCl 1 2 3 0 1 1,4 BeneFIX®+77 мМ NaCl 2 1 1 1 1 1,2 кцій) для відновлення вологовмісту знижувало або виключало аглютинацію та лізис. Таким чином, ці результати показують, що жоден конкретний компонент композиції BeneFIX® не стосується аглютинації, яка спостерігалася. Хоча видалення гліцину з композиції BeneFIX® та відновлення вологовмісту водою в результаті дає гіпотонічний розчин, який викликає лізис, осмолярність та тонічність не є пов'язаними з іонною силою та аглютинацією. Результати показують, що аглютинація є пов'язаною з низькою іонною силою відновленого рекомбінантного Фактора IX (rFIX) у sWFI, і відновлення з застосуванням NaCl знижує або виключає аглютинацію. Таким чином, відновлення вологовмісту інших фармацевтичних композицій розчинами NaCl, навіть якщо розчини NaCl мають концентрацію, нижчу за 154 мМ, може запобігати як аглютинації, так і лізисові після внутрішньовенної ін'єкції. Приклад 2: Пристосування модифікованого методу Вестергрена з вимірювання швидкості садження еритроцитів для оцінки агрегації еритроцитів, викликаної фармацевтичними агентами композицій Композиція BeneFIX®, яка нині реалізується на ринку, є неіонною композицією. Під час введення композиції BeneFIX®, відновленої у sWFI, час від часу спостерігається агрегація (тобто, аглютинація) еритроцитів, коли кров пацієнта змішується 27 97234 з відновленим BeneFIX®, наприклад, у трубках для внутрішньовенного введення. Згідно з винаходом, було виявлено, що агрегація еритроцитів є пов'язаною з композицією, а не rFIX, і їй перешкоджає застосування розріджувачів, які містять принаймні приблизно 40 мМ NaCl. Для сприяння складанню традиційних розріджувачів, які містять принаймні приблизно 40 мМ NaCl, було розроблено вимірюваний аналіз, який може застосовуватися для вимірювання осадження еритроцитів, який є загальноприйнятим способом оцінки агрегації еритроцитів in vitro. Модифікований метод Вестергрена, згідно з яким кров розводять у співвідношенні 4:5 у нормальному сольовому розчині, було пристосовано для оцінки агрегації у крові, яку було розведено у співвідношенні 1:4 або 1:8 сольовим розчином або випробуваними розчинами (тобто, традиційними розріджувачами). Людську кров брали у здорових дорослих добровольців і збирали у пробірки, які містять EDTA. Для демонстрації придатності зразків крові для експериментів з осадженням, клінічно визначену швидкість осадження еритроцитів E8R60 вимірювали за допомогою модифікованого методу Вестергрена. Тобто, добре змішану кров розводили у співвідношенні 4:5 154 мМ NaCl, обережно належним чином перемішували, а потім відразу поміщали у самоонулювані пробірки Вестергрена, які поміщали у традиційний 10-пробірковий стенд. Відстань у мМ від нульової позначки вгорі пробірки до межі плазми:еритроцитів через 60 хвилин вимі 28 рювали й записували. Результати ESR60 порівнювали з опублікованими нормальними еталонними значеннями (Morris, M.W. et al., Basic examination of blood, in Henry, J.B., ed., Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods, Philadelphia, PA, WB Saunders, 2001: 479-519). Два експерименти здійснювали для демонстрації придатності адаптованого, модифікованого метода Вестергрена для оцінки агрегації еритроцитів, пов'язаної з фармацевтичними композиціями. Зразки людської крові були придатними для застосування в цих аналізах, оскільки всі мали значення ESR60 у нормальних межах. Ці зразки розводили у співвідношенні 1:4 у першому експерименті і 1:8 у другому. У першому експерименті осадження еритроцитів збільшувалося при застосуванні 5 % декстрану 70 або BeneFIX®, відновленого sWFI або 10 мМ NaCl. Протягом 5 хвилин агрегати були видимими у пробірках, заповнених кров'ю, розведеною 3 % декстраном 70 або BeneFIX®, відновленим у sWFI. До 60-ї хвилини осадження еритроцитів у цих пробірках помітно збільшувалося порівняно з контрольним сольовим розчином (Таблиця 6). До 90-ї хвилини кров одного донора, яку розводили у BeneFIX®, відновленому у 10 мМ NaCl, демонструвала двофазний характер осадження з чіткою межею еритроцитів:плазми, розташованою за 8 мМ від нульової позначки та іншою межею між щільно упакованими еритроцитами, розташованою за 149 мМ від нульової позначки. Таблиця 6 Осадження еритроцитів людської крові, розведеної у співвідношенні 1:4 у BeneFIX® або 3 % декстрані (Відстань осадження у мМ, виміряна від нульової позначки) Донор та час Сольовий розведення розчин Донор 5 60 хв 2 90 хв 3 120 хв 4 150 хв 6 Донор 22 60 хв 90 хв 120 хв 150 хв 0 3 4 7 0 мМ 10 мМ 20 мМ 30 мМ 40 мМ 50 мМ 60 мМ 77 мМ 154 мМ 3 % ДекNaCl NaCl NaCl NaCl NaCl NaCl NaCl NaCl NaCl стран 70 135 145 150 153 н.в. н.в. н.в. н.в. 2 4 5 7 2 3 4 6 2 3 4 5 1 3 4 5 1 2 3 5 2 2 4 5 1 2 3 5 132 159 167 169 161 164 166 167 4 149 151 152 3 3 6 8 0 3 4 6 0 3 4 5 0 2 4 5 0 2 3 5 0 3 4 6 н.в. н.в. н.в. н.в. 145 166 171 172 Концентрація NaCl є такою, яку застосовують для відновлення вологовмісту BeneFIX®. У другому експерименті осадження еритроцитів посилювали 5 % декстрозою, "MFR-927" (рецептувальний буфер для BeneFIX®, який не містить rFIX) та BeneFIX®, відновленим 10 мМ NaCl Таблиця 7). На відміну від першого експерименту, осадження в цих пробірках було швидким, з максимальним або майже максимальним осадженням, яке досягалося через 15-30 хвилин. 29 97234 30 Таблиця 7 Осадження еритроцитів людської крові, розведених у співвідношенні 1:8 у MFR-927, BeneFIX® або 5 % декстрозі (Відстань осадження у мМ, виміряна від нульової позначки) Донор та час розведення Донор 56 15 хв 30 хв 45 хв 60 хв Донор 57 15 хв 30 хв 45 хв 60 хв Сольовий розчин MFR927 10 мМ 25 мМ 30 мМ 40 мМ 50 мМ 60 мМ 77 мМ 5 % ДекстроNaCl NaCl NaCl NaCl NaCl NaCl NaCl за 0 0 1 2 >180 >180 >180 >180 -155 177 180 >180 1 2 3 3 0 1 2 2 0 0 1 1 0 0 1 1 0 0 1 1 0 0 1 1 175 178 179 180 0 1 1 2 >180 >180 >180 >180 180 >180 >180 >180 1 2 3 4 1 2 3 3 0 1 1 2 0 0 2 3 0 1 1 2 0 1 1 2 179 >180 >180 >180 Концентрація NaCl є такою, яку застосовують для відновлення вологовмісту BeneFIX®; MFR-927 є рецептувальним буфером для BeneFIX®, який не містить rFIX. Результати цих експериментів демонструють, що модифікований метод Вестергрена, який застосовують для вимірювання осадження еритроцитів, може бути застосований для оцінки агрегації еритроцитів, викликаної фармацевтичними препаратами або композиціями. Наприклад, вимірювання осадження еритроцитів у пробірках Вестергрена через 60 хвилин після поміщення крові, розведеної у співвідношенні 1:4 випробуваними розчинами є достатнім для відрізнення агентів, які посилюють агрегацію (тобто, 5 % декстрози, 3 % декстрану 70, MFR-927 та BeneFIX®, відновленого у sWFI) від тих, які не посилюють (тобто, сольового розчину та BeneFIX®, відновленого у розріджувачах, які містять приблизно 25 мМ або більше NaCl). Приклад 3: Достатність 40 мМ NaCl у розріджувачі для перерецептованого BeneFIX® для зменшення пов'язаної з композицією агрегації еритроцитів Неіонна композиція BeneFIX® серійного виробництва, була пов'язана з in vitro агрегацією еритроцитів, яка трапляється під час введення, коли кров пацієнта змішується з BeneFIX® у трубках для внутрішньовенного введення. Згідно з винаходом, виявляється, що агрегація еритроцитів є пов'язаною з композицією, а не з рекомбінантним Фактором IX, і агрегації може перешкоджати відновлення вологовмісту BeneFIX® розріджувачами, які містять принаймні 40 мМ NaCl. Метою цього Прикладу є випробування стійкості 40 мМ розріджувача для відновлення вологовмісту перерецептованих композицій BeneFIX® (BeneFIX®-R). Зокрема, експерименти призначалися для визначення достатності концентрації NaCl, яка відхиляється від 40 мМ на 10 %, для запобігання пов'язаній з композицією агрегації еритроцитів, яку оцінювали за допомогою адаптованого, модифікованого методу Вестергрена для вимірювання швидкості осадження еритроцитів (ESR). Крім того, стійкість концентрації NaCl при осадженні еритроцитів оцінювали у флаконах, як з високою (тобто, 2000 IU), так і низькою (тобто, 250 IU) BeneFIX®-R. Вплив композицій BeneFIX®-R, MFR-927 та 3 % декстрану 70 на осадження еритроцитів вимірювали при кімнатній температурі, пристосовуючи видозмінений метод Вестергрена, як описано у Прикладі 2. Схему дослідження представлено у Таблиці 8. Таблиця 8 Схема дослідження для Прикладу 3 Група 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Обробка Сольовий розчин MFR-927 BeneFIX®-R (55 IU/мл); 36 мМ NaCl BeneFIX®-R (55 IU/мл); 40 мМ NaCl BeneFIX®-R (55 IU/мл); 44 мМ NaCl BeneFIX®-R (440 IU/мл); 36 мМ NaCl BeneFIX®-R (440 IU/мл); 40 мМ NaCl BeneFIX®-R (440 IU/мл); 44 мМ NaCl 3 % Декстран 70 Кількість експериментів 4 4 4 4 4 4 4 4 4 Загальна кількість оцінюваних зразків донорів 12 12 12 12 12 12 12 12 12 Розведення крові 1:4 1:4 1:4 1:4 1:4 1:4 1:4 1:4 1:4 31 У день експерименту флакони як з високою (флакони з ліофілізованим BeneFIX®-R, які містять 2000 IU rFIX), так і з низькою дозою BeneFIX®-R (флакони з ліофілізованим BeneFIX®-R, які містять 250 IU rFIX) відновлювали безпосередньо перед використанням 5 мл 36 мМ, 40 мМ або 44 мМ NaCl. Позитивний контрольний розчин 3 % (маса/об'єм) декстрану 70 приготовляли у стерильному модифікованому Дульбекко. вільному від кальцію та магнію фосфатно-буферному сольовому розчині (PBS-CMF; рН 7,4). Людську кров брали у донорів і збирали у пробірки з вакуумом, які містили EDTA. Зразки крові використовували для експериментів з осадженням еритроцитів протягом 3 годин з моменту збирання. Суцільну кров розводили у співвідношенні 1:4 у випробуваних розчинах (тобто, 400 мкл суцільної крові додавали до 1,2 мл випробуваного розчину), ретельно перемішували, а потім поміщали у самоонулювані одноразові скляні пробірки Вестергрена, які тримали абсолютно вертикально у спеціально призначеному стенді. Вимірювали й записували осадження еритроцитів через 60 хвилин, виражене як відстань у мМ від нульової позначки вгорі пробірки до межі плазми-еритроцитів. Результати всіх 12 донорів були подібними. Рецептувальний буфер BeneFIX® серійного виробництва, який не містить rFIX (MFR-927), та 3 % декстран 70, стандартний позитивний контрольний розчин, демонстрували підвищене осадження еритроцитів порівняно з кров'ю, яку було змішано з випробуваними розчинами NaCl (див. Фіг.1). Незалежно від концентрації NaCl у буфері (36 мМ, 40 мМ або 44 мМ) або концентрації rFIX у продукті, BeneFIX®-R не збільшував осадження еритроцитів під час його відновлення розріджувачем NaCl. Результати цього дослідження демонструють, що концентрація NaCl, на 10 % вища або нижча за 40 мМ у розріджувачах BeneFIX®-R, є достатньою для запобігання осадженню або агрегації (аглютинації) еритроцитів. Результати також показують, що на поліпшення впливу NaCl на пов'язану з композицією агрегацію еритроцитів не впливає концентрація активного інгредієнта (тобто, rFIX). Приклад 4: Роль іонної сили у буфері для відновлення вологовмісту BeneFIX® у викликанні аглютинації RBC Людську кров брали шляхом венепункції у чотирьох різних донорів у стандартні гепаринізовані збиральні пробірки. Утворення аглютинатів RBC випробували шляхом набирання 2,6 мл буфера або відновленого білка BeneFIX® у шприці з на 97234 32 ступним набиранням 0,6 мл гепаринізованої крові. У цих шприцах спостерігали змішування/осадження аглютинатів з часом і фотографічно фіксували за допомогою цифрової камери. Склад існуючої композиції BeneFIX® до ліофілізації включає rFIX, приблизно 10 мМ гістидину, приблизно 260 мМ гліцину, приблизно 1 % цукрози та приблизно 0,005 % полісорбату-80, рН 6,8. Композицію BeneFIX® ліофілізують і перед ін'єкцією відновлюють у sWFI. Первісно вважалося, що цукроза є причиною аглютинації. Таким чином, випробувані буфери рецептували з 1 %, 0,5 % або 0 % цукрози. Кожен цукрозний випробуваний буфер набирали у шприці з наступним набиранням невеликої кількості гепаринізованої крові. Аглютинація RBC та наступне швидке осадження виявлялися ідентичними для трьох буферів, вказуючи на те, що вміст цукрозі у композиції BeneFIX® не зумовлює аглютинацію, яка спостерігалася. BeneFIX®, відновлений у нормальному сольовому розчині, а не у стерильній воді, не викликав аглютинації. Ці дані свідчать, що іонна сила композиції BeneFIX® є недостатньою для запобігання аглютинації, коли BeneFIX® відновлюють у воді. Для визначення мінімальної іонної сили, необхідної для виключення аглютинації, BeneFIX® відновлювали (або композицію BeneFIX® до ліофілізації змінювали таким чином, щоб вона включала хлорид натрію, хоча способи ліофілізації композицій з хлоридом натрію є важчими порівняно з ліофілізацією композицій, які не містять хлориду натрію) розчинами, які мають різні концентрації NaCl (0, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 та 137 мМ). BeneFIX® також відновлювали у нормальному сольовому розчині, який містив 154 мМ NaCl. Аглютинацію та осадження RBC досліджували в усіх із цих розчинів. У Таблиці 9 показано осмоляльність та іонну силу (виражену як провідність) деяких із цих розчинів разом з іншими звичайними розчинами для внутрішньовенного введення. Передбачається, що після додавання хлориду натрію до композиції BeneFIX®, або шляхом прямого додавання до ліофілізації, або шляхом відновлення вологовмісту ліофілізату розчином хлориду натрію, NaCl має повністю дисоціюватися до еквіва+ лентної концентрації іонів Na та Сl . Таким чином, передбачається, що іонна сила (виражена у + мекв/л (міліеквівалентів/л) Na та Сl ) рецептувального буфера плюс NaCl має бути еквівалентною концентрації NaCl, якщо рецептувальний буфер не містить інших іонів. 33 97234 34 Таблиця 9 Характеризація різних розчинів Розчин Композиція BeneFIX® Композиція BeneFIX®+10 мМ NaCl Композиція BeneFIX®+20 мМ NaCl Композиція BeneFIX®+40 мМ NaCl Композиція BeneFIX®+80 мМ NaCl Композиція BeneFIX®+137 мМ NaCl Композиція BeneFIX®+154 мM NaCl 0,9 % хлорид натрію (еквівалент 154 + мM NaCl; 154 мекв/л іонів Na та Сl ) 5 % декстрози для ін'єкцій Приблизна розрахована Приблизна розрахована проосмоляльність (мОсм/л) відність (мС/см) 0 (спостерігається 300 провідність