Мутант глікозилування fsh

1. Рекомбінантний FSH, в якому альфасубодиниця FSH містить ПОСЛІДОВНІСТЬ №3, а бета-субодиниця FSH містить ПОСЛІДОВНІСТЬ №4. C2 1 3 них терапевтичних заходах є обов'язковим у методиках допоміжної репродукції (ART), наприклад, у заплідненні in vitro (IVF), FVF у поєднанні з інтрацитоплазматичним введенням сперми (IVF/ICSI) та трансплантації зародка (ЕТ), а також для індукції овуляції (ОІ) у ановуляторних хворих, що зазнають запліднення in vivo природним шляхом або шляхом внутрішньоматкового запліднення (IUI). Патент США №4,589,402 і патент США №4,845,077 розкривають очищений людський FSH, що не містить LH, та його застосування для запліднення in vitro. ЕР 322438 розкриває білок із активністю FSH (щонайменше 6200Од/мг), по суті позбавлений активності LH, де α-субодиниця і βсубодиниця FSH можуть бути, відповідно, субодиницями дикого типу або їхніми специфічними скороченими формами. Для досягнення терапевтичного ефекту необхідним є тривале лікування, як правило, впродовж 8-Ю послідовних днів, а подеколи до 21 дня для стимулювання фолікулогенезу у жінок та майже до 18 місяців у гіпогонадотропних чоловіків для індукування сперматогенезу. Рекомбінантний hFSH, як правило, вводять шляхом внутрішньом'язових або підшкірних щоденних ін'єкцій, що пов'язано з дискомфортом та потенційною можливістю виникнення місцевих реакцій на ділянці ін'єкції. Зменшення частоти введень полегшило б лікування і забезпечило б зручність введення гонадотропінів із більшою стерпністю та легкістю для хворих. с. Глікозилування FSH Гонадотропіни є глікопротеїнами, кожна субодиниця яких має зв'язані з аспарагіном (Nзв'язані) бічні олігосахаридні ланцюги, які є важливими для їх in vivo активності і функціонування. Додання вуглеводів (глікозилування) до поліпептидів є посттрансляційним явищем, наслідком якого є додання цукрових ланцюгів до специфічних аспарагін-зв'язаних (N-зв'язаних) або серин/треонін-зв'язаних (О-зв'язаних) амінокислот. Вуглеводні структури, у протилежність до інваріантної амінокислотної послідовності білкової частини глікопротеїнів, є варіабельними і цю особливість називають мікрогетерогенністю. Наприклад, сайта N-глікозилування на одному й тому самому білку можуть містити різні вуглеводні структури. Окрім того, навіть на одному й тому самому сайті глікозилування на даному глікопротеїні можна знайти різні вуглеводні структури. Ця гетерогенність є наслідком позаматричного синтезу вуглеводів. N-глікозилування білків відбувається конкретно на консенсусній послідовності Asn-Xaa-Ser/Thr і, меншою мірою, на консенсусній послідовності Asn-Xaa-Cys, де Хаа може бути залишком будьякої амінокислоти. Присутність консенсусного трипептиду не є, однак, достатньою умовою для забезпечення глікозилування залишку аспарагіну. Наприклад, N-глікозилування послідовності AsnPro-Ser/Thr відбувається з частотою, у 50 разів меншою за глікозилування інших консенсусних послідовностей Asn-Xaa-Ser/Thr. Людський FSH містить чотири N-зв'язані сайти глікозилування: два на спільній α-субодиниці у положеннях 52 і 78 і два на β-субодиниці у положеннях 7 і 24. Вуглеводи, приєднані до α 88879 4 субодиниці FSH, є критичними для складання димерів, їх цільності, секретування та трансдукції сигналу, у той час як вуглеводи β-субодиниці є важливими для складання димерів, їх секретування та виведення гетеродимерів із системи кровообігу. Гелвей (Galway) та інші, Endocrinology 1990; 127(1): 93-100, демонструє, що варіанти FSH, одержані у лінії клітин СНО з Nацетилглюкозамінтрансферазою-І або у лінії клітин СНО, дефективних за перенесенням сіалової кислоти, є активними in vitro такою ж мірою, що і FSH, секретований клітинами дикого типу або очищений гіпофізарний FSH, але їм бракує in vivo активності, ймовірно унаслідок швидкого виведення недостатньо глікозилованих варіантів із сироватки. Д'Антоніо (D'Antonio) та інші, Human Reprod., 1999; 14(5): 1160-1167, описує різні ізоформи FSH, які циркулюють у системі кровообігу. Згадані ізоформи мають ідентичні амінокислотні послідовності, однак різняться за ступенем їх посттрансляційної модифікації. Було встановлено, що менш кисла ізоформна група виводиться in vivo швидше за кислу ізоформну групу, можливо унаслідок різниць у вмісті сіалової кислоти між ізоформами. Більше того, Бішоп (Bishop) та інші, Endocrinology 1995; 136(6): 2635-2640, дійшов висновку, що період напіввиведення із системи кровообігу, як видається, є головним визначником активності in vivo. Ці спостереження призвели до виникнення гіпотези, суть якої полягає у тому, що період напіввиведення FSH із кровотоку може бути збільшеним шляхом введення додаткових сайтів глікозилування для підвищення вмісту сіалової кислоти у поліпептиді. d. Варіанти FSH Агоністи FSH зі збільшеним періодом напіввиведення з кровотоку були одержані шляхом злиття карбоксикінцевого пептиду hCG (CTP) з нативним рекомбінантним людським FSH (rhFSH). Складова СТР містить амінокислоти від 112-118 до 145 з чотирма О-зв'язаними сайтами глікозилування, які знаходяться у положеннях 121, 127, 132 та 138. Патент США №5,338,835 і патент США №5,585,345 розкривають β-субодиницю модифікованого FSH, подовжену на С-кінцевому Glu складовою СТР hCG. Стверджують, що одержаний модифікований аналог має біологічну активність нативного FSH, але подовжений період напіввиведення з кровотоку. Патент США №5,405,945 розкриває, що карбоксикінцева ділянка β-субодиниці hCG або її варіант виявляють значний вплив на виведення CG, FSH та LH. Патент США №5,883,073 розкриває одноланцюгові білки, до складу яких входить дві αсубодиниці, з агоністичною або антагоністичною активністю відносно CG, TSH (тиреотропний гормон), LH та FSH. Патент США №5,508,261 розкриває гетеродимерні поліпептиди, що мають зв'язувальну спорідненість до рецепторів LH та FSH, до складу яких входить α-субодиниця глікопротеїнового гормону та β-субодиничний поліпептид, який не зустрічається за природних умов, де згаданий β-субодиничний поліпептид являє собою ланцюг амінокислот, що містить чотири сполучені послі 5 довності, кожна з яких вибрана з переліку специфічних послідовностей. Клейн (Klein) та інші (2003) розкриває одноланцюговий аналог FSH із подовженим періодом напіввиведення з кровотоку, де αі β-субодиниці зв'язуються олігопептидом, що містить два N-зв'язаних сайти глікозилування. WO 01/58493 розкриває 77 мутацій, які можуть бути здійснені на α-субодиниці FSH та 51 мутацію, які можуть бути здійснені на β-субодиниці FSH для поліпшення періоду напіввиведення FSH з кровотоку in vivo. WO 01/58493 розкриває, що мутантні α- і β-субодиниці можуть застосовуватись індивідуально (1 додатковий сайт глікозилування) або у поєднанні (2 додаткові сайти глікозилування). 128 мутантів-"кандидатів" ідентифікували шляхом застосування 50 моделей об'ємної структури FSH, які одержали виключно на основі структури hCG та порівняльного аналізу первинної структури FSH та hCG, незважаючи на лише 32% ідентичність між βсубодиницями hCG та FSH. WO 01/58493 не розкриває одержання або випробування жодних αабо β-субодиниць FSH, де сайт глікозилування було введено шляхом сайт-спрямованого мутагенезу. Існує клінічна потреба у продукті, який повністю або частково забезпечував би усі терапевтично важливі ефекти FSH і який міг би вводитись рідше, аніж доступні на цей час продукти FSH, і який, відповідно до варіанта, якому віддають перевагу, забезпечував би більш стабільний рівень активності циркулюючого FSH, порівняно з відповідними показниками, які одержують за допомогою сучасних методів лікування. Цей винахід спрямовано на такі продукти, а також на способи одержання таких продуктів. Цей винахід стосується мутантного FSH, де αсубодиниця FSH включає ПОСЛІДОВНІСТЬ №3 і де β-субодиниця FSH включає ПОСЛІДОВНІСТЬ №4. Мутантний FSH може бути N-глікозилований на 0, 1, 2, 3, 4, 5 або 6 залишках аспарагіну згаданого мутантного FSH. Глікозилованою може бути N83 мутантної α-субодиниці. Глікозилованою може бути N55 мутантної β-субодиниці. Цей винахід також стосується виділеної ДНК, що кодує α-субодиницю мутантного FSH, що містить ПОСЛІДОВНІСТЬ №3. Цей винахід також стосується виділеної ДНК, що кодує β-субодиницю мутантного FSH, що містить ПОСЛІДОВНІСТЬ №4. Цей винахід також стосується вектора, що містить ДНК, що кодує α-субодиницю мутантного FSH, що містить ПОСЛІДОВНІСТЬ №3. Згаданий вектор може бути експресійним вектором. Цей винахід також стосується вектора, що містить ДНК, що кодує β-субодиницю мутантного FSH, що містить ПОСЛІДОВНІСТЬ №4. Згаданий вектор може бути експресійним вектором. Цей винахід також стосується вектора, що містить першу ДНК і другу ДНК, де згадана перша ДНК кодує α-субодиницю мутантного FSH, що містить ПОСЛІДОВНІСТЬ №3, і де згадана друга ДНК кодує β-субодиницю мутантного FSH, що містить ПОСЛІДОВНІСТЬ №4. Згаданий вектор може бути експресійним вектором. Цей винахід також стосується клітини, що містить вектор, що містить ДНК, що кодує α 88879 6 субодиницю мутантного FSH, що містить ПОСЛІДОВНІСТЬ №3. Згаданий вектор може бути експресійним вектором. Згадана клітина може бути клітиною ссавця. Цей винахід також стосується клітини, що містить вектор, що містить ДНК, що кодує βсубодиницю мутантного FSH, що містить ПОСЛІДОВНІСТЬ №4. Згаданий вектор може бути експресійним вектором. Згадана клітина може бути клітиною ссавця. Цей винахід також стосується клітини, що містить вектор, що містить першу ДНК і другу ДНК, де згадана перша ДНК кодує α-субодиницю мутантного FSH, що містить ПОСЛІДОВНІСТЬ №3, і де згадана друга ДНК кодує β-субодиницю мутантного FSH, що містить ПОСЛІДОВНІСТЬ №4. Згаданий вектор може бути експресійним вектором. Згадана клітина може бути клітиною ссавця. Цей винахід також стосується клітини, що містить перший і другий вектор, де перший згаданий вектор містить ДНК, що кодує α-субодиницю мутантного FSH, що містить ПОСЛІДОВНІСТЬ №3, і де другий згаданий вектор містить ДНК, що кодує βсубодиницю мутантного FSH, що містить ПОСЛІДОВНІСТЬ №4. Згаданий вектор може бути експресійним вектором. Згадана клітина може бути клітиною ссавця. Цей винахід також стосується способу одержання FSH-мутанта, що включає культивування клітин ссавця, здатних до глікозилування білків, де згадані клітини містять перший експресійний вектор, що містить ДНА, що кодує α-субодиницю FSH, що містить ПОСЛІДОВНІСТЬ №1, і другий експресійний вектор, що містить ДНК, що кодує βсубодиницю FSH, що містить ПОСЛІДОВНІСТЬ №2. Цей винахід також стосується композиції, що місить FSH-мутант і фармацевтично прийнятний носій або наповнювач, де α-субодиниця FSH містить ПОСЛІДОВНІСТЬ №3, і де β-субодиниця FSH містить ПОСЛІДОВНІСТЬ №4. Цей винахід також стосується способу лікування безплідного ссавця, що включає введення ссавцю, який цього потребує, ефективної кількості FSH-мутанта, де α-субодиниця FSH містить ПОСЛІДОВНІСТЬ №3, і де β-субодиниця FSH містить ПОСЛІДОВНІСТЬ №4. Цей винахід також стосується способу стимулювання фолікулогенезу у ссавця, що включає введення ссавцю, який цього потребує, ефективної кількості FSH-мутанта, де α-субодиниця FSH містить ПОСЛІДОВНІСТЬ №3, і де β-субодиниця FSH містить ПОСЛІДОВНІСТЬ №4. Цей винахід також стосується способу індукування гіперстимуляції яєчників у ссавця, що включає введення ссавцю, який цього потребує, ефективної кількості FSH-мутанта, де α-субодиниця FSH містить ПОСЛІДОВНІСТЬ №3, і де βсубодиниця FSH містить ПОСЛІДОВНІСТЬ №4. На Фіг.1 показана плазмідна карта експресійного вектора, що застосовується для експресії субодиниці αΗ83Ν. На Фіг.2 показана плазмідна карта експресійного вектора, що застосовується для тимчасової експресії субодиниці βΕ55/V57Τ. 7 На Фіг.3 показана плазмідна карта експресійного вектора, що застосовується для експресії βΕ55/V57Τ. На Фіг.4 показана морфологія GM-1. Фіг.4А і Фіг.4С: MALDI-TOF мас-спектрометрія (масспектрометрія з іонізацією методом лазерної десорбції у матричному розчині з часопролітним аналізатором) GM-1 та Gonal-F. Фіг.4B: SDS-PAGE (електрофорез у поліакриламідному гелі у присутності додецилсульфату натрію) аналіз GM-1 та Gonal-F. На Фіг.5 показані характеристики GM-1 на моделі дводенної індукції овуляції у нестатевозрілих пацюків. Незважаючи не те, що було показано, що наслідком підвищення вуглеводного вмісту FSH може бути збільшення періоду його напіввиведення з кровотоку in vivo, поліпшення періоду напіввиведення FSH із кровотоку є більш складною проблемою, аніж просте додання додаткових сайтів глікозилування. Консенсусна послідовність глікозилування є необхідною умовою додання вуглеводів, oднак вона не є достатньою для забезпечення того, що сайт додання вуглеводу буде використаним. Інші фактори, наприклад, місцеве укладання білка та конформація під час біосинтезу, вирішують, чи приєднається олігосахарид на даному сайті консенсусної послідовності. Окрім того, консенсусна послідовність повинна знаходитись у такому положенні, щоб глікозилування згаданого сайту не перешкоджало зв'язуванню рецептора або не погіршувало укладання, конформацію чи стабільність глікопротеїну. До цього часу аналоги FSH зі збільшеним періодом напіввиведення обмежувались гібридними білками, де гібридна частина поліпептиду включала додаткові сайти глікозилування. Аналоги FSH із підвищеним періодом напіввиведення ще належало одержати введенням сайтів глікозилування шляхом сайт-спрямованого мутагенезу. Знання структури FSH є критичним у разі додання сайтів глікозилування шляхом сайтспрямованого мутагенезу, оскільки консенсусні залишки повинні додаватись у положеннях, що є сумісними з доданням вуглеводів. У разі, якщо сайт глікозилування вводять шляхом мутації, мутовані залишки не повинні руйнувати тривимірної структури білка або суттєво погіршувати бажану функцію білка, наприклад, зв'язування рецептора або активацію. Окрім того, консенсусні залишки не повинні додаватись таким чином, що вони опиняються захованими у нутрощах укладеної білкової структури, оскількиу такому разі зменшується ймовірність здійснення глікозилування на конкретному сайті. До недавніх часів відомості про тривимірну структуру гонадотропінів обмежувались двома незалежними повідомленнями про кристалічну структуру hCG: одна структура частково деглікозилованого hCG (Лепторн (Lapthorn) та інші, 1994; By (Wu) та інші, 1994) і структура трикомпонентного комплексу повністю глікозилованого hCG і двох Fv фрагментів, визначена з низькою роздільною здатністю (Тегоні (Tegoni) та інші, 1999). 88879 8 Незважаючи на те, що hCG і FSH мають по суті ідентичні схеми укладання, дві згадані структури суттєво різняться (Фокс (Fox) та інші, 2001), і докладна структура окремих амінокислотних залишків молекули FSH не може бути відповідним чином модельована на основі попередньо визначених структур hCG (By (Wu) та інші, 1994; Лепторн (Lapthorn) та інші, 1994). Цей винахід спрямовано на FSH-мутант, який розробили виключно на основі тривимірної кристалічної структури молекули людського FSH (Фокс (Fox) та інші, 2001). FSH-мутант відповідно до цього винаходу ("GM-1") модифікували для введення представлених нижче замін для одержання додаткових сайтів упізнання глікозилування: H83N αсубодиниці та E55N/V57T β-субодиниці. Глікозилуватись може один або декілька додаткових сайтів глікозилування рекомбінантного FSH. Один або декілька додаткових сайтів глікозилування мутантного FSH можуть глікозилуватись in vitro або in vivo. [042] FSH-мутант відповідно до цього винаходу можна одержати за допомогою будь-якого відповідного способу, відомого у цій галузі. До цих способів належить конструювання нуклеотидних послідовностей, що кодують відповідні FSHмутанти та експресія амінокислотної послідовності у відповідному трансфікованому хазяїні. FSHмутант відповідно до цього винаходу можна також одержати шляхом хімічного синтезу або комбінуванням хімічного синтезу та методів рекомбінантних ДНК. [043] FSH-мутант відповідно до цього винаходу може містити α- та β-субодиниці FSH у формі двох окремих поліпептидних ланцюгів, де два згадані ланцюги димеризуються in vivo таким чином, що утворюють димерний поліпептид, або він може містити одноланцюгову генно-інженерну конструкцію, що містить дві субодиниці, ковалентно зв'язані пептидним зв'язком або пептидним лінкером. Амінокислотні залишки лінкерного пептиду можуть демонструвати властивості, які суттєво не перешкоджають активності FSH-мутанта. FSH-мутант відповідно до цього винаходу може мати збільшений період напіввиведення порівняно з FSH дикого типу. FSH-мутант відповідно до цього винаходу може також мати підвищену стабільність порівняно з FSH дикого типу. FSH-мутант може містити олігосахариди на 0, 1, 2, 3, 4, 5 або 6 N-зв-'язаному сайтах глікозилування. FSH-мутант може містити один або декілька ізоформ FSHмутанта, де кожна ізоформа містить олігосахариди на 0, 1, 2, 3, 4, 5 або 6 N-зв'язаному сайтах глікозилування. Нуклеотидна послідовність, що кодує α- або βсубодиниці FSH-мутантів відповідно до цього винаходу, може конструюватись шляхом виділення або синтезування нуклеотидної послідовності, що кодує субодиницю батьківського FSH, наприклад, hFSH-альфа або hFSH-бета, з амінокислотними послідовностями, представленими ПОСЛІДОВНІСТЮ №3 і ПОСЛІДОВНІСТЮ №4, відповідно. Нуклеотидна послідовність у подальшому може змінюватись таким чином, щоб забезпечити можливість заміни відповідних амінокислотних 9 залишків. Згадана нуклеотидна послідовність може модифікуватись сайт-спрямованим мутагенезом. Як альтернатива, нуклеотидна послідовність може бути одержана шляхом хімічного синтезу, де олігонуклеотиди конструюються на основі специфічної амінокислотної послідовності FSH-мутанта. Нуклеотидна послідовність, що кодує поліпептид, може вводитись до рекомбінантного вектора і функціонально зв'язуватись із контрольними послідовностями, необхідними для експресії поліпептиду у бажаній трансфікованій клітині-хазяїні. Фахівець у цій галузі може зробити вибір серед цих векторів, послідовностей контролювання експресії та хазяїв без зайвого експериментування. Згаданим рекомбінантним вектором може бути вектор з автономною реплікацією, тобто вектор, що існує як позахромосомна структура, реплікація якої не залежить від реплікації хромосоми, наприклад, плазміда. Як альтернатива, згаданим вектором може бути вектор, який, у разі введення до клітини-хазяїна, інтегрується у геном клітинихазяїна і реплікується разом із хромосомою(-ами), з якою(-ими) він об'єднався. Згаданим вектором може бути експресійний вектор, у якому нуклеотидна послідовність, що кодує поліпептид відповідно до цього винаходу, є функціонально зв'язаною з додатковими сегментами, необхідними для транскрипції нуклеотидної послідовності. Згаданий вектор можна одержати з плазмідної або вірусної ДНК. Ряд придатних експресійних векторів для експресії у клітинах-хазяях, які були згадані у цьому описі, є комерційно доступними або описаними у літературі. Згаданий рекомбінантний вектор може додатково містити послідовність ДНК, яка надає можливість реплікування згаданого вектора у відповідній клітині-хазяїні. Прикладом такої послідовності (у разі, коли клітиною-хазяїном є клітина ссавця) є точка початку реплікації SV40. Згаданий вектор може також містити селективний маркер, наприклад, ген, продукт якого доповнює Дефект клітинихазяїна, наприклад, ген, що кодує дигідрофолатредуктазу (DHFR) або ген, який забезпечує стійкість до лікарського препарату, наприклад, ампіциліну, канаміцину, тетрацикліну, хлорамфеніколу, неоміцину, гігроміцину або метотрексату. Згаданий вектор може містити також ампліфікувальний ген, наприклад, DHFR, завдяки чому клітини, що мають численні копії ампліфікувального гена та фланкувальні послідовності, у тому числі ДНК мутантного FSH, можуть відбиратись на відповідних живильних середовищах. Термін "контрольні послідовності", що застосовується у цьому описі, означає усі компоненти, необхідні або прийнятні для експресії поліпептиду відповідно до цього винаходу. Прикладами відповідних контрольних послідовностей для спрямування транскрипції у клітинах ссавців є ранні та пізні промотори SV40 та аденовірусу, наприклад, головний пізній промотор аденовірусу 2, промотор МТ-1 (ген металотіонеїну) та передранній промотор гена людського цитомегаловірусу (CMV) Цей винахід також стосується виділеної ДНК, що кодує α-субодиницю H83N та виділеної ДНК, що кодує β-субодиницю E55N/V57T FSH. Нуклео 88879 10 тидні послідовності цього винаходу, що кодують FSH-мутанти, незалежно від того, чи були вони одержані сайт-спрямованим мутагенезом, синтезом, полімерною ланцюговою реакцією або іншими способами, можуть факультативно містити також нуклеотидну послідовність, що кодує сигнальний пептид. Згаданий сигнальний пептид є присутнім у тому разі, коли поліпептид повинен секретуватись клітинами, у яких він експресується. Такий сигнальний пептид, у разі присутності, повинен належати до числа тих, що розпізнаються клітиною, вибраною для експресії поліпептиду. Згаданий сигнальний пептид може бути гомологічним (наприклад, бути таким, який є за нормальних умов зв'язаним із субодиницею hFSH) або гетерологічним (тобто походити з іншого джерела, аніж hFSH) поліпептиду чи може бути гомологічним або гетерологічним клітині-хазяїну, тобто бути сигнальним пептидом, який за нормальних умов експресується клітиною-хазяїном або який за нормальних умов клітиною-хазяїном не експресується. Для продукування поліпептидних субодиниць відповідно до цього винаходу може застосовуватись будь-який придатний хазяїн, у тому числі клітини або лінії клітин бактерій, грибів (у тому числі дріжджів), рослин, комах, ссавців або клітини "чи лінії клітин інших придатних тварин, а також трансгенні тварини або рослини. Прикладами придатних клітин-хазяїв ссавців є лінії клітин яєчника китайського хом'ячка (СНО) (наприклад, CHO-KL; АТСС (Американська колекція типових культур) CCL-61), лінії клітин зеленої мавпи (COS) (наприклад, COS 1 (АТСС CRL-1650), COS 7 (АТСС CRL-1651); клітини мишей (наприклад, NSIO), лінії клітин нирок хом'ячка (ВІ-ЕK) (наприклад, АТСС CRL-1632 або АТСС CCL-10) і людські клітини (наприклад, ВЕK 293 (АТСС CRL-1573)), а також клітини рослин у культурі клітин тканини. У цій галузі відомі додаткові придатні лінії клітин, доступні з колекцій, наприклад, з Американської колекції типових культур, США. Способи введення екзогенної ДНК до клітин-хазяїв ссавців включають трансфекцію, опосередковану фосфатом кальцію, електропорацію, трансфекцію, опосередковану DEAE (діетиламіноетил)-декстраном, трансфекцію, опосередковану ліпосомами та застосування векторів на основі вірусних геномів. Клітини можуть культивуватись у живильному середовищі, придатному для продукування поліпептиду із застосуванням способів, відомих у цій галузі. Клітина, наприклад, можуть культивуватись у хитальних колбах, шляхом ферментації у лабораторних або промислових масштабах (у тому числі шляхом безперервної ферментації, періодичної ферментації, періодичної ферментації з підживленням або твердофазної ферментації) у лабораторних або промислових ферментерах у придатному середовищі або за умов, які забезпечують можливість експресії та/або виділення поліпептиду. Культивування відбувається у придатному живильному середовищі, що містить джерела вуглецю і азоту та неорганічні солі, за методами, відомими у цій галузі. Придатні живильні середовища є доступними від комерційних постачальників або можуть готуватись за опублікованими про 11 писами (наприклад, у каталогах Американської колекції типових культур). Якщо поліпептид секретується до живильного середовища, його можна виділяти безпосередньо зі згаданого середовища. Якщо поліпептид не секретується, його можна виділяти з клітинних лізатів. Одержаний мутантний поліпептид FSH може виділятись способами, відомими у цій галузі. Наприклад, він може виділятись із живильного середовища традиційними способами, у тому числі (але без обмеження) центрифугуванням, фільтруванням, екстрагуванням, сушінням розпилюванням, випарюванням або осадженням. Мутантні поліпептиди FSH можуть очищатись різноманітними способами, відомими у цій галузі, у тому числі (але без обмеження) хроматографуванням (іонообмінним, афінним, гідрофобним, хроматофокусувальним та гель-хроматографуванням), методами електрофорезу (наприклад, препаративним ізоелектричним фокусуванням), завдяки різниці розчинності (наприклад, осадженням сульфатом амонію), SDS-PAGE або екстрагуванням. Цей винахід також стосується фармацевтичної композиції, що містить FSH-мутант відповідно до цього винаходу. Такі фармацевтичні композиції можуть застосовуватись для стимулювання фолікулогенезу, наприклад, у поєднанні з індукцією овуляції або методиками допоміжної репродукції (ART). Оскільки FSH-мутант відповідно до цього винаходу є особливо ефективним у відношенні індукування розвитку та визрівання численних фолікулів, він є особливо придатним для застосування у методиках допоміжної репродукції, у яких бажаним є збирання численних овоцитів. Як альтернатива, у разі ретельного підбирання дози, FSH-мутант відповідно до цього винаходу може застосовуватись для індукування монофолікулогенезу для ОІ або нечисленного фолікулогенезу (приблизно до трьох фолікулів) для IUI для запліднення in vivo. Монофолікулогенез може забезпечуватись також зменшеною дозою FSHмутанта або рідшим введенням дози, порівняно з традиційними препаратами FSH. Наприклад, препарат FSH відповідно до цього винаходу для ОІ може вводитись у дозі 225-400МОд через три дні або у менших дозах у залежності від реакції хворого. Реакція хворого може відслідковуватись за допомогою двовимірної ультразвукової ехографії. FSH-мутант відповідно до цього винаходу може застосовуватись у схемах контрольованої гіперстимуляції яєчників (СОН). Стандартні схеми СОН включають фазу регуляції за типом негативного зворотного зв'язку, впродовж якої виділення ендогенного лютеїнізуючого гормону (LH) інгібується введенням агоніста гонадотропінвивільнювального гормону (GnRH), з подальшою стимуляторною фазою, на якій розвиток фолікулів (фолікулогенез) індукується щоденним введення фолікулостимулювального гормону (FSH), як правило, у дозі приблизно 150-225МОд/добу. Як альтернатива, стимулювання розпочинають FSH після спонтанної або індукованої менструації, з подальшим введенням GnRH-антагоніста (із започаткуванням, як правило, приблизно на шостий день стимуляторної фази). У разі появи щонайменше 3 88879 12 фолікулів >16мм (одного 18мм), вводять разову ударну дозу hCG (5-10000МОд) для імітації імпульсного викиду природного LH і індукування овуляції. Виділення овоцитів відбувається через 3638год. після ін'єкції hCG. FSH-мутант відповідно до цього винаходу може застосовуватись також для ОІ та IUІ. FSHстимуляцію препаратом відповідно до цього винаходу розпочинають після спонтанної або індукованої менструації у добовій дозі 75-150МОд. Коли 1 фолікул або 3 фолікули досягнуть діаметра щонайменше 16мм, вводять разову ударну дозу hCG для індукування овуляції. Запліднення здійснюють in vivo шляхом регулярних статевих зносин або IUІ. Оскільки FSH-мутант відповідно до цього винаходу може мати збільшений період напіввиведення, порівняно з препаратами FSH дикого типу, у схемах, опис яких було наведено вище, можуть застосовуватись нижчі (у МОд) дози FSH та/або вони можуть модифікуватись шляхом скорочення FSH-стимуляторного періоду, з досягненням такої самої або кращої реакції з точки зору кількості та життєздатності фолікулів. Наприклад, у разі застосування препарату FSH відповідно до цього винаходу, адекватного фолікулогенезу можна досягти з добовими дозами, що дорівнюють або приблизно дорівнюють 50-150МОд FSH, відповідно до варіанта, якому віддають перевагу, 50-100МОд, відповідно до варіанта, якому віддають більшу перевагу, що дорівнюють або приблизно дорівнюють 5075МОд FSH. Введення FSH здійснюють, як правило, на добовій або напівдобовій основі. Період введення може бути меншим або становити приблизно 14 днів, відповідно до варіанта, якому віддають перевагу, бути меншим або становити приблизно 12 днів, відповідно до варіанта, якому віддають більшу перевагу, бути меншим або становити приблизно 11 днів або 10 днів. У разі 01, препарати FSH-мутанта відповідно до цього винаходу можуть вводитись у дозах 25-150МОд FSH/добу, відповідно до варіанта, якому віддають перевагу, 50-125МОд FSH/добу. Для лікування безпліддя у чоловіків, препарат FSH-мутанта відповідно до цього винаходу може вводитись у дозі 3´150-300МОд/тиждень, доки сперматогенез не досягне рівнів, адекватних для запліднення шляхом регулярних статевих зносин або шляхом застосуванням методик допоміжної репродукції. Завдяки довшому періоду напіввиведення мутантного FSH відповідно до цього винаходу, він може вводитись як препарат пролонгованої дії. Традиційний FSH може вводитись у дозі, що дорівнює або приблизно дорівнює 300МОд через день із досягненням таких самих результатів, як і у разі введення кожного дня у дозі, що дорівнює або приблизно дорівнює 150МОд. Словосполучення "пролонговані" означає препарати FSH, які можуть вводитись рідше, аніж через два дні. Мутантний FSH відповідно до цього винаходу може вводитись через три дні, через чотири дні, через п'ять днів, через шість днів або через сім днів із досягненням подібних або кращих результатів, порівняно з щоденним введенням традиційного FSH. 13 Відповідно до одного аспекта, FSH-мутант або композиція, що містить FSH-мутант, застосовуються для виготовлення лікарського препарату для лікування захворювань, розладів або станів. Відповідно до іншого аспекта, поліпептид або фармацевтична композиція відповідно до цього винаходу застосовуються у способі лікування ссавця, зокрема, людини, що включає введення ссавцю, який цього потребує, такого поліпептиду або фармацевтичної композиції. Фахівцям у цій галузі буде зрозуміло, що ефективна кількість поліпептиду, препарату або композиції відповідно до цього винаходу залежить, inter alia, від захворювання, дози, схеми введення лікарського засобу, незалежно від того, вводять поліпептид, препарат або композицію незалежно або у поєднанні з іншими лікарськими засобами, періоду напіввиведення згаданої композиції із сироватки та від загального стану здоров'я хворого. За типовим варіантом, ефективна доза препарату або композиції відповідно до цього винаходу є достатньою для забезпечення терапевтичного ефекту. FSH-мутант відповідно до цього винаходу може вводитись у композиції, що містить один або декілька фармацевтично прийнятних носіїв або наповнювачів. "Фармацевтично прийнятний" означає носій або наповнювач, який не викликає жодних небажаних ефектів у хворих, яким він вводиться. Такі фармацевтично прийнятні носії та наповнювачі є добре відомими у цій галузі і поліпептид відповідно до цього винаходу може вводитись до складу фармацевтичних композицій добре відомими способами (дивись, наприклад, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18 видання, під редакцією АР. Геннаро (A.R. Gennaro), Mack Publishing Company (1990); Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, під редакцією С. Фрокер (S. Frokjaer), Л. Хогаард (L. Hovgaard), Taylor&Francis (2000); Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3 видання, під редакцією А. Кібб (Α. Kibbe), Pharmaceutical Press (2000)). Фармацевтично прийнятними наповнювачами, які можуть застосовуватись у композиціях, що містять поліпептид відповідно до цього винаходу, є, наприклад, буферні агенти, стабілізувальні агенти, консерванти, ізотонічні агенти, неіонні поверхневоактивні речовини або детергенти, змочувальні компоненти, антиоксиданти, заповнювачі або наповнювачі, хелатоутворювачі і співрозчинники. Фармацевтичні композиції відповідно до цього винаходу, що містять FSH-мутант, можуть виготовлятись у різноманітних формах, у тому числі у формі рідин, наприклад, готових до застосування розчинів або суспензій, гелів, у ліофілізованій або будь-якій іншій придатній формі, наприклад, у формі порошку або кристалів, придатних для виготовлення розчину. Форма композиції може залежати від конкретного показання, за яким її застосовують і буде очевидною для фахівця у цій галузі. Фармацевтична композиція, що містить FSHмутант відповідно до цього винаходу, може вводитись внутрішньовенним, внутрішньом'язовим, внутрішньоочеревинним, внутрішньошкірним, підшкірним, під'язиковим, букальним, інтраназальним, 88879 14 черезшкірним, інгаляційним або будь-яким іншим прийнятним шляхом, наприклад, за методом PowderJect або ProLease або за допомогою шприца-ін'єктора. Спосіб введення може залежати від конкретного показання, за яким композиція застосовується, і буде очевидним для фахівця у цій галузі техніки. Композиція може вводитись підшкірним шляхом, оскільки це може надати можливість хворому здійснення самостійного введення. Фармацевтичні композиції відповідно до цього винаходу можуть вводитись у поєднанні з іншими лікарськими засобами. Ці лікарські засоби можуть включатись як складова частина тієї самої фармацевтичної композиції або можуть вводитись окремо від поліпептиду відповідно до цього винаходу, одночасно або відповідно до будь-якої іншої прийнятної схеми введення лікарського засобу. На додаток до цього, поліпептид, препарат або фармацевтична композиція відповідно до цього винаходу може застосовуватись як допоміжний засіб з іншими способами лікувального впливу. Цей винахід має численні аспекти, які ілюструються наведеними нижче необмежувальними прикладами. Приклад 1 Одиночні FSH-мутанти Ідентифікація можливих сайтів глікозилування Об'ємну кристалічну структуру людського FSH застосовували для ідентифікування можливих сайтів глікозилування у α- і β-субодиниць FSH. Кожна асиметрична одиниця кристалічної структури має дві молекули FSH (чотири субодиниці). Дві молекули FSH взаємно накладали і порівнювали, причому кожний залишок візуально перевіряли для ідентифікування потенційних сайтів Nглікозилування. Кристалографічну структуру FSH об'єднували зі знанням взаємодії FSH/рецептора FSH (FSHR) для додаткової допомоги у виборі потенційних сайтів N-глікозилування. Принципові критерії конструювання полягали у мінімальному руйнуванні об'ємної структури, мінімальному руйнуванні прогнозованих сайтів зв'язування і активації та прогнозованої об'ємної структури, сумісної з глікозилуванням. Виходячи з вищенаведених критеріїв, з амінокислотної послідовності FSH одержали двадцять одиночних мутантів (8α і 12β), у тому числі два наведених нижче мутанти: α-субодиниця Η83Ν; β-субодиниця E55N/V57T. Тимчасова експресія одиночних FSH-мутантів Кожен із мутантів одержали шляхом сайтспрямованого мутагенезу подібно до опису, наведеному у Прикладі 3. Мутанти тимчасово експресувались у невеликій кількості у клітинах CHODukx разом з комплементарною субодиницею дикого типу подібно до опису, наведеному у Прикладі 4. Твердофазний імуноферментний аналіз (ELISA) одержаних культуральних супернатантів показав придатність 19 з 20 мутантів до тимчасової експресії. Рівні тимчасової експресії контрольних препаратів і мутантів знаходились у межах 01,95мкг/мл із середнім значенням 0,59мкг/мл і медіаною 0,5мкг/мл, відповідно, при неодноразово 15 підтвердженому рівні експресії 0мкг/мл при псевдотрансфекціях. Морфологічний аналіз одиночних FSHмутантів Аліквоти концентрованих культуральних супернатантів тимчасової експресії одиночних FSHмутантів піддавали електрофоретичному аналізу за невідновних умов (електрофорез у поліакриламідному гелі у присутності додецилсульфату натрію), що дозволило відділити інтактні гетеродимери FSH від вільних α- і β-субодиниць. Білки електрофоретично переносили до PVDF (полівініліденфторид) і аналізували із застосуванням первинних антитіл, спрямованих проти α- і βсубодиниць FSH. Під час попереднього добору перевірили цілий ряд первинних антитіл різних постачальників, які подеколи застосовували і у подальшому при проведенні підтверджувальних аналізів, однак найчастіше застосовували такі первинні антитіла: Chromaprobe BHS104 (біотиніловане поліклональне козяче антитіло проти αсубодиниці FSH) (1,5мкг/мл) і Chromaprobe BHS 105 (мишаче моноклональне антитіло проти βсубодиниці FSH) (1,5мкг/мл). Дані морфологічного аналізу двох додаткових типів доповнили результати вестерн-блотингу інтактних гетеродимерних проб. Проби мутантів та контрольних препаратів із дисоційованими гетеродимерами, які піддавали вестерн-блотингу, та електрофоретично відділені імунні осади мутантів та контрольних препаратів із дисоційованими гетеродимерами, які піддавали авторадіографії, метаболічним шляхом мітили за допомогою 35S-Cys. З 19 експресованих FSH-мутантів лише п'ять продемонстрували підвищений ступінь глікозилування, що засвідчувалось зсувом розподілу середньої молекулярної маси субодиниці або гетеродимеру. П'ять мутантів продемонстрували підвищений ступінь глікозилування, у тому числі один α-субодиничний мутант і чотири βсубодиничні мутанти, у тому числі βE55N/V57T. Цікаво те, що α-субодиничний мутант Η83Ν не показав ознак підвищеного рівня глікозилування, однак, як видається, викликав появу підвищеного відносного вмісту гетеродимерів у білковій популяції, порівняно з відносним вмістом гетеродимерів серед субодиниць FSH дикого типу, коекспресованих за тих самих тимчасових умов. Період напіввиведення тимчасово експресованих одиночних FSH-мутантів Фармакокінетику п'яти гіперглікозилованих одиночних мутантів, які одержали шляхом тимчасової експресії, у тому числі β Ε55Ν/V57Τ, порівнювали з Gonal-F. Gonal-F являє собою рекомбінантну форму FSH, що не відрізняється від нативного hFSH. Кількісне визначення вмісту FSH у ін'єкційному матеріалі та у пробах сироватки пацюків, які відбирали у визначені періоди часу після ін'єкції для кожного фармакокінетичного експерименту, здійснювали за допомогою ELISA. Жоден з 5 одиночних мутантів, у тому числі βсубодиничний мутант E55N/V57T, не продемонстрував періоду напіввиведення, який перевищував би період напіввиведення контрольного Gonal-F. 88879 16 Очищення і аналіз мутантів, одержаних шляхом глікозилування на одному сайті Три з чотирьох гіперглікозилованих одиночних β-субодиничних мутантів, у тому числі мутант E55N/V57T, експресували і очищали засобами імуноафінного хроматографування. In vitro активність трьох гіперглікозилованих β-субодиничних мутантів, у тому числі мутанта E55N/V57T, порівнювали з рекомбінантним FSH за (і) здатністю конкурувати з FSH, міченим радіоактивним ізотопом 125 І, за зв'язування з мембранними препаратами, що містять рецептор людського FSH (Ki) та за (ії) здатністю стимулювати продукування FSHRсполученого цАМФ (ЕС50): βE55N/V57T rhFSH Ki 8,6´10-10Μ 4,8´10-10Μ ЕС50 3,9´10-11Μ 1,2´10-11Μ Вищенаведені результати показують, що βсубодиничний мутант E55N/V57T мав in vitro активність, порівняну з активністю FSH дикого типу. Фактично кожен з трьох одиночних βсубодиничних мутантів мав in vitro активність, порівнянну з активністю FSH дикого типу. Більше того, мас-спектрометричний аналіз очищених одиночних β-субодиничних мутантів показав, що зсуви розподілу маси спостерігались у кожного з трьох мутантів. Жоден з одиночних глікозилованих мутантів, однак, не продемонстрував суттєво подовженого періоду напіввиведення під час визначення фармакокінетичних характеристик очищених білків після одноразової внутрішньовенної ін'єкції нестатевозрілим пацюкам-самицям. Порівняно з rhFSH, період напіввиведення якого становив 3,8±0,6год., період напіввиведення βE55N/V57T дорівнював 4,8±0,4год. Приклад 2 Продукування і аналіз мутантів подвійного глікозилування Унаслідок нездатності одиночних α- і βсубодиничних мутантів до поліпшення періоду напіввиведення FSH, два одиночних αсубодиничних мутанти об'єднали з трьома одиночними β-субодиницями у процесі тимчасової експресії з одержанням шести різних подвійних мутантів, у тому числі GM-1, який включав αсубодиничний мутант Η83Ν і β-субодиничний мутант E55N/V57T. [078] П'ять із шести подвійних мутантів, у тому числі GM-1, були здатними до експресування. П'ять експресійних подвійних мутантів аналізували на здатність до стимулювання продукування FSHR-сполученого цАМФ. Кожен із п'яти подвійних мутантів, у тому числі і GM-1, був порівнянним із rhFSH щодо здатності до стимулювання in vivo продукування FSHR-сполученого цАМФ. [079] Фармакокінетику тих самих п'яти подвійних мутантів FSH порівнювали також із рекомбінантним hFSH і CTP-FSH. Результати, наведені у Таблиці 1, вказують на те, що період напіввиведення GM-1 значно перевищував період напіввиведення rhFSH і наближався до періоду напіввиведення CTP-FSH. 17 88879 Таблиця 1 Фармакокінетика Білок rhFSH CTP-FSH GM-1 t1/2 (год) 3,4±0,5 7,6±2,6 5,1±1,6 Підвищений період напіввиведення GM-1 викликає подив, приймаючи до уваги те, що одиночний β-субодиничний мутант E55N/V57T сам по собі не впливав на період напіввиведення. Додатковий подив викликає підвищений період напіввиведення GM-1, приймаючи до уваги, що α-субодиничний 18 мутант Н83N не викликав посилення глікозилування. Приклад 3 Продукування GM-1 кДНК α- і β-субодиниць людського FSH субклонували у векторі pDONR (фірма Invitrogen). Для введення N-зв'язаних сайтів глікозилування до α- і β-субодиниць FSH застосовували набір для сайтспрямованого мутагенезу QuikChange™ (фірма Stratagene). У системі QuikChange™ застосовуються два синтетичні олігонуклеотидні праймери, що містять бажану(-і) мутацію(-ії). Наведені нижче пари олігонуклеотидів застосовувались для введення N-зв'язаних сайтів глікозилування: Таблиця 2 Олігонуклеотиди Субодиниця α α β β Мутація Η83Ν Η83Ν Ε55Ν, V57T Ε55Ν, V57T Олігонуклеотид cacacggcgtgcaactgcagtacttg caagtactgcagttgcacgccgtgtg gcactctcactgtttcatatgtcaggttcttgaaggtacatgttttctg cagaaaacatgtaccttcaagaacctgacatatgaaacagtgagagtgc Послідовність мутантів було підтверджено за допомогою набору для секвенування АВІ PRISM BigDye™ Terminator v3.0 Ready Reaction Cycle Sequencing Kit з подальшим аналізом за допомогою генетичного аналізатора АВІ PRISM 310. Мутанти αΗ83Ν і βΕ55Ν/V57Τ субклонували у модифікованому експресійному векторі рСІ за методикою клонування Gateway™ (фірма Invitrogen) з одержанням плазмід р13251 і р13252, як показано на Фіг.1 і Фіг.2. Експресійний вектор рСІ ссавців (фірма Promega) попередньо перетворили на вектор цілеспрямованої доставки GATEWAY за допомогою системи перетворення векторів GATEWAY (фірма Invitrogen). Експресійний вектор рСІ містить передранній енхансер/промотор людського цитомегаловірусу для регулювання експресії вставленого гена, інтрон у зворотному напрямку відносно гена для стимулювання експресії і пізній сигнал поліаденілування мавпячого вірусу SV 40 у прямому напрямку відносно введеного гена для термінації транскрипції. Мутант αΗ83Ν також субклонували у векторі Dα з одержанням плазміди р13538, як показано на Фіг.3. Вектор Dα є похідною pCLH3AXSV2DHFR. Вектор модифікували для включення гетерологічного інтрону із синтетичним донором сплайсованого фрагмента з інтрону А гена α-субодиниці гонадотропіну (що містить акцептор сплайсованого фрагмента) у зворотному напрямку відносно 2тис. п.н. фрагмента Xbal-Pstl. Гетерологічний інтрон розміщується між промотором та сайтом клонування Xhol, завдяки чому він опиняється на 5' нетрансльованій ділянці транскрипту ДНК. Докладніше вектор Dα був описаний Келтон (Kelton) та іншими, Моl. Cell Endocrinol, 89: 141-151 (1992). Приклад 4 Експресія мутантного FSH GM-1, глікозиляційний мутант FSH, вперше одержали ("GM-1, партія 1") шляхом котрансфекції ПОСЛІДОВНІСТЬ № 5 6 7 8 p13251 (αΗ83Ν) і p13251 (βE55N/V57T) для тимчасової експресії гонадотропіну у безсироватковому культуральному середовищі. Для ліпофектамінопосередкованої трансфекції у промислових масштабах (12-24 колб Т175) клітини CHO-Dukx висівали (1,3´107клітин/колбу) на культуральне середовище (MEM а(+) (мінімальне підтримувальне середовище), 10% FBS (сироватка зародка великої рогатої худоби), 1% L-глутаміну) за 18-24год. до трансфекції. Для трансфекції клітин готували як основну кількість суміші ліпофектаміну 2000/середовища Оптімем (1:17,6), так і суміш ДНК/Оптімем за таким прописом: 33мкг ДНК на кожну субодиницю (у загальній кількості 66мкг) на колбу Т175. Через 20хв. після змішування ошімем/ДНК та оптімем/ліпофектаміну, комплекси ДНК/ліпофектамін у середовищі оптімем наносили (-10мл/колбу) на нещодавно підживлені (43,8мкл/колбу) клітинні моношари. Після 4-6год. При температурі 37°С клітинні моношари підживлювали 50 мл середовища для вирощування. Приблизно через 24год. після трансфекції клітини переносили до виробничого живильного середовища (Sigma CHO PFM, доповненого L-глутаміном або до запатентованого фірмою Serono середовища Sigma CHO PFM C0234). Клітини з кондиціонованого виробничого середовища збирали через 48год. Приклад 5 Клони мутантного FSH Протоклони Котрансфектування клітин CHO-DUKX αΗ83Ν у Dα (плазміда №13538) та βE55N/V57T/ y CIattR (плазміда №13252) у співвідношенні 1:3 здійснювали за стандартним кальційфосфатним методом. Протоклони одержували через 48год. після трансфекції шляхом висівання клітин на селекційне середовище (МЕМа(-), 10% dFBS, 4мM розчин 19 L-глутаміну) (10000 клітин/лунку) у 96-лункових планшетах (загалом 1596 лунок). Приблизно через 2 тижні протоклони розділяли 1:8 на селекційному середовищі, що містило 0,02мкМ МТХ (метотрексат). Згаданий процес розділення повторювали шляхом підвищення концентрації метотрексату (0,1 мкМ (192 лунки), 0,5мкМ, 1,0мкМ (116 лунок)) впродовж 6-8 тижнів з 116 протоклонами, які вижили при 1,0мкМ концентрації метотрексату. Експресію 116 протоклонів оцінювали за допомогою DSL ELISA (безпосередній мономаркерний твердофазний імуноферментний аналіз) із застосуванням проб 24год. експресії з 96-лункових планшетів (у 1,0мкМ МТХ і 10% FBS). Експресія коливалась у межах від рівня, що не піддавався визначенню, до 3,72мкг/мл. Сімнадцять протоклонів із найвищим рівнем експресії висівали на 24 лункові планшети та у колбі Т25 із подальшим збереженням на холоду кожної культури у вигляді набору з 3 флаконів. Два протоклони з максимальним рівнем експресії відтаювали і висівали для підтвердження рівня експресії у колбах Т25. Об'ємна продуктивність GM1-21 і GM1-22 становила 1,74мкг/мл і 0,74мкг/мл, відповідно, з питомою продуктивністю 5,06 відносного відсотка густини і 1,28 відносного відсотка густини, відповідно. На основі цих результатів, GM1-21 відібрали для клонування і продукування другої партії GM-1 у бугелях, вміст яких перемішується під час обертання, як описано у Прикладі 6. Клони Клонування з кінцевим розведенням розпочинали шляхом інокуляції 96-лункових планшетів 0,25, 0,5, 1,0 та 2,0 клітинами GM-1-21/лунку, відповідно. Клонувальне середовище являло собою DMEM (модифіковане за способом Дульбекко середовище Іглa)/F12, що містило 10% cFBS та 1% L-глутаміну за відсутності МТХ. Усі лунки перевіряли за допомогою мікроскопа і будь-які лунки, що містили численні клітини, ліквідували. Після вирощування впродовж приблизно 2 тижнів, популяцію клітин пересівали на 24 лункові планшети і, зрештою, у колби Т25. Після досягнення клітинами рівня 80-100% злиття, об'ємну продуктивність визначали за допомогою DSL FSH ELISA (проби містили 10% FBS). 8 найкращих клонів пересівали у колби Т75 для визначення 24год. об'ємної та питомої експресії. Проби кожного клону (у вигляді набору з 3 флаконів) зберігали на холоді у середовищі DMEM/F12, що містило 10% cFBS, 1% L-глутаміну і 10% DMSO (диметилсульфоксид). CHO-B1-GM1-21-98 демонстрували об'ємну продуктивність 7,21мкг/мл із питомою продуктивністю 6,25 відносного відсотка густини. У протилежність до цього, CHO-B1-GM1-21-107 демонстрували найвищу питому продуктивність (7,71 відносного відсотка густини) у поєднанні з об'ємною продуктивністю, яка становила 5,81мкг/мл. CHO-B1-GM1-21-98 і CHO-B1-GM1-21-107 пересівали у чотири колби Т175. Приблизно при 90% рівні злиття перед-МСВ (25 флаконів кожного клону) зберігали на холоді у середовищі DMEM/F12, що містило 10% FBS, 1% L-глутаміну і 10% DMSO. Культура GM1-21-98 (7 пасаж) містила 3,26млн. клітин/флакон, а культура GM1-21-07 (6 пасаж) 88879 20 містила 6,1млн. клітин/флакон. Флакон із пробою кожної культури пересилали до фірми Charles River Laboratories (Malvern, штат Пенсільванія) для перевірки на відповідність вимогам доброякісної медичної практики. Тести включали: виявлення фактора IX мікоплазм, перевірку стерильності, провокаційну пробу на вірус лімфоцитарного хоріоменінгіту з мітогенактивованою протеїнкіназою, реакцію гемаглютинації, довгостроковий аналіз in vitro індукування клітинних фокусів для виявлення ксенотропного вірусу лейкемії мишей, довгостроковий вірусологічний тест бляшкоутворення для виявлення вірусу лейкемії мишей та ізоферментний аналіз. Кожну пробу піддавали перевірці усіма тестами. Приклад 6 Додаткова експресія мутантного FSH GM-1 продукували шляхом вирощування протоклону GM1-21, який було описано у Прикладі 5, у двох 850см2 бугелях, вміст яких перемішувався під час обертання ("GM-1, партія 2"). Об'єм безсироваткового виробничого середовища (DMEMF12+IFCS), кондиціонованого у цій серії, дорівнював 2600мл. Невелику кількість (13мл) концентрованого культурального супернатанту, що містила приблизно 0,2мг GM-1, залишили на збереженні при температурі -80°С у 'середовищі SRBI, оскільки 36мл аліквоту концентрованого культурального супернатанту втратили під час перенесення шляхом діалізу. Кількісне визначення здійснювали за допомогою DSL Active® FSH ELISA із застосуванням перевідного множника 1МОд=138нг FSH. Приклад 7 Очищення мутантного FSH Одержання проби Виробничі середовища, що містили мутантний FSH, збирали, фільтрували за допомогою 0,22мкм фільтрувальних блоків і заморожували при температурі -70°С. Цільові білки у середовищах відтаювали впродовж ночі при температурі 4°С і концентрували шляхом ультрафільтрації із застосуванням приладу Ultrasette Screen Channel TFF, мембрани 10 K Omega, P/N 0S010C70 (фірма Pall Life Science). Осад на мембранах збирали і діалізували впродовж ночі проти 0,1Μ розчину трис-буфера (рН7,4), що містив 0,5Μ розчин NaCl (3´5л). Діалізований білок збирали, фільтрували (0,22мкм) і негайно очищали або зберігали при температурі -70°С до очищення. Очищення шляхом імуноафінного хроматографування Глікозилований мутант GM-1 очищали на анти-FSH імуноафінній смолі В5 (фірма Serobio), що містила 2,2мг анти-FSH антитіла на 1мл смоли. Колонка OmniFit (1,5см´10см) містила шар об'ємом 10,2мл. Для попереднього врівноваження смоли застосовували 0,1Μ розчин трис-буфера (рН7,4), що містив 0,5Μ розчин NaCl. Діалізований неочищений білок завантажували в колонку із розрахунку 1мл/хв. Колонку послідовно промивали (п'ять об'ємів колонки) 0,1Μ розчином трис-буфера (рН7,4), що містив 0,5Μ розчин NaCl, 100мм розчином бікарбонату амонію (рН7,6) (п'ять об'ємів колонки) і цільовий білок елюювали (18-20 об'ємів колонки) 1Μ розчином ΝΗ4ΟΗ. Фракції, що містили 21 елюйований білок, змішували, нейтралізували льодяною оцтовою кислотою і концентрували шляхом ультрафільтрації у кюветі з перемішуванням (фірма Amicon) із застосуванням мембрани YM 10 (фірма Amicon). Осад на мембрані піддавали діалізу на діалізаторі Pierce Snakeskin зі смугою пропускання 10кДа проти 4´5л води впродовж 24год. Діалізований білок збирали і концентрували на Centriprep YM 10 зі зменшенням об'єму до приблизно одного мл. Визначення характеристик Середнє виділення очищеного білка шляхом цього одностадійного процесу імуноафінного хроматографування становить 31,4-52,9% із чистотою гетеродимеру від 73,8% до 80,6%, де концентрацію білка визначали шляхом аналізу амінокислотного складу, а формульна маса, за попереднім визначенням, становила 35000 Да за розподілом глікозилованих субодиниць, який визначали за допомогою MALDI-TOF. Ідентичність білка підтвердили секвенуванням N-кінцевого пептиду. Усі N-кінцеві послідовності, які могли бути ідентифіковані у GM-1, є кінцями αабо β-субодиниць FSH. Незважаючи на те, що ідентичність однієї смуги білка малого відносного вмісту, виявленої забарвленням сріблом, встановити не вдалось, дані відповідають >80% рівню чистоти субодиниць. Приклад 8 Морфологія мутантного FSH Для визначення розподілу глікозилованих форм очищеного білка, GM-1 і Gonal-F піддавали MALDI-TOF мас-спектрометрії. Мас-спектральний аналіз, зображений на Фіг.4, показує 26% зростання відносного вмісту масових класів, що містять гіперглікозиловані форми у GM-1, порівняно з Gonal-F, де вони становлять 36,8% від загального обсягу глікозилованих субодиниць, у протилежність до 29,2% глікозилованих субодиниць у GonalF. Різниця MALDI-TOF мас-спектрів Gonal-F і GM-1 відповідає зсувам розподілу середніх молекулярних мас субодиниць і.гетеродимерів, виявлених PAGE із забарвленням сріблом та вестернблотингом (Фіг.4В). За даними MALDI-TOF мас-спектрометрії, GM1, як видається, відповідно до варіанта, якому віддається перевага, зберігає гетеродимерну конформацію αβ, зображену на Фіг.4С, у протилежність до довільного розподілу дилерів αα, αβ і ββ, що спостерігається у Gonal-F. Це дозволяє висунути припущення про менший рівень дисоціації GM-1, порівняно з Gonal-F, за умов піддання проб MALDI-TOF мас-спектрометрії, і відповідає припущенню можливості більш високої термодинамічної або кінетичної стабільності гетеродимеру GM-1. Модель глікозилування GM-1 обчислювали як біноміальний розподіл довільного ступеню заповнення шести сайтів розгалуженими (з 2 ланцюгами), фукозилованими, дисіалілованими, глікозилованими формами без класів для повністю неглікозилованих субодиниць і порівнювали з фактичними мас-спектрами. Результати свідчать про більш високий (0,021 проти 0,0), порівняно з прогнозованим, ступінь заповнення крайнього класу (α0), більш низький (0,095 проти 0,214) ступінь 88879 22 заповнення (α1 або β0) класу, більш високий (0,516 проти 0,428) ступінь заповнення (а2 або β1) класу, більш високий (0,312 проти 0,285) ступінь заповнення (а3 або β2) класу і більш низький (0,056 проти 0,071) ступінь заповнення β3 класу. Приклад 9 Аналіз мутантного FSH In vitro зв'язування мутантного FSH Ефективність GM-1, партія 1 і GM-1, партія 2 визначали аналізом продукування FSHRсполученого цАМФ. Вирощували великі партії клітин СНО, які забезпечували рекомбінантне експресування рецептора людського FSH або рецептора людського LH, і руйнували їх азотною кавітацією (20хв. врівноважування до 900фунтів/дюйм2 (6,2МПа)) з різким зниженням тиску) у 0,025Μ розчині трис-буфера (рН7,4), що містив 0,25Μ розчин цукрози, 10мм розчин MgCl2, 1мм розчин EDTA і одну частину на тисячу суміші інгібітора протеаз фірми Sigma (p8350). Після попереднього просвітлення (10хв´1000´g при температурі 4°С) мембранні фракції осаджували (60хв´100000´g при температурі 4°С) шляхом ультрацентрифугування. Мембранні фракції ресуспендували у зв'язувальному буфері (0,01Μ розчин трис-буфера (рН7,4), що містив 5мм розчин MgCl2), визначали концентрацію білка за допомогою реакції на білок Bradford (фірма BioRad) і зберігали у замороженому стані при температурі 80°С до майбутнього застосування. Конкурентному аналізу, як правило, піддавали 15мкг мембранного білка/лунку, який ніс, відповідно, FSHR або LHR (рецептор лютеїнізуючого гормону). Зв'язування радіоліганду визначали на 96лункових планшетах (100мкл/лунка з пробою). Як аналітичний буфер застосовували 0,01Μ розчин трис-буфера (рН7,4), що містив 5мм розчин MgCl2, 0,1% розчин BSA, 0,3нМ розчин 125I-hCG (для LHR) або 0,4нМ розчин 125I-FSH (для FSHR). Конкурентний GM-1 розбавляли аналітичним буфером і змішували з лігандом, міченим радіоактивним ізотопом, перед доданням мембран, що несли рецептор. Неспецифічне зв'язування визначали у присутності 500нМ розчину неміченого hCG або FSH. Зв'язувальну реакційну суміш витримували до врівноважування впродовж 90хв. при температурі 37°С зі збовтуванням. Реакцію зв'язування закінчували фільтрацією через мембрану з низьким зв'язуванням білка (дурапор) (фірма Мillіроrе Multiscreen), попередньо інкубовану у аналітичному буфері. Лунки фільтра тричі промивали зв'язувальним буфером, що мав температуру танення льоду (аналітичний буфер без сироваткового альбуміну великої рогатої худоби), сушили і вирізали. Рівень зв'язаної радіоактивності визначали за допомогою гамма-лічильника HP Cobra II із застосуванням попередньо запрограмованого вікна детектування, специфічного для випромінювання 125І. Дані аналізували за допомогою односайтової моделі і програми Graph Pad Prizm. In vitro функціонування мутантного FSH Функцію GM-1, партія 1 і GM-1, партія 2 визначали за допомогою дозозалежних кривих продукування цАМФ у клітинах СНО, трансфікованих рецептором гонадотропіну, які описувались вище. 23 88879 Кваліфікаційні дані щодо виділення двома партіями згаданого білка наведені у поданій нижче Таблиці 3: Таблиця 3 In vitro функціональні та рецепторзв'язувальні характеристики GM-1 Білок/Партія GM-1/1 GM-1/2 FSHR EC50 61,2±4,5´10-12Μ 20,9±2,0´10-12Μ FSHR Ki 1,9±0,3´10-9Μ 2,3±0,6´10-9Μ Приклад 10 Стабільність мутантного FSH Стабільність біоактивності GM-1 досліджували впродовж трьох місяців із застосуванням стерильної аліквоти GM-1, яку впродовж трьох місяців витримували при температурі 4°С. GM-1 цієї аліквоти перевіряли на продукування FSHR-сполученого цАМФ у час нуль днів, через сім днів, через 32 дні і через 91 день. ЕС50 GM-1 впродовж 91-денного збереження при температурі 4°С змінилась менше ніж у два рази. Ці дані вказують на те, що біоактивність GM-1, який зберігається при температурі 4°С, залишається стабільною до трьох місяців. 24 Приклад 11 Активність мутантного FSH На Фіг.5 зображені характеристики GM-1, визначені на моделі дводенної індукції овуляції у нестатевозрілих пацюків. При введенні одноразовою дозою рекомбінантний hFSH не викликав овуляторної реакції, у той час як GM-1 овуляторну реакцію викликав. Більше того, характеристики GM-1, визначені аналізом приросту маси яєчників за Стілменом-Полі (Steelman-Pohley), були порівнянними з відповідними характеристиками Gonal-F (дані не наведені). Дози, випробувані на Фіг.5, відповідають 6, 12 і 24МОд FSH. При перевірці FSH-CTP (Organon 36286) на цій моделі у одноразовій дозі (10МОд) за схемою введення трьох доз (4´25%, 2´50% і 1´100%), середня кількість яйцеклітин на тварину становила 16,3±3,8, 19,1±3,6 і 21,5±3,9, відповідно (дані не наведені). За вищенаведеними даними, GM-1 у дозі 12МОд (1´100%) викликав середню овуляторну реакцію 9,4±2,1 яйцеклітин на тварину (6,8±1,6 яйцеклітин на тварину при 6МОд і 14,6±3,6 яйцеклітин на тварину при 24МОд). Дані вказують на можливість того, що GM-1 може виявитись більш придатним "моноовуляторним" засобом або таким, що краще контролюється змінами схеми введення лікарського засобу. 25 88879 26 27 88879 28 29 88879 30 31 88879 32 33 88879 34 35 88879 36 37 Комп’ютерна верстка Т. Чепелева 88879 Підписне 38 Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601