Спосіб визначення зиготності гена fad-2 каноли з використанням плр із детекцією за кінцевою точкою

Реферат: Винахід належить до способу визначення зиготності рослини каноли, що містить ген fad-2 за допомогою ПЛР-аналізів за кінцевою точкою для детектування гена fad-2 в канолі. Винахід також належить до набору для визначення зиготності рослини або насіння каноли. UA 114302 C2 (12) UA 114302 C2 UA 114302 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Перехресне посилання на споріднену заявку Дана заявка запитує пріоритет попередньої патентної заявки США № 61/550165, поданої 21 жовтня 2011 р., що у всій своїй повноті включається в даний документ за допомогою посилання. Рівень техніки, до якої належить винахід Рід Brassica (капуста) включає канолу, одну з найбільш важливих у світі олійних культур, причому цю важливу олійну культуру вирощують у географічних регіонах із помірним кліматом. Канола традиційно характеризується як Brassicanapus L., вид, отриманий у результаті міжвидового схрещування видів Brassicarapa (ріпа) і Brassicaoleracea (капуста городня), у якому вміст ерукової кислоти і глюкозинолатів усунутий або значно скорочений за допомогою традиційної селекції. Основна маса олії каноли присутня у формі рослинних олій, вироблених для харчування людини. Крім того, росте ринок для використання олії каноли в промислових додатках. Рід Brassica складають три диплоїдні види, кожний з який характеризує унікальний геном, що називається "геном A", "геном B" або "геном C". Рослини виду Brassicarapa (ріпа) мають диплоїдний геном A. Рослини виду Brassicanigra (гірчиця чорна) мають диплоїдний геном B. Рослини виду Brassicaoleracea (капуста городня) мають диплоїдний геном C. Гібриди цих видів можна робити за допомогою схрещування між двома з диплоїдних видів. Канола являє собою амфідиплоїдний вид, що розглядається як продукт гібридизації виду Brassicaoleracea, що має диплоїдний геном C, і виду Brassicarapa, що має диплоїдний геном A. Цитогенетичне дослідження виявило, що геноми AA і CC виявляють ступінь споріднення, будучи частково гомологічними відносно один одного, і вважається, що вони походять від геному їхнього загального предка (Prakash і Hinata, 1980 р.). Хоча технічно вони класифікуються як диплоїдні, геноми обох видів-попередників мають високий процентний вміст областей, які дублюють одна одну (Songetal., 1991 р.). Генетичний аналіз виявив, що вид Brassicanapus одержав десять хромосом від геному AA виду Brassicarapa і дев'ять хромосом від геному CC виду Brassicaoleracea як материнського донора (Songetal., 1992 р.). Якість харчового і технічного мастила, одержуваного з визначеного асортименту різноманітного насіння каноли, визначається жирними кислотами, які складають його, оскільки тип і кількість ненасичених жирних кислот мають значення для харчового і промислового застосування. Традиційна олія каноли містить приблизно 60 % олеїнової кислоти (C18:1), 20 % лінолевої кислоти (C18:2) і 10 % ліноленової кислоти (18:3). Рівні поліненасиченої ліноленової кислоти, що є типовими для традиційної каноли, виявляються небажаними, оскільки олія легко окислюється, причому на швидкість окислювання впливають кілька факторів, зокрема присутність кисню, вплив світла і тепла, а також присутність в олії природних або доданих речовин, які перешкоджають і сприяють окислюванню. Окислювання викликає неприємний запах і прогірклий смак у результаті повторного смаження (індуковане окислювання) або в процесі збереження протягом тривалого періоду (автоокислення). Окислювання може також змінювати мастильні і в'язкі властивості олії каноли. Властивості олії каноли, яка виявляє знижені рівні поліненасичених жирних кислот і підвищені рівні мононенасиченої олеїнової кислоти порівняно з традиційною олією каноли, пов'язані з підвищеною стійкістю до окислювання. Схильність окремих жирних кислот до окислювання залежить від ступеня їх ненасиченості. Таким чином, швидкість окислювання ліноленової кислоти, молекула якої містить три подвійні зв'язки між атомами вуглецю, у 25 разів перевищує швидкість окислювання олеїнової кислоти, молекула якої містить тільки один подвійний зв'язок між атомами вуглецю, і в два рази перевищує швидкість окислювання лінолевої кислоти, молекула якої містить два подвійні зв'язки між атомами вуглецю. Лінолева і ліноленова кислоти також роблять найбільший внесок у смак і запах, тому що вони легко утворюють гідропероксиди. Олія, що має високий вміст олеїнової кислоти (не менше, ніж 70 % олеїнової кислоти), піддається окислюванню в меншому ступені в процесі збереження, смаження й очищення, і її можна нагрівати до більш високої температури без утворення диму, що робить її більш придатною як кулінарну олію. Якість олії каноли визначається жирними кислотами, які складають її, такими, як олеїнова кислота (C18:1), лінолева кислота (C18:2) і ліноленова кислота (C18:3). З більшості культурних сортів каноли, як правило, роблять олію, що містить приблизно від 55 до 65 % олеїнової кислоти і від 8 до 12 % ліноленової кислоти. Високі концентрації ліноленової кислоти приводять до того, що олія стає нестійкою і здобуває неприємний запах, у той час як високі рівні олеїнової кислоти підвищують стійкість до окислювання і поживну цінність олії. Таким чином, виведення культурних сортів каноли з підвищеним вмістом олеїнової кислоти і зниженим вмістом ліноленової кислоти є у високому ступені бажаним для підвищення якості олії каноли. 1 UA 114302 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Були визначені два локуси і їх геномне положення, локалізоване від культурного сорту каноли, який має підвищений вміст олеїнової кислоти і знижений вміст ліноленової кислоти. Один локус здійснює основний ефект, і другий локус здійснює другорядний ефект на утворення підвищеного вмісту олеїнової кислоти і зниженого вмісту ліноленової кислоти. Основний локус для високого вмісту олеїнової кислоти (C18:1) був визначений у гені десатурази-2 жирних кислот (fad-2), і він розташований на групі зчеплення N5. Другий другорядний локус розташований на групі зчеплення N1. Один основний локус кількісних ознак (ЛКО) для ліноленової кислоти (C18:3) являє собою ген десатурази-3 жирних кислот геному C (fad-3c) і розташований на групі зчеплення N14. Другий основний ЛКО розташований на групі зчеплення N4 і являє собою ген десатурази-3 жирних кислот геному A (fad-3a). Геномні послідовності генів fad-2 і fad-3c були ампліфіковані і секвеновані з індукованого етилметансульфонатом (ЕМС) мутантного і (немутантного) культурного сорту каноли дикого типу. Порівняння алельних послідовностей генів fad-2 і fad-3c мутантного і дикого типів виявило однонуклеотидні поліморфізми (ОНП) у генах з індукованих ЕМС мутантних рослин. На основі розходжень послідовностей між алелями мутантного і дикого типів були розроблені два маркери ОНП, які відповідають мутаціям генів fad-2 і fad-3c (Huetal., 2006). Існуючі дотепер способи одержання насіння гібриду Brassica першого покоління (F 1) мають обмеження відносно вартості і чистоти насіння. Як правило, для цих способів вимагаються стійкі, споріднені-несумісні і самонесумісні, майже гомозиготні батьківські генеалогічні лінії, причому дані батьківські генеалогічні лінії можна зробити тільки після багаторазового самозапилення для одержання інбредних ліній. Крім того, близькоспоріднене схрещування (інбридинг) для розвитку і збереження батьківських ліній здійснюється за допомогою трудомістких технологій, таких, як брунькове запилення, оскільки системи виробництва гібридного насіння роду Brassica на основі самонесумісних ознак повинні використовувати рослини, що мають сильну самонесумісність. Умови навколишнього середовища протягом процесу розведення, такі, як температура і вологість, як правило, впливають на ліпідний метаболізм рослин і, таким чином, впливають також на рівень вмісту жирних кислот (Harwood, 1999 р.). Таким чином, мінливість умов навколишнього середовища робить фенотипову селекцію рослин менш надійною. Deng і Scarth (1998 р.) виявили, що підвищення температури після цвітіння значно знижує рівні C18:3 і підвищує рівні C18:1. Аналогічні результати були отримані й у інших дослідженнях (Yermanos і Goodin, 1965 р.; Canvin, 1965 р.). Селекція з метою низького вмісту ліноленової кислоти є особливо проблематичною, оскільки вміст C18:3 являє собою мультигенну ознаку й успадковується рецесивним чином із відносно низькою здатністю успадкування. Генетичний аналіз популяції, отриманої в результаті схрещування сорту Stellar (який має низький вміст C18:3 на рівні 3 %) і сорту Drakkar (який має "традиційний" вміст C18:3 на рівні від 9 до 10 %) показав, що ознаку низького вмісту C18:3 регулюють два основні локуси, які роблять адитивні ефекти, позначені L1 і L2 (Jourdrenetal., b, 1996 р.). Було виявлено, що ці два основні локуси, які регулюють вміст C18:3, відповідають двом генам fad-3 (десатураза-3 жирних кислот), причому один із них містить геном A (що походить від виду Brassicarapa), а інший містить геном C (що походить від виду Brassicaoleracea) (Jourdrenetal., 1996 р.; Barretet al., 1999 р.). Ознаки, що постійно змінюються внаслідок генетичних факторів (адитивних, домінантних і епістатичних) і впливів навколишнього середовища, звичайно називають терміном "кількісні ознаки". Кількісні ознаки можуть відрізнятися від "якісних" або "дискретних" ознак на основі двох факторів: вплив умов навколишнього середовища на експресію генів, які роблять безперервний розподіл фенотипів; і складна картина сегрегації, яку робить мультигенне успадкування. Визначення однієї або декількох областей геному, пов'язаних з експресією кількісної ознаки, привело до відкриття локусів кількісних ознак (ЛКО). Thormannetal. (1996 р.) картували два ЛКО, що пояснювали 60 % мінливості вмісту ліноленової кислоти, а потім Somersetal. (1998 р.) визначили три ЛКО, які у сукупності пояснювали 51 % фенотипової мінливості вмісту C18:3. Трилокусну адитивну модель також описали Chen і Beversdorf (1990 р.). Rucker і Robbelen (1996 р.) показали, що кілька другорядних генів найбільш імовірно беруть участь на стадії десатурації. Здатність успадкування вмісту C18:3 була оцінена на рівні від 26 до 59 % (Kondra і Thomas, 1975 р.) (де мінливість здатності успадкування являє собою функцію генетичних факторів, а не факторів навколишнього середовища). Складність успадкування вмісту ліноленової кислоти може бути обумовлена тим, що ліноленова кислота може бути синтезована як шляхом десатурації C18:2, так і шляхом збільшення ланцюга C16:3 (Thompson, 1983 р.). На відміну від ліноленової кислоти успадкування вмісту олеїнової кислоти є менш складним, і здатність успадкування вмісту олеїнової кислоти є відносно високою. Відповідно до повідомлень високий вміст олеїнової кислоти регулює основний локус, так званий ген fad-2 2 UA 114302 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (десатураза-2 жирних кислот), який кодує фермент, відповідальний за десатурацію олеїнової кислоти в лінолеву кислоту (C18:2) (Tanhuanpaaetal., 1998 р.; Schierholtetal., 2001 р.). Усі функціональні генні копії гена fad-2, що були описані і картовані дотепер, розташовані на групі зчеплення N5, яка походить із геному A (Scheffleret al., 1997 р.; Schierholtet al., 2000 р.). Chen і Beversdorf (1990) повідомили, що нагромадження олеїнової кислоти регулюється в двох сегрегаційних генетичних системах, причому одна впливає на подовження ланцюга, а друга бере участь у десатурації. Здатність успадкування вмісту C18:1 була оцінена на рівні від 53 % до 78 % (Kondra і Thomas1975 р.) і 94 % (Schierholt і Becker, 1999 р.) відповідно. Унаслідок підвищеної здатності успадкування, на експресію вмісту C18:1 у меншому ступені впливають умови навколишнього середовища, і вона є відносно стійкою (Schierholt і Becker, 1999 р.). Було виявлено, що в зародковій плазмі каноли Nexera™ (Nexera™ являє собою товарний знак компанії DowAgroSciences, LLC) один або два гени регулюють вміст C18:1 і, щонайменше, три гени беруть участь в експресії C18:3. При сегрегації потомства розподіл вмісту C18:3 у насінні є безперервним, і в результаті цього виявляється складним визначення генотипових класів із бажаними рівнями вмісту C18:3. Крім того, існує низька кореляція вмісту жирних кислот між рослинами, вирощуваними в оранжереї (GH) і в польових умовах, що робить ще більш проблематичним надійну селекцію оранжерейних рослин з бажаними рівнями вмісту C18:3. Можна використовувати різноманітні способи для виявлення присутності конкретного гена у зразку рослинної тканини. Один приклад являє собою спосіб піросеквенування, що описав Winge (Innov. Pharma. Tech. 00:18-24, 2000 р.). Відповідно до даного способу, олігонуклеотид повинен перекривати послідовність вставленої ДНК і прилеглої до неї геномної ДНК. З олігонуклеотидом гібридизується одноланцюжковий продукт ПЛР (амплікон) із розглянутої області (тобто один праймер у вставленій послідовності й один у фланкуючій геномній послідовності), і здійснюється інкубація, при якій присутні ДНК-полімераза, аденозинтрифосфат (АТФ), сульфурилаза, люцифераза, апіраза, аденозин-5'-фосфосульфат і люциферин. Дезоксирибонуклеозидтрифосфати (дНТФ) додають індивідуально, і їхнє введення приводить до світлового сигналу, який вимірюється. Світловий сигнал показує присутність трансгенної вставленої/фланкуючої послідовності внаслідок успішної ампліфікації, гібридизації і подовження ланцюга на одну або кілька основ. (Цей спосіб звичайно використовується для початкового секвенування, а не для виявлення конкретного гена, коли він відомий). Флуоресцентна поляризація являє собою ще один спосіб, який можна використовувати, щоб виявляти амплікон. Відповідно до даного способу олігонуклеотид повинен перекривати з'єднання геномної фланкуючої і вставленої ДНК. З олігонуклеотидом гібридизується одноланцюжковий продукт ПЛР із розглянутої області (один праймер у вставленій ДНК і один праймер у послідовності фланкуючої геномної ДНК), і здійснюється інкубація, при якій присутні ДНК-полімераза й дидезоксирибонуклеозидтрифосфат (ддНТФ), який містить флуоресцентну мітку. Подовження ланцюга на одну основу приводить до введення ддНТФ. Ступінь уведення можна вимірювати як зміну поляризації, використовуючи флуорометр. Зміна поляризації показує присутність трансгенної вставленої/фланкуючої послідовності внаслідок успішної ампліфікації, гібридизації і подовження ланцюга на одну основу. Були описані молекулярні маяки для використання у виявленні послідовностей. Коротко, молекулярні маяки включають олігонуклеотидний зонд, який здійснює РПЕФ (резонансне перенесення енергії флуоресценції), який може бути влаштований таким чином, що зонд РПЕФ перекриває з'єднання фланкуючої геномної і вставленої ДНК. Унікальна структура зонда РПЕФ приводить до того, що вона містить вторинну структуру, яка зберігає в безпосередній близькості флуоресцентні і гасильні фрагменти. Зонд РПЕФ і праймери ПЛР (один праймер у послідовності вставленої ДНК і один праймер у фланкуючій геномній послідовності) циклічно обробляють у присутності термостійкої полімерази і дНТФ. Після успішної ампліфікації ПЛР гібридизація зонда РПЕФ із цільовою послідовністю приводить до видалення вторинної структури зонда і просторового поділу флуоресцентних і гасильних фрагментів. Флуоресцентний сигнал показує, що присутня фланкуюча геномна/трансгенна вставлена послідовність внаслідок успішної ампліфікації і гібридизації. Дослідження з гідролітичним зондом, також відомі як ПЛР TaqMan® (TaqMan® являє собою зареєстрований товарний знак компанії RocheMolecularSystems, Inc.), пропонують спосіб виявлення і кількісного визначення присутності of послідовності ДНК. Коротко, у методі ПЛР TaqMan® використовується олігонуклеотидний зонд РПЕФ, який містить частину олігонуклеотиду в трансгені й іншу частину олігонуклеотиду у фланкуючій геномній послідовності для виявлення визначеної події. Зонд РПЕФ і праймери ПЛР (один праймер у вставленій послідовності ДНК і один праймер у фланкуючій геномній послідовності) циклічно обробляють у присутності термостійкої полімерази і дНТФ. Гібридизація зонда РПЕФ і 3 UA 114302 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 подальший гідроліз протягом стадії ампліфікації ПЛР унаслідок 5'-екзонуклеазної активності полімерази термофільної бактерії Thermus aquaticus (Taq) приводить до розщеплення зв'язку і відділення флуоресцентного фрагмента від гасильного фрагмента на зонді РПЕФ. Флуоресцентний сигнал показує, що фланкуюча/трансгенна вставлена послідовність присутня внаслідок успішної гібридизації й ампліфікації. Молекулярні маркери можна також використовувати для специфічного визначення послідовності ДНК. Вибір молекулярних маркерів здійснюється на основі генотипів і, таким чином, є незалежним від впливу навколишнього середовища. Молекулярні маркери сприяють усуненню проблеми ненадійної селекції рослин в оранжереї, що обумовлено низькою кореляцією вмісту жирних кислот між рослинами, вирощуваними в оранжереї, і рослинами, вирощуваними в польових умовах. Слід зазначити, що молекулярні маркери, міцно зв'язані з генами, які регулюють вміст C18:1 і C18:3, можуть сприяти ранній селекції рослин, які несуть гени високого вмісту C18:1 і низького вмісту C18:3. Селекція за допомогою маркерів на ранній стадії може сприяти економії оранжерейного простору, підвищенню ефективності використання оранжереї і скороченню трудомісткості селекції в польових умовах. Більш конкретно, молекулярні маркери мають наступні переваги порівняно з морфологічними маркерами: молекулярні маркери можуть бути високополіморфними, у той час як морфологічні маркери є суворо залежними від фенотипу; морфологічні маркери можуть втручатися у підрахунок визначених кількісних фенотипів, у той час як молекулярні маркери виявляють співвідношення 1:1 між генотипом і фенотипом (таким чином, забезпечується однозначний підрахунок усіх можливих генотипів для даного локусу); і епістатичні взаємодії, як правило, обмежують кількість морфологічних маркерів, які можна використовувати в популяції, у той час як молекулярні маркери не вступають у епістатичні взаємодії. Було визначено, що різні типи молекулярних маркерів, таких, як маркери статистично ампліфікованої поліморфної ДНК (САПД) (Tanhuanpaaet al., 1995 р.; Huet al., 1995 р.; Rajcanet al., 1999 р.; Jourdrenet al., 1996 р.), маркери поліморфізму довжини рестрикційних фрагментів (ПДРФ) (Thormannet al., 1996 р.) і маркери характеризованої послідовністю ампліфікованої області (ХПАО) (Huet al., 1999 р.) зв'язані з низькими рівнями C18:3 у виду Brassicanapus. Молекулярні маркери були також визначені для високого вмісту C18:1. Було визначено, що маркер САПД зв'язаний із ЛКО, що впливає на концентрацію олеїнової кислоти в ярової ріпи олійної (підвид Brassica rapa oleifera виду Brassica rapa), а потім його перетворили в маркер ХПАО (Tanhuanpaaet al., 1996 р.). Schierholtet al., (2000р.) ідентифікували три маркери поліморфізму довжини ампліфікованого фрагмента (ПДАФ), зв'язані з мутацією убік підвищеного вмісту олеїнової кислоти в озимого рапсу олійного (Brassicanapus.). Tanhuanpaaet al., (1998 р.) розробили алель-специфічний маркер ПЛР для олеїнової кислоти, порівнюючи алелі дикого типу і високого вмісту олеїнової кислоти локусу гена fad-2 у ярової ріпи олійної (підвид Brassicarapaoleifera виду Brassicarapa). Однак більшість цих маркерів являють собою низькопродуктивні маркери, такі, як САПД, ПДАФ і ПДРФ, які не є придатними для великомасштабного автоматизованого дослідження. Сутність винаходу Даний винахід стосується, зокрема, досліджень методом ПЛР TaqMan® за кінцевою точкою для виявлення і високопродуктивного аналізу зиготності гена fad-2 каноли. Даний винахід також стосується, зокрема, використання ДНК дикого типу як стандарту для застосування у визначенні зиготності. Ці й інші споріднені процедури можна використовувати для унікальної ідентифікації зиготності і мінливості ліній каноли, які включають досліджуваний ген. Даний винахід також пропонує відповідні набори для визначення зиготності і мінливості в зразку, наприклад, каноли. Таким чином, відповідно до варіанта здійснення даного винаходу, пропонується ПЛР TaqMan® як універсальна основа для високопродуктивного аналізу зиготності і селекції. Використання методу ПЛР TaqMan® за кінцевою точкою, що пропонує даний винахід, являє собою надійний, точний і високопродуктивний додаток для аналізу зиготності fad-2 і селекції каноли. Короткий опис фігур Фіг. 1 представляє ділянку послідовності гена fad-2 (SEQ ID NO: 1), яка ілюструє положення мутації fad-2c, яку визначили Huet al., (2006 р.). Фіг. 2 представляє приклад результатів аналізу зиготності (каноли), що ілюструє три генотипи fad-2 після дослідження TaqMan® за кінцевою точкою; дані результати отримані з використанням програмного забезпечення SDS 2.4, що постачається компанією AppliedBiosystems (Фостер-сіті, штат Каліфорнія, США). Короткий опис послідовностей 4 UA 114302 C2 5 10 15 20 25 30 SEQ ID NO: 1 являє собою ділянку послідовності гена fad-2, який ілюструє положення мутації fad-2c. SEQ ID NO: 2 являє собою прямий праймер D-CL-FAD-2-F, що зв'язує фланкуючу геномну послідовність. SEQ ID NO: 3 являє собою зворотний праймер D-CL-FAD-2-R2, що зв'язує послідовність, яка вставляється. SEQ ID NO: 4 являє собою зонд D-CL-FAD-2-VIC для кращого зв'язування гена fad-2, який мутував, який має однонуклеотидний поліморфізм CT. SEQ ID NO: 5 являє собою зонд D-CL-FAD-2-FAM для виявлення гена fad-2 дикого типу. Докладний опис винаходу Даний винахід стосується, зокрема, досліджень методом ПЛР TaqMan® за кінцевою точкою для виявлення і високопродуктивного аналізу зиготності гена fad-2 каноли. Даний винахід також стосується, зокрема, використання ДНК дикого типу як стандарту для застосування у визначенні зиготності. Ці й інші споріднені процедури можна використовувати для унікальної ідентифікації зиготності і мінливості ліній каноли, що включають досліджуваний ген. Даний винахід також пропонує відповідні набори для визначення зиготності і мінливості в зразку, наприклад, каноли. Таким чином, відповідно до варіанта здійснення даного винаходу, пропонується ПЛР TaqMan® як універсальна основа для високопродуктивного аналізу зиготності і селекції. Використання методу ПЛР TaqMan® за кінцевою точкою, що пропонує даний винахід, являє собою надійний, точний і високопродуктивний додаток для аналізу зиготності fad-2 і селекції каноли. Нові дослідження згідно із даним винаходом були розроблені, зокрема, на основі мутації однонуклеотидного поліморфізму (ОНП) алеля fad-2 reportedbyHuet al., (2006). У даному дослідженні використовуються дві області праймера і два зонди MGB, щоб виявляти алелі fad-2 мутантного і дикого типу (див. таблицю 1). Праймери і зонди TaqMan® для виявлення цієї мутації SNP призначені, зокрема, для програмного забезпечення PrimerExpress від компанії AppliedBiosystems (Остін, штат Техас) із використанням послідовностей гена fad-2. Дане нове дослідження гена fad-2 методом TaqMan® було підтверджене з використанням ДНК, екстрагованої з рослин каноли, які належать гомозиготного, гемізиготного і дикого типу (відсутність мутації) гена fad-2. Дослідження гена fad-2 методом TaqMan® було також оптимізовано для здійснення, зокрема, з використанням у режимі реального часу системи ПЛР 7900HT від компанії AppliedBiosystems у форматах 96 або 384 ямок в умовах ПЛР зі швидкою циклічною зміною температури. Таблиця 1 Послідовності праймерів і зондів, використовуваних у дослідженні гена fad-2 методом TaqMan® SEQ ID NO: SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 5 35 40 45 Олігонуклеотид Прямий праймер Найменування D-CL-FAD2-F Зворотний праймер D-CL-FAD2-R2 Зонд для D-CL-FAD2-VIC виявлення мутанта Зонд для виявлення дикого D-CL-FAD2-FAM типу Послідовність (5’–3") AGACGTTGAAGGCTAAGTACAAAGG GGCAAGTACCTCAACAACCCT VIC-ATGTTAACGGTTTAGTTCAC-MGB 6FAM-TTAACGGTTCAGTTCAC-MGB У дослідженні використовували зразки листків NEX845 і Quantum. Для підтвердження даного дослідження використовували ДНК виведених популяцій каноли. Аспекти даного винаходу включають способи розробки і/або одержання діагностичних молекул нуклеїнових кислот, приклади яких представлені і/або запропоновані в даному документі. Конкретні праймери і зонди для методу TaqMan® були розроблені, як докладно описано в даному документі, зокрема, відповідно до послідовностей ДНК, які розташовані точно або поблизу вище або нижче визначених у даному документі конкретних SNP гена fad-2. Таким чином, відповідно до деяких варіантів здійснення, даний винахід стосується визначення зиготності рослин каноли, які виробляють олію. Даний винахід стосується, зокрема, виявлення присутності ОНП, відповідно до опису в даному документі, з метою визначення того, чи містить потомство від статевого схрещування ОНП, які розглядаються, а також зиготності 5 UA 114302 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 потомства. Крім того, передбачені способи виявлення, які можуть виявитися корисними, наприклад, для дотримання вимог, що визначають передпродажний дозвіл і маркування продуктів харчування, виготовлених із рекомбінантних культурних рослин. Даний винахід стосується, зокрема, дослідження на основі флуоресцентного методу ПЛР TaqMan® за кінцевою точкою з використанням ендогенного немутантного гена fad-2 як контрольного зразка для високопродуктивного аналізу зиготності рослини каноли. Даний винахід також стосується, зокрема, розробки біплексного методу ПЛР TaqMan® за кінцевою точкою для аналізу зиготності каноли. Крім того, даний винахід стосується, зокрема, розробки наборів для дослідження гена fad-2 вирощуваної каноли. Як правило, дослідження методом TaqMan® за кінцевою точкою основані на стратегії "плюс/мінус", відповідно до якої "плюс" означає, що зразок є позитивним для досліджуваного гена, а "мінус" означає, що зразок є негативним для досліджуваного гена. У цих дослідженнях, як правило, використовується один набір олігонуклеотидних праймерів і два олігонуклеотидні зонди, причому один зонд переважно гібридизується з SNP fad-2, який мутував, а інший зонд переважно гібридизується з послідовністю fad-2 дикого типу відповідно. Переваги, пов'язані з даним винаходом, включають зменшення його залежності від якості і кількості ДНК. Крім того, для даного винаходу не потрібна тривала початкова стадія денатурації, що, якщо не здійснюється належним чином, може часто робити безуспішними інші дослідження з виявлення ОНП. Крім того, даний винахід пропонує спосіб ефективного аналізу численних зразків каноли високопродуктивним чином на промисловій основі. Ще одна перевага даного винаходу являє собою економію часу. Пропоноване дослідження методом TaqMan® за кінцевою точкою для аналізу зиготності каноли й аналізу селекції надає переваги порівняно з іншими прикладними форматами, зокрема, у цілях аналізу великої кількості зразків. Даний винахід стосується, зокрема, аналізу селекції рослин. Даний винахід пропонує новий спосіб виявлення SNP у рослинах каноли, що впливають на рівні вмісту олеїнової і ліноленової кислот у досліджуваних рослинах. Крім того, стає можливим виявлення присутності досліджуваних ОНП, використовуючи інші відомі способи виявлення нуклеїнових кислот, такі, як ПЛР або гібридизація ДНК із застосуванням зондів, які містять нуклеїнові кислоти, що описані в даному документі. У даному документі обговорюються дослідження визначеної події методом ПЛР. (Див. також статті Windelset al., Med. Fac. Landbouww, Univ. Gent (Факультет медицини і сільського господарства Гентського університету), 1999 р., 64/5b:459462). При використанні в даному документі термін "потомство" означає будь-яке покоління потомства батьківської рослини. Способи виявлення згідно із даним винаходом є особливо корисними в поєднанні із селекцією рослин, наприклад, для визначення зиготності потомства рослин після того, як батьківська рослина, яка включає розглянутий ОНП, схрещується з іншою рослиною. Досліджувані додатки і способи сприяють програмам селекції каноли, а також процесам контролю якості. Набори виявлення методом ПЛР для ліній каноли, способи їх застосування і дослідження, що описані в даному документі, тепер можна здійснювати і використовувати. Крім того, даний винахід може сприяти реєстрації продуктів і обслуговуванню продуктів. Рослину каноли, яка включає бажане сполучення гена fad-2, можна виводити, здійснюючи спочатку статеве схрещування першої батьківської рослини каноли, що представляє собою рослину каноли, вирощену з насіння кожної з ліній, які зазначені в даному документі, і другої батьківської рослини каноли, одержуючи в результаті цього множину рослин першого покоління; потім здійснюючи селекцію з першого покоління рослин, які мають бажаний ген fad-2, як передбачено в даному винаході; проводячи самозапилення першого покоління рослин, одержуючи у результаті цього множину рослин другого покоління; і потім здійснюючи селекцію з другого покоління рослин, які мають бажаний ген fad-2 згідно із даним винаходом. Ці стадії можуть додатково включати зворотне схрещування першого покоління рослин або другого покоління рослин із другою батьківською рослиною каноли або третьою батьківською рослиною каноли. Після цього можна вирощувати врожай каноли, що включає насіння каноли згідно із даним винаходом або відповідне потомство. Даний винахід додатково включає способи здійснення схрещування з використанням рослини каноли, яка включає бажане сполучення гена fad-2, як щонайменше однієї батьківської рослини. Наприклад, даний винахід включає гібридну рослину першого покоління F 1, яка має як одну або обидві батьківські рослини будь-які рослини каноли, що включають бажане сполучення гена fad-2. Крім того, в об'єм даного винаходу входить насіння, вироблене такими гібридними рослинами першого покоління F1. Даний винахід включає спосіб ідентифікації насіння гібридної рослини першого покоління F1 за допомогою схрещування обраної як приклад 6 UA 114302 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 рослини з іншою (наприклад, інбредною батьківською) рослиною, одержання врожаю і дослідження отриманого у результаті гібридного насіння з використанням способу згідно із даним винаходом. Рослини каноли, які використовуються для виробництва гібридних рослин першого покоління F1, можуть являти собою жіночі батьківські рослини або чоловічі батьківські рослини. Крім того, варто розуміти, що можна виготовляти трансгенні рослини, які містять гени fad-2, описані в даному документі. Крім того, трансгенні рослини, які включають генетичні характеристики fad-2, що описані в даному документі, можна схрещувати із рослинами, які включають інше генетичне сполучення, і в результаті цього виходить потомство, яке містить незалежно сегреговані екзогенні гени. Шляхом самозапилення відповідного потомство можна виготовляти рослини, які є гомозиготними відносно додаткових екзогенних генів. Крім того, передбачені зворотне схрещування з батьківською рослиною і схрещування з нетрансгенною рослиною з іншої лінії, а також вегетативне розмноження. У техніці також відомі й інші способи розмноження, звичайно використовувані для одержання різних рослин і ознак. Розмноження за допомогою зворотного схрещування використовується для перенесення генів, які легко піддаються інтрогресії і несуть ознаку, яка має високу здатність успадкування, у бажану гомозиготну культурну рослину або інбредну лінію, яка є рекурентною батьківською лінією. Джерело переданої ознаки називається терміном "батько-донор". Передбачається, що одержувана в результаті рослина повинна мати ознаки рекурентної батьківської (наприклад, культурної) рослини, і що бажана ознака передається від батька-донора. Після вихідного схрещування вибираються екземпляри, що мають фенотип батька-донора, які повторно схрещуються (зворотне схрещування) з рекурентною батьківською рослиною. Передбачається, що одержувана в результаті рослина повинна мати ознаки рекурентної батьківської (наприклад, культурної) рослини, і що бажана ознака передається від батька-донора. Спосіб згідно із даним винаходом являє собою високопродуктивне, засноване на флуоресценції дослідження ПЛР TaqMan® за кінцевою точкою для виявлення трансгена fad-2 у рослинах потомства і визначення рівня зиготності в рослинах потомства. Засоби згідно із даним винаходом, наприклад, олігонуклеотидні праймери і зонди, можна застосовувати для способів схрещування з використанням маркера (СВМ). Засоби згідно із даним винаходом, наприклад, олігонуклеотидні праймери і зонди, можна застосовувати у споріднених дослідженнях, таких, як дослідження поліморфізму довжини ампліфікованого фрагмента (ПДАФ), дослідження поліморфізму довжини рестрикційних фрагментів (ПДРФ), дослідження статистично ампліфікованої поліморфної ДНК (САПД), у яких ідентифікуються генетично зв'язані агрономічно корисні ознаки за допомогою виявлення SNP або простих послідовностей, що повторюються (ППП), використовуючи загальнодоступні методики, які відомі в техніці. Описані в даному документі SNP можна спостерігати в потомстві від схрещування з рослиною каноли згідно із даним винаходом (або в потомстві її і будь-якої іншої культурної рослини каноли або її різновиду), використовуючи способи СВМ. Молекули ДНК можна використовувати як маркери для даної ознаки, і способи СВМ, які є добре відомими в техніці, можна використовувати для спостереження SNP у рослинах каноли, де щонайменше одна рослина каноли згідно із даним винаходом або її потомство являє собою рослину батька або предка. Способи згідно із даним винаходом можна використовувати для ідентифікації будьякого різновиду каноли, що має досліджувані ОНП, описані в даному документі. Способи згідно із даним винаходом включають спосіб одержання рослини каноли, яка включає сполучення ОНП, що визначені в даному документі, причому вищезгаданий спосіб включає схрещування із рослиною згідно із даним винаходом. Більш конкретно, вищезгадані способи можуть включати схрещування двох рослин згідно із даним винаходом або однієї рослини згідно із даним винаходом і будь-якої іншої рослини. Зразкові способи можуть додатково включати селекцію потомства від вищезгаданого схрещування за допомогою аналізу вищезгаданого потомства відносно SNP згідно із даним винаходом, що можуть бути виявлені з використанням даного винаходу. Наприклад, даний винахід можна використовувати для спостереження зиготності рослин каноли в ході циклів схрещування з рослинами, які включають інші бажані ознаки, такі, як агрономічні ознаки, зокрема ознаки, що досліджуються в різноманітних прикладах, описаних у даному документі. Рослини, які включають досліджувані SNP і бажані ознаки, можна також виявляти, ідентифікувати, вибирати і швидко використовувати, наприклад, у наступних циклах схрещування. Досліджувані ОНП/ознаки можна також поєднувати в процесі схрещування і спостерігати згідно із даним винаходом разом з іншими ознаками, наприклад, такими, як можлива ознака (ознаки) стійкості до комах і/або ознаки стійкості до гербіцидів. Один варіант здійснення останнього являє собою рослину, що включає 7 UA 114302 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 один або більше досліджуваних SNP у поєднанні з геном, який кодує стійкість до гербіцидів, таких, як гліфосат. Відповідно до деяких варіантів здійснення даного винаходу запропоновані послідовності ДНК, що включають сусідній фрагмент, який можна використовувати як послідовність праймера, щоб виробити амплікон як продукт для діагностики однієї або декількох рослин каноли, які мають ген fad-2. Відповідно до споріднених варіантів здійснення запропоновані послідовності ДНК, які включають щонайменше 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 або більше сусідніх нуклеотидів частини послідовностей ДНК гена fad-2, що визначені в даному документі, або відповідних комплементів. Такі послідовності можуть виявитися корисними як праймери ДНК у способах ампліфікації ДНК. Амплікони, вироблені з використанням цих праймерів, можна використовувати для діагностики будь-якого сполучення і зиготності різновидів каноли, які містять ген fad-2, що згадані в даному документі. Таким чином, даний винахід також включає амплікони, які виробляються такими праймерами ДНК і гомологічними праймерами. Відповідно до наступних варіантів здійснення даного винаходу пропонуються способи одержання SNP fad-2, що передбачені даним винаходом, причому вищезгаданий спосіб включає наступні стадії: (a) статеве схрещування першої батьківської лінії каноли, яка включає один з ОНП, описаних у даному документі, і передає одну з ознак вмісту олеїнової і/або ліноленової кислоти, що описані в даному документі, і другої батьківської лінії каноли, у якій відсутні дані ОНП, і одержання в результаті цього множини рослин потомства; і (b) селекція рослин потомства за допомогою використання молекулярних маркерів. Такі способи можуть необов'язково включати додаткову стадію зворотного схрещування рослини потомства з другої батьківської лінії каноли для здійснення розмноження гомозигот або одержання гомозиготної рослини каноли, яка включає вищезгадані ознаки гена fad-2. Згідно з ще одним аспектом даного винаходу пропонуються способи визначення зиготності потомства від схрещування із вищезгаданими рослинами каноли, що мають ген fad-2. Вищезгадані способи можуть включати контакт зразка, що включає ДНК каноли, з набором праймерів згідно із даним винаходом. Коли вищезгадані праймери використовуються в реакції ампліфікації нуклеїнових кислот з геномної ДНК щонайменше від однієї з вищезгаданих рослин каноли, утворюється перший амплікон, який являє собою засіб діагностики щонайменше для одного з вищезгаданих SNP каноли, що має ген fad-2 або гени дикого типу. Такі способи додатково включають здійснення реакції ампліфікації нуклеїнових кислот, у результаті якої утворюється перший амплікон, і виявлення першого амплікону зондами, специфічними для SNP гена fad-2, який описаний у даному документі, і генів дикого типу. Способи додатково включають здійснення додатків плавлення алельної дискримінації ампліконів, що мають ренатуровані описані зонди, і порівняння відносної флуоресценції зондів, використовуваних у додатку плавлення алельної дискримінації (наприклад, із флуоресценцією відомих контрольних зразків). Відносна флуоресценція зондів показує, чи містить зразок ОНП, що розглядається, і якщо містить, то чи є гетерозиготним або гомозиготним для ОНП. Набори для виявлення ДНК можна розробляти, використовуючи композиції, описані в даному документі, у поєднанні зі способами, які добре відомі в техніці виявлення ДНК. Ці набори виявляються корисними для ідентифікації досліджуваних SNP каноли в зразку, і їх можна використовувати в способах розмноження рослин каноли, які містять дану ДНК. Набори містять послідовності ДНК, що є гомологічними або комплементарними відносно ампліконів, які, наприклад, описані в даному документі. Ці послідовності ДНК можна використовувати в реакціях ампліфікації ДНК або як зонди в способі гібридизації ДНК. Набори можуть також містити реагенти і матеріали, необхідні для здійснення способу виявлення. Термін "зонд" означає виділену молекулу нуклеїнової кислоти, до якої приєднана традиційна мітка, що виявляється, або репортерна молекула (така, як радіоактивний ізотоп, ліганд, хемілюмінесцентна речовина або фермент). Такий зонд є комплементарним відносно ланцюжка цільової нуклеїнової кислоти, у випадку даного винаходу, відносно ланцюжка геномної ДНК від однієї з вищезгаданих рослин каноли, які включають розглянуті гени fad-2, зокрема від рослини каноли або від зразка, що включає ДНК від даної події. Зонди згідно із даним винаходом включають не тільки дезоксирибонуклеїнові або рибонуклеїнові кислоти, а й також поліаміди й інші зондові матеріали, які специфічно приєднуються до цільової послідовності ДНК і які можна використовувати для виявлення даної цільової послідовності ДНК. Були розроблені специфічні зонди, які включають флуоресцентний репортер (флуорофор) і гасник, який гібридизується з цільовою ДНК між праймерами ПЛР. Молекула флуорофору приєднується до олігонуклеотидного зонда в процесі синтезу олігонуклеотидного зонда, і в 8 UA 114302 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 результаті цього олігонуклеотидний зонд одержує мітку. До олігонуклеотидного зонда можна приєднувати й інші молекули, такі, як молекули гасника. Приєднання цих молекул до олігонуклеотидного зонда не порушує функцію олігонуклеотидного зонда при гібридизації до одноланцюжкової ДНК і утворенні нового ланцюжка ДНК за допомогою процесу ампліфікації. У техніці розроблені і відомі численні флуорофори, які збуджуються при визначених довжинах хвилі. Порушення флуорофору приводить до створення флуорофором флуоресцентного сигналу, який може бути погашений гасником, розташованим у безпосередній близькості до флуорофору. Коли гасник дисоціює від флуорофору, флуоресцентний сигнал більше не гаситься, і нагромадження флуоресцентного сигналу, що прямо пропорційний до кількості цільової ДНК, можна виявляти в режимі реального часу, використовуючи автоматичний флуорометр. Флуорофори можна використовувати в сполученні, у якому спектри збудження і випромінювання значно розрізняються, таким чином, щоб мати можливість одночасного виявлення двох або більше флуорофорів. Відповідно до деяких переважних варіантів здійснення флуорофори включають флуоресцентний барвник HEX, флуоресцентний барвник TET, флуоресцентний барвник Cy 3, флуоресцентний барвник Cy 3.5, флуоресцентний барвник Cy 5, флуоресцентний барвник Cy 5.5, флуоресцентний барвник Cy 7 або флуоресцентний барвник ROX. Відповідно до одного переважного варіанта здійснення флуорофор для використання в даному способі являє собою гомогенну дослідницьку систему для виявлення в процесі ПЛР із використанням РПЕФ згідно із даним винаходом, включаючи флуоресцентний барвник FAM або флуоресцентний барвник JOE. Розроблені і відомі в техніці гасники, які гасять флуорофори при визначеній довжині хвилі. Коли гасник знаходиться в безпосередній близькості до флуорофору, флуорофор передає енергію гаснику. Гасник передає цю енергію і повертається у свій природний основний стан за допомогою випромінювального розпаду або без випромінювання. При невипромінювальному або темному розпаді енергія, передана від флуорофору, вивільняється у формі молекулярних коливань. При виборі гасника розглядаються такі якості, як низька фонова флуоресценція, висока чутливість і максимальне спектральне перекривання, щоб одержати гасник, який може забезпечувати більш широке використання флуорофорів. Відповідно до деяких переважних варіантів здійснення гасники включають гасники Dabcyl, гасники Tamra, гасник Qxl, гасник IowablackFQ, гасник IowablackRQ або гасник IRDyeQC-1. Згідно з особливо переважним варіантом здійснення гасник являє собою гасник Blackhole, нанесений як мітка на олігонуклеотидний праймер, що є антисмисловим відносно міченого FAM олігонуклеотиду. Термін "праймери" означає виділені/синтезовані нуклеїнові кислоти, які приєднуються до ланцюжка комплементарної цільової ДНК за допомогою гібридизації нуклеїнової кислоти, у результаті чого утворюється гібрид праймера і ланцюжка цільової ДНК, а потім розтягуються уздовж ланцюжка цільової ДНК за допомогою полімерази, наприклад, ДНК-полімерази. Згідно із даним винаходом пари праймерів використовуються для ампліфікації послідовності цільової нуклеїнової кислоти, наприклад, за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) або інших традиційних способів ампліфікації нуклеїнових кислот. Довжина зондів і праймерів складає, як правило, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 11 1, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 9 UA 114302 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500 або більше полінуклеотидів. Такі зонди і праймери гібридизуються специфічно з цільовою послідовністю в суворо визначених умовах гібридизації. Переважні зонди і праймери згідно із даним винаходом мають послідовність, повністю аналогічну цільовій послідовності, хоча зонди, які відрізняються від цільової послідовності і зберігають здатність гібридизації з цільовою послідовністю, можна створювати традиційними способами. Способи одержання і використання зондів і праймерів описані, наприклад, у книзі "Молекулярне клонування: лабораторний довідник", друге видання, т. 1-3, за ред. Sambrook et al., видавництво Cold Spring Harbor Laboratory Press, Колд-Спрінг-Харбор, штат Нью-Йорк, 1989 р. Пари ПЛР-праймера можна робити з відомої послідовності, наприклад, за допомогою використання комп'ютерних програм, призначених для даної мети. Праймери і зонди на основі послідовностей ДНК вище і нижче ОНП, що описані в даному документі, можна використовувати, щоб підтверджувати (і виправляти у випадку потреби) описані послідовності за допомогою традиційних способів, наприклад, здійснюючи реклонування і секвенування таких послідовностей. Зонди і праймери на основі нуклеїнових кислот згідно із даним винаходом гібридизуються в суворо визначених умовах з цільовою послідовністю ДНК. Як правило, можна використовувати будь-який традиційний спосіб гібридизації або ампліфікації нуклеїнових кислот, щоб визначати присутність ДНК зі зразка fad-2. Молекули нуклеїнових кислот або їхній фрагмент здатні до специфічної гібридизації з іншими молекулами нуклеїнових кислот у визначених умовах. При згадуванні в даному документі говорять, що дві молекули нуклеїнових кислот здатні до специфічної гібридизації одна з одною, якщо ці дві молекули здатні утворювати антипаралельну дволанцюжкову структуру нуклеїнової кислоти. Говорять, що молекула нуклеїнової кислоти є "комплементарною" відносно іншої молекули нуклеїнової кислоти, якщо вони виявляють повну комплементарність. При згадуванні в даному документі говорять, що молекули "виявляють повну комплементарність", коли кожен нуклеотид однієї молекули є комплементарним відносно нуклеотиду іншої молекули. Говорять, що дві молекули є "мінімально комплементарними", якщо вони можуть гібридизуватися одна з одною, забезпечуючи достатню стійкість, що дозволяє їм залишатися приєднаними одна до одної щонайменше у традиційних умовах "низької суворості". Аналогічним чином говорять, що молекули є "комплементарними", якщо вони можуть гібридизуватися одна з одною, забезпечуючи достатню стійкість, що дозволяє їм залишатися приєднаними одна до одної в традиційних умовах "високої суворості". Традиційні умови суворості описали Sambrooket al., (1989 р.). Таким чином, відхилення від повної комплементарності є припустимими за тієї умови, що такі відхилення не цілком позбавляють молекули здатності утворювати дволанцюжкову структуру. Щоб молекула нуклеїнової кислоти служила як праймер або зонд, їй потрібно тільки бути досить комплементарною у своїй послідовності, щоб мати здатність утворювати стійку дволанцюжкову структуру при використанні визначеного розчинника і концентрацій солей. При згадуванні в даному документі практично гомологічна послідовність являє собою послідовність нуклеїнової кислоти, яка специфічно гібридизується до комплементарної послідовності нуклеїнової кислоти, з якою її порівнювали в умовах високої суворості. Термін "суворі умови" функціонально визначається відносно гібридизації зондової нуклеїнової кислоти і цільової нуклеїнової кислоти (тобто відносно визначеної послідовність нуклеїнової кислоти, яка розглядається) за допомогою специфічної процедури гібридизації, обговорюваної в книзі Sambrooket al., (1989 р.), с. 9.52-9.55. Див. також Sambrooket al., (1989 р.), с. 9.47-9.52 і 9.569.58. Відповідно, можна використовувати нуклеотидні послідовності згідно із даним винаходом внаслідок їхньої здатності селективно утворювати подвійні молекули з комплементарними подовженнями фрагментів ДНК. Залежно від розглянутого додатка можна використовувати перемінні умови гібридизації для досягнення різних ступенів селективності зонда відносно цільової послідовності. Для додатків, що вимагають високої селективності, як правило, використовують відносно суворі умови для утворення гібридів, наприклад, вибирають умови відносно низької концентрації солі і/або високої температури, наприклад, концентрація складає від приблизно 0,50 мМ до приблизно 2,00 мМ MgCl2 при температурі від приблизно 50C до приблизно 75C. Можна одночасно змінювати температуру і концентрацію солі, або зберігати постійну температуру або концентрацію солі при зміні іншого параметра. Такі селективні умови долають у невеликому ступені, якщо взагалі долають, невідповідність між зондом і матрицею або цільовим ланцюжком. 10 UA 114302 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Виявлення послідовностей ДНК за допомогою гібридизації добре відомо фахівцям у даній галузі техніки, і описи патентів США № 4965188 і 5176995 являють собою зразкові способи гібридизаційного аналізу. Відповідно до одного зразкового варіанта здійснення даного винаходу нуклеїнова кислота специфічно гібридизується з одним або декількома праймерами (або ампліконами, або іншими послідовностями), що представлені як приклади або пропонуються в даному документі, включаючи комплементи і їхні фрагменти, в умовах високої суворості. Відповідно до одного аспекту даного винаходу маркерна молекула нуклеїнової кислоти, використовувана в даному винаході, має послідовність нуклеїнової кислоти, що визначена в даному документі як одна зі зразкових послідовностей, або комплементи і/або їхні фрагменти. Відповідно до наступного аспекту даного винаходу маркерна молекула нуклеїнової кислоти, що використовується в даному винаході, має ідентичність послідовності, що складає від 80 % до 100 % або від 90 % до 100 % відносно таких послідовностей нуклеїнових кислот. Відповідно до наступного аспекту даного винаходу маркерна молекула нуклеїнової кислоти, що використовується в даному винаході, має ідентичність послідовності, що складає від 95 %, 96 %, 97 %, 98 % і/або 99 % до 100 % відносно таких послідовностей. Такі послідовності можна використовувати як маркери в способах розмноження рослин для ідентифікації потомства від генетичного схрещування. Гібридизацію зонда і цільової молекули ДНК можна виявляти, використовуючи будь-яку кількість способів, що є відомими фахівцям у даній галузі техніки, і які можуть включати, але не обмежуються цим, флуоресцентні мітки, радіоактивні мітки, мітки на основі антитіл і хемілюмінесцентні мітки. Що стосується ампліфікації цільової послідовності нуклеїнової кислоти (наприклад, за допомогою ПЛР) із використанням визначеної ампліфікаційної пари праймерів, "суворі умови" являють собою умови, які дозволяють парі праймерів гібридизуватися переважно і з високим ступенем переваги з цільовими послідовностями нуклеїнових кислот, і в результаті цього пара праймерів має можливість зв'язування і переважно виробляти унікальний амплікон. Термін "специфічний (відносно цільової послідовності)» означає, що зонд або праймер гібридизується в суворих умовах гібридизації переважно і з високим ступенем переваги з послідовністю нуклеїнової кислоти в зразку, що включає цільову послідовність. При згадуванні в даному документі термін "ампліфікована ДНК" або "амплікон" означає продукт ампліфікації нуклеїнової кислоти цільової послідовності нуклеїнової кислоти, яка становить частину матриці нуклеїнової кислоти. Наприклад, для визначення того, що рослина каноли, одержувана в результаті статевого схрещування, містить розглянутий ОНП, який описаний у даному документі, ДНК, виділену зі зразка тканини рослини каноли, можна вводити в процес ампліфікація нуклеїнової кислоти з використанням пари праймерів, які включають праймер, отриманий з розташованої вище або нижче послідовності в геномі рослини каноли поблизу положення ОНП, і другий праймер, отриманий з їхнього іншого кінця розташованої вище або нижче послідовності в геномі рослини каноли поблизу положення ОНП, і в результаті цього виходить амплікон, який можна використовувати для виявлення присутності ОНП. Амплікон має таку довжину і послідовність, які також дозволяють виявляти ген fad-2 дикого типу або ген, що мутував. Амплікон може мати різну довжину, яка являє собою сумарну довжину пари праймерів плюс одна пара нуклеотидних основ і/або сумарну довжину пари праймерів плюс приблизно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 11 1, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 11 UA 114302 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 або 500, 750, 1000, 1250, 1500, 1750, 2000 або більше пар нуклеотидних основ (плюс або мінус будь-яке з прирощень, перерахованих вище). Елемент пари праймерів, витягнутий з геномної послідовності рослини, може знаходитися на відстані від послідовності ОНП. Ця відстань може становити від однієї нуклеотидної пари основ аж до приблизно двадцяти тисяч нуклеотидних пар основ. Використовуваний термін "амплікон" виразно виключає димери праймерів, які можуть утворюватися в реакції термічної ампліфікації ДНК. Ампліфікацію нуклеїнової кислоти можна здійснювати, використовуючи будь-який із різноманітних відомих у техніці способів ампліфікації нуклеїнової кислоти, включаючи ПЛР. У техніці відомі різноманітні способи ампліфікації, що описані, зокрема, у патенті США № 4683195 і патенті США № 4683202. Розроблені способи ампліфікації ПЛР, які дозволяють ампліфікувати аж до 22 тисяч основ геномної ДНК. Ці способи, а також і інші відомі в техніці способи ампліфікації ДНК можна використовувати для практичного здійснення даного винаходу. Послідовність SNP fad-2 можна перевіряти за допомогою ампліфікації такої послідовності з використанням праймерів, отриманих з послідовностей, які описані в даному документі, здійснюючи стандартне секвенування ДНК амплікону ПЛР або клонованої ДНК. Амплікон, що виробляється цими способами, можна виявляти множиною способів. Електрофорез в агарозному гелі і фарбування бромідом етидію являє собою розповсюджений і добре відомий спосіб виявлення ампліконів ДНК. Ще один такий спосіб являє собою генетичний бітовий аналіз, де використовується олігонуклеотид ДНК, який одночасно перекриває сусідню фланкуючу геномну послідовність ДНК і вставлену послідовність ДНК. Олігонуклеотид імобілізується в ямках мікроямкового планшета. Після ПЛР області, що розглядається (з використанням одного праймера у вставленій послідовності й одного праймера в сусідній фланкуючій геномній послідовності), одноланцюжковий продукт ПЛР може гібридизуватися з імобілізованим олігонуклеотидом і служити як матриця для реакції збільшення ланцюжка на одну основу з використанням ДНК-полімерази і мічених ддНТФ, специфічних для наступної очікуваної основи. Зчитувані показання можуть являти собою сигнал на основі флуоресценції або імуноферментного твердофазного аналізу (ІФА). Даний сигнал показує присутність вставленої/фланкуючої послідовності внаслідок успішної ампліфікації, гібридизації і подовження на одну основу. ПЛР TaqMan® являє собою спосіб виявлення і кількісного визначення присутності послідовності ДНК. Коротко, виробляється олігонуклеотидний зонд РПЕФ, який перекриває ОНП, що розглядається. Зонд РПЕФ і праймери ПЛР (щонайменше один, розташований вище, і щонайменше один, розташований нижче ОНП, що розглядається) циклічно обробляють у присутності термічно стійкої полімерази і дНТФ. Після ампліфікації можна здійснювати алельний дискримінаційний аналіз (з використанням описаного вище гідролітичного зонда TaqMan®) для визначення присутності SNP, що розглядається, і зиготності зразка. У процесі алельного дискримінаційного аналізу два різні гібридизаційні зонди (один зонд, що включає нуклеотид, комплементарний відносно послідовності ОНП, і інший зонд, що включає нуклеотид, комплементарний відносно послідовності дикого типу; причому кожний зонд включає різні введені в них флуорофори) гібридизуються з ампліконом і гідролізуются, і в результаті цього із зонда вивільняються фрагменти гасника внаслідок 5'-екзонуклеазної активності полімерази мітки, і виробляється флуоресценція. Порівняння відносної флуоресценції зонда, специфічної для гена дикого типу, і зонда, специфічного для ОНП, являє собою показник присутності і зиготності ОНП, що розглядається. Усі патенти, патентні заявки, проміжні заявки і публікації, які згадуються або цитуються в даному документі, у всій своїй повноті включаються в нього за допомогою посилання в такому ступені, у якому вони не суперечать визначеному опису даного винаходу. Наступні приклади представлені, щоб проілюструвати процедури практичного здійснення даного винаходу і продемонструвати визначені переважні варіанти здійснення даного винаходу. Ці приклади не слід витлумачувати як обмежувальні. Фахівці в даній галузі техніки повинні розуміти, що технології, які описані в наступних прикладах, являють собою конкретні підходи, використовувані для ілюстрації переважних варіантів для їхнього практичного здійснення. Однак у світлі даного винаходу фахівці в даній галузі техніки повинні розуміти, що численні 12 UA 114302 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 зміни можуть бути внесені в дані конкретні варіанти здійснення для одержання однакових або аналогічних результатів без відхилення від ідеї і виходу за межі обсягу даного винаходу. Якщо не визначені інші умови, усі процентні частки означають масові співвідношення, а всі пропорції розчинників у сумішах означають об'ємні співвідношення, якщо не зазначене інше. Якщо не визначені інші умови, використовуються наступні скорочення. п. о. - пара основ °C - градус Цельсія ДНК - дезоксирибонуклеїнова кислота РПЕФ - резонансне перенесення енергії флуоресценції ДИГ - дигоксигенін ЕДТК - етилендіамінтетраоцтова кислота т. о. - тисяча основ мкг - мікрограм мкл - мікролітр мл - мілілітр М - молярна маса ПЗ - зонд, що перекривається ПЛР - полімеразна ланцюгова реакція РТО - рослинна транскрипційна одиниця ДСН - додецилсульфат натрію ОНП - однонуклеотидний поліморфізм СРП - стандартна робоча процедура ХЦН - буферний розчин, який містить суміш хлориду натрію і цитрату натрію, pН=7,0 ТБЕ - буферний розчин, який містить суміш тріс(гідроксиметил)амінометану, борної кислоти і ЕДТК, pН=8,3 В - вольт Приклади Приклад 1. Дослідження fad-2 методом TaqMan® за кінцевою точкою Дослідження за кінцевою точкою було призначене для виявлення мутації SNP fad-2 і визначення стану зиготності рослин каноли, які містять мутацію гена fad-2 у вирощуваних популяціях. Два праймери були призначені для зв'язування висококонсервативних послідовностей ДНК, розташованих вище і нижче відносно гена fad-2. Ці праймери ампліфікували фрагмент ДНК, який містить 91 пару основ, який перекривав SNP fad-2 у рослинах каноли, які мутували і які не мутували. Мутація fad-2 у каноли була описана в роботі Huet al., (2006 р.) і охарактеризована як SNP цитозин (C)тимін (T), розташований в області експресії гена fad-2 (фіг. 1). Два нефлуоресцентні гасники (MGBNFQ) TaqMan®, що зв'язуються з малою борозною, як зонди були призначені з FAM і VIC як репортерів-барвників для виявлення присутності гена fad-2 °F дикого типу і гена fad-2 (який складається з ОНП), який мутував, відповідно. Ці зонди були призначені, щоб забезпечувати підвищену специфічність (наприклад, маючи більшу спорідненість) для виявлення fad-2 дикого типу і SNP fad-2 відповідно. Спосіб виявлення TaqMan® для рослин каноли, які містять SNP fad-2, був досліджений відносно різновиду каноли NEX 828 (що містить SNP fad-2), контрольного різновиду каноли Quantum (що не містить SNP fad-2) і зразка ДНК, виділеної з рослин, відомих як гетерозиготні для SNP fad-2. Дослідження методом TaqMan® за кінцевою точкою використовували, щоб визначати присутність SNP fad-2, а також визначати зиготність досліджуваних рослин у високопродуктивному форматі, наприклад, у форматі 96- і 384-ямкових планшетів. Приклад 1.1. Виділення геномної ДНК У даному дослідженні використовували зразки геномної ДНК (гДНК) з 625 різних рослин каноли, що містять SNP fad-2, і контрольних рослин каноли, що містять fad-2 дикого типу. Виділення гДНК здійснювали, використовуючи модифікований набір QiagenMagAttract для дослідження ДНК рослин від компанії Qiagen (Валенсія, штат Каліфорнія). Для виділення гДНК на кожен зразок використовували по чотири диски, вирізаних зі свіжих листків каноли. Кількісне визначення гДНК здійснювали способом PicoGreen відповідно до інструкцій продавця (компанія MolecularProbes, Юджин, штат Орегон). Для мети даного дослідження зразки розбавляли водою, у якій була відсутня дезоксирибонуклеаза, і отримана в результаті концентрація становила 5 нг/мкл. Приклад 1.2. Дослідження методом TaqMan® і результати Специфічні праймери і зонди TaqMan®s були призначені для використання в дослідженні методом TaqMan® за кінцевою точкою. Ці праймери і зонди були призначені для ампліфікації і 13 UA 114302 C2 виявлення області гена fad-2, яка включає ОНП, що розглядається. Ці реагенти можна використовувати в перерахованих нижче умовах для виявлення гена fad-2, який мутував, у рослинах каноли. У таблиці 1 перераховані послідовності праймерів і зондів, які були розроблені для специфічного виявлення SNP fad-2 у рослинах каноли. 5 Таблиця 1 Праймери і зонди ПЛР TaqMan® SEQ ID NO: SEQ ID NO:2 SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:4 SEQ ID NO:5 SEQ ID NO:6 10 15 20 25 30 35 Найменування Опис Послідовність D-CL-FAD2-F Прямий праймер AGACGTTGAAGGCTAAGTACAAAGG D-CL-FAD2-R2 Зворотний праймер GGCAAGTACCTCAACAACCCT Зонд для виявлення мутанта Зонд для виявлення D-CL-FAD2-FAM дикого типу Зворотний D-CL-FAD2-R праймер № 2 D-CL-FAD2-VIC VIC-ATGTTAACGGTTTAGTTCAC-MGB 6FAM-TTAACGGTTCAGTTCAC-MGB CAAGTACCTCAACAACCCTTTGG Реакційні суміші ПЛР для ампліфікації являли собою наступні: концентрована суміш 1xTaqManGTExpress, 0,9 мкм прямого праймера (SEQ ID NO: 2), 0,9 мкм зворотного праймера (SEQ ID NO: 3), 0,2 мкм мутантного зонда fad-2 (SEQ ID NO: 4), 0,2 мкм зонда дикого типу (SEQ ID NO: 5), 15 нг гДНК у сумарному об'ємі 6 мкл. Реакційну суміш ампліфікували, використовуючи наступні умови циклічної термічної обробки: дві початкові стадії при 50C протягом 2 хвилин і при 95C протягом 30 секунд; потім 40 циклів по 3 секунди при 95C і 30 секунд при 62C. Реакційні суміші витримували при 10C до витягнення із пристрою для термічної циклічної обробки. ПЛР в умовах термічної циклічної обробки можна здійснювати, використовуючи систему ПЛР у режимі реального часу ABI-AppliedBiosystems 7900 HT або пристрої для термічної циклічної обробки AppliedBiosystemsVerity від компанії LifeTechnologies (Карлсбад, штат Каліфорнія). Планшети зі зразками містили контрольний зразок ДНК із рослин каноли, які були гомозиготними відносно SNP fad-2 (NEX 828), гетерозиготними відносно SNP fad-2 або гомозиготними відносно fad-2 дикого типу (Quantum). Крім того, був використаний нематричний контрольний зразок, у якому не містилася ДНК. Після ампліфікації флуоресцентні сигнали (VIC і FAM) за кінцевою точкою зчитували, використовуючи систему ПЛР у режимі реального часу ABIAppliedBiosystems 7900 HT, відповідно до процедури зчитування планшета для алельної дискримінації, що описана виробником. Дані аналізували, використовуючи програмне забезпечення SDS 2.4 від компанії LifeTechnologies (Карлсбад, штат Каліфорнія), щоб визначити відносну флуоресценцію кожного зразка (фіг. 2). Спосіб виявлення TaqMan® для SNP fad-2 каноли досліджували, використовуючи відомі гомозиготні і гемізиготні зразки, а також зразки дикого типу. Аналіз флуоресценції, яку здійснював кожен зонд (реагуючий зразок), порівняно з флуоресценцією, яку здійснювали зонди контрольних зразків, дозволяв визначати зиготність кожного зразка. Для дослідження використовували два різні зворотні праймери. Праймер D-CL-FAD-2-R (SEQ ID NO: 6) не функціонував з такою ж ефективністю, як праймер D-CL-FAD-2-R2 (SEQ ID NO: 3). Праймер DCL-FAD-2-R2 (SEQ ID NO: 3) приєднувався до геномної ДНК із більш високою специфічністю і забезпечував більш надійне виявлення of SNP fad-2. Дане дослідження продемонструвало високу специфічність виявлення SNP fad-2 і генів дикого типу каноли, і не робило і не підсилювало які-небудь хибно-позитивні результати, що виявляються, від контрольних зразків. Ці праймери і зонди можна використовувати для виявлення SNP fad-2 і гена fad-2 дикого типу каноли, і дані умови і реагенти є застосовними до досліджень зиготності. 14 UA 114302 C2 15 UA 114302 C2 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 5 10 15 20 25 30 35 40 45 1. Спосіб визначення зиготності рослини каноли, яка включає ген fad-2, причому згідно зі згаданим способом: одержують зразок геномної ДНК із рослини каноли; гібридизують зразок геномної ДНК з першим праймером і другим праймером, причому перший праймер і другий праймер містять SEQ ID NO: 2 і SEQ ID NO: 3; піддають згаданий зразок умовам полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), при яких утворюється амплікон; надають можливість кожному з першого зонда і другого зонда гібридизуватися з вказаним ампліконом протягом періоду часу при температурі від 50 до 70 C, причому вищезгаданий перший зонд і вищезгаданий другий зонд містять SEQ ID NO: 5 і SEQ ID NO: 4, де кожний із вищезгаданого першого зонда і вищезгаданого другого зонда помічений флуоресцентним барвником і гасником; збільшують вищезгадану температуру після періоду часу; вимірюють флуоресценцію вищезгаданого першого зонда, вищезгаданого другого зонда або їх комбінації; і визначають зиготність вищезгаданої рослини каноли. 2. Спосіб за п. 1, у якому вищезгаданий амплікон складається з 91 пари основ. 3. Спосіб за п. 1, в якому зразок геномної ДНК містить мутовану fad-2 послідовність, що має однонуклеотидний поліморфізм, де вищезгаданий однонуклеотидний поліморфізм складається з поліморфізму C→T. 4. Спосіб за п. 3, в якому зразок геномної ДНК додатково містить fad-2 послідовність дикого типу. 5. Спосіб за п. 1, причому вищезгаданий спосіб використовують для перевірки інтрогресії схрещування кросбредних рослин каноли. 6. Спосіб за п. 1, в якому вищезгаданий перший зонд гібридизується з ділянкою мутованої fad-2 послідовності, що має однонуклеотидний поліморфізм (SNP), і вищезгаданий другий зонд гібридизується з ділянкою fad-2 послідовності дикого типу. 7. Спосіб за п. 6, у якому вищезгаданий перший зонд включає FАМ як вищезгаданий флуоресцентний барвник на кінці 5' вищезгаданого першого зонда і гасник MGB на кінці 3' вищезгаданого першого зонда. 8. Спосіб за п. 6, у якому вищезгаданий другий зонд мітять VIC на кінці 5' вищезгаданого другого зонда і гасником MGB на кінці 3' вищезгаданого другого зонда. 9. Спосіб за п. 1, у якому вищезгаданий другий зонд включає SEQ ID NO: 4. 10. Спосіб за п. 1, причому результати флуоресценції у вищезгаданому способі аналізують безпосередньо в планшет-рідері. 11. Спосіб за п. 1, у якому вищезгаданий зразок ДНК одержують із рослини каноли в полі. 12. Спосіб за п. 1, у якому стадія збільшення включає стадію, на якій підвищують вищезгадану температуру при практично рівномірному прирощенні температури протягом періоду часу. 13. Спосіб за п. 1, у якому вищезгадану флуоресценцію, яка виробляється кожним з вищезгаданого першого зонда і вищезгаданого другого зонда протягом стадії збільшення, вимірюють протягом кожного прирощення стадії збільшення вищезгаданої температури. 14. Набір для здійснення способу за п. 1, причому вищезгаданий набір включає перший праймер, який складається з SEQ ID NO: 2, другий праймер, який складається з SEQ ID NO: 3, перший зонд, який складається з SEQ ID NO: 5, і другий зонд, який складається з SEQ ID NO: 4. 16 UA 114302 C2 Комп’ютерна верстка В. Мацело Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 17