Інсектицидні білкові токсини з photorhabdus

1. Полінуклеотид, функціонально зв'язаний з гетерологічним промотором, що кодує білок, який має активність токсину проти комахи-шкідника, де нуклеотидна молекула, що кодує вказаний білок, зберігає здатність до гібридизації з комплементарною послідовністю нуклеїнової кислоти після гібридизації і промивання, причому вказану гібридизацію здійснюють при 60 °С в розчині, що містить 10 % (м/о) ПЕГ (поліетиленгліколю, М.м. приблизно 8000 Да), 0,6 x SSC, 7 % (м/о) SDS, 10 мМ натрійфосфатний буфер, 5 мМ ЕДТА і 100 мг/мл денатурованої ДНК із молочка лосося, де вказана послідовність нуклеїнової кислоти являє собою SEQ ID NO: 46. 2 (19) 1 3 Цей винахід стосується токсинів, виділених з бактерій, та до застосування цих токсинів як інсектицидів. Численні комахи широко розглядаються як шкідники володарями будинків, учасниками пікніків, садівниками й фермерами та іншими людьми, вкладення яких у сільськогосподарські продукти часто пропадають або зменшуються внаслідок пошкодження комахами польових культур. Зокрема, в зонах, де вегетаційний сезон є коротким, значне пошкодження комахами може означати втрату всіх прибутків для фермерів і сильне зниження врожайності. Мізерне постачання конкретних сільськогосподарських продуктів неминуче призводить до більш високих цін для людей, що займаються переробкою харчових продуктів, і потім - для кінцевих споживачів харчових рослин та продуктів, які одержують з цих рослин. Відвертання пошкодження комахами сільськогосподарських культур та квітів і виключення неприємностей, пов'язаних з комахами-шкідниками, як правило засновано на використанні сильних пестицидів та інсектицидів з широкими спектрами токсичності. Ці синтетичні продукти стикаються з різким неприйняттям усього населення як занадто жорстокі по відношенню до довкілля та об'єктів, що їх піддають дії таких агентів. Таким чином, поза сільським господарством, володарі будинків задовольнилися б тим, щоб комахи уникали їх будинків та місць пікніків, без знищення цих комах. Інтенсивне застосування хімічних інсектицидів викликало занепокоєність щодо довкілля та здоров'я у фермерів, компаній, які продукують ці інсектициди, державних органів, груп захисту суспільних інтересів та громадськості в цілому. Розробка менш жорстких стратегій захисту від шкідників стимулювалася разом з стурбованістю суспільства про довкілля та з розвитком біологічних засобів, що використовують біологічні механізми боротьби з комахами. Засоби біологічного захисту є перспективною альтернативою хімічним інсектицидам. Організми на кожному рівні еволюційного розвитку розвивали засоби для підсилення їх власного поступу й виживання. Використання біологічних молекул як інструментів захисту й агресії відомо в царстві тварин і в рослинному світі. Крім того, відносно нові інструменти генної інженерії дозволяють модифікувати біологічні інсектициди для втілення конкретних рішень конкретних проблем. Один з таких агентів, Bacillus thuringiensis (Bt), є ефективним інсектицидним агентом і, як такий, широко використовується комерційно. Фактично, інсектицидний агент бактерії Bt являє собою білок, який має таку обмежену токсичність, що його можна використовувати на харчових культурах людини в день збирання врожаю. Для організмів, які не є мішенню, токсин Bt є нетоксичним білком, що легко засвоюється. Іншим відомим класом біологічних агентів захисту від комах є деякі роди нематод, котрі, як відомо, є векторами переносу бактеріальних симбіонтів, що вбивають комах. Нематоди, що містять інсектицидні бактерії, заселяють личинки комах. 82485 4 Потім ці бактерії вбивають личинки. Нематоди розмножуються у вбитих личинках. Потомство нематод поїдає вбитих личинок зсередини. Одержане у такий спосіб потомство нематод, що містить бактерії, може потім заселяти інші личинки. У минулому інсектицидних нематод у родах Steinernema та Heterorhabditis використовували як агентів захисту від комах. Певно, кожен рід нематод є живителем для конкретного виду бактерій. У нематодах роду Heterorhabditis симбіотичною бактерією є Photorhabdus luminescens. Хоча ці нематоди є ефективними агентами захисту від комах, зараз важкою, дорогою й неефективною справою є одержання, підтримання та розповсюдження нематод для боротьби з комахами. У цій галузі було відомо, що з Photorhabdus liminiscens можна виділити інсектицидний токсин, який є активним лише при введенні у личинки лускокрилих та твердокрилих комах. Це робило неможливим ефективне застосування інсектицидних властивостей цих нематод чи їх бактеріального симбіонту. Корисним був би більш практичний, менш трудомісткий, такий, що охоплює великі простори, спосіб доставляння інсектицидного токсину, який зберігав би його біологічні властивості після доставки. Вельми бажаним було б відкриття токсинів з пероральною активністю, що їх продукує рід Photorhabdus. Виділення й застосування цих токсинів є бажаним завдяки їх ефективності. До відкриттів, що їх було здійснено заявниками, такі токсини не було виділено або охарактеризовано. Нативні токсини являють собою білкові комплекси, що їх продукують та секретують бактеріальні клітини роду Photorhabdus, які ростуть, та увагу привертають білки, що їх продукує вид Photorhabdus luminescens. Білкові комплекси з розміром молекул приблизно 1000кДа можуть бути поділені аналізом за допомогою електрофорезу у ПААГ-ДСН на численні складові білки. Ці токсини не містять гемолізіну, ліпази, фосфоліпази С або нуклеазних активностей. Вони виявляють значну токсичність при введенні ряду комах. Цей винахід забезпечує інсектицидний білок, що його може бути легко введено, а також експресію токсину у гетерологічній системі. Цей винахід забезпечує також спосіб доставляння інсектицидних токсинів, які є функціонально активними та ефективними проти багатьох рядів комах. Цілі, переваги й ознаки цього винаходу стануть очевидними з подальшого опису. Стислий опис малюнків Фіг.1 - ілюстрація збігу клонованих ізолятів ДНК, що використовуються як частина послідовності генів для токсину цього винаходу. Фіг.2 - карта трьох плазмид, що використовуються у процесі секвенування. Фіг.3 - карта, що ілюструє взаємовідношення кількох часткових фрагментів ДНК. Фіг.4 - ілюстрація аналізу гомології між білковими послідовностями білків TcbAii та ТсаВii. Фіг.5 - фенограма штамів Photorhabdus. Спорідненість штамів Photorhabdus визначали за до 5 помогою rep-PCR. Верхня частина Фіг.5 вимірює процентну схожість штамів на основі бальної оцінки продуктів rep-PCR (тобто, 0,0 [немає схожості] 1,0 [100% схожість]). На правій осі цифри й літери означають різні штами, які було випробувано; 14=W-14, Hm=Hm, Н9=Н9, 7=WX-7, 1=WX-1, 2=WX-2, 88=HP88, NC-1=NC-1, 4=WX-4, 9=WX-9, 8=WX-8, 10=WX-10, WIR=WIR, 3=WX-3, 11-WX-ll, 5=WX-5, 6=WX-6, 12=WX-12, xl4=WX-14, 15=WX15, Hb=Hb, B2=B2, 48-52=ATCC43948-ATCC43952. Вертикальні лінії, що поділяють горизонтальні лінії, вказують ступінь спорідненості (що його зчитують з перетинання, що екстраполюється, вертикальної лінії з верхньою віссю) між штамами або групами штамів при основі горизонтальних ліній (наприклад, штам W-14 приблизно на 60% є подібним до штаму Н9 і Нm). Фіг.6 - ілюстрація геномних карт штаму W-14. Цей винахід спрямовано на відкриття унікального класу інсектицидних білкових токсинів з виду Photorhabdus, що мають пероральну токсичність в відношенні до комах. Унікальною ознакою Photorhabdus є його біолюмінесценція. Photorhabdus може бути виділено з різноманітних джерел. Одним з таких джерел є нематоди, більш конкретно - нематоди виду Heterorhabditis. Інше подібне джерело виділено з клінічних проб з ран людини, [див. Farmer et al., 1989, J. Clin. Microbiol., 27pp., 1594-1600]. Ці сапрофітні штами депоновано в [American Type Culture Collection (Rockville, MD) ATCC №№43948, 43949, 43950, 43951 і 43952] та включено сюди як посилання. Можливо, що інші джерела могли б захоплювати бактерії Photorhabdus, які продукують інсектицидні токсини. Такі джерела в довкіллі могли б бути або такими, що живуть у землі чи на землі, або водними. Рід Photorhabdus таксономічно визначається як член родини Enterobacteriaceae, хоча він має деякі ознаки, атипові для цієї родини. Наприклад, штами цього виду не відновлюють нітрати, продукують жовтий та червоний пігмент та мають таку ознаку, як біолюмінесценція. Ця остання ознака не є відомою для інших членів родини Enterobacteriaceae. Photorhabdus тільки недавно було описано як вид, що відрізняється від Xenorhabdus [Boemare et al., 1993, Int. J. Syst. Bacteriol., 43, 249-255]. Ця диференціація заснована на дослідженнях гібридизації ДНК-ДНК, фенотипічних відмінностях (наприклад, наявності (Photorhabdus) або відсутності (Xenorhabdus) каталази та біолюмінесценції) та родині живителянематоди (Xenorhabdus; Steinernematode, Photorhabdus; Heterorhabditidae). Порівняльні аналізи жирних кислот у клітинах [Janse et al., 1990, Lett. Appl. Microbiol., 10, 131-135; Suzuki et al., 1990, J. Gen. Appl. Microbiol., 36, 393-401] підтверджують диференціацію Photorhabdus від Xenorhabdus. Щоб встановити, що колекція штамів, яку описано тут, складається з штамів Photorhabdus, ці штами характеризували на основі ознак, що їх можна впізнати, які визначають Photorhabdus та відрізняють його від інших Enterobacteriaceae і від видів Xenorhabdus [Farmer, 1984, Bergey's Manual of Systemic Bacteriology, vol.1, pp.510-511; Akhurst 82485 6 and Boemare, 1988, J. Gen. Microbiol., 134, pp.18351845; Boemare et al., 1993, Int. J. Syst. Bacteriol., 43, pp.249-255], що їх включено сюди як посилання). Було досліджено такі ознаки: грамнегативні палички, розмір організму, пігментація колоній, тіла включення, наявність каталази, спроможність відновлювати нітрати, біолюмінесценція, зростання на елективних середовищах, температура росту, виживання за анаеробних умов та рухливість. Аналіз жирних кислот використовували, щоб підтвердити те, що всі ці штами належать до одного роду Photorhabdus. Зараз бактеріальний рід Photorhabdus складається з єдиного визначеного виду, Photorhabdus luminescens [ATCC Type strain №29999, Poinar et al., 1977, Nematologica, 23, 97-102]. Численні споріднені штами було описано в літературі [наприклад, Akhurst et al., 1988, J. gen. Microbiol., 134, 1835-1845; Boemare et al., 1993, Int. J. Syst. Bacteriol., 43, pp.249-255; Putz et al., 1990, Appl. Environ. Microbiol., 56, 181-186]. Численні штами Photorhabdus було описано тут. Ці штами наведено в списку таблиці 18 у Прикладах. Оскільки зараз є тільки один вид (luminescens), який визначено у роді Photorhabdus, ознаки виду luminescens використали для характеристики штамів, що їх описано тут. Не можна не передбачити, що в майбутньому можуть бути виявлені інші види Photorhabdus, які матимуть деякі характерні ознаки виду luminescens, а також деякі властивості, що відрізняються, які зараз не визначено як ознаку Photorhabdus luminescens. Однак, обсяг цього винаходу охоплює будь-які види або штами Photorhabdus, що продукують білки, які мають функціональну активність як агенти боротьби з комахами, незалежно від інших ознак та відмітних властивостей. Крім того, як показано тут, бактерії роду Photorhabdus продукують білки, які мають функціональну активність, що її визначено тут. Особливий інтерес представляють білки, які продукує вид Photorhabdus luminescens. Цей винахід не повинен обмежуватися штамами, які описано в ньому. Ці штами ілюструють вперше, що білки, які продукують різноманітні ізоляти Photorhabdus, є токсичними при обробленні ними комах. Таким чином, до описаного тут винаходу належать штами, які заявлено тут, і будь-які їх мутанти, а також будь-які штами або види роду Photorhabdus, що мають описану тут функціональну активність. Тут використано кілька термінів, які мають визначене значення: Під "функціональною активністю" тут розуміють те, що білкові токсини діють як агенти боротьби з комахами, у тому значенні, що вони є активними перорально або виявляють токсичну дію чи здатні порушувати або погіршувати живлення, що може спричинювати або не спричинювати загибель комахи. При вступі комахи в контакт з ефективною кількістю токсину, що поставляється через експресію трансгенної рослини, через приготовані білкові композиції, білкові композиції, які розприскують, матрикс принади або іншу систему доставки, результатами, як правило, є загибель комахи, 7 або комахи не поїдають джерело, яке робить ці токсини доступними для комах. Термін "токсин Photorhabdus" означає будьякий білок, що його продукує штам мікроорганізму Photorhabdus, який має функціональну активність у відношенні до комах, причому токсин Photorhabdus може бути приготовано у вигляді композиції, що її розприскують, експресовано трансгенною рослиною, приготовано у вигляді матриксу принади, доставлятися за допомогою бакуловірусу або за допомогою будь-якого іншого прийнятного живителя або будь-якої іншої системи доставки. Білкові токсини, які обговорюються тут, як правило, називають "інсектицидами". Під інсектицидами тут розуміють те, що ці білкові токсини мають "функціональну активність", визначену тут раніше, та використовуються як агенти боротьби з комахами. Під терміном "олігонуклеотиди" розуміють макромолекулу, що складається з короткого ланцюга нуклеотидів або РНК, чи ДНК. Такою довжиною може бути, принаймні, один нуклеотид, але, як правило, довжина знаходиться у діапазоні від приблизно 10 до приблизно 12 нуклеотидів. Визначення довжини олігонуклеотиду є добре відомим для фахівців у цій галузі та не є обмеженням у цьому винаході. Таким чином, олігонуклеотиди можуть мати менше 10 або більше 12 нуклеотидів. Термін "токсичний" або "токсичність", як його застосовано тут, означає, що токсини, які продукує Photorhabdus, мають визначену тут "функціональну активність". Термін "генетичний матеріал", що використовується тут, стосується до генів, нуклеїнової кислоти, ДНК або РНК. Ферментаційні бульйони від вибраних штамів, які описано у Таблиці 18, використовували для визначення: широти продукування інсектицидних токсинів видом Photorhabdus, інсектицидного спектру цих токсинів, і для забезпечення вихідного матеріалу для очищення комплексів токсинів. Було показано, що штами, які охарактеризовано тут, мають пероральну токсичність для численних рядів комах. Такі ряди комах включають (але не обмежуються ними) Coleoptera, Homoptera, Lepidoptera, Diptera, Acarina, Hymenoptera та Dictyoptera. Як і у випадку інших бактеріальних токсинів, швидкість мутації бактерій у популяції спричинює утворення багатьох споріднених токсинів, які трохи відрізняються за їх послідовністю. Токсини, що описано тут, являють собою такі токсини, що утворюють білкові комплекси, токсичні для різних комах, які експонуються із ними, як це описано тут. Більш прийнятно, ці токсини є активними проти Lepidoptera, Coleoptera, Homoptera, Diptera, Hymenoptera, Dictyoptera та Acarina. Цей винахід стосується отримання білкових токсинів, гомологічних білковим токсинам, що їх продукують описані тут штами та будь-які утворені з них штами, а також будь-яких білкових токсинів, продукованих Photorhabdus. Ці гомологічні білки можуть відрізнятися за їх послідовністю, але вони не відрізняються за функцією від описаних тут токсинів. Ро 82485 8 зуміється, що гомологічні токсини включають білкові комплекси з розміром між 300кДа та 2000кДа і складаються, принаймні, з двох (2) субодиниць, причому субодиниця являє собою пептид, що може бути таким самим, як друга субодиниця, або відрізнятися від неї. Різноманітні білкові субодиниці були ідентифіковано та наведено в Прикладах цього винаходу. Як правило, субодиниці білка мають розмір між приблизно 18кДа та приблизно 230кДа; між приблизно 160кДа та приблизно 230кДа; 100кДа - 160кДа; приблизно 80кДа - приблизно 100кДа; і приблизно 50кДа - приблизно 80кДа. Як обговорювалось вище, деякі штам Photorhabdus може бути виділено з нематод. Деякі нематод, подовжені циліндричні паразитичні черв'яки типу Nematoda, розвинули здатність використовувати личинки комах як більш прийнятне середовища для росту. Личинки комах забезпечують джерело їжі для нематод, що ростуть, і середовище, де вони розмножуються. Драматичним ефектом після інвазії личинок деякими нематодами є загибель личинок. Смерть личинок зумовлена наявністю (у деяких нематодах) бактерій, що продукують інсектицидний токсин, який зупиняє зростання личинок та інгібує активність живлення. Цікаво, що, по-видимому, кожен рід паразитичних нематод з комахами є живителем певного виду бактерії, який є унікально пристосованим для симбіотичного росту з цією нематодою. Протягом часу, що минув з початку цього дослідження, назву бактеріального роду Xenorhabdus було змінено на Xenorhabdus та Photorhabdus. Бактерії роду Photorhabdus охарактеризовано як симбіонт нематод Heterorhabditis, тоді як види Xenorhabdus є симбіонтами видів Steinernema. Цю модифікацію в номенклатурі відображено у цій заявці, але модифікація в номенклатурі ніяк не змінює обсягу описаного тут винаходу. Пептиди та гени, які описано тут, називаються відповідно до основних вказівок, що їх опубліковано недавно в [Journal of Bacteriology "Instructions to Authors", p.i-xii (Jan. 1996)], які включено тут як посилання. Названі нижче пептиди й гени було виділено з штаму W-14 Photorhabdus. Номенклатура пептидів /генів комплексу токсинів (Тс) Назва пептиду Геномний tca ТсаА ТсаАiii ТсаВi TcaBii ТсаС Геномний tcb TcbA ТсbАі ТсbАіі ТсbАiii Геномний Назва гена Патентований SEQ ID № район tcaA tcaA tcaB tcaB tcaC 12 4 3 (19, 20) 5 2 tcbA tcbA tcbA tcbA 16 (пропептид) 1 (21, 22, 23, 24) 40 район район 9 tcc ТссА ТссВ Геномний tcd TcdAi TcdAii TcdAiii TcdB 82485 tccA tccB 8 7 tcdA tcdA tcdA tcdB (пропептид) 13, (38, 39, 17, 18) 41, (42, 43) 14 район (послідовність у дужках вказує внутрішню амінокислотну послідовність, яку одержано на основі продуктів розщеплення трипсином) Наведені вище послідовності згруповано на основі району геному. Ген tcbA експресували у Е. соїі у вигляді двох білкових фрагментів ТсbА та TcbAiii, як показано у Прикладах. Може бути вигідним мати протеолітичне розрізування деяких послідовностей для одержання більш високої активності токсинів для комерційних трансгенних прикладень. Токсини, що їх описано тут, є цілковито унікальними у тому розумінні, що ці токсини мають функціональну активність, яка є ключовою для розробляння стратегії боротьби з комахами. У розробці стратегії боротьби з комахами можна уповільнити чи обійти процес деградації білка шляхом введення білка безпосередньо у організм, обминаючи травний тракт. У такому разі білок, який введено в організм, буде зберігати його функцію до тих пір, поки він не денатурується, неспецифічно зруйнується чи його буде еліміновано імунною системою у вищих організмах. Ін'єкція у комах інсектицидного токсину має потенційне прикладення лише у лабораторії і, крім того, тільки у разі великих комах, які легко ін'єкувати. Спостереження, що інсектицидні білкові токсини, що їх описано тут, виявляють їх токсичну активність після проковтування через рот або контакту з токсинами, дозволяє розробити стратегію боротьби з комахами, яка ґрунтується лише на можливості включення цих білкових токсинів до раціону комах. Така стратегія веде до створення принад для комах. Токсини Photorhabdus можна вводити комахам у очищеному вигляді. Токсини можна також поставляти кількістю від приблизно 1 до приблизно 100мг/л бульйону. Кількість може змінюватись залежно від умов приготування, умов джерела інокуляту, способів виділення токсину тощо. Токсини можна вводити у вигляді білка секреції ексудату чи клітинного білка, який спочатку було експресовано у гетерологічному прокаріотичному чи еукаріотичному живителі. Живителями, у який експресуються білки, є, як правило, бактерії. Еукаріотичними живителями могли би бути (але не обмежуються ними) рослини, комахи й дріжджі. Альтернативно, ці токсини можуть продукуватись у бактеріях чи трансгенних рослинах у полі або комахах з використанням бакуловірусного вектора. Як правило, ці токсини вводять комасі шляхом включення одного чи кількох токсинів у їжу комах. Повна летальність щодо комах, які живляться, є застосовуваною, але не є потрібною для досягнення корисної токсичності. Якщо комахи уникають 10 токсину або припиняють живитись, це уникання їжі буде вигідним у деяких прикладеннях, навіть якщо ці ефекти є сублетальними. Наприклад, якщо бажаними є стійкі до комах трансгенні сільськогосподарські рослини, небажання комах живитись на цих рослинах так само цінно, як і летальна токсичність для цих комах, оскільки кінцевою метою є захист рослин, а не вбивання комахи. Існує багато інших шляхів того, як токсини може бути введено у їжу комахи. Наприклад, можна підробити джерело їжі личинок за допомогою токсичного білка шляхом обприскування їжі розчином білка, як це описано тут. Альтернативно, очищений білок можна ввести за допомогою генної інженерії у бактерію, нешкідливу у інших відношеннях, яка могла би потім рости у культурі і або наноситись на джерело їжі, або приміщуватись у грунт у тій зоні, де бажаним є винищення комах. Також можна було б ввести одержаний за допомогою генної інженерії білок безпосередньо у джерело їжі комахи. Наприклад, основним джерелом живлення багатьох личинок комах є рослинний матеріал. Внаслідок включення генетичного матеріалу, який кодує інсектицидні властивості токсинів Photorhabdus, до геному рослини, що його поїдає конкретна комаха-шкідник, доросла комаха або личинки гинуть після живлення цією рослиною. Численні члени однодольних та дводольних родів було трансформовано. Трансгенні агрономічні культури, а також фрукти й овочі, являють собою комерційний інтерес. Такі сільськогосподарські культури включають (але не обмежуються ними) кукурудзу, рис, сою, canola, соняшник, люцерну, сорго, пшеницю, бавовник, земляний горіх, томати, картоплю тощо. Існує декілька способів для введення чужорідного генетичного матеріалу у клітини рослин та для одержання рослин, що стабільно зберігають та експресують ген, який введено. Такі способи включають прискорення генетичного матеріалу, який нанесено на мікрочастки, для введення безпосередньо у клітини [U.S. Patents 4945050 to Cornell та 5141131 to Dow Elanco]. Рослини може бути трансформовано відповідно до технології з використанням Agrobacterium, [див. U.S. Patent 5177010 to University of Toledo, 5104310 to Texas A and M, European Patent Application 0131624B1, European Patent Applications 120516, 159418B1 та 176112 to Schilperoot, U.S. Patents 5149645, 5469976, 5464763 та 4940838 та 4693976 to Schilperoot, European Patent Applications 116718, 290799, 320500 to MaxPlanck, European Patent Applications 604662 and 627752 to Japan Tobacco, European Patent Applications 0267159 and 0292435, and U.S. Patent 5231019 to Ciba Geigy,U.S. Patents 5463174 та 4762785 to Calgene та U.S. Patents 5004863 і 5159135 to Agracetus]. Інші технології трансформацію включають "whiskers"-технологію, [див. U.S. Patents 5302523 та 5464765 to Zeneca]. Технологію електропорації також використовували для трансформації рослин, [див. WO 87/06614 to Boyce Thompson Institute, 5472869 та 5384253 to Dekalb, WO 9209696 і WO 9321335 to PGS]. Усі ці патенти й публікації щодо трансформації включено як посилання. Окрім численних технологій для транс 11 формації рослин, можна такою варіювати тип тканини, яку приводять до контакту з чужорідними генами. Така тканина може включати (але не обмежуватись ними) ембріогенну тканину, калусну тканину типів І та ІІ, гіпокотиль, меристему тощо. Майже усі тканини рослини може бути трансформовано під час дедиференціації з використанням відповідних способів, що відомі фахівцям у цій галузі. Іншою змінною є вибір маркера, що його селектують. Більш прийнятний конкретний маркер визначають за розсудом фахівця, але можна використовувати будь який з наведених далі маркерів, які селектують, разом з будь-яким іншим геном, який не названо тут, що він міг би функціонувати як маркер, який селектують. Такі маркери, які селектують, включають (але не обмежуються ними) ген аміноглікозилфосфотрансферази транспозону Tn5 (Aph II), який кодує стійкість до антибіотиків канаміцину, неоміцину та G418, а також гени, що кодують стійкість чи толерантність до гліфозату, гігроміцину, метотрексату, фосфінотрицину (біалофосу), імідазолінонів, сульфонілсечовин та триазопіримідинових гербіцидів, таких як хлорсульфон, бромоксиніл, далапон тощо. Крім маркера, який селектують, може бути бажаним використання репортерного гена. У деяких випадках репортерний ген може бути використано без маркера, який селектують. Репортерні гени являють собою гени, які, як правило, не є наявними чи не експресуються у організмі- або тканиніреципієнті. Репортерний ген часто кодує білок, що забезпечує якусь фенотипічну зміну чи ферментативну властивість. Приклади таких генів наведено у [K. Weising et al., Ann. Rev. Genetics, 22, 421 (1988)], що включено тут як посилання. Більш прийнятним репортерним геном є ген глюкуронідази (GUS). Незалежно від способу трансформації ген більш прийнятно включають до вектора переносу гена, який є пристосованим для експресії токсинів Photorhabdus у клітині рослини шляхом включення до цього вектору рослинного промотору. Крім промоторів рослин можна використовувати ефективно промотори з різноманітних джерел у клітинах рослин для експресування чужорідних генів. Наприклад, можна використовувати промотори бактеріального походження, такі як промотор октопінсинтази, промотор нопалінсинтази, промотор маннопінсинтази; промотори вірусного походження, такі як промотор вірусу тютюнової мозаїки (35S та 19S) тощо. Промотори рослин включають (але не обмежуються ними) промотор малої субодиниці (МС) рибулозо-1,6-бісфосфат(РБФ)карбоксилази, промотор бета-конгліциніну, промотор фазеоліну, промотор ADH, промотори теплового шоку та тканиноспецифічні промотори. Промотори можуть також містити деякі елементи енхансерної послідовності, які можуть покращувати ефективність транскрипції. Типові енхансери включають (але не обмежуються ними) Adh-інтрон І та Adh-інтрон 6. Може бути використано й конститутивні промотори. Конститутивні промотори регулюють неперервну експресію генів в усіх типах клітин та у будьякий час (наприклад, актину, убіквітину, CaMV 82485 12 35S). Тканиноспецифічні промотори відповідають за експресію генів у специфічних типах клітин чи тканин, таких як листя або насіння (наприклад, зеїну, олеозіну, напіну, АСР), і ці промотори можна також використовувати. Можна також застосовувати промотори, що є активними протягом певної стадії розвитку рослини, а також активними у тканинах рослин та їх органах. Прикладами таких промоторів є (але не обмежуються ними) специфічні для пилку, специфічні для ембріону, специфічні для кукурудзяного "шовку", специфічні для волокон бавовнику, специфічні для коріння, специфічні для ендосперму насіння промотори тощо. За певних обставин може бути бажаним застосування індукованого промотору. Індукований промотор відповідає за експресію генів у відповідь на специфічний сигнал, такий як: фізичний фактор (гени теплового шоку); світло (РБФ-карбоксилаза); гормон (Em); метаболіти й стрес. Можуть використовуватись інші бажані елементи транскрипції та трансляції. У цій галузі відомі численні специфічні для рослин вектори переносу генів. Крім того, відомо, що для одержання високої експресії бактеріальних генів у рослинах краще перебудувати бактеріальні гени таким чином, щоб вони більш ефективно експресувались у цитоплазмі рослин. Кукурудза є однією з таких рослин, для яких більш прийнятним є переконструювання бактеріального гена (генів) перед трансформацією для підвищення рівня експресії токсину у цій рослині. Однією з причин такої перебудови генної інженерії є низький вміст G+C нативного бактеріального гена (генів) (та подальше відхилення у бік високого вмісту А+Т). Це спричинює утворення послідовностей, що імітують або дублюють регуляторні послідовності генів рослин, які, як відомо, вельми багаті на А+Т. Наявність деякої кількості багатих на А+Т послідовностей у ДНК гена (генів), які вводять у рослини (наприклад, районів ТАТАбоксу, що у нормі є наявним у промоторах генів), може спричинювати аберантну транскрипцію цього гена (генів). З іншого боку, присутність інших регуляторних послідовностей, наявних у мРНK, що транскибується (наприклад, послідовностей сигналу поліаденілування (AAUAAA), або послідовностей, які є комплементарними до малих ядерних РНК, що беруть участь у сплайсінгу пре-мРНK), може спричинювати нестабільність РНК. Таким чином, однією з цілей у конструюванні бактеріального гена (генів), що його (їх) перебудовують, та який, більш прийнятно, називають оптимізованим для рослин геном (генами), є утворення послідовності ДНК, що має високий вміст G+C, та, більш прийнятно, послідовності, близької до послідовності генів рослин, які кодують метаболічні ферменти. Іншою метою побудови оптимізованого для рослини гена (генів) є утворення послідовності ДНК, яка не тільки має більш високий вміст G+C, але її має бути виготовлено, шляхом модифікації змін послідовності, таким чином, щоб не заважати трансляції. Прикладом рослини, що має високий вміст G+C, є кукурудза. Наведена нижче таблиця ілюструє, наскільки високим є вміст G+C у кукурудзі. 13 82485 Вважають, що, як і у кукурудзі, вміст G+C у інших рослинах є теж високим. Таблиця 1 Зведення вмісту G+C кодуючих білок районів генів кукурудзи Діапазон Середнє G+C, % G+Cb, % Метаболічні ферменти (40) 44.4-75.3 59.0 (8.0) Запасні білки Група І (23) 46.0-51.9 48.1 (1.3) Група ІІ (13) 60.4-74.3 67.5 (3.2) Група І+II (36) 46.0-74.3 55.1 (9.6)с Структурні білки (18) 48.6-70.5 63.6 (6.7) Регуляторні білки (5) 57.2-68.9 62.0 (4.9) Білки, які не охарактеризо41.5-70.3 64.3 (7.2) вано (9) Усі білки (108) 44.4-75.3 60.8 (5.2) Клас білкаа a У дужках наведено кількість генів у класі. У дужках наведено стандартне відхилення. c Середнє об'єднаних груп, що не враховується у розрахунках загального середнього. b Для даних у Таблиці 1 кодуючі райони генів вибирали з GenBank (Release 71), та склад основ розраховували, використовуючи програму MacVectorÔ (IBI, New Haven, CT). Послідовності нітронів не брали до уваги у цих розрахунках. Послідовності генів запасних білків груп І та ІІ розрізняли за помітною відмінністю у складі основ. Завдяки гнучкості, що її надавав надмір генетичного коду (тобто тим, що деякі амінокислоти кодуються більш ніж одним кодоном), еволюція геномів різних організмів або класів організмів спричинила диференційне використання надмірних кодонів. Це таксономічне "зміщення кодонів" відображено у середньому складі основ районів, що кодують білки. Наприклад, організми з відносно низьким вмістом G+C використовують кодони, що мають А чи Τ у третій позиції надмірних кодонів, тоді як кодони, що мають високий вміст G+C, використовують кодони, які мають G чи С у третій позиції. Припускають, що наявність "мінорних" кодонів у мРНK гена може зменшувати абсолютну швидкість трансляції цієї мРНK, особливо, коли відносний достаток заряджених тРНK, які відповідають мінорному кодону, є низьким. Продовженням цього є те, що зменшення швидкості трансляції окремими мінорними кодонами було би, принаймні, адитивно для численних мінорних кодонів. Таким чином, мРНK, що мають високий відносний вміст мінорних кодонів, матимуть, відповідно, більш низькі швидкості трансляції. Ця швидкість відбивається у синтезі низьких рівнів білка, що кодується. Для перебудови бактеріального гена (генів) визначають зміщення кодонів рослини. Зміщення кодонів являє собою статистичний розподіл кодонів, які рослина використовує для кодування її білків. Визначивши це зміщення, знаходять частоту 14 стрічання цих кодонів у гені (генах) що являє інтерес. Треба визначити первинні, більш прийнятні для рослини кодони, а також другий та третій вибір більш прийнятних кодонів. Амінокислотна послідовність білка, що представляє інтерес, зворотно транслюється таким чином, що одержана послідовність нуклеїнової кислоти кодує той самий білок, що й нативний бактеріальний ген, але ця отримана послідовність нуклеїнової кислоти відповідає першим більш прийнятним кодонам цільової рослини. Нову послідовність аналізують на сайти рестриктаз, які може бути створено шляхом цієї модифікації. Ідентифіковані сайти модифікують далі заміною кодонів більш прийнятними кодонами другого й третього вибору. Іншими сайтами у цій послідовності, що можуть впливати на транскрипцію чи трансляцію цільового гена, є місця з'єднання 5’ або 3’ екзон: інтрон, сигнали приєднання полі А чи сигнали термінації РНK-полімерази. Цю послідовність аналізують далі та модифікують, щоб зменшити частоту стрічання дуплетів ТА або GC. Крім цих дуплетів, блоки послідовностей з G або С, які мають більше приблизно 4 залишків, можуть впливати на транскрипцію цієї послідовності. Тому ці блоки також модифікують, заміняючи кодони першого чи другого вибору тощо наступним більш прийнятним кодоном вибору. Більш прийнятним є те, щоб оптимізований для рослин ген (гени) містив приблизно 63% кодонів першого вибору, приблизно 22% - приблизно 37% кодонів другого вибору та 15% - 0% кодонів третього вибору, причому загальний процент дорівнює 100%. Найбільш прийнятний оптимізований для рослин ген (гени) містить близько 63% кодонів першого вибору, принаймні, близько 22% кодонів другого вибору, близько 7,5% кодонів третього вибору та близько 7,5% кодонів четвертого вибору, причому загальний процент дорівнює 100%. Спосіб, який описано вище, дає змогу фахівцеві у цій галузі модифікувати ген (гени), чужорідні для конкретної рослини таким чином, що ці гени оптимально експресуються у рослинах. Спосіб ілюстровано додатково у попередній заявці, що очікує розглядання, [U.S. 60/005405, яку подано 13 жовтня 1995 року], що її включено сюди як посилання. Такий чином, для побудови оптимізованого для рослини гена (генів) амінокислотну послідовність токсинів зворотно транслюють (переводять) у послідовність ДНК, що використовує ненадмірний генетичний код, який визначено з таблиці зміщення кодонів, яку компільовано для ДНКпослідовності гена для конкретної трансформованої рослини. Одержану послідовність ДНК, яка є цілком гомогенною щодо використання кодонів, модифікують далі для утворення послідовності ДНК, яка, крім того, що має високий ступінь різноманіття кодонів, містить також стратегічно розташовані сайти впізнавання рестриктаз, бажаний склад основ та не містить послідовностей, які можуть перешкоджати транскрипції цього гена чи трансляції продукту мРНК. Теоретично припускається, що бактеріальні гени могуть легше експресуватись у рослинах, якщо ці бактеріальні гени експресуються у пластидах. Таким чином, можна експресувати бактеріа 15 льні гени у рослинах, не оптимізуючи ці гени для експресії рослинами, та одержувати високий рівень експресії білка [див. U.S. Patents №№4762785, 5451513 та 5545817, що їх включено тут як посилання]. Одним з результатів з точки зору комерційного використання трансгенних рослин є управління стійкістю. Це особливо стосується токсинів Bacillus thuringiensis. Існують численні компанії, що комерційно використовують Bacillus thuringiensis, та було чимало занепокоєння щодо токсинів Bt, які стають стійкими. Однією з стратегій для управління стійкістю до комах може бути комбінування токсинів, які продукує Photorhabdus, з токсинами, такими як Bt, вегетативними білками комах (Ciba Geigy) чи іншими токсинами. Такі комбінації можна було б готувати для використання шляхом розприскування або вони могли би бути молекулярними комбінаціями. Рослини можна трансформувати генами Photorhabdus, що продукують токсини комахи, та генами токсинів інших комах, таких як Bt. [В European Patent Application 0400246A1] описано трансформацію 2 генів Bt у рослину, причому ці 2 гени могли би бути будь-якими іншими двома генами. Інший спосіб отримання трансгенної рослини, що містить більше, ніж один ген стійкості до комах, міг би складатись з тримання двох рослин, кожна з яких має ген стійкості до комахи. Ці рослини можна було б піддати зворотному схрещуванню з використанням традиційного способі схрещування рослин для одержання рослини, що містить більше одного гена стійкості до комах. Крім одержання трансформованої рослини, яка має оптимізований для рослини ген (гени), існують інші системи доставляння для випадків, коли бажаною є перебудова бактеріального гена (генів). За тим самим типом генетично сконструйований білковий токсин, що легко виділяється, злитий разом з молекулою, яка атрагує комах, як джерело живлення та інсектицидної активності токсину, може бути генетично сконструйовано та експресовано у бактеріях або в еукаріотичних клітинах за допомогою стандартних, добре відомих способів. Після очищення у лабораторії такий токсичний агент з вбудованою "принадою" може бути упаковано у стандартних пастках для комах. Інша схема доставки являє собою включення генетичного матеріалу токсинів до бакуловірусного вектора. Бакуловіруси інфікують конкретних комахживителів, у тому числі тих, яких поражають токсини Photorhabdus. Інфекційний бакуловірус, що несе експресійну конструкцію для токсинів Photorhabdus, міг би вводитись у зони зараження комахами для інтоксикації чи отруєння інфікованих комах. Перенос інсектицидних властивостей вимагає, щоб послідовності нуклеїнових кислот, що кодують амінокислотні послідовності токсинів Photorhabdus, було інтегровано до вектора експресії білка, придатного для застосування у живителі, у якому цей вектор буде знаходитись. Одним з способів одержання послідовності нуклеїнової кислоти, що кодує білок з інсектицидними властивостями, є виділення нативного генетичного матеріалу, який продукує токсини Photorhabdus, з вико 82485 16 ристанням інформації, що її розшифровано з амінокислотної послідовності токсину, більші частки якої наведено нижче. Як описано нижче, наведено також способи очищення білків, що відповідають за активність токсину. Використовуючи дані про N-кінцеву амінокислотну послідовність, що їх наведено нижче, можна сконструювати олігонуклеотиди, комплементарні усім чи частині основ ДНК, які кодують перші амінокислоти токсину. Ці олігонуклеотиди можуть бути радіоактивно мічені та можуть використовуватись як молекулярні зонди для виділення генетичного матеріалу з геномної генетичної бібліотеки, яку побудовано з генетичного матеріалу, що його виділено з штамів Photorhabdus. Генетичну бібліотеку може бути клоновано у плазмидному, космидному, фаговому чи фагмидному векторах. Бібліотеку можна трансформувати у Escherichia coli та скринювати на утворення токсину трансформованими клітинами з використанням антитіл, які вироблено проти токсину, або прямими аналізами на токсичність по відношенню до комах. Цей підхід вимагає отримання набору олігонуклеотидів, оскільки вироджений генетичний код дає змогу кодувати одну амінокислоту у ДНК будьякої з кількох трьохнуклеотидних комбінацій. Наприклад, амінокислота аргінін може кодуватись триплетами CGA, CGC, CGG, CGT, AGA та AGG. Оскільки неможливо передбачити, який триплет використовується у цих позиціях у гені токсину, слід приготувати олігонуклеотиди з кожним потенційно характерним триплетом. Може виникнути потреба у більш, ніж одній молекулі ДНК, що відповідає субодиниці балка, для конструювання достатньої кількості олігонуклеотидних зондів для визначення усіх субодиниць білка, що необхідні для пероральної токсичності. На основі амінокислотної послідовності очищеного білка генетичні матеріали, які відповідають за продукування токсинів, може бути легко виділено та клоновано, повністю або частково, у експресуючий вектор з використання будь-якого з кількох способів, що добре відомі фахівцям у галузі молекулярної біології. Типовим експресуючим вектором є ДНК-плазмида, хоча передбачаються також і інші переносники, у тому числі (але не тільки), космиди, фагмиди й фаги. Крім ознак, потрібних чи бажаних для реплікації плазмид, таких як запал реплікації та стійкість до антибіотиків чи інша форма маркера, який селектують, наприклад, ген bar Streptomyces hydroscopicus або viridochromogenes, вектори експресії білка часто потребують додатково касети експресії, яка включає цис-діючі послідовності, необхідні для транскрипції і трансляції цільового гена. Цис-діючі послідовності, необхідні для експресії в прокаріотах, відрізняються від подібних елементів, що потрібні в еукаріотах та рослинах. Еукаріотична касета експресії вимагає наявності транскрипційного промотору проти ходу транскрипції (5’) відносно цільового гена, району термінації транскрипції, такого як сайт приєднання поліΑ, та місця зв'язування рибосом проти ходу транскрипції від першого кодону цільового гена. У бактеріальних клітинах застосовуваним транскрипцій 17 ним промотором, який можна було б включити до вектора, є промотор, що зв'язує РНK-полімеразу Т7. Як описано вище, промотори ефективно підсилюють транскрипцію мРНK. Також проти ходу транскрипції (зліва) від цільового гена вектор може мати нуклеотидну послідовність, що кодує сигнальну послідовність, яка, як відомо, направляє ковалентно зв'язаний з нею білок до конкретного компартменту клітин-живителів, такий як клітинна поверхня. Відомо, що віруси комах, або бакуловіруси, інфікують деяких комах та несприятливо діють на них. Дія цих вірусів на комах є повільною, та віруси не припиняють живлення комах. Тому віруси не вважаються такими, що можуть застосовуватись як агенти боротьби з комахами. Введення генів токсинів Photorhabdus у бакуловірусний вектор могло б стати ефективним засобом передавання токсинів з одночасним підвищенням летальності такого вірусу. Крім того, оскільки різні бакуловіруси є специфічними до різних комах, можна використовувати конкретний токсин для селективного націлювання на конкретних шкідників-комах. Особливо цінним вектором для генів токсинів є вірус ядерного поліедрозу. Вектори-переносники, що використовують цей вірус, було описано у літературі та зараз їх може бути вибрано як вектори для перенесення чужорідних генів у комах. Рекомбінант вірус-ген токсину може бути сконструйовано у формі, що передається перорально. Бакуловіруси часто інфікують комах через слизову оболонку середньої кишки. Ген токсину, що його вбудовано за сильним промотором білка оболонки вірусу, буде експресуватись та швидко вбивати інфіковану комаху. Крім вірусу комах або бакуловірусу чи системи доставки трансгенної рослини для білкових токсинів цього винаходу, ці білки може бути інкапсульовано, використовуючи технологію Bacillus Thuringiensis, таку як (але не тільки) [U.S. Patents №№4695455, 4695462, 4861595], які включено тут як посилання. Іншою системою доставки для білкових токсинів цього винаходу є введення цього білка у матрикс принади, яку можна було б потім використовувати у надземних та підземних ділянках пробування. Приклади такої технології наведено у (але не тільки) [PST Patent Application WO 93/23998], яку включено тут як посилання. Як описано вище, може бути необхідною модифікація послідовності, що кодує цільовий білок, при експресії її у ненативному живителі, оскільки прийнятність кодонів інших живителів може відрізнятись від прийнятності кодонів Photorhabdus. У такому разі трансляція може бути цілком неефективною у новому живителі, якщо не ввести компенсуючих модифікацій у кодуючу послідовність. Крім того, можуть бути бажаними модифікації амінокислотної послідовності, щоб уникнути інгібіторної перехресної реактивності з білками нового живителя, чи для вдосконалення інсектицидних властивостей білка у новому живителі. Генетично модифікований ген токсину може кодувати токсин, що виявляє, наприклад, підсилену чи послаблену токсичність, змінений розвиток стійкості до комах, 82485 18 змінену стабільність чи модифіковану специфічність щодо виду-мішені. Крім генів Photorhabdus, що кодують його токсини, обсяг цього винаходу включає споріднені послідовності нуклеїнових кислот, які кодують амінокислотні біополімери, гомологічні білкам токсинів, та які зберігають токсичну дію білків Photorhabdus у видах комах після перорального проковтування. Наприклад, токсини, що використовуються у цьому винаході, певно, спочатку інгібують живлення личинок перед настанням смерті. Шляхом маніпулювання послідовністю нуклеїнової кислоти токсинів Photorhabdus або її регуляторними послідовностями генні інженери, приміщуючи ген токсину у рослини, могли би модулювати його силу або спосіб дії, наприклад, для зберігання інгібуючої живлення активності з одночасним виключенням абсолютної токсичності для личинок. Ця зміна могла би дати змогу трансформованій рослині виживати до збирання врожаю, не справляючи необов'язкового драматичного впливу на екосистему внаслідок знищення усіх ком ах-мішеней. Передбачається, що усі подібні модифікації гена, що кодує токсин, або білка, що його кодує цей ген, входять до обсягу цього винаходу. Інші передбачені модифікації нуклеїнової кислоти включають приєднання направляючих послідовностей для направлення токсину у конкретні частини личинок комах для підсилення ефективності. Штами АТСС 55397, 43948, 43950, 43951, 43952 було депоновано у [American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852 USA]. Дані про амінокислотну послідовність та нуклеотидну послідовність для нативного токсину W-14 (АТСС 55397) наведено нижче. Виділення геномної ДНК для токсинів з бактеріальних живителен також наведено тут як приклад. У цій заявці використано й описано стандартні способи та способи молекулярної біології. Додаткову інформацію можна знайти у [Sambrook J., Fritsch, E.F., and Maniatis, Т. (1989), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press], яку включено тут як посилання. У Прикладах використано такі абревіатури: Трис= трис(гідроксиметил)амінометан; ДСН= додецилсульфат натрію; ЕДТК= етилендіамінтетраоцтова кислота; ІПТГ= ізопропилтіо-бета-галактозид; Х-гал= 5-бром-4-хлор-3-індоліл-бета-Dгалактозид; ЦТАБ= цетилтриметиламонійбромід; т.п.ο.= тисячі пар основ; dATP, dCTP, dGTP, dTTP, I= 2'дезоксинуклеозид-5'-трифосфати аденіну, цитозину, гуаніну, тиміну та інозин, відповідно; АТР= аденозин-5'-трифосфат. Приклад 1 Очищення токсину з Ρ. luminescens та демонстрація токсичності після пероральної доставки очищеного токсину Інсектицидний токсин цього винаходу очищували з штаму W-14 Р. luminescens, АТСС Accession №55397. Вихідні культури Р. 19 luminescens зберігали у чашках Петрі, що містили 2% Протеоза Пептон №3 (тобто РРЗ, Difco Laboratories, Detroit MI) у 1,5% агарі, інкубували при 25°С та пересіювали щотижня. Колонії первинної форми цих бактерій інокулювали у 200мл РРЗ-бульйону, доповненого 0,5% моностеаратом поліоксиетиленсорбітану (Твін 60, Sigma Chemical Company, St. Louis, MO), в однолітровій колбі. Бульйонні культури вирощували протягом 72 годин при 30°С на ротаційному шейкері. Білки токсину здобували з культур, які було вирощено у присутності чи відсутності Твіну; однак, відсутність Твіну може впливати на форму бактерій, що їх вирощують, та профіль білків, що їх продукують бактерії. При відсутності Твіну може мати місце варіантне зміщення, оскільки молекулярна маса принаймні одного ідентифікованого токсину зміщується від приблизно 200кДа до приблизно 185кДа. 72-годинні культури центрифугували при 10000´g протягом 30 хвилин для видалення клітин та залишків клітин (дебрісу). Фракцію супернатанту, що містить інсектицидну активність, зливали та доводили до 50мМ k2НРО4 шляхом додання підхожого об'єму 1,0Μ Κ2ΗΡΟ4. рН доводили до 8,6, додавши гідроксид калію. Потім цю фракцію супернатанту змішували з DEAE-Sephacel (Pharmacia LKB Biotechnology), який було врівноважено 50мМ k2НРО4. Токсична активність адсорбувалась на DEAE. Потім цю суміш виливали у колонку 2,6´40см та промивали 50мМ K2НРО4 при кімнатній температурі при швидкості потоку 340мл/год. до тих пір, поки ефлюєнт не досягав постійної базової лінії поглинання УФ при 280нм. Потім колонку промивали 150мМ RC1 до тих пір, поки ефлюєнт знову не досягав постійної базової лінії при 280нм. Нарешті, колонку промивали 300мМ KСI та збирали фракції. Фракції, що містять токсин, об'єднували та стерилізували, пропускаючи крізь стерилізуючий фільтр, яким був мембранний фільтр з порами 0,2 мікрон. Потім токсин концентрували й зрівноважували до 100мМ KРО4, рН6,9, застосовуючи ультрафільтраційну мембрану з відсіканням молекулярної маси 100кДа при 4°С (Centryprep 100, Amicon Division-W.R., Grace and Company). Пробу (3мл) концентрату токсину наносили на верхню частину гель-фільтраційної колонки (Pharmacia LKB Biotechnology). Елюуючим буфером був 100мМ KРO4, рН6,9, швидкість потоку 17мл/год., при 4°С. Ефлюєнт піддавали моніторингу при 280нм. Фракції збирали та тестували на токсичну активність. Токсичність хроматографічних фракцій випробували у біологічному тесті з використанням личинок Manduca sexta. Фракції або наносили на корм комахи (корм з зародків пшениці для шовкопряда непарного, ICN Biochemical Division - ICN Biomedicals, Inc.), або вводили внутрішньогемоцельною ін'єкцією проби 5 мкл через першу несправжню ніжку за допомогою голки калібру 30. Вагу кожної личинки у групі, що одержувала токсин, реєстрували з інтервалами 24 години. Токсичність припускалась, якщо комаха припиняла їсти та вмирала у межах кількох днів поїдання обробленого корму для комах, або якщо смерть наставала у межах 24 годин після ін'єкції фракції. 82485 20 Токсичні фракції об'єднували та концентрували за допомогою Centryprep-100 і потім аналізували за допомогою ВЕРХ з використанням гельфільтраційної колонки 7,5мМ´60см TSK-GEL G4000 SW з 100мМ фосфатом калію, рН6,9, швидкість потоку елюуючого буфера 0,4мл/хвил. Цей аналіз виявив, що білок токсину міститься у єдиному гострому піку, що його елюювали з колонки з часом утримування приблизно 33,6 хвилини. Цей час утримування відповідає молекулярній масі 1000кДа, яку було оцінено. Фракції піку збирали для подальшого очищення, а фракції, що не містили цього білка, викидали. Пік, що його елюювали з колонки ВЕРХ, поглинає УФ світло при 218 та 280нм, але не поглинає світло при 405нм. Було показано, що поглинання при 405нм є ознакою ксенорабдинових антибіотичних сполук. Електрофорез об'єднаних фракцій піку у неденатуруючому агарозному гелі (Metaphor Agarose, FMC BioProducts) показав, що у піку наявні два білкових комплекси. Матеріал піку, який було забуферено у 50мМ Трис-НСІ, рН7,0, розділяли на 1,5% агарозному концентруючому гелі, що його було забуферено 100мМ Трис-НСІ при рН7,0, та 1,9% агарозному розділяючому гелі, який було забуферено 200мМ Трис-борату при рН8,3, за стандартних буферних умов (анодний буфер 1Μ Трис-НСІ, рН8,3; катодний буфер 0,025Μ Трис, 0,192Μ гліцин). Електрофорез проводили при 13мА постійного струму при 15°С до тих пір, поки барвник-"свідок", феноловий червоний, не доходив кінця гелю. Дві білкові смуги візуалізували в агарозних гелях забарвленням Кумасі (Coomassi Brilliant blue). Смугу, що переміщувалась повільніше, називали "білковою полосою 1", а смугу, що переміщалась швидше, називали "білковою полосою 2". Дві білкові смуги були наявні приблизно у рівних кількостях. Забарвлені Кумасі агарозні гелі використовували як шаблон для точного вирізання двох білкових смуг з незабарвлених частин гелів. Вирізані ділянки, що містили ці білкові полоси, мацерували та додавали невелику кількість стерильної води. Для контролю також вирізали частину гелю, яка не містила білка, та обробляли її так само, як і ділянки гелю, що містили білок. Білок здобували з шматочків гелю за допомогою електрофорезу у 100мМ Трис-боратному буфері, рН8,3, при 100 вольтах (постійна напруга) протягом двох годин. Альтернативно, білок пасивно елюювали з шматочків гелю доданням рівного об'єму 50мМ Трис-НСІ, рН7,0 до шматочків гелю з подальшим інкубуванням при 30°С протягом 16 годин. Це дозволяло білку дифундувати з гелю до буфера, який потім збирали. Результати тестів токсичності для комах з використанням очищеного за допомогою ВЕРХ токсину (пік 33,6хвил.) та очищеного за допомогою агарозного гелю токсину продемонстрували токсичність цих екстрактів. Ін'єкція 1,5мкг ВЕРХочищеного білка вбиває у межах 24 годин. Обидві білкові смуги 1 та 2, здобуті з агарозних гелів пасивною елюцією або електроелюцією, були летальними при ін'єкції. Концентрація білка, визначена для цих проб була меншою за 50нг на личинку. Порівняння збільшення маси та смертності між 21 82485 групами личинок, які було ін'єктовано білковими смугами 1 та 2, показує, що білкова смуга 1 була більш токсичною при доставлянні шляхом ін'єкції. При нанесенні ВЕРХ-очищеного токсину на корм для личинок при концентрації 7,5мкг на личинку відбувалось припинення збільшення маси личинки (досліджували 24 личинки). Личинки починали живитись кормом, але після поїдання лише вельми малої частини корму, який було оброблено токсином, вони починали виявляти патологічні симптоми, що їх викликав токсин, та припиняли поїдати корм. Екскременти комах ставали безбарвними, та більшість личинок виявляла ознаки діареї. Значна смертність комах спостерігалась, коли кілька доз по 5мкг наносили на корм протягом періоду 7 - 10 днів. Одержана шляхом розділу на агарозі смуга 1 значно інгібувала збільшення маси личинок при дозі 200нг на личинку. Личинки, що отримували подібні концентрації білкової смуги 2 з кормом, не інгібувались та давали збільшення маси з тією самою швидкістю, що й контрольні личинки. Дванадцять личинок годували елюйованим білком та 45 личинок годували шматочками агарози, що містили білок. Ці два набори даних показують, що білкова смуга 1 була перорально токсичною для Manduca sexta. У цьому експерименті, напевно, білкова смуга 2 не була токсичною для Manduca sexta. Подальший аналіз білкових смуг 1 та 2 за допомогою електрофорезу у ППАГ-ДСН за денатуруючих умов показав, що кожна смуга складалась з кількох менших білкових субодиниць. Білки візуалізували забарвленням Кумасі з подальшим за 22 барвленням сріблом для досягнення максимальної чутливості. Білкові субодиниці у цих двох смугах були дуже схожими. Білкова смуга 1 містить 8 білкових субодиниць 25,1, 56,2, 60,8, 65,6, 166, 171, 184 та 208кДа. Білкова смуга 2 мала ідентичний профіль за винятком того, що не були наявними білки 25,1, 60,8 та 65,6кДа. Білки 56,2, 60,8, 65,6 та 184кДа були наявні у комплексі білкової смуги 1 у приблизно однакових концентраціях та складали 80% чи більше від загального вмісту білка цього комплексу. Нативний ВЕРХ-очищений токсин характеризували далі таким чином. Токсин був термолабільним, оскільки після нагрівання до 60°С протягом 15 хвилин він втрачав здатність вбивати чи інгібувати збільшення маси при ін'єкції або надання з кормом личинкам М. sexta. Було створено тести для виявлення ліпазної активності, активності фосфоліпази С, нуклеазної активності чи активності гемолізу еритроцитів, та їх проводили з очищеним токсином. Не було виявлено жодної з цих активностей. Проводили також тести антибіотичного зонального інгібування, та очищений токсин не інгібував ріст грамнегативних та грампозитивних бактерій, дріжджів або ниткоподібних грибів, а це свідчило про те, що він не є ксенорабдиновим антибіотиком. Нативний очищений ВЕРХ токсин тестували на здатність вбивати комах, інших ніж Manduca sexta. У Таблиці 2 наведено список комах, що їх вбивав очищений ВЕРХ токсин Ρ. luminescens у цьому дослідженні. Таблиця 2 Комахи, яких вбиває токсин P. Luminescens Звичайна назва Бражник "Борошняний черв'як" Фараонів мурашка Прусак Комар жовтогарячковий Ряд Lepidoptera Coleoptera Hymenoptera Dictyoptera Diptera Приклад 2 Застосовність як інсектициду Далі було охарактеризовано застосовність та токсичність Photorhabdus luminescens. Культуральний бульйон штаму W-14 Photorhabdus luminescens одержали у такий спосіб. Продукційним середовищем був 2% Bacto Proteose Peptone* Number 3 (PP3, Difco Laboratories, Detroit, Michigan) у деіонізованій Milli-Q* воді. Колби для культури для засівання, що містили 175мл середовища, приміщували у перегороджену на три частини по 500мл колбу з горлом Делонга, закривали Kaput та автоклавували протягом 20 хвилин при температурі 250°F (121,1°С). Продукційні колби містили 500мл у колбі на 2,8л, яку було перегороджено на три частини по 500мл, з горлом Делонга, закрито пробкою з кремнійорганічного пенопласту Shin-etsu. їх автоклавували протягом 45 хвилин при 250°F (121,1°С). Культуру для засіву Рід та вид Manduca sexta Tenebrio molitor Monomorium pharoanis Blatella germanica Aedes aegypti Спосіб доставки пероральний та ін'єкція пероральний пероральний пероральний та ін'єкція пероральний інкубували при 28°С при 150об./хвил. у термостаті, що обертався та струшував, з ексцентриситетом 2 дюйми. Після 16 годин росту 1% культури для засівання приміщували у продукційну колбу та давали їм рости протягом 24 годин до збирання. Продукування токсину відбувається, напевно, упродовж логарифмічної фази росту. Бульйон, що містив мікроби, переносили до центрифугової пляшки на 1л, та клітинну біомасу осаджували (30 хвилин при 2500об./хвил. при 4°С [R.C.F.=~1600] HG-4L Rotor RC3Sorval centrifuge, Dupont, Wilmington, Delaware). Первинний бульйон охолоджували при 4°С протягом 8 - 16 годин та повторно центрифугували принаймні протягом 2 годин (за умов, що описано вище) для подальшого освітлення бульйону шляхом вилучення можливого мукополісахариду, який осаджується при стоянні. (Альтернативний спосіб обробки об'єднував обидві ці стадії та включав використання 16-годинного 23 центрифугування для освітлення за описаних вище умов). Потім бульйон зберігали при 4°С до біотесту або фільтрування. Культуральний бульйон Photorhabdus та білковий токсин (токсини), які було очищено з цього бульйону, виявили активність (смертність та/або інгібування росту, зменшене вилуплення дорослих особин) щодо ряду комах. Більш конкретно, було виявлено активність проти блішки довговусої (личинок та дорослих особин), колорадського жука та газонних червоподібних личинок хрущика японського, що є членами ряду комах Coleoptera. Інші члени ряду Coleoptera включають дротяників, квітогриза рапсового, земляних блошек, жуків, що поїдають насіння, та жуків-довгоносиків. Також спостерігали активність проти цикадки айстр, що є членом ряду Homoptera. Інші члени Homoptera включають цикад, листоблішку грушеву, мідяницю яблуневу, червеців, білокрилок та spittle-жуків, а також численні специфічні у відношенні до живителя види тлі. Бульйон та очищені фракції є активними також проти совки малої, совки капустяної, совки іпсилон, совки тютюнової, точильника зернового, совки бавовняної та плодожерки яблуневої, що є членами ряду Lepidoptera. Іншими типовими членами цього ряду є справжня міль, вогнівка амбарна південна, метелики-листовійки, совка капустяна, совка бавовняна американська, мішечница поденкоподібна, коконопряд кільчастий американський, лучний метелик та совка трав'яна. Активність також спостерігалася проти плодової мушки звичайної та личинок комарів, що є членами ряду Diptera. Іншими членами ряду Diptera є галіця горохова, муха морквяна, муха капустяна весняна, муха ріпи, муха цибульна, довгоніг, муха кімнатна та різні види комарів. Активність спостерігали проти мурашки-деревоточця, мурашки аргентинського, які є членами ряду, що включає також мурашку Ріхтера, мурашку кімнатного та мурашок малих. Описані бульйон та фракція можуть застосовуватись для зменшення популяції комах та їх використовували у способі інгібування популяція комах. Спосіб може включати внесення до осередку комах ефективної кількості, яка інгібує комах, описаного активного начала. Результати наведено в таблиці 3. Активність проти личинок блішки довговусої тестували таким чином. Культуральний бульйон Photorhabdus (який було стерилізовано за допомогою стерилізуючого фільтру, безклітинний) або очищені за допомогою ВЕРХ фракції наносили безпосередньо на поверхню (~1,5см2) 0,25мл штучного корму у вигляді аліквот по 30мкл після розведення в контрольному середовищі або 10мМ фосфатному буфері, рН7.0, відповідно. Планшетам з кормом давали висохнути на повітрі у стерильному ламінарному боксі, та лунки заражали однією новонародженою Diabrotica undecimpunctata howardi (блішкою кукурудзяною довговусою (Південною), SCR), що вилупилася з поверхнево стерилізованого яйця), а личинки другої вікової стадії SCR росли на штучному кормі, або личинки другої вікової стадії Diabrotica virgifera virgifera (Western corn rootworm (блішки довговусої західної), WCR) 82485 24 вирощували на проростках кукурудзи, що росли в Metromix*. Личинки другої стадії зважували перед приміщенням на корм. Планшети герметизували, приміщували у зволожену камеру для вирощування та тримали при 27°С протягом підхожого періоду часу (4 дні для новонароджених та дорослих особин SCR, 2 - 5 днів для личинок WCR). Визначення смертності та маси оцінювали у балах, як зазначено. Як правило, в усіх дослідженнях використовували 16 комах на обробку. Смертність у контролях була такою: новонароджені личинки 1000кДа) та основний пік, що елюювався при середній мол. масі приблизно 860кДа. Протягом періоду одного тижня наступні проби, що їх піддавали гельфільтруванню, виявили поступову появу третього піку (приблизно 325кДа), який, напевно, виникав з основного піку, можливо, внаслідок обмеженого протеолізу. Біотести, які було проведено на цих трьох піках, показали, що пік вільного об'єму не 82485 36 мав активності, тоді як фракція 860кДа комплексу токсину була високоактивною, а пік 325кДа був менш активним, хоча й цілком активним. Аналіз піків комплексу токсину з різних ферментаційних процесів, отриманих з використанням Sepharose CL-4B, за допомогою електрофорезу в ПААГ-ДСН виявив два різних розподіла пептидів, які позначено як "Р" та "S". Ці два розподіли пептидів мали помітні відмінності в молекулярних масах та концентраціях пептидних компонентів в їх фракціях. Розподіл "S", який одержують частіше за все, мав 4 високомолекулярних пептиду (>150кДа), тоді як розподіл "Р" мав 3 високомолекулярних пептиду. Крім того, було виявлено, що пептидна фракція "S" має в 2 - 3 рази більшу активність проти точильника зернового. Це зміщення може бути пов'язане з модифікаціями в експресії білка, пов'язаними з віком інокуляту та/або з іншими факторами, що ґрунтуються на параметрах росту культур, які старіють. Кількість близько мг фракцій комплексу токсину, що їх визначено як розподіл пептидів "Р" або "S", піддавали препаративному електрофорезу в ПААГ-ДСН та транс-блотингу з Трис-гліцином (Seprabuff™ to PVDF membranes (ProBlott™, Applied Biosystems) протягом 3 - 4 годин. Блоти посилали для амінокислотного аналізу та Nкінцевого секвенування амінокислот до Harvard MicroChem та Cambridge ProChem, відповідно. Три пептиди в розподілі "S" мали унікальні N-кінцеві амінокислотні послідовності порівняно з послідовностями, що ідентифікувалися в попередньому прикладі. Пептид 201кДа (TcdAii), який наведено у вигляді SEQ ID №13 має 33% ідентичних амінокислот та 50% схожих амінокислот з SEQ ID №1 (TcbAii) (Таблиця 10, де вертикальні лінії означають амінокислотну ідентичність, а двокрапки вказують заміни консервативних амінокислот). Другий пептид 197кДа, SEQ ID №14 (TcdB), мав 42% ідентичність та 58% гомологію з SEQ ID №2 (ТсаС). Третій пептид 205кДа було позначено як TcdAii. Крім того, обмежена N-кінцева амінокислотна послідовність, SEQ ID №16 (TcbA), пептиду принаймні 235кДа була ідентичною в гомології з амінокислотною послідовністю SEQ ID №12, яку було розшифровано з клонованого гену (tcbA), SEQ ID №11, та яка містила розшифровану амінокислотну послідовність, що відповідала SEQ ID №1 (TcbAii). Це вказує на те, що більш великий пептид 235кДа протеолітично перетворювався на пептид 201кДа, (TcbAii), (SEQ ID №1) під час ферментації, можливо, спричинюючи активацію молекули. У випадку ще однієї послідовності, послідовності, яку спочатку було розкрито як SEQ ID №5 (ТсаВii) в Прикладі 5 вище, було виявлено, що вона містить залишок аспарагінової кислоти (Asp) у позиції 3, а не гліцин (Gly) та дві додаткові амінокислоти Gly та Asp в позиціях 8 та 9, відповідно. У випадку ще двох інших послідовностей, SEQ ID №2 (ТсаС) та SEQ ID №3 (ТсаВі), було одержано додаткові амінокислоти. Денситометричні визначення виконували, застосовуючи пробу, що була ідентичною препарату "S", який було відіслано на аналіз N-кінцевої послідовності. Цей аналіз показав, що пептиди 201кДа та 197кДа складають 7,0% та 7,2%, відпо 37 відно, загального білка в розподілі "S", що його забарвлюють Кумасі (Coomassie brilliant blue), та наявні в кількостях, подібних до інших пептидів, що утворюють більші кількості. Обговорюється, що ці пептиди можуть бути білковими гомологами, аналогічно до ситуації, виявленої для інших бактеріальних токсинів, таких як різноманітні токсини Gryl Bt. Ці білки дають варіації від 40% до 90% гомології у їх N-кінцевій амінокислотній послідовності, що включає їх токсичний фрагмент. Секвенування внутрішньої амінокислотної послідовності: Для полегшення клонування генів пептидів токсину внутрішні амінокислотні послідовності вибраних пептидів одержували так. Кількість близько кількох міліграмів фракцій піка 2А, що їх визначено як пептидні розподіли "Р" або "S", піддавали препаративному електрофорезу в ПААГ-ДСН та транс-блотингу з Трис-гліцином (Seprabuff™ на PVDF-мембранах (ProBlott™, Applied Biosystems) протягом 3 - 4 годин. Блоти посилали на амінокислотний аналіз та N-кінцеве секвенування амінокислот до Harvard MicroChem та Cambridge ProChem, відповідно. Три пептиди, які називають ТсbАii (що містить SEQ ID №1), TcdAii, та TcaBt (що містить SEQ ID №3), піддавали розщепленню трипсином в Harvard MicroChem з подальшою ВЕРХ для розділення індивідуальних пептидів. Аналіз N-кінцевих амінокислот виконували на вибраних пептидних фрагментах, отриманих при розщепленні трипсином. Два внутрішніх пептиду секвенували для пептиду TcaBi (пептиду 205кДа), які названо ТсаВі-РТlll (SEQ ID №17) та TcaBi-PT79 (SEQ ID №18). Два внутрішніх пептиду секвенували для пептиду TcaBi (пептиду 68кДа), які названо TcaBi-PT158 (SEQ ID №19) та ТсаВi-РТ108 (SEQ ID №20). Чотири внутрішніх пептиду секвенували для пептиду TcbAii (пептиду 201кДа), які названо ТсbАii-РТ103 (SEQ ID №21), ТсbАii-РТ56 (SEQ ID №22), TcbAii-PT81 (a) (SEQ ID №23) та TcbAii-PT81 (b) (SEQ ID №24). Приклад 8 Конструювання космидної бібліотеки геномної ДНК Photorhabdus luminescens W-14 та її скринінг для виділення генів, що кодують пептиди, які містяться в препараті токсичного білка Необхідною умовою для отримання токсичних для комах білків Photorhabdus в гетеро логічних живителях та для інших застосувань є виділення та характеристика генів, що кодують ці пептиди. 82485 38 Цим завданням займалися паралельно. Один підхід, який буде описано нижче, ґрунтується на використанні моноклональних та поліклональних антитіл, індукованих проти очищеного токсину, які потім використовували для виділення клонів з експресійної бібліотеки. Інший підхід, що його описано в цьому прикладі, ґрунтується на використанні даних про N-кінцеву та внутрішню амінокислотну послідовність для конструювання вироджених олігонуклеотидів для застосування їх в ПЦРампліфікації. Кожен спосіб можна використовувати для ідентифікація клонів ДНК, що містять кодуючі пептид гени, таким чином, щоб зробити можливим виділення відповідних генів та визначення послідовності основ їх ДНК. Виділення геномної ДНК: Штам W-14 Photorhabdus luminescens (ATCC accession number 55397) вирощували на 2% агарі Proteoso Pepton №3 (Difco Laboratories, Detroit, MI) та компетентність інсектицидного токсину підтримували шляхом біотестів, що повторювалися, після пасажу, за допомогою засобу, який описано в Прикладі 1 та вище. 50мл культури, що її струшували, одержували в колбах з перегородками на 175мл в середовищі з 2% Proteose Pepton №3, вирощування проводили при 28°С та 150об./хвил. протягом приблизно 24 годин. 15мл цієї культури осаджували та заморожували в її середовищі при 20°С до того часу, коли її розморожували для виділення ДНК. Культуру, яку було розморожено, центрифугували (700´g, 30хвил.) та оранжевий мукополісахаридний матеріал, що плавав, видаляли. Клітинний матеріал, що залишався, центрифугували (25000´g, 15хвил.) для осадження бактеріальних клітин та середовище видаляли й викидали. Геномну ДНК виділяли адаптацією способу ЦТАБ, який описано в розділі 2.4.1 Current Protocols in Molecular Biology [Ausubel et al., eds John Wiley and Sons, 1994], що модифікувався для включення в нього сольового шоку та із збільшенням всіх об'ємів в 10 разів. Осаджені бактеріальні клітини повторно суспендували в ТЕ-буфері (10мМ Трис-НСl, 1мМ ЕДТК, рН8,0) до кінцевого об'єму 10мл, потім додавали 12мл 5Μ NaCl; цю суміш центрифугували протягом 20 хвилин при 15000´g. Осад повторно суспендували в 5,7мл ТЕ та до суспензії додавали 300мл 10% ДСН та 60мл протехнази K 20мг/мл (Gibco BRL Products, Grand Island, NY; в стерильній дистильованій воді). Цю суміш інкубували при 37°С протягом 1 години; після цього додавали приблизно 10мг лізозиму (Worthington Biochemical Corp., Freehold, NJ). Ще за 45 хвилин додавали 1мл 5Μ NaCl та 800мл розчину ЦТАБ/NaCl (10% мас./об. ЦТАБ, 0,7Μ NaCl). Цей препарат інкубували 10 хвилин при 65°С, потім обережно перемішували та інкубували далі та перемішували протягом приблизно 20 хвилин для виведення клітинного матеріалу. Додавали рівний об'єм розчину хлороформ/ізоаміловий спирт (24:1, об./об.), обережно перемішували та центрифугували. Після двох екстракцій рівним об'ємом ФХІ (фенол/хлороформ/ізоаміловий спирт; 50:49:1, об/об/об, зрівноваження 1 Μ Трис-НСІ, рН8,0; Intermountain Scientific Corporation, Kaysville, UT), 39 ДНК осаджували 0,6 об'ємами ізопропанолу. Осад ДНК обережно видаляли скляною паличкою, промивали двічі 70% етанолом, сушили та розчиняли в 2мл СТЕ (10мМ Трис-НСІ, рН8,0, 10мМ NaCl, 1мМ ЕДТК). Цей препарат містив 2,5мг/мл ДНК, як визначено за оптичною густиною при 260нм (тобто OD260). Діапазон молекулярних розмірів виділеної геномної ДНК оцінювали на придатність для конструювання бібліотеки. CHEF-аналіз на гелі виконували в 1,5% агарозних (Seakem ® LE, FMS BioProducts, Rockland, ME) гелях з 0,5´ТБЕбуфером (44,5мМ Трис-НСІ, рН8,0, 44,5мМ Н3ВО3, 1мМ ЕДТК) на пристрої BioRad CHEF-DR 11 з Pulsewave 760 Switcher (BioRad Laboratories, Inc., Richmond, CA). Параметри переміщення в гелі: початковий А час, 3сек.; кінцевий А час, 12 сек.; 200 вольт; температура 4 - 18°С; час форезу, 16,5 годин. Забарвлення етидійбромидом та дослідження гелю під УФ світлом показали ДНК в діапазоні розмірів 30-250т.п.н. Конструювання бібліотеки: Частковий гідролізат Sau3A 1 було отримано з цього препарату геномної ДНК Photorhabdus. Спосіб ґрунтується на розділі 3.1.3 Ausubel (supra). Адаптації включали проведення реакцій меншого масштабу за різних умов до тих пор, доки не досягали майже оптимальних результатів. Проводили декілька широкомасштабних реакцій з різними умовами, результати аналізували в CHEF-гелях та вибирали тільки найкращий широкомасштабний спосіб проведення реакції. В такому оптимальному випадку 200мкг геномної ДНК Photorhabdus інкубували з 1,5 одиницями Sau3A I (New England Biolabs, "NEB", Beverly, MA) протягом 15 хвилин при 37°С в 2мл загального об'єму їх NEB 4-буферу (що поставляється у вигляді 10х виробником). Реакцію зупиняли доданням 2мл ФХІ та центрифугуванням при 8000´g протягом 10 хвилин. До супернатанту додавали 200мкл 5Μ NaCl та 6мл охолодженого на льоду етанолу. Цей препарат охолоджували протягом 30 хвилин при -20°С, після цього центрифугували при 12000´g протягом 15 хвилин. Супернатант видаляли та осад сушили у вакуумній сушильній шафі при 40°С, після цього повторно суспендували в 400мкл СТЕ. Спектрофотометричний аналіз показав приблизно 40% здобування введеної ДНК. Розщеплену ДНК фракціонували за розміром на сахарозному градієнті відповідно до розділу 5.3.2 СРМВ (цит. вище). Лінійний сахарозний градієнт 10% - 40% готували з пристроєм для приготування градієнтів у пробірках Ultra-Clear (Beckman Instruments, Inc., Palo Alto, CA) та пробу ДНК нашаровували на градієнт. Після центрифугування (26000об./хвил., 17 годин, ротор SW41 Beckman, 20°С) фракції (приблизно 750мкл) відтягували з верхньої частини градієнта та аналізували за допомогою електрофорезу в CHEF-гелі (як описано раніше). Фракції, що містять Sau3A 1-фрагменти в діапазоні розмірів 20 40т.п.н., відбирали та ДНК осаджували модифікацією (кількості усіх розчинів збільшували приблизно у 6,3 разів) способу в розділі 5.3.3 Ausubel (supra). Після осадження протягом ночі ДНК збирали центрифугуванням (17000´g, 15хвил.), суши 82485 40 ли, повторно розчиняли в ТЕ, об'єднували в кінцевий об'єм 80мкл та повторно осаджували доданням 8мкл 3Μ ацетату натрію та 220мкл етанолу. Осад, який було зібрано центрифугуванням, як описано вище, повторно суспендували в 12мкл ТЕ. Концентрацію ДНК визначали, застосовуючи флюорометрію з барвником Hoechst 33258 (Polysciences, Inc., Warrington, PA) у флуорометрі Hoefer TK 100 (Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, CA). Здобували приблизно 2,5мкг фракціонованої за розміром ДНК. Тридцять мкг ДНК космиди pWE15 (Stratagene, La Jolla, CA) розщепляли повністю з 100 одиницями рестриктази BamH I (NEB) в буфері виробника (кінцевий об'єм 200мкл, 37°С, 1 година). Реакційну суміш екстрагували 100мкл ФХІ та ДНК осаджували з водної фази доданням 20мкл 3Μ ацетату натрію та 550мкл охолодженого до 20°С абсолютного етанолу. Після 20 хвилин при -70°С ДНК збирали центрифугуванням (17000´g, 15 хвилин), сушили під вакуумом та розчиняли в 180мкл 10мМ Трис-НСI, рН8,0. До розчину додавали 20мкл 10х СІР-буферу (100мМ Трис-НСI, рН8,3, 10мМ ZnCl2, 10мМ MgCl2) та 1мкл (0,25 одиниць) розбавленої 1:4 лужної фосфатази кишечнику теляти (Boeringer Mannheim Corporation, Indianapolis, IN). Після 30 хвилин при 37°С робили такі додання: 2мкл 0,5Μ ЕДТК, рН8,0; 10мкл 10% ДСН; 0,5мкл 20мг/мл протеїнази K (як зазначено вище) з подальшим інкубуванням при 55°С протягом 30 хвилин. Після послідовних екстракцій 100мкл ФХІ та 100мкл фенолу (Intermountain Scientific Corporation), зрівноваженого 1Μ Трис-HCl, рН8,0, дефосфорильовану ДНК осаджували доданням 72мкл 7,5Μ ацетату амонію та 550мкл етанолу (20°С), інкубуванням на льоду протягом 30 хвилин та центрифугуванням, як описано вище. Осаджену ДНК промивали один раз 500мкл 70% етанолу (70°С), сушили під вакуумом та розчиняли в 20мкл ТЕ-буферу. Літування фракціонованих за розміром Sau3A 1-фрагментів з Ваш 1, що його розщеплено, та обробленим фосфатазою вектором pWE15 виконували з застосуванням лігази Т4 (NEB) шляхом модифікації (тобто з застосуванням попередньо змішаного 10х буферу для літування, що поставляється виробником) протоколу у розділі 3.3.3 Ausubel. Лігування проводили протягом ночі в загальному об'ємі 20мкл при 15°С, з подальшим зберіганням при -20°С. 4мкл реакційної суміші для лігування космидної ДНК, що містять приблизно 1мкг ДНК, упаковували в бактеріофаг лямбда з використанням комерційного екстракту для упаковки (Gigapack® III Gold Packaging Extract/Stratagene) відповідно до вказівок виробника. Препарат, який було упаковано, зберігали при 4°С до застосування. Препарат космиди, який було упаковано, використовували для інфікування клітин Escherichia coli XL1 Blue MR (Stratagene) відповідно до протоколів Gigapack III Gold ("Titering the Cosmid Library") так. Клітини XLI Blue MR вирощували в LB-середовищі (г/л: Бактотриптон, 10; Бакто-дріжджовий екстракт, 5; Бактоагар, 15; NaCl, 5; [Difco Laboratories, Detroit, MI]), що містить 0,2% (м/об) мальтозу плюс 10мМ MgSO4, 41 при 37°С. Після 5 годин зростання клітини осаджували при 700´g (15хвил.) та повторно суспендували в 6мл 10мМ MgSO4. Густину культури доводили до OD600=0,5 10мМ MgSO4. Космидну бібліотеку, яку було упаковано, розбавляли 1:10 або 1:20 стерильним SM-середовищем (0,1Μ NaCl, 10мМ MgSO4, 50мМ Трис-HCl, рН7,5, 0,01% (м/об) желатин) та 25мкл розбавленого препарату змішували з 25мкл розбавлених клітин XLI Blue MR. Суміш інкубували при 25°С протягом 30 хвилин (без качання), після цього додавали 200мкл LB-бульйону та інкубування продовжували протягом приблизно 1 години з рідким обережним струшуванням. Аліквоти (20 - 40мкл) цієї культури розподіляли по чашках з LB-агаром, що містили 100мг/л ампіциліну (тобто LB-Amp100) та інкубували протягом ночі при 37°С. Для зберігання бібліотеки без ампліфікації окремі колонії вискрібали та інокулювали в індивідуальні лунки стерильних 96-луночних мікротитраційних планшетів; кожна лунка містила 75мкл Terrific Broth (ТВ - середовища: 12г/л Бактотриптону, 24г/л Бакто-дріжджового екстракту, 0,4% (об/об) гліцерин, 17мМ KН2РО4, 72мМ K2НРО4) плюс 100мг/л ампіциліну (тобто TB-Amp100) та інкубували (без качання) протягом ночі при 37°С. Після реплікації 96-луночного планшета у планшет-копію до планшету додавали 75мкл/лунку стерилізованої за допомогою стерилізуючого фільтру суміші ТВ: гліцерин (1:1, об./об.; з 100мг/л ампіциліну або без нього), планшет качали недовго при 100об./хвил., 37°С та після цього закривали парафільмом (Parafilm®, American National Can, Greenwich, CT) та приміщували в холодильник при 70°С для зберігання. Планшети-копії вирощували та обробляли так само, як і основні планшети. Всього одержували 40 таких основних планшетів (та їх копії). Скринінг бібліотеки радіоактивно міченими зондами ДНК Для приготування фільтрів з колоніями для зондування радіоактивно міченими зондами 10 96луночних планшетів бібліотеки розморожували при 25°С (на столі при кімнатній температурі). Інструмент для способу відбитків (реплік) з 96 зубцями використовували для інокулювання свіжого 96-луночного планшета-копії, що містить 75мкл на лунку ТВ-Аmр100. Планшет-копію вирощували протягом ночі (стаціонарно) при 37°С, після цього качали приблизно 30 хвилин при 100об./хвил. при 37°С. Всього 800 колоній було представлено в цих планшетах-копіях, оскільки деякі ізоляти не росли. Інструмент для отримання реплік використовували для інокулювання дублікатних відбитків 96луночних рядів на нейлонові мембрани Magna NT (MSI, Westboro, MA) (0,45 мікрон, 220´250мм), які приміщували на тверді середовища LB-Amp100 (100мл/чашку) в пластикові чашки BioAssay (Nunc, 243´243´18мм; Curtin Mathison Scientific, Inc., Wood Dale, IL). Колонії вирощували на цих мембранах при 37°С протягом приблизно 3 годин. Колонію позитивного контролю (бактеріальний клон, що містив вставку послідовності GZ4, див. нижче) вирощували на окремій мембрані Magna NT (Nunc, 0,45 мікрон, 82мМ в діаметрі) на середовищі LB з доданням 35мг/л хлорамфеніколу 82485 42 (тобто LB-Cam45) та обробляли разом з мембранами з колоніями бібліотеки. Бактеріальні колонії на мембранах лізували та ДНК денатуровували та нейтралізували відповідно до протоколу, який було взято з версії 2,0 посібника для користувача Genius™ System (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Мембрани приміщували на фільтраційний папір, який було просочено 0,5н NaOH плюс 1,5Μ NaCl, на 15 хвилин для денатурації та нейтралізували на фільтраційному папері, який було просочено 1Μ Трис-НСІ, рН8,0, 1,5Μ NaCl, протягом 15 хвилин. Після УФ-зшивання з використанням Stratagene UV Stratalinker set on auto crosslink мембрани зберігали сухими при 25°С до використання. Мембрани нарізали на смужки, що містили точно відтворені відбитки одного 96луночного планшету, після цього промивали ретельно відповідно до способу розділу 6.4.1 в СРМВ (цит. раніше): 3 години при 25°С в 3x SSC, 0,1% (м/об) ДСН, після цього протягом 1 години при 65°С в тому самому розчині, після цього промивали в 2х SSC при підготуванні до стадії гібридизації (20х SSC=3M NaCl, 0,3Μ цитрат натрію, рН7,0). Ампліфікація специфічного геномного фрагменту гена tcaC На основі N-кінцевої амінокислотної послідовності, визначеної для очищеної пептидної фракції ТсаС (яку наведено тут у вигляді SEQ ID №2), синтезували пул вироджених олігонуклеотидів (пул S4Psh) у стандартний хімічний спосіб з використанням β-ціаноетилювання на синтезаторі ДНК/РНК Applied BioSystem AB1394 (Perkin Elmer, Foster City, CA). Захисні групи олігонуклеотидів видаляли протягом 8 годин при 55°С, після цього олігонуклеотиди розчиняли у воді, визначали їх кількість спектрофотометричним вимірюванням та розбавляли для використання. Цей пул відповідає визначеній N-кінцевій амінокислотній послідовності пептиду ТсаС. Визначену амінокислотну послідовність та відповідну вироджену послідовність ДНК подано нижче, де А, С, G та Τ являють собою стандартні основи ДНК, а I означає інозит: Синтезували інший набір вироджених олігонуклеотидів (пул P2.3.5R), який являв собою комплемент кодуючого ланцюга для визначеної амінокислотної послідовності SEQ ID №17: Ці олігонуклеотиди використовували як праймери в Полімеразних Ланцюгових Реакціях (PCR®, Roche Molecular Systems, Branchburg, NJ) для ампліфікації ДНК-фрагменту з геномної ДНК, яку було отримано з штаму W-14 Photorhabdus (див. вище). Типова реакція (50мкл) містила 125пмоль кожного пула праймерів P2Psh та P2.3.5R, 253нг геномної матричної ДНК, 10нмоль кожного з dATP, 43 dCTP, dGTP та dTTP, буфер ПЦР ІХ GeneAmp® та 2,5 одиниць ДНК-полімерази AmpliTaq® (Roche Molecular Systems; 10x GeneAmp® буфер містить 100мМ Трис-НСІ, рН8,3, 500мМ KСl, 0,01% м/об желатин). Ампліфікації проводили в Термоциклері для ДНК Perkin Elmer Cetus (Perkin Elmer, Foster City, CA) з використанням 35 циклів 94°С (1хвил.), 55°С (2хвил.), 72°С (3хвил.), з подальшим періодом подовження 7хвил. при 72°С. Продукти ампліфікації аналізували за допомогою електрофорезу на 2% (м/об) NuSieve® 3:1 агарозі (FMC BioProducts) у ТЕА-буфері (40мМ Трис-ацетат, 2мМ ЕДТК, рН8,0). Спостерігали специфічний продукт визначеного розміру 250п.н. серед численних інших продуктів ампліфікації при забарвленні зтидійбромідом (0,5мкг/мл) гелю та дослідженні під УФ-світлом. Зону гелю, що містила продукт приблизно 250п.н., вирізали та видаляли з неї невелику пробку (діаметр 0,5мм) і використовували для подавання матриці для ПЦР-ампліфікації (40 циклів). Реакційна суміш (50мкл) містила ті самі компоненти, що описано вище, але без геномної матричної ДНК. Після ампліфікації кінці фрагментів затупляли та фосфорилювали шляхом інкубування при 25°С протягом 20 хвилин з 1 одиницею ДНКполімерази Т4 (NEB), 1нмоль АТР та 2,15 одиницями кінази Т4 (Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ). Фрагменти ДНК відділяли від решти праймерів за допомогою електрофорезу на 1% (м/об) GTG® agarose (FMC) в TEA. Вирізали шматок гелю, що містив фрагменти з розміром 250п.н., та ДНК екстрагували, застосовуючи набір Qiaex (Qiagen Inc., Chatsworth, CA). Фрагменти ДНК, які було екстраговано, лігу вали з плазмидним вектором pBS KS(+) (Stratagene), який було розщеплено повністю рестриктазою Sma 1, та екстрагували у спосіб, подібний до описаного для ДНК рWЕ15 вище. Типова реакційна суміш для літування (16,3мкл) містила 100нг розщепленої ДНК pBS (+), 70нг фрагменту ДНК 250п.н., 1нмоль [Co(NH3)6]Cl3 та 3,9 одиниць Weiss ДНК-лігази Т4 (Collaborative Biomedical Products, Bedford, MA) в lХ буфері для літування (50мМ Трис-НСІ, рН7,4; 10мМ MgCl2; 10мМ дітіотреїтол; 1мМ спермідин, 1мМ АТР, 100мг/мл бичачого сироваткового альбуміну). Після інкубування протягом ночі при 14°С ліговані продукти трансформували в заморожені, компетентні клітини DH5α Escherichia coli (Gibco BRL) відповідно до рекомендацій виробника та висіювали на чашки з LB-Cam35, що містили ІПТГ (119мкг/мл) та Х-гал (50мкг/мл). Незалежні білі колонії вискрібали та плазмидну ДНК одержували у модифікаційний спосіб, застосовуючи лужний лізис/осадження ПЕГ (PRISM Ready Reaction DyeDeoxy™ Terminator Cycle Sequencing Kit Protocols; ABI/Perkin Elmer). Визначали нуклеотидну послідовність обох ланцюгів ДНК, яку було вставлено, застосовуючи праймери Т7 [основи 601 - 623 рВС KS (+): TAAAACGACGGCCAGTGAGCGCG) та LacZ праймери [основи 792 816 рВС KS(+): ATGACCATGATTACGCCAAGCGCGC) й протоколи, що поставляються з набором для секвенуван 82485 44 ня PRISM™ (ABI/Perkin Elmer). Комплекси барвник-термінуючі дідезоксирибонуклеотиди, які не було включено, видаляли шляхом пропускання через колонки Centry-Sep 100 (Princeton Separations, Inc., Adelphia, NJ) відповідно до інструкцій виробника. Послідовність ДНК одержували шляхом аналізу проб на ДНК-секвенаторі АВІ Model 373A (ABI/Perkin Elmer). Було виявлено, що послідовності ДНК двох ізолятів, GZ4 та НВ14, були такими, як показано на Фіг.1. Ця послідовність ілюструє такі ознаки: і) основи 1-20 представляють одну з 64 можливих послідовностей вироджених олігонуклеотидів S4Psh, іі) послідовність амінокислот 1 - 3 та 6 - 12 відповідає точно послідовності, визначеної для Nкінця ТсаС (яку представлено у вигляді SEQ ID №2), ііі) четверта амінокислота, що її кодують, скоріше є залишком цистеїну, ніж залишком серину; цю відмінність закодовано у виродженості для серинових кодонів (див. вище), iv) п'ята амінокислота, яку кодують, є проліном, що відповідає N-кінцевій послідовності ТсаС, яку представлено у вигляді SEQ ID №2, ν) основи 257 - 276 кодують одну з 192 можливих послідовностей, які було сконструйовано у виродженому пулі, vi) термінуючий кодон TGA, введений при основах 268 - 270, є результатом комплементарності виродженої частини, вбудованої в пул олігонуклеотидів у відповідній позиції, та не свідчить про скороченість рамки зчитування для відповідного гена. Мічення зонда, специфічного для гена пептиду ТсаС. Фрагменти ДНК, що відповідають наведеним вище 276 основам, було ампліфіковано (35 циклів) за допомогою ПЦР в реакційному об'ємі 100мкл з використанням 100пмоль кожного з праймерів P2Psh та P2.3.5R, 10нг плазмид GZ4 або НВ14 як матриць, 20нмоль кожного з dATP, dCTP, dGTP та dTTP, 5 одиниць ДНК-полімерази AmpliTaq® та буферу GeneAmp в концентрації їх за температурних режимів, які описано вище. Продукти ампліфікації екстрагували з 1% GTG-агарозного гелю з використанням набору Qiaex та визначали їх кількість за допомогою флюорометрії. Екстраговані продукти ампліфікації з плазмиди НВ14 як матриці (приблизно 400нг) ділили на п'ять аліквот та мітили 32P-dCTP з використанням суміші High Prime Labeling Mix (Boehringer Mannheim) відповідно до інструкцій виробника. Радіоізотопи, що виявились не включеними, видаляли шляхом пропускання через колонки для очищення зондів NucTrap (Stratagene) відповідно до інструкцій постачальника. Питому активність міченого ДНКпродукту визначали за допомогою сцинтиляційного лічильника, та вона дорівнювала 3,11´108 розпадів на хвилину на мкг. Цю мічену ДНК використовували для зондування мембран, які було приготовано з 800 членів геномної бібліотеки. Скринінг з зондом, специфічним для гена пептиду ТсаС. Радіоактивно мічений зонд НВ14 кип'ятили приблизно 10 хвилин, після цього додавали до 45 розчину "мінімальний гіб.". [Примітка: спосіб "мінімальний гіб." Взято з протоколу CERES; "Restriction Fragment Length Polymorphism Laboratory Manual version 4,0", розділи 4 - 40 та 4 47; CERES/NPI, Salt Lake City, Ut. Зараз NPI не функціонує, його наступники діють як Linkage Genetics]. Розчин "мінімальної гіб." містить 10% м/об. ПЕГ (поліетиленгліколь, мол. маса приблизно 8000), 7% м/об. ДСН; 0,6´SSC, 10мМ буфер з фосфатом натрію (з 1Μ вихідного розчину, що містить 95г/л NaH2PO4×1H2O та 84,5г/л NaH2PO4×7H2O), 5мМ ЕДТК та 100мг/мл денатурованої ДНК сперми лосося. Мембрани обсушували короткочасним промакуванням та після цього, без попередньої гібридизації, 5 смужок мембрани приміщували в кожний з 2 пластикових боксів, які містили 75мл розчину "мінімальної гіб." та 2,6нг/мл радіоактивно міченого зонда НВ14. Їх інкубували протягом ночі при повільному струшуванні (50об/хвил) при 60°С. Фільтри промивали три рази протягом приблизно 10хвил. (кожний) при 25°С в "промивному розчині мінімальної гіб." (0,25´SSC, 0,2% ДСН) з подальшими двома 30-хвилинними промиваннями з повільним струшуванням при 60°С в тому самому розчині. Фільтри приміщували на папір, покритий Saran Wrap® (Dow Brands, Indianapolis, IN) в світлонепроникній авторадіографічній касеті та експонували з рентгенівською плівкою X-Omat (Kodak, Rochester, NY) з двома підсилюючими екранами Du Pont Cronex LightningPlus Cl (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) протягом 4 годин при -70°С. При проявленні (стандартні процедури фотографії) значні сигнали було видно в обох копіях серед високого тла більш слабких, більш нерівномірних сигналів. Фільтри знову промивали протягом приблизно 4 годин при 68°С в "промивному розчині мінімальної гіб." і потім приміщували знов в ці касети та плівку експонували протягом ночі при -70°С. 12 можливих позитивних відбитків ідентифікували внаслідок сильних сигналів на обох дублікатах відбитків 96-луночних колоній. Сигнали не було виявлено з мембранами негативного контролю (колонії клітин XL1 Blue MR, що містили pWE15), та дуже сильний сигнал спостерігали з мембранами позитивного контролю (клітини DH5α, що містили ізолят GZ4 продукту ПЦР), які обробляли паралельно з експериментальними пробами. Дванадцять можливих гібридизаційнопозитивних колоній здобували з заморожених 96луночних планшетів з бібліотекою та вирощували протягом ночі при 37°С на твердому середовищі LB-Amp100. Потім їх приміщували на тверде середовище LB-Amp100 (3 на чашку плюс 3 негативних контролі: клітини XL1 Blue MR, що містять вектор pWE15). Два набору мембран (Magna NT nylon 0,45 мікрон) готували для гібридизації. Перший набір готували, приміщуючи фільтр безпосередньо на колонії на чашці з "петчами" ("осередками") та витягаючи його разом з бактеріальними клітинами, що поприлипали, з подальшою обробкою, як описано нижче. Фільтри другого набору приміщували на чашки, що містили середовище LB-Amp100, яку було інокульовано потім шляхом перенесення клітинами з чашок з "петчами" на фільтри. Після рос 82485 46 ту протягом ночі при 37°С фільтри видаляли з чашок та обробляли. Бактеріальні клітини на фільтрах лізували та ДНК денатуровували шляхом приміщення кожного фільтру (колоніями догори) на пул (калюжку) (1,0мл) 0,5н NaOH в пластиковій чашці на 3 хвилини. Фільтри обсушували промакуванням на паперовому рушнику, потім процес повторювали зі свіжим розчином 0,5н NaOH. Після промакування фільтри нейтралізували шляхом приміщення кожного на пул 1,0мл 1Μ Трис-НСІ, рН7,5, на три хвилини, промакували для обсушування та повторно нейтралізували свіжим буфером. Після цього проводили два подібних просочування (по 5 хвилин) на калюжках з 0,5Μ Трис-НСІ, рН7,5, плюс 1,5Μ NaCl. Після промакування для обсушування ДНК зшивали ультрафіолетом з фільтром (як описано вище) та фільтри промивали (25°C, 100об/хвил) приблизно в 100мл 3х SSC плюс 0,1% (м/об) ДСН (4 рази по 30 хвилин зі свіжим розчином для кожного промивання). Потім їх приміщували в мінімальний об'єм передгібридизаційного розчину [6х SSC плюс 1% (м/об) (кожний) Ficoll400 (Pharmacia), полівінілпіролідон (середня мол. маса 360000; Sigma) та бичачий сироватковий альбумін (фракція V) (Sigma)] протягом 2 годин при 65°С, 50об/хвил. Передгібризаційний розчин видаляли та замінювали 32Р-міченим зондом НВ14, що його було збережено з попередньої гібридизації мембран з бібліотекою та який денатуровували при 95°С протягом 5 хвилин. Гібридизацію проводили при 60°С протягом 16 годин з качанням при 50об/хвил. Після видалення розчину міченого зонда мембрани промивали 3 рази при 25°С (50об/хвил, 15 хвилин) в 3х SSC (приблизно по 150мл для кожного промивання). Потім їх промивали протягом 3 годин при 68°С (50об/хвил) в 0,25x SSC плюс 0,2% ДСН (промивний розчин мінімальної гіб.) та експонували на рентгенівській плівці, як описано вище, протягом 1,5 години при 25°С (без підсилюючих екранів). Це експонування виявило дуже сильні сигнали гібридизації з ізолятами космид 22G12, 25А10, 26А5 та 26В10 та дуже слабкий сигнал з ізолятом космиди 8В10. Не спостерігали сигналу з колоніями негативного контролю (pWE15), та дуже сильний сигнал спостерігали з мембранами позитивного контролю (клітини DH5α, що містять ізолят GZ4 продукту ПЛР), які обробляли паралельно з експериментальними пробами. Ампліфікація специфічного геномного фрагменту гена tcaB На основі N-кінцевої амінокислотної послідовності, яку було визначено для очищеної фракції пептиду ТсаВi (що її описано тут у вигляді SEQ ID №3), синтезували пул вироджених олігонуклеотидів (пул P8F), як описано для пептиду ТсаС. Визначену амінокислотну послідовність та відповідну вироджену послідовність ДНК наведено нижче, де А, С, G та Τ є стандартними основами ДНК, а I означає інозин: 47 Синтезували інший набір вироджених олігонуклеотидів (пул P8.108.3R), який являв собою комплемент кодуючого ланцюга для визначеної амінокислотної послідовності внутрішнього пептиду ТсаВi-РТ108 (яку описано тут як SEQ ID №20): Ці олігонуклеотиди використовували як праймери для ПЛР з застосуванням пробірок HotStart 50 Tubes (Molecular Bioproducts, Inc., San Diego, CA) для ампліфікації специфічного фрагменту ДНК з геномної ДНК, отриманої з штаму W-14 Photorhabdus (див. вище). Типова реакційна суміш (50мкл) містила (нижній шар) 25пмоль кожного пула праймерів, P8F та P8.108.3R з 2пмоль кожного з dATP, dCTP, dGTP та dTTP в буфері ПЛР 1х GeneAmp® та (верхній шар) 230нг геномної матричної ДНК, 8нмоль кожного з dATP, dCTP, dGTP та dTTP та 2,5 одиниць ДНК-полімерази AmpliTaq в буфері їх GeneAmp®. Ампліфікації проводили шляхом 35 циклів, як описано для пептиду ТсаС. Продукти ампліфікації аналізували за допомогою електрофорезу на 0,7% (м/об) SeaKem ®LE агарозі (FEM) в ТЕА-буфері. Спостерігали специфічний продукт з визначеним розміром 1600п.н. Чотири таких реакції об'єднували та ДНК, яку було ампліфіковано, екстрагували з 1,0% SeaKem LE гелю з використанням набору Qiaex, як описано для пептиду ТсаС. ДНК, яку було екстраговано, використовували безпосередньо у вигляді матриці для визначення послідовності (набір для секвенування PRISM ) з використанням пулів праймерів P8F та P8.108.3R. Кожна реакція містила приблизно 100нг матричної ДНК та 25пмоль одного з пулів праймерів та проводилася відповідно до стандартного протоколу, як описано для пептиду ТсаС. Аналіз послідовності, отриманої з подовження праймерів P8F, виявив коротку послідовність ДНК (та амінокислотну послідовність, яку кодують): яка відповідає частині N-кінцевої пептидної послідовності, описаної у вигляді SEQ ID №3 (ТсаВi). Мічення зонда, специфічного для гена пептиду ТсаВi Приблизно 50нг очищеного на гелі фрагменту ДНК TcaBi мітили 32Р-dCTP, як описано вище, та радіоізотопи, що не було включено, видаляли шляхом пропускання через колонку NICK (Pharmacia). Було визначено, що питома активність міченої ДНК дорівнювала 6´10 розпадів на хвилину на мкг. Цю мічену ДНК використовували для зондування мембран з колоніями, отриманими з членів геномної бібліотеки, які гібридизувались з зондом, специфічним для пептиду ТсаС. Мембрани, що містили ці 12 колоній, які було ідентифіковано в скринінгу бібліотеки ТсаС-зондом 82485 48 (див. вище), звільняли від радіоактивної, ТсаСспецифічної мітки шляхом кип'ятіння 2 рази по 30 хвилин в 1 літрі 0,1x SSC плюс 0,1% ДСН. Видалення радіоактивної мітки перевіряли з 6годинною експозицією плівки. Потім звільнені від мітки мембрани інкубували з отриманим, як описано вище, зондом, специфічним для пептиду TcaBi. Мічену ДНК денатуровували кип'ятінням протягом 10 хвилин та потім додавали до фільтрів, які після цього інкубували протягом 1 години в 100мл розчину "мінімального гіб." при 60°С. Після гібридизації протягом ночі при цій температурі розчин зонда видаляли та фільтри промивали так (всі в 0,3x SSC+0,1% ДСН): один раз протягом 5 хвилин при 25°С, один раз протягом 1 години при 60°С в свіжому розчині та один раз протягом 1 години в свіжому розчині. Після 1,5-годинної експозиції на рентгенівській плівці відповідно до стандартних процедур спостерігали 4 колонії, що сильно гібридизувалися. Це були, як і з зондом, специфічним для ТсаС, ізоляти 22G12, 25А10, 26А5 та 26В10. Той самий розчин зонда розбавляли рівним об'ємом (приблизно 100мл) розчину "мінімальний гіб." та потім використовували для скринінга мембран, що містять 800 членів геномної бібліотеки. Після гібридизації, промивання та експозиції з рентгенівською плівкою, як описано вище, було виявлено, що тільки чотири космидних клони 22G12, 25А10, 26А5 та 26В10 сильно гібридизувались з цим зондом. Виділення субклонів. що містять гени, які кодують пептиди ТсаС та ТсаВі. та визначення послідовності основ їх ДНК: Три гібридизаційно-позитивні космиди в штамі XLI Blue MR вирощували з качанням протягом ночі (200об./хвил.) при 30°С в 100мл середовища ТВАmр100. Після збирання клітин центрифугуванням, космидну ДНК одержували за допомогою комерційно доступного набору (BIGprepÔ, 5 Prime 3 Prime, Inc., Boulder, CO) відповідно до протоколів виробника. Тільки одну космиду, 26А5, було виділено успішно у цей спосіб. При розщепленні рестриктазою EcoR 1 (NEB) та аналізі за допомогою гель-електрофорезу було виявлено фрагменти з приблизними розмірами 14, 10, 8 (вектор), 5. 3,3, 2,9 та 1,5т.п.н. В другій спробі виділити космидну ДНК з тих самих трьох штамів (культура в 8мл; ТВАтр100, 30°С) використовували miniprep-спосіб з кип'ятінням [Evans G. And G. Wahl., 1987, "Cosmid vectors for genomic walking and rapid restriction mapping" in Guide to Molecular Cloning Techniques Meth. Enzvmology, vol.152, S. Berger and Kimmel, eds., pgs. 604-610]. У цей спосіб успішно виділили лише одну космиду. При розщепленні рестриктазою EcoR 1 та аналізі за допомогою гель - електрофорезу ця космида виявила розподіл фрагментів, що є ідентичним розподілу, який було виявлено з космидою 26А5. 0,15мкг проби ДНК космиди 26А5 використовували для трансформації 50мл клітин DH5α Ε. Coli (Gibco BRL) відповідно до протоколів виробника. Ізолят однієї колонії цього штаму інокулювали в 4мл середовища TB-Amp100 та вирощували протягом 8 годин при 37°С. Додавали хлорамфенікол аж до кінцевої концентрації 225мкг/мл, інкуба 49 цію продовжували ще протягом 24 годин, потім клітини збирали центрифугуванням та заморожували при -20°С. ДНК космиди 26А5 виділяли шляхом стандартного лужного лізису (miniprep) [Maniatis et al., цит. вище, p.382] з модифікацією, що полягає в збільшенні всіх об'ємів на 50%, та з перемішуванням або обережним змішуванням, а не за допомогою вортексу, на кожній стадії. Після промивання осаду ДНК в 70% етанолі її розчиняли в ТЕ, що містив 25мкг/мл рибонуклеази A (Boehringer Mannheim). Ідентифікація фрагментів EcoR 1. що гібридизуються з отриманими з GZ4 та TcaBi-зондів. Приблизно 0,4мкг космиди 25А10 (з клітин XL1 Blue MR) та приблизно 0,5мкг космиди 26А5 (з ампліфікованих з хлорамфеніколом клітин DH5α) розщепляли окремо приблизно з 15 одиницями EcoR I (NEB) протягом 85 хвилин, заморожували протягом ночі, потім нагрівали при 65°С протягом 5 хвилин та піддавали електрофорезу в 0,7% агарозному гелі (Seakem ® LE, 1х TEA, 80 вольт, 90 хвилин). ДНК забарвлювали етилійбромідом, як описано вище, та фотографували під УФ-світлом. За цих умов продукт розщеплення EcoR 1 космиди 25А10 було розщеплено повністю, але пробу космиди 26А5 було лише частково розщеплено. Агарозні гелі, що містили фрагменти ДНК, піддавали депуринізації, денатурації та нейтралізації з подальшим блотингом за Саузерном на нейлоновій мембрані Magna NT з використанням протоколу з високою концентрацією солі (20х SSC), всі ці засоби описано [в розділі 2.9 Ausubel et al. (CPMB, цит. вище)]. Потім перенесену ДНК зшивали УФсвітлом з нейлоновою мембраною, як описано раніше. Фрагмент ДНК, специфічний для пептиду ТсаС, який відповідав вставці плазмидного ізоляту GZ4, ампліфікували за допомогою ПЛР в реакційному об'ємі 100мл, як описано вище. Продукти ампліфікації з трьох таких реакцій об'єднували та екстрагували з 1% GTG®-агарозного гелю з використанням набору Qiaex, як описано вище, та кількісно визначали за допомогою флуориметрії. Очищену на гелі ДНК (100нг) мітили 32P-dCTP з використанням суміші для мічення High Prime Labeling Mix (Boehringer Mannheim), як описано вище, аж до питомої активності 6,34´108 розпадів на хвилину на мкг. 32 Р-мічений зонд GZ4 кип'ятили 10 хвилин, потім додавали до буферу "мінімальний гіб." (при 1нг/мл), додавали мембрану з блотом за Саузерном, що містила розщеплені фрагменти ДНК космиди, та інкубували протягом 4 годин при 60°С з обережним струшуванням при 50об./хвил. Потім мембрану промивали 3 рази при 25°С протягом приблизно 5 хвилин в кожному випадку (промивним розчином "мінімальної гіб. "), з подальшими двома промиваннями протягом 20 хвилин (кожен) при 60°С. Блот експонували на плівці (з підсилюючими екранами) протягом приблизно 30хвил. при 70°С. Зонд GZ4 сильно гібридизувався з фрагментом EcoR 1 5,0т.п.н. (видимий розмір) обох плазмид, 26А5 та 25А10. Мембрану визволяли від радіоактивності кип'ятінням протягом 30 хвилин в 0,1x SSC+0,1% 82485 50 ДСН та відсутність радіоактивної мітки перевіряли експозицією на плівці. Потім її гібридизували при 60°С протягом 3,5 годин з денатурованим зондом ТсаВі в буфері "мінімальної гіб.", що використовувався раніше для скринінгу мембран з колоніями (див. вище), промивали, як описано раніше, та експонували на плівці протягом 40 хвилин при 70°С з двома підсилюючими екранами. У випадку обох плазмид, зонд TcaBi гібридизувався слабко з фрагментом EcoR 1 5,0т.п.н. та сильно з фрагментом приблизно 2,9т.п.н. Пробу ДНК космиди 26А5, яку було описано раніше, (з клітин DH5α) використовували як джерело ДНК, з якого субклонували цільові смуги. Цю ДНК (2,5мкг) переварювали з приблизно 3 одиницями EcoR 1 (NEB) в загальному об'ємі 30мкл протягом 1,5 годин з отриманням продукту часткового розщеплення, що було підтверджено гельелектрофорезом. Десять мкг ДНК рВС KS (+) (Stratagene) розщепляли протягом 1,5 годин з 20 одиницями EcoR 1 в загальному об'ємі 20 мкл, що спричинювало повне розщеплення, як було підтверджено електрофорезом. Обидва препарати розрізаної EcoR 1 ДНК розбавляли до 50мкл водою, до кожного додавали рівний об'єм ФХІ, суспензію обережно змішували, відкручували у мікроцентрифузі та водний супернатант збирали. ДНК осаджували 150мкл етанолу та суміш приміщували при -20°С на ніч. Після центрифугування та висушування розщеплену EcoR 1 плазмиду pBS KS (+) розчиняли в 100мкл ТЕ; частково розщеплену 26А5 розчиняли в 20мкл ТЕ. Здобування ДНК контролювали флуориметрією. В окремих реакціях приблизно 60нг ДНК pBS KS (+), розщепленої EcoR 1, лігували приблизно з 180нг або 270нг частково розщепленою ДНК космиди 26А5. Літування проводили в об'ємі 20мкл при 15°С протягом 5 годин з використанням лігази Т4 та буферу з New England BioLabs. Суміш для літування, розбавлену до 100мкл стерильним ТЕ, використовували для трансформації заморожених, компетентних клітин DH5α Ε. Coli (Gibco BRL) відповідно до інструкцій виробника. Різноманітні кількості (25 - 200мкл) клітин, що їх було трансформовано, висіювали на свіжоприготовлене тверде середовище LB-Cam 35 з 1мМ ІПГТ та 5мг/л Х-гал. Чашки інкубували при 37°С протягом 20 годин, потім охолоджували в темряві протягом приблизно 3 годин для підсилення забарвлення для відбирання інсертів. Білі колонії вискрібали та переносили на чашки з "петчами" того самого складу та інкубували протягом ночі при 37°С. Два "ліфти" колоній кожної з вибраних "петч"чашок готували так. Після перенесення білих колоній на свіжі чашки круглі нейлонові мембрани Magna NT притискали на "петч"-чашки, мембрану піднімали та піддавали денатурації, нейтралізації та зшиванню під впливом УФ, як описане вище для мембран з колоніями бібліотеки. Піддані зшиванню "ліфти" колоній інтенсивно промивали, обережно змиваючи надлишок залишків клітин тканиною. Набір гібридизували з розчином зонда GZ4 (ТсаС), описаного раніше, а інший набір гібридизували з розчином зонда ТсаВ±, який було описано вище, відповідно до протоколу "мінімальної гіб.", з 51 подальшим промиванням та експозицією на плівці, як описано для мембран з колоніями бібліотеки. Колонії, що виявляли сигнали гібридизації, або тільки з зондом GZ4, з обома зондами GZ4 та ТсаВі, або тільки з зондом ТсаВi, відбирали для подальшої роботи та клітини висіювали штрихом для виділення окремої колонії на середовища LBCam 35 з ІПТГ та Х-гал, як описано раніше. Приблизно 35 окремих колоній, з 16 ізолятів, переносили до рідких середовищ LB-Cam 35 та вирощували протягом ночі при 37°С; клітини збирали центрифугуванням та плазмидну ДНК виділяли за допомогою стандартного лужного лізису (miniprep) відповідно до Maniatis et al. (цит. вище, p.368). Осади ДНК розчиняли в ТЕ+25мкг/мл рибонуклеази А та концентрацію ДНК визначали флуориметрією. Розподіл продуктів розщеплення EcoR 1 аналізували гель-електрофорезом. Наступні ізоляти здобували у звичайний спосіб. Ізолят А17.2 містить тільки повторно ліговану рВС KS (+) та його використовували для (негативного) контролю. Ізоляти D38,3 та С44,1 (кожний) містять лише 2,9т.п.н., фрагмент EcoR 1, що гібридизується з ТсаВі, який вбудовано в рВС KS (+). Ці плазмиди, які названо pDAB2000 та pDAB2001, відповідно, показано на Фіг.2. Ізолят А35,3 містить лише приблизно 5 т.п.н., фрагмент EcoR 1, що гібридизується з GZ4, який вбудовано в рВС KS (+). Цю плазмиду назвали pDAB2002 (також Фіг.2). Ці ізоляти забезпечили матриці для секвенування ДНК. Плазмиди pDAB2000 та pDAB2001 одержували з використанням набору BIGprepÔ, як описано вище. Культури (30мл) вирощували протягом ночі в середовищі ТВ-Саm35 аж до OD6002, потім плазмиду виділяли відповідно до інструкцій виробника. Осад ДНК перерозчиняли в 100мкл ТЕ (кожну) та цілісність проб перевіряли розщепленням EcoR 1 та аналізом за допомогою гель-електрофорезу. Реакції секвенування проводили в двох повторностях, з однією реплікою, що використовує як матрицю ДНК pDAB2000, та з іншою реплікою, що використовує як матрицю ДНК pDAB2001. Реакції проводили, застосовуючи спосіб циклічного секвенування з комплексом дідезокси-барвник як термінатором, який описано вище для секвенування ДНК GZ4/HB14. Початкові раунди секвенування використовували як праймери праймери LacZ та Т7, описані вище, плюс праймери, основані на визначеній послідовності ПЛР-ампліфікованого продукту ТсаВі Після аналізу первинної структури та підготовки кожного секвенуючого продукту, кожен укорочували до 250-350 основ, залежно від повноти хроматографічних даних, що інтерпретувалися програмним забезпеченням Perkin Elmer Applied Biosystems Division SeqEd675. Подальші "стадії" секвенування виконували шляхом вибору підхожої послідовності для нових праймерів. За невеликими винятками, праймери (синтезовані, як описано вище) мали довжину 24 основи зі складом, що мав 50% G+C. Секвенування у цей спосіб проводили 82485 52 на обох ланцюгах фрагменту EcoR 1 з величиною приблизно 2,9т.п.н. Для подальшого використання як матриці для секвенування ДНК одержували плазмидну ДНК з ізоляту pDAB2002, використовуючи набір BIGprep. Реакції секвенування проводили та аналізували, як описано вище. Спочатку праймер ТЗ (основи 774-796 рВС KS (+): CGCGCAATTAACCCTCACTAAAG) та праймер Т7 (основи 621-643 рВС KS (+): GCGCGTAATACGACTCACTATAG) використовували для праймування реакцій секвенування з фланкуючих вектор послідовностей зі зчитуванням у вставлення ДНК. Інший набір праймерів LW1-204: GGGAAGTGACAGCGTTGTAATCGATAC) застосовували для праймування с внутрішніх послідовностей, які визначали попередньо шляхом секвенування з використанням вироджених олігонуклеотидів субклонованих ПЛР-продуктів пептиду ТсаС. На основі даних, отриманих під час початкових раундів секвенування, конструювали нові набори праймерів та використовували їх для "прогулянки" по всій довжині фрагменту ~5т.п.н. Всього використовували 55 оліго-праймерів, що дозволило ідентифікувати в цілому 4832п.н. неперервної послідовності. При об'єднанні послідовності ДНК інсерту фрагменту EcoR 1 pDAB2002 з частиною визначеної послідовності ізолятів pDAB2000/pDAB2001 одержували спільну послідовність суміжних нуклеотидів довжиною 6005п.н. (яку наведено тут у вигляді SEQ ID №25). При трансляції довгих відкритих рамок зчитування у відповідні амінокислоти ця послідовність ясно виявляє N-кінцевий пептид (який описано у вигляді SEQ ID №3), що його кодують основами 19-75, безпосередньо після залишку метіоніну (стартова точка трансляції). Далі по ходу транскрипції, в тій самій рамці зчитування, при основах 1738 - 1773 знаходиться послідовність, що кодує внутрішній пептид ТсаВі-РТ108 (який описано у вигляді SEQ ID №20). Також в тій самій рамці зчитування, при основах 1897-1923, кодується N-кінцевий пептид ТсаВі (який описано тут у вигляді SEQ ID №5) та рамка зчитування продовжується без переривання до кодона термінації транскрипції при нуклеотидах 3586 - 3588. Відсутність всередині рамки зчитування стопкодону між кінцем послідовності, що кодує ТсаВіРТ108, та початком кодуючого району ТсаВ1 та відсутність помітного сайту зв'язування рибосом безпосередньо проти ходу транскрипції від кодуючого району TcaBіі вказує на те, що пептиди TcaBіі та TcaBі кодуються однією відкритою рамкою зчитування з 3567п.н., що починається при парі основ 16 в SEQ ID №25, та найбільш ймовірно, вони утворюються з єдиного первинного продукту гена з 1189 амінокислот (131586Да; який описано тут у вигляді SEQ ID №26) в результаті посттрансляційного розщеплення. Якщо амінокислота, яка безпо 53 середньо передує N-кінцевому пептиду ТсаВі, являє собою С-кінцеву амінокислоту пептиду ТсаВі, то прогнозована маса ТсаВіі (627 амінокислот) дорівнює 70814Да (яку описано тут у вигляді SEQ ID №28), що дещо більше, ніж розмір, який спостерігався за допомогою електрофорезу в ПААГДСН (68кДа). Цей пептид кодувався б неперервним відрізком з 1881п.н. (який описано тут у вигляді SEQ ID №27). Можна думати, що нативний С-кінець ТсаВі лежить дещо ближче до С-кінця TcaBi-ΡΤ108. Молекулярна маса РТ108 [3,438кДа; визначена під час аналізу N-кінцевої амінокислотної послідовності цього пептиду] передбачає розмір з 30 амінокислот. Використовуючи цей розмір пептиду для визначення С-кінця кодуючого району ТсаВі [Glu у позиції 604 SEQ ID №28], отриманий розмір TcaBі можна визначити як 604 амінокислоти або 68463Да, що більше погоджується з експериментальними спостереженнями. Трансляція кодуючого району з 1686 пар основ пептиду ТсаВіі (який описано тут у вигляді SEQ ID №29) дає білок з 562 амінокислот (який описано тут у вигляді SEQ ID №30) з прогнозованою масою 60789 Да, що добре погоджується з розміром 61кДа, який спостерігають. Потенційний сайт зв'язування рибосом (основи 3633 - 3638) було виявлено на відстані 48п.н. по ходу транскрипції від стоп-кодону для відкритої рамки зчитування tcaB. При основах 3645 - 3677 виявлено послідовність, що кодує N-кінець пептиду ТсаС, (яку описано тут у вигляді SEQ ID №21). Відкрита рамка зчитування, що починається цим N-кінцевим пептидом, триває без перерви до основи 6005 (2361п.н., що її представлено тут у вигляді перших 2361п.н. SEQ ID №31). Ген (tcaC), що кодує весь пептид ТсаС, (середній розмір ~165т.п.н.; ~1500 амінокислот), має містити приблизно 4500п.н. Інший ізолят, що містив клоновані фрагменти EcoR 1 космиди 26А5, Е20.6, також ідентифікували за його гомологією з названими раніше зондами GZ4 та ТсаВі. Аналіз в агарозному гелі продуктів розщеплення EcoR 1 ДНК цієї плазмиди, що її утримує цей штам (pDAB2004, Фіг.2), виявив вставлені фрагменти визначених розмірів 2,9, 5 та 3,3т.п.н. Аналіз послідовності ДНК, що ініціюється від праймерів, які було сконструйовано з послідовності плазмиди pDAB2002, виявив, що фрагмент EcoR 1 3,3т.п.н. pDAB2004 лежить поруч з фрагментом EcoR 1 5т.п.н., представленим в pDAB2002. Відкрита рамка зчитування з 2361п.н., яку виявлено в pDAB2002, продовжується без переривання на наступні 2094п.н. в pDAB2004 [яку описано тут у вигляді пар основ 2362 - 4458 SEQ ID №31]. Аналіз послідовності ДНК з використанням ДНК батьківської космиди 26А5 як матриці підтвердив неперервність цієї відкритої рамки зчитування. В цілому, ця відкрита рамка зчитування (ТсаС SEQ ID №31) містить 4455п.н. та кодує білок (ТсаС) з 1485 амінокислот [який представлено тут у вигляді SEQ ID №32]. Розрахований молекулярний розмір 166214Да погоджується з визначеним розміром пептиду ТсаС (165кДа) та вироблена амінокислотна послідовність співпадає точно з 82485 54 послідовністю, яку описано для N-кінцевої послідовності ТсаС [SEQ ID №2]. Відсутність амінокислотної послідовності, що відповідає SEQ ID №17, яку використано для конструювання пула вироджених олігонуклеотидних праймерів, у виявленій послідовності вказує на те, що утворення продуктів ПЛР, виявлених в ізолятах GZ4 та НВ14, які було використано як зонди в початковому скринінгу бібліотеки, здійснювалося шляхом випадкового праймування зворотного ланцюга однім з праймерів в виродженому пулі. Крім того, утворена білкова послідовність не містить внутрішнього фрагменту, який описано тут у вигляді SEQ ID №18. Ці послідовності показують, що плазмида pDAB2004 містить повний кодуючий район для пептиду ТсаС. Приклад 9 Скринінг геномної бібліотеки Photorhabdus на гени, що кодують пептид ТсbАii Цей приклад описує спосіб, що застосовується для ідентифікації клонів ДНК, які містять гени, кодуючі пептид TcbAii, виділення цього гена та визначення його часткової послідовності основ ДНК. Праймери та ПЛР-реакціі Поліпептид ТсbА11, активного проти комах препарату має мол. масу ~206кДа. Амінокислотну послідовність N-кінця цього пептиду описано у вигляді SEQ ID №1. Синтезували 4 пула вироджених олігонуклеотидних праймерів ("Прямі праймери": ТН-4, ТН-5, ТН-6 та ТН-7) для кодування цієї амінокислотної послідовності, як описано в Прикладі 8. їх показано нижче. Крім того, було визначено первинну ("а") та вторинну ("b") послідовність препарату внутрішнього пептиду (ТсbАii-РТ81), що описано тут у вигляді SEQ ID №23 та SEQ ID №24, відповідно. У подібний спосіб було сконструйовано та синтезовано 4 пула вироджених олігонуклеотидів ("Зворотні праймери": ТН-8, ТН-9, ТН-10 та ТН-11) для кодування зворотного комплементу послідовностей, що кодують частину пептидів SEQ ID №23, яку показано нижче. Набори цих праймерів використовували в реакціях ПЛР для ампліфікації фрагментів гена, що кодує ТсbАii, з геномної ДНК штаму W-14 55 82485 Photorhabdus luminescens, яку було отримано в Прикладі 6. Всі реакції ПЛР виконували за способом "Hot Start" з використанням AmpliWaxÔ gems та інших реагентів та протоколів Perkin Elmer. Як правило, суміш (загальний об'єм 11мкл) MgCL2, dNTP, 10х буферу II для ПЛР GeneAmp® та праймери додавали до пробірок, що містили одну воскову бусину, [10х GeneAmp® PCR Buffer II складається з 100мМ Трис-НСl, рН8,3, та 500мМ KСl]. Пробірки нагрівали до 80°С протягом 2 хвилин та давали їм охолонути. На верхню поверхню воскових затворів, що утворилися, додавали розчин, що містив 10х GeneAmp® PCR буфер II, ДНК-матрицю та ДНК-полімеразу AmpliTaq®. Після розплавлення воскової пробки та змішування компонентів шляхом термоциклювання кінцеві умови реакції (об'єм 50мкл) були такими: 10мМ Трис-НСІ, рН 8,3; 50мМ KCl; 2,5 MgCl2, 200мкМ кожного з dATP, dCTP, dGTP, dTTP; 1,25мМ в одному пулі Прямих праймерів; 1,25мкМ в одному пулі Зворотних праймерів, 1,25 одиниць ДНК-полімерази AmpliTaq та 170нг матричної ДНК. Реакційні суміші приміщували до термоциклеру (як у Прикладі 8) та проводили ПЛР за такою програмою: Таблиця 13 Температура 94°С 94°С 55-56°С 72°С 72°С 15°С Час 2 хвилини 15 секунд 30 секунд 1 хвилина 7 хвилин Постійна Повторення циклів 1Х 30Х 30Х 30Х 1Х Серію ампліфікацій проводили при трьох різних температурах відпала (55°, 60°, 65°С) з використанням пулів вироджених олігонуклеотидів. Реакції з відпалом при 65°С не давали продуктів ампліфікації, видимих після електрофорезу в агарозних гелях. Реакції, що мали режим відпала з 60°С та містили праймери ТН-5+ТН-10, давали продукт ампліфікації, що мав рухливість, яка відповідала 2,9т.п.н. Менша кількість продукту 2,9т.п.н. продукувалася за цих умов з праймерами ТН-7+ТН-10. При відпалі реакцій при 55°С ці пари праймерів продукували більше продукту 2,9т.п.н., та цей продукт одержували також з парами праймерів ТН-5+ТН-8 та ТН-5+ТН-11. Додаткові дуже слабкі смуги 2,9т.п.н. було видно в доріжках, що містили продукти ампліфікації від пар праймерів ТН-7+ТН-8, ТН-9, ТН-10 та ТН-11. Для отримання достатньої кількості продукту ПЛР-ампліфікації для клонування та визначення послідовності ДНК готували 10 окремих ПЛР-реакцій з праймерами ТН-5+ТН-10 та їх проводили за описаних вище умов з температурою відпала 55°С. Всі реакційні суміші об'єднували та продукт 2,9т.п.н. очищували екстракцією по Qiaex з агарозного гелю, як описано вище. Додаткові послідовності, визначені для внутрішніх пептидів ТСbАіі, описано тут у вигляді SEQ ID №21 та SEQ ID №22. Як і раніше, було приготовано вироджені олігонуклеотиди (Зворотні праймери ТН-17 та ТН-18), що відповідають зворотно 56 му комплементу послідовностей, які кодують частину амінокислотної послідовності цих пептидів. Вироджені олігонуклеотиди ТН-18 та ТН-17 використовували в експерименті по ампліфікації з ДНК Photorhabdus luminescens W-14 як матрицю та праймерів ТН-4, ТН-5, ТН-6 або ТН-7 як 5'(Прямі) праймери. Ці реакції ампліфікували продукти приблизно 4т.п.н. та 4, 5т.п.н., відповідно. Ці ДНК переносили з агарозних гелів на нейлонові мембрани та гібридизували з Ρ-міченим зондом (як описано вище), який було приготовано з продукту 2,9т.п.н., ампліфікованим за допомогою пари праймерів ТН-5+ΤΗ-10. Обидва продукти ампліфікації 4т.п.н. та 4,5т.п.н. сильно гібридизувалися з зондом 2,9т.п.н. Ці результати використовували для побудови карти, що розташовує внутрішні пептидні послідовності ТсbАii, як показане на Фіг.3. Послідовність фрагменту, що кодує ТсbАii 2,9т.п.н. Приблизно 200нг очищеного фрагменту 2,9т.п.н. (отриманого, як описано вище) осаджували етанолом та розчиняли в 17мл води. Одну половину використовували як матрицю з 25 пмоль пула ТН-5 як праймерів, а іншу половину використовували як матрицю з праймером ТН-10. Реакції секвенування проводили, як описано в Прикладі 8. З пулом праймерів ТН-10 не було отримано вірогідної послідовності; однак реакції з пулом праймерів ТН-5 продукували описану нижче послідовність: На основі цієї послідовності було сконструйовано секвенуючий праймер (ТН-21, 5'CCGGGCGACGTTTATCTAGG-3') для основ зворотного комплементу 120-139 та ініціації полімеризації у напрямі 5'-кінця (тобто ТН-5-кінця) очищеного на гелі ПЛР-фрагменту 2,9т.п.н. ТсbАіi. Визначену послідовність показано нижче та її порівняно з біохімічно визначеною N-кінцевою послідовністю пептиду TcbAii SEQ ID №1. Підтвердження послідовності ПЛР-фрагменту 2,9т.п.н. ТсbАii (Підкреслені амінокислоти= послідовності, що їх кодують вироджені олігонуклеотиди) 57 З гомології виробленої амінокислотної послідовності з послідовністю, визначеною біохімічно, випливає, що ПЛР-фрагмент 2, 9т.п.н. являє собою район, що кодує ТсbА. Цей фрагмент 2,9т.п.н. використовували потім як гібридизаційний зонд для скринінгу геномної бібліотеки Photorhabdus W14, отриманої в Прикладі 8, на космиди, що містять ген, який кодує TcbAii. Скринінг космидної бібліотеки Photorhabdus Очищений на гелі фрагмент ПЛР 2,9т.п.н. мітили 32Р з використанням набору для мічення Boehringer Mannheim High Prime, як описано в Прикладі 8. Фільтри, що містили залишки приблизно 800 колоній з космидної бібліотеки, скринювали, як описано раніше (Приклад 8), та позитивні клони висіювали штрихом для отримання окремих колоній та повторно піддавали скринінгу. Три клони (8А11, 25G8 та 26DI) давали позитивні результати протягом декількох стадій скринінгу та характеристики. Гібридизації ТсbАii-специфічного зонда ніколи не одержували з будь-якою з чотирьох космид, що ідентифікувалися в Прикладі 8, які містять гени tcaB та tcaC. ДНК з космид 8А11, 25G8 та 26DI розщепляли рестриктазами Big 2, EcoR 1 або Hind 3 (окремо або в комбінації одна з одною), та фрагменти розділяли на агарозному гелі та переносили на нейлонову мембрану, як описано в Прикладі 8. Мембрану гібридизували з 32р-міченим зондом, отриманим з фрагменту 4,5т.п.н. (отриманого шляхом ампліфікації геномної ДНК Photorhabdus з праймерами ТН-5+ТН-17). Розподіли (малюнки смуг), отримані з космидних ДНК 8А11 та 26DI, були ідентичними з розподілами, отриманими з геномного ДНК, що її розрізають у подібний спосіб, на тій самій мембрані. Було зроблено висновок, що космиди 8А11 та 26DI є точними відображеннями кодуючого локусу геномного ТсbАii. Однак, космида 25G8 має один фрагмент Bgl 2, що є дещо більшим за геномну ДНК. Це може бути результатом розташування інсерту всередині вектору. Послідовність ДНК гена, що кодує ТсbА Гібридизаційний аналіз на мембрані космиди 26DI виявив зонд 4,5т.п.н., який було гібридизовано з одним великим фрагментом EcoR 1 (більшим, ніж 9т.п.н.). Цей фрагмент очищали на гелі та лігували в сайт EcoR 1 рВС KS (+), як описано в Прикладі 8, для створення плазмиди рВС-S1/R1. Часткову послідовність ДНК інсерту ДНК цієї плазмиди визначали "прогулянкою праймера" від фланкуючої послідовності вектору з використанням процедур, описаних в Прикладі 8. Подальшу послідовність генерували шляхом подовження від нових олігонуклеотидів, що їх було сконструйовано з раніше визначеної послідовності. При порівнянні з визначеною послідовністю ДНК для гена tcbA, яку ідентифікували іншими способами (яку описано 82485 58 тут у вигляді SEQ ID №11, як описано в Прикладі 12 нижче) було виявлена повну гомологію з нуклеотидами 1-272, 319-826, 2578-3036 та 3068-3540 (загальна кількість основ = 1712). Було зроблено висновок, що обидва підходи може бути використано для ідентифікації фрагментів ДНК, які кодують пептид TcbAii. Аналіз отриманої з гена tcbA амінокислотної послідовності Послідовність фрагменту ДНК, яку ідентифіковано як SEQ ID №11, кодує білок, амінокислотну послідовність якого описано тут як SEQ ID №12. Деякі ознаки підтверджують ідентичність цього гена як гена, що кодує білок TcbAii. N-кінцевий пептид (SEQ ID №1: Phe lie Gin Gly Туr Ser Asp Leu Phe Gly Asn Arg Ala) кодує амінокислоти 88-100. Внутрішній пептид ТсbАіі TcbAii-PT81 (a) (SEQ ID №23) кодує амінокислоти 1065-1077, a TcbAii-PT81 (b) (SEQ ID №24) кодує амінокислоти 1571-1592. Крім того, внутрішній пептид ТсbАii-РТ56 (SEQ ID №22) кодує амінокислоти 1474-1488, а внутрішній пептид ТсbА1±-РТ103 (SEQ ID №24) кодує амінокислоти 1614-1639. Очевидно, що цей ген є аутентичним клоном, що кодує пептид TcbAii, який виділено з препаратів інсектицидного білка штаму W-14 Photorhabdus luminescens. Білок, який виділено у вигляді пептиду TcbAii, утворено внаслідок розщеплення більш довгого пептиду. Доводить це той факт, що нуклеотиди, які кодують N-кінцевий пептид SEQ ID №1 TcbAii, мають перед ними 261 основу (кодуючі 87 найближчих N-кінцевих амінокислот) більш довгої відкритої рамки зчитування (SEQ ID №11). Ця рамка зчитування починається нуклеотидами, що кодують амінокислотну послідовність Met Gin Asn Ser Leu, яка відповідає N-кінцевій послідовності великого пептиду TcbA, та яку описано тут як SEQ ID №16. Можна думати, що TcbA є білком-попередником ТсbАii. Спорідненість генів tcbA, tcaB та tcaC Гени tcaB та tcaC є тісно зв'язаними та можуть транскрибуватись у вигляді однієї мРНК (Приклад 8). Ген tcbA знаходиться на космидах, які, очевидно, не перекриваються з космидами, що несуть кластер tcaB та tcaC, тому що відповідні скринінги геномної бібліотеки ідентифікували різні космиди. Однак, порівняння амінокислотних послідовностей, що їх кодують гени tcaB та tcaC, з геном tcbA, виявило значну міру гомології. Консервативність амінокислот (Protein Alignment Mode of MacVectorÔ Sequence Analysis Software, scoring matrix pam250, hash value=2; Kodak Scientific Imaging Systems, Rochester, NY) показано на Фіг.4. На лінії оцінки кожної частини в Фіг.4 направлені догори значки (^) вказують гомологію або зміни консервативних амінокислот, а направлені донизу значки (ν) вказують відсутність гомології. Цей аналіз показує, що амінокислотна послідовність пептиду TcbA від залишку 1739 до залишку 1894 є високо гомологічною амінокислотам 441-603 пептиду ТсаВi (162 з 627 амінокислот Р8; SEQ ID №28). Крім того, послідовність амінокислот TcbA 1932-2459 є високо гомологічною амінокислотам 12-531 пептиду ТсаВii (520 з 562 амінокислот; SEQ ID №30). Зважаючи на те, що пептид TcbA (SEQ ID №12) містить 2505 амінокислот, 59 всього 684 амінокислоти (27%) при Спроксимальному кінці його є гомологічними пептидам ТсаВі або ТсаВii, та гомології розміщені колінеарно з розташуванням можливого препротеїну ТсаВ (SEQ ID №26). Розмір проміжку в гомології ТсbА співпадає з місцем сполучення між частинами TcaBi та ТсаВii препротеїну ТсаВ. Ясно, що генні продукти ТсbА та ТсаВ є еволюційно спорідненими, та припускається, що вони мають загальну функцію (функції) в Photorhabdus. Приклад 10 Характеристика цинк-металопротеаз в бульйоні Photorhabdus: Інгібування протеази, класифікація та очищення Аналіз інгібування протеази та класифікаційні аналізи: Тести на протеазу виконували з застосуванням ФІТЦ-казеїну, який було розчинено у воді, як субстрату (кінцева концентрація в тесті 0,08%). Реакції протеолізу проводили при 25°С протягом 1 години в підхожому буфері з 25мкл бульйону Photorhabdus (загальний реакційний об'єм 150мкл). Проби також аналізували на присутність та відсутність дітіотреїтолу. Після інкубації додавали рівний об'єм 12% трихлороцтової кислоти до осаду нерозщепленого білка. Після осадження протягом 0,5 години та подальшого центрифугування 100мкл супернатанту приміщували в 96луночний мікротитраційний планшет та рН розчину доводили доданням рівного об'єму 4н NaOH. Потім протеоліз визначали кількісно, застосовуючи флуориметричний планшет-рідер Fluoroscan II за довжин хвиль збудження та емісії 485 та 538нм, відповідно. Протеазну активність вимірювали в діапазоні рН5,0 - 10 з приростами 0,5 одиниць. Використовували такі буфери при остаточній концентрації 50мМ: ацетат натрію (рН5,0 - 6,5); ТрисНСІ (рН7,0 - 8,0) та біс-Трис-пропан (рН8,5 - 10,0). Для ідентифікації класу протеази (протеаз), що її спостерігали, вихідний бульйон обробляли різними інгібіторами протеаз (кінцева концентрація 0,5мкг/мкл) та потім випробовували на протеазну активність при рН8,0 з застосуванням описаного вище субстрату. Інгібітори протеаз, що їх використовували, включали Е-64 (L-трансепоксисукциніллейциламідо[4-гуанідино]-бутан), 3,4-діхлоризокумарин, Лейпептин, пепстатин, амастатин, етилен-діамінтетраоцтову кислоту (ЕДТК) та 1,10-фенантролін. Визначення протеази, проведені в діапазоні рН, виявили, що дійсно наявна протеаза (або протеази), що виявляють максимальну активність при рН ~8,0 (Таблиця 16). Додання ДТТ не впливало на протеазну активність. Потім вихідний бульйон обробляли різними інгібіторами протеаз (Таблиця 17). Обробка вихідного бульйону описаними вище інгібіторами виявила, що 1,10-фенантролін викликав повне інгібування всієї протеазної активності при доданні при остаточній концентрації 50мкг, з ІС50=5мкг в 100мкл вихідного розчину бульйону 2мг/мл. Ці дані вказують на те, що наявною у найбільшій кількості протеазою (протеазами) в бульйоні Photorhabdus є ферменти класу цинкметалопротеаз. 82485 60 Таблиця 16 Вплив рН на протеазну активність, виявлену в продуктах 1-го дня Photorhabdus luminescens (штам W-14) рН 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 9,5 10,0 Флуор. одиниціa Активність b 3013±78 7994±448 12965±483 14390±1291 14386±1287 14135±198 17582±831 16183±953 16795±760 16279±1022 15225±210 Відсоток 17 45 74 82 82 80 100 92 96 93 87 a Флуор. одиниці = Одиниці флуоресценції (Максимум =~28000; тло =~2200). b Активність у відсотках відносно до максимуму при рН8,0 Таблиця 17 Вплив різних. Інгібіторів протеаз на протеазну активність при рН8, виявлену в продуктах 1-го дня Photorhabdus luminescens (штам W-14) Флуор. од.а, які % інгібуванбуло скоректовано няb Контроль 13053 0 Е-64 14259 0 1,10-Фенантролінс 15 99 3,47956 39 Діхлорізокумаринd Лейпептин 13074 0 Пепстатинс 13441 0 Амастатин 12474 4 Контроль з ДМСО 12005 8 Контроль з мета12125 7 нолом Інгібітор a Флуор. одиниці, що було скоректовано = Одиниці флуоресценції - тло (2200 флуор. одиниць) b Відсоток інгібування відносно протеазної активності при рН 8,0 c Інгібітори розчиняли в метанолі d Інгібітори розчиняли в ДМСО Виділення цинк-металопротеази виконували шляхом нанесення діалізованого отриманого осадженням 10 - 80% сульфатом амонію осаду на колонку Q Sepharose, зрівноважену 50мМ Na2PO4, рН7,0, як описано в Прикладі 5 для токсину Photorhabdus. Після інтенсивного промивання використовували градієнт 0 - 0,5Μ NaCl для елюції білка токсину. Більша частина біологічної активності та білка елюювалася в діапазоні 0,15 - 0,45Μ