Імунологічні тести на активність ендопептидаз із зміненою націленістю

Реферат: Винахід стосується способу виявлення активності ендопептидаз зі зміненою націленістю та aнти-SNAP-25 антитіл, які зв'язуються з епітопом, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок Р1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A з продукту розщеплення SNAP25. UA 104456 C2 (12) UA 104456 C2 UA 104456 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 [01] Дана заявка на патент претендує на пріоритет відповідно до § 119(e) розділу 35 Зводу законів США відповідно до попередньої заявки на патент США № 61/160217, поданої 13 березня 2009 р., зміст якої повністю включений в дану заявку за допомогою посилання. [02] Послідовності, охарактеризовані в даному описі, наведені в переліку послідовностей, поданому разом з даною заявкою, який повністю включений у дану заявку за допомогою посилання. [03] Здатність токсинів клостридій, таких як, наприклад, ботулінічні нейротоксини (BoNT, ), BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F й BoNT/G, і правцевий нейротоксин (TeNT), інгібувати нейронну передачу сигналу знаходить широке застосування в терапії й косметології, див., наприклад, William J. Lipham, Cosmetic and Clinical Applications of Botulinum Toxin (Slack, Inc., 2004). Токсини клостридій, комерційно доступні у формі фармацевтичних композицій, включають препарати BoNT/A, такі як, наприклад, BOTOX® (Allergan, Inc., Ірвін, Каліфорнія), DYSPORT®/RELOXIN® (Ipsen Ltd., Слау, Англія), PURTOX® (Mentor Corp., Санта-Барбара, Каліфорнія), XEOMIN® (Merz Pharmaceuticals, Gmb., Франкфурт, Німеччина), NEURONOX® (Medy-Tox, Inc., Очанг-мієон, Південна Корея), BTX-A (Biogen-tech Ltd., University, Яньтай, Шаньдун, Китай); і препарати BoNT/B, такі як, наприклад, MYOBLOC®/NEUROBLOC® (Solstice Neurosciences, Inc., Південний Сан-Франциско, Каліфорнія). Наприклад, BOTOX® у даний час схвалений в одній або декількох країнах для наступних показань: ахалазія, м'язова спластичність у дорослих, анальні тріщини, біль у спині, блефароспазм, бруксизм, шийна дистонія, есенціальний тремор, міжбровні зморшки або гіперкінетичні лицьові зморшки, головний біль, геміфаціальний спазм, гіперактивність сечового міхура, підвищене потовиділення, дитячий церебральний параліч, розсіяний склероз, міоклонічні порушення, носогубні зморшки, спастична дисфонія, косоокість і ураження VII нерва. [04] Обробка токсином клостридій призводить до інгібування вивільненню нейромедіаторів і нейропептидів шляхом порушення процесу екзоцитозу, за допомогою якого здійснюється секреція нейромедіаторів і нейропептидів у синаптичну щілину. Фармацевтична промисловість прагне розширити терапевтичне застосування токсину клостридій за межі нинішнього використання як міорелаксанту й застосовувати його для лікування захворювань, пов'язаних із сенсорними нервами, таких як, наприклад, різні види хронічного болю, нейрогенного запалення й урогенітальних порушень, а також інших захворювань, таких як, наприклад, панкреатит. Один підхід, що використовується у даний час для розширення сфери застосування способів лікування на основі токсину клостридій, включає модифікацію токсину клостридій, у результаті якої модифікований токсин має змінену націленість стосовно нервових або стосовно не нервових клітин, які представляють собою інтерес. Ці молекули, названі ендопептидазами зі зміненою націленістю або Білками-Модуляторами Направленого Везикулярного Екзоцитозу (TVEMP), здійснюють свою інгібуючу дію відносно екзоцитозу, використовуючи рецептормішень, який є присутнім на нервових, або таких що не відносяться до нервових клітинахмішенях, що представляють собою інтерес. Така зміна специфічності стосовно клітин-мішеней досягається за рахунок заміни природного домена зв'язування токсину клостридій на націлюючий домен, який демонструє вибіркову зв'язуючу активність стосовно рецептора, відмінного від рецептора токсину клостридій і присутнього на нервових або таких що не відносяться до нервових клітинах-мішенях, що представляють собою інтерес. Такі модифікації домена зв'язування призводять до того, що молекула здобуває здатність вибірково зв'язувати рецептор, відмінний від рецептора токсину клостридій і присутній на клітинах-мішенях. Ендопептидаза зі зміненою націленістю здатна зв'язуватися з рецептором-мішенню, переміщатися в цитоплазму й проявляти свій протеолітичний ефект стосовно комплекса SNARE нервових або стосовно не нервових клітин-мішеней, що представляють собою інтерес. [05] Одна група ендопептидаз зі зміненою націленістю включає молекули, які мають домен зв'язування з опіоїдними рецепторами. Ці ендопептидази зі зміненою опіоїдною націленістю включають домен зв'язування з опіоїдними рецепторами, транслокаційний домен токсину клостридій і ферментативний домен токсину клостридій. Необмежуючі приклади ендопептидаз зі зміненою опіоїдною націленістю або опіоїдно-TVEMP описані, наприклад, в Keith A. Foster et al., Clostridial Toxin Derivatives Able To Modify Peripheral Sensory Afferent Functions, патенті США 5989545; J. Oliver Dolly et al., Activatable Recombinant Neurotoxins, патенті США 7132259; Stephan Donovan, Clostridial Toxin Derivatives and Methods For Treating Pain, патенті США 7244437; Stephan Donovan, Clostridial Toxin Derivatives and Methods For Treating Pain, патенті США 7413742; Stephan Donovan, Clostridial Toxin Derivatives and Methods For Treating Pain, патенті США 7415338; Lance E. Steward et al., Multivalent Clostridial Toxin Derivatives and Methods of Their Use, патенті США 7514088; Keith A. Foster, Fusion Proteins, публікації заявки на патент США 2008/0064092; Keith A. Foster, Fusion Proteins, публікації заявки на патент США 1 UA 104456 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2009/0035822; Lance E. Steward et al., Multivalent Clostridial Toxin Derivatives and Methods of Their Use, публікації заявки на патент США 2009/0048431; Keith A. Foster, Non-Cytotoxic Protein Conjugates, публікації заявки на патент США 2009/0162341; Keith A. Foster et al., Re-targeted Toxin Conjugates, публікації міжнародної заявки WO 2005/023309; і Lance E. Steward, Modified Clostridial Toxins with Enhanced Translocation Capabilities and Altered Targeting Capabilities for Non-Clostridial Toxin Target Cells, публікації міжнародної заявки WO 2008/008805; зміст кожного з яких повністю включений в дану заявку за допомогою посилання. [06] Одна із головних відмінностей між ендопептидазами зі зміненою націленістю й токсинами клостридій полягає в тому, що оскільки мотонейрони зазвичай не є мішенями ендопептидаз зі зміненою націленістю, смертність, пов'язана з перевищенням дози ендопептидаз зі зміненою націленістю, у ссавців значно знижена або навіть повністю виключена. Наприклад, ендопептидази зі зміненої опіоїдною націленістю можна ввести в дозі, що перевищує терапевтично ефективну дозу в 10000 раз без прояву свідчень летальності, яка в цьому випадку є результатом пасивної дифузії молекули, а не процесу інтоксикації. Таким чином, ендопептидази зі зміненою націленістю являють собою нелетальні молекули при будьяких практичних застосуваннях. Хоча ця властивість відсутності летальності має великі переваги для застосування в терапії, виникає проблема, пов'язана з виробництвом, оскільки стандартним тестом на активність, що використовується у виробництві біопрепаратів на основі токсину клостридій, є біотест ЛД50 на мишах, тест на летальність. S. S. Arnon et al., JAMA 285: 1059-1070 (2001). У цей час біотест ЛД50 на мишах використовується всіма виробниками фармацевтичної продукції для вираження активності їхніх препаратів на основі токсину клостридій. Фактично, одиниці активності токсинів клостридій являють собою одиниці ЛД50 у мишей. Однак, внаслідок того, що ендопептидази зі зміненою націленістю власне кажучи нелетальні, біотест ЛД50 на мишах не можна використовувати для оцінки активності цих молекул. Таким чином, простий, надійний, перевірений і прийнятний з погляду державних органів тест на активність, який дозволяє оцінити надійність всіх етапів, необхідних для поглинання ендопептидази зі зміненою націленістю, мав би значну цінність. [07] Відповідно до даної заявки запропоновані нові композиції, клітини й способи для оцінки активності ендопептидаз зі зміненою націленістю, що підходять для застосування в різних галузях промисловості, таких як, наприклад, фармацевтична й харчова промисловість, із забезпеченням пов'язаних із цим переваг. Ці композиції, клітини й способи не припускають використання живих тварин або тканин, взятих у живих тварин, але дозволяють оцінити всі етапи, необхідні для дії ендопептидаз зі зміненою націленістю. Детальний опис графічних матеріалів [08] На Фіг. 1 показана схема сучасної парадигми вивільнення нейромедіатора й токсичної дії токсину клостридій у центральному й периферичному нейроні. На Фіг. 1А показана схема механізму вивільнення нейромедіатора в центральному й периферичному нейроні. Процес вивільнення можна описати як такий, що складається з двох етапів: 1) стикування пухирця, при якому пов'язаний з пухирцем білок SNARE пухирця, що містить молекули нейромедіатора, взаємодіє з пов'язаними з мембраною білками SNARE, розташованими на плазматичній мембрані; і 2) вивільнення нейромедіатора, при якому пухирець зливається із плазматичною мембраною й відбувається екзоцитоз молекул нейромедіатора. На Фіг. 1Б показана схема механізму токсичної дії правцевого й ботулінічного токсинів у центральному й периферичному нейроні. Цей процес інтоксикації можна описати як такий, що складається із чотирьох етапів: 1) зв'язування рецептора, при якому токсин клостридій зв'язується з рецепторним комплексом клостридій й ініціює процес інтоксикації; 2) інтерналізації комплексу, при якій після зв'язування токсину відбувається перенесення пухирця, що містить комплекс токсин/рецепторна система, у клітину шляхом ендоцитозу; 3) транслокації легкого ланцюга, при якій, як припускають, має місце велика кількість подій, включаючи зміну pН всередині пухирця, формування каналу пори, що включає домен HN важкого ланцюга токсину клостридій, розділення легкого й важкого ланцюгів токсину клостридій і вивільнення легкого ланцюга, і 4) ферментативної модифікації мішені, при якій легкий ланцюг токсину клостридій протеолітично розщеплює свої субстратимішені SNARE, такі як, наприклад, SNAP-25, VAMP або Syntaxin, таким чином запобігаючи стикуванню пухирця й вивільненню нейромедіатора. [09] На Фіг. 2 показана повнодозова відповідь на ендопептидазу зі зміненою націленістю Noc/A у клональній клітинній лінії ORL-1Clone #6 з підвищеною експресією ORL-1. Специфічне поглинання Noc/A можна спостерігати в клональній клітинній лінії ORL-1Clone #6, надекспресуючою ORL-1. Обробка Noc/A (LHN/A плюс варіант зв'язуючого ліганду ноцицептину) і LHN/A (LC/A й HN без домену зв'язування), проведена на клоні №6 стабільної клітинної лінії ORL-1 у тесті методом твердофазного ІФА в модифікації ECL на розщеплений SNAP-25197, 2 UA 104456 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 продемонструвала, що поглинання Noc/A є специфічним у цієї клональної клітинної лінії. Клональна клітинна лінія також демонструє значну чутливість до Noc/A, яка характеризується значенням EC50, що дорівнює 1,2 нМ. [010] На Фіг. 3 показана повнодозова відповідь на Noc/A у клонах №3 й №22 SK-N-DZ, одержаних з однієї клітини. Специфічне поглинання Noc/A у клонах №3 й №22 SK-N-DZ у порівнянні з LHN/A (n=4 проведених незалежних експерименти). Клітини розсівали на 96-лункові планшети, покриті полі-D-лізином, у СБС RPMI+N2+B27+NGF. Обробка речовинами тривала 22 години. Тест методом твердофазного ІФА в модифікації ECL на розщеплений SNAP-25197 продемонстрував, що поглинання Noc/A є специфічним у цих клональних клітинних лініях. Клональні клітинні лінії також демонструють значну чутливість до Noc/A, яка характеризується значенням EC50, що дорівнює 0,3 нМ для клону №3 й 0,9 нМ для клону №22. [011] На Фіг. 4 показані результати аналізу "сендвіч”-методом твердофазного ІФА в модифікації ECL на клонах 1C11, 4B7 й 4C9 ORL1 ND7, оброблених ендопептидазою зі зміненою націленістю Noc/A. Батьківські клони ND7 й ORL1 ND7 обробляли Noc/A протягом 24 годин, після чого проводили інкубацію протягом двох днів. EC50 для батьківського ND7 неможливо було обчислити, тому що розщеплення SNAP-25197 відбувалося лише приблизно на 50 %. У клонах 4B7 й 1C11 розщеплення SNAP-25197 відбувалося більше ніж на 80 %. Обчислені значення EC50 становили відповідно 5,7±0,5, 6,7±1 й 8,6±2 нМ. [012] На Фіг. 5 показано, що поліклональні антитіла проти ноцицептину здатні блокувати поглинання ендопептидази зі зміненою націленістю Noc/A у клітинних лініях клону №3, клону №22 SK-N-DZ і клону №6 AGN P33 ORL-1. Клітини розсівали на 96-лункові планшети, покриті полі-D-лізином, у СБС RPMI+N2+B27+NGF й обробляли протягом 22 годин середовищем без сироватки, що містить поліклональні антитіла проти ноцицептину в різних розведеннях (0-3 мкг/мл) і 1 нМ Noc/A. [013] На Фіг. 6 показані клітини клону AF4 SiMa і стабільної клітинної лінії PC-12, оброблені ендопептидазою зі зміненою націленістю Dyn/A у концентрації від 0,017 нМ до 1 мкМ, як представлено на зображенні Вестерн блоту. В обох клітинних лініях спостерігали дозозалежне поглинання. [014] На Фіг. 7 показані нормовані криві аналізу методом поверхневого плазменного резонансу SPR BIAcore з використанням 7,8 нМ антитіл 2E2A6, 1D3B8, 3C1A5 й 2C9B10 і комерційних MC-6050 й MC-6053. На Фіг. 7A показані нормовані дані за швидкістю асоціації для кожного антитіла. На Фіг. 7Б показані нормовані дані за швидкостю дисоціації для кожного антитіла. Детальний опис винаходу [015] Згідно із даним винаходом запропоновані нові тести для аналізу присутності або відсутності в зразку активної ендопептидази зі зміненою націленістю й для аналізу активності ендопептидази зі зміненою націленістю. Нові клітинні тести, описані в даній заявці, основані на клітинах, реагентах і способах детектування, завдяки яким дані тести можна використовувати для детектування наномолярних кількостей ендопептидази зі зміненою націленістю в зразку. Клітинні тести, що описані в даній заявці, призначені для аналізу множинних функцій ендопептидази зі зміненою націленістю, а саме, зв'язування ендопептидази зі зміненою націленістю з рецептором на поверхні клітини, інтерналізації комплексу ендопептидазарецептор, транслокації ферментативного домену в цитоплазму й розщеплення субстрату ферментативним доменом. Як більш детально обговорюється нижче, нові способи й композиції можна використовувати для аналізу як неопрацьованих й об'єднаних зразків, так і високоочищених дволанцюгових ендопептидаз зі зміненою націленістю й складів на основі ендопептидаз зі зміненою націленістю, а також у форматі автоматизованого високопродуктивного аналізу. [016] Таким чином, відповідно до одного аспекту даного винаходу запропоновані композиції, що викликають імунну відповідь, для одержання анти-SNAP-25 антитіл, які вибірково зв'язуються з епітопом, що містить продукт розщеплення SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A. Композиції, що викликають імунну відповідь, можуть включати ад'ювант і композиції, що викликають імунну відповідь, включаючи антиген SNAP-25, носій, пов'язаний з антигеном SNAP-25, або носій, пов'язаний із гнучким спейсером, у свою чергу пов'язаним з антигеном SNAP-25, де між антигеном SNAP-25 і носієм поміщений гнучкий лінкер. Припускається, що всі без винятку антигени SNAP-25, які викликають імунну відповідь, яка призводить до вироблення анти-SNAP25 антитіл, здатних вибірково зв'язуватися з епітопом SNAP-25, карбоксильний кінець якого відповідає залишку P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення токсином BoNT/A, можуть бути придатні як антигени SNAP-25, включаючи, але не обмежуючись перерахованими: антигени 3 UA 104456 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 SNAP-25, одержані із природного SNAP-25, антигени SNAP-25, одержані з SNAP-25, що не зустрічається в природі, і антигени SNAP-25, що включають імунореактивні фрагменти SNAP25, SNAP-25 із природного SNAP-25 або SNAP-25, що не зустрічається в природі. Антигени SNAP-25, придатні для одержання анти-SNAP-25 антитіл, здатних вибірково зв'язуватися з епітопом SNAP-25, карбоксильний кінець якого відповідає залишку P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення токсином BoNT/A, включають, без обмеження, антигени SNAP-25, що включають пептид SNAP-25, на C-кінці якого знаходиться карбоксильований залишок глутаміну, пов'язаний з пептидом-носієм, включаючи, без обмеження, SEQ ID NO: 38. Інші композиції, що викликають імунну відповідь, придатні для одержання анти-SNAP-25 антитіл, здатних вибірково зв'язуватися з епітопом SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A, включають, без обмеження, композиції, що викликають імунну відповідь, які містять носій, пов'язаний із гнучким лінкером, у свою чергу пов'язаним з антигеном SNAP-25-карбоксильованим C-кінцевим глутаміном, причому гнучкий лінкер поміщений між антигеном SNAP-25 і носієм. Припускається, що в такій композиції, яка викликає імунну відповідь, можуть застосовуватися будь-які ад'юванти, включаючи, але не обмежуючись перерахованими: поліетиленгліколь (ПЕГ), монометоксиполіетиленгліколь (мПЕГ), полівінілалкоголь (ПВА), повний і неповний ад'ювант Фрейнда. [017] Відповідно до іншого аспекту даного винаходу запропоновані способи одержання антиSNAP-25 антитіл, які вибірково зв'язуються з епітопом, що містить продукт розщеплення SNAP25, карбоксильний кінець якого відповідає залишку P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення токсином BoNT/A. Аспекти даного способу включають етапи (а) введення тваринам композиції, що викликає імунну відповідь стосовно SNAP-25, яка описана в даній заявці; (б) відбір у тварин зразка, що містить анти-SNAP-25 антитіло або клітину, що продукує анти-SNAP-25 антитіло; і (в) виділення анти-SNAP-25 антитіла зі зразка. Описані способи придатні для одержання моноклональних анти-SNAP-25 антитіл, які вибірково зв'язуються з епітопом, що містить продукт розщеплення SNAP-25, карбоксильний кінець якого відповідає залишку P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення токсином BoNT/A, або поліклональних анти-SNAP-25 антитіл, які вибірково зв'язуються з епітопом, що містить продукт розщеплення SNAP-25, карбоксильний кінець якого відповідає залишку P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення токсином BoNT/A. [018] Відповідно до ще одного аспекту даного винаходу запропоновані анти-SNAP-25 антитіла, які вибірково зв'язуються з епітопом, що містить SNAP-25, карбоксильний кінець якого відповідає залишку P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення токсином BoNT/A. Такі антиSNAP-25 антитіла включають як природні антитіла, так і антитіла, що не зустрічаються в природі, а також поліклональні антитіла або поліклональні анти-SNAP-25 антитіла. Моноклональні анти-SNAP-25 антитіла, придатні як анти-SNAP-25 антитіла, які вибірково зв'язуються з антигеном SNAP-25, карбоксильний кінець якого відповідає залишку P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення токсином BoNT/A, включають, без обмеження, моноклональні анти-SNAP-25 антитіла, одержані в гібридомних клітинних лініях 1D3B8, 2C9B10, 2E2A6, 3C1A5 й 3C3E2. [019] Відповідно до ще одного аспекту даного винаходу запропоновані імунологічні способи детектування активності ендопептидаз зі зміненою націленістю. Аспекти даного способу включають етапи (а) обробки клітини зі стабільної клітинної лінії зразком, що містить ендопептидазу зі зміненою націленістю, причому клітина зі стабільної клітинної лінії чутлива до активності ендопептидази зі зміненою націленістю; (б) виділення з оброблених клітин компонента SNAP-25, що містить продукт розщеплення SNAP-25, карбоксильний кінець якого відповідає залишку P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення токсином BoNT/A; (в) приведення компонента SNAP-25 у контакт із анти-SNAP-25 антитілами, описаними в даній заявці; і (г) детектування присутності комплексу антитіло-антиген, що включає анти-SNAP-25 антитіло й продукт розщеплення SNAP-25, карбоксильний кінець якого відповідає залишку P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення токсином BoNT/A; при цьому детектування з використанням комплексу антитіло-антиген є показником активності ендопептидази зі зміненою націленістю. Анти-SNAP-25 антитіла з етапу (в) можуть бути пов'язані із твердофазною підкладкою. [020] Відповідно до ще одного аспекту даного винаходу запропоновані імунологічні способи детектування активності опіоїдно-TVEMP. Аспекти даного способу включають етапи (а) обробки клітини зі стабільної клітинної лінії зразком, що містить ендопептидазу зі зміненою націленістю, причому клітина зі стабільної клітинної лінії має здатність до поглинання ендопептидази зі зміненою націленістю; (б) виділення з оброблених клітин компонента SNAP-25, що містить SNAP-25, карбоксильний кінець якого відповідає залишку P1 розрізуваного зв'язку у сайті 4 UA 104456 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 розщеплення токсином BoNT/A; (в) здійснення контакту компонента SNAP-25 з анти-SNAP-25 антитілами, описаними в даній заявці; і (г) детектування присутності комплексу антитілоантиген, що включає анти-SNAP-25 антитіло й SNAP-25, карбоксильний кінець якого відповідає залишку P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення токсином BoNT/A; при цьому детектування з використанням комплексу антитіло-антиген є показником активності ендопептидази зі зміненою націленістю. Анти-SNAP-25 антитіла з етапу (в) можуть бути пов'язані із твердофазною підкладкою. [021] Відповідно до подальшого аспекту даного винаходу запропоновані способи визначення імунної резистентності ссавців стосовно ендопептидази зі зміненою націленістю. Аспекти даного способу включають етапи (а) додавання ендопептидази зі зміненою націленістю до тестуємого зразка, одержаного з організму ссавця, досліджуваного на наявність або відсутність нейтралізуючих антитіл проти ендопептидази зі зміненою націленістю; (б) обробки клітини зі стабільної клітинної лінії тестувальним зразком, причому клітина зі стабільної клітинної лінії чутлива до активності ендопептидази зі зміненою націленістю; (в) виділення з оброблених клітин компонента SNAP-25, що містить продукт розщеплення SNAP-25, карбоксильний кінець якого відповідає залишку P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення токсином BoNT/A; (г) здійснення контакту компонента SNAP-25 з анти-SNAP-25 антитілами, описаними в даній заявці; (д) детектування присутності комплексу антитіло-антиген, що включає анти-SNAP-25 антитіло й продукт розщеплення SNAP-25, карбоксильний кінець якого відповідає залишку P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення токсином BoNT/A; (е) повторення етапів а-д зі зразком для негативного контролю замість тестувального зразка; (ж) порівняння кількості комплексу антитіло-антиген, детектованного на етапі (д), з кількістю комплексу антитілоантиген, детектованою на етапі (е), при цьому детекція меншої кількості комплексу антитілоантиген, детектованої на етапі (д), у порівнянні з кількістю комплексу антитіло-антиген, детектованою на етапі (е), свідчить про присутність нейтралізуючих антитіл проти ендопептидази зі зміненою націленістю. Анти-SNAP-25 антитіла з етапу (г) можуть бути пов'язані із твердофазною підкладкою. Контрольний зразок з етапу (е) може також включати зразок для позитивного контролю на додаток до зразка для негативного контролю. [022] Токсини клостридій, що виробляються Clostridium botulinum, Clostridium tetani, Clostridium baratii й Clostridium butyricum, є найбільш широко використовуваними в терапевтичних і косметичних цілях у людини й інших ссавців. Штами C. botulinum виробляють сім імунологічно відмінних серотипів ботулінічних токсинів (BoNTs), які були виявлені при дослідженні спалахів ботулізму в людини (BoNT/A, BoNT/B, BoNT/E й BoNT/F), тварин (BoNT/C1 й BoNT/D) або були ізольовані із ґрунту (BoNT/G). Хоча всі сім серотипів ботулінічного токсину мають подібну структуру й біологічні властивості, кожен з них також демонструє гетерогенні характеристики, такі як, наприклад, різні фармакологічні властивості. Навпаки, токсин правця (TeNT) виробляє однорідна група C. tetani. Два інші види Clostridia, C. baratii й C. butyricum, також виробляють токсини, подібні відповідно BoNT/F й BoNT/E. [023] Кожен з токсинів клостридій транслюється у виді одного поліланцюга масою приблизно 150 кДа, який згодом протеолітично розрізається в межах дисульфідної петлі природною протеазою, такою як, наприклад, ендогенна протеаза токсину клостридій або природною протеазою, що виробляється в навколишньому середовищі. Цей посттрансляційний процесінг призводить до утворення молекули, яка складається із двох ланцюгів і включає легкий ланцюг (LC) масою приблизно 50 кДа й важкий ланцюг (HC) масою приблизно 100 кДа, що втримуються разом єдиним дисульфідним зв'язком і нековалентними взаємодіями. Кожна зріла дволанцюгова молекула включає три функціонально відмінних домени: 1) ферментативний домен, розташований в LC, який включає металопротеазну область, що має цинк-залежну ендопептидазну активність, специфічною мішенню якої є основні компоненти апарату вивільнення нейромедіатора; 2) транслокаційний домен, який міститься в межах аміно-кінцевої половини HC (HN) і полегшує вивільнення LC із внутрішньоклітинних пухирців у цитоплазму клітини-мішені; і 3) зв'язуючий домен, що знаходиться в межах карбокси-кінцевої половини HC (HC), який визначає зв'язуючу активність і специфічність зв'язування токсину з рецепторним комплексом, розташованим на поверхні клітини-мішені. [024] Зв'язуюча, транслокаційна й ферментативна активності цих трьох функціональних доменів є необхідними для токсичності. Хоча деталі цього процесу ще не відомі повністю, загальні механізми клітинної інтоксикації, завдяки яким токсини клостридій проникають у нейрон й інгібують вивільнення нейромедіатора, є подібними, незалежно від серотипу або підтипу. Хоча заявники не мають на увазі, що даний опис буде обмежувати даний винахід, механізм інтоксикації можна описати як такий, що включає щонайменше чотири етапи: 1) зв'язування рецептора, 2) інтерналізація комплексу, 3) транслокація легкого ланцюга й 4) ферментативна 5 UA 104456 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 модифікація мішені (ФІГ. 1). Процес починається, коли домен HC токсину клостридій зв'язується з токсин-специфічною рецепторною системою, розташованою на поверхні плазматичної мембрани клітини-мішені. Специфічність зв'язування рецепторного комплексу, як припускають, частково забезпечується певними комбінаціями гангліозидів і білкових рецепторів, які, очевидно, включають кожен окремий рецепторний комплекс токсину клостридій. Після утворення комплексу токсин/рецептор він інтерналізується за механізмом ендоцитозу, а інтерналізовані пухирці направляються за визначеними внутрішньоклітинними маршрутами. Припускають, що етап транслокації ініціюється закисленням компартменту пухирця. Цей процес, очевидно, ініціює важливі залежні від pН структурні перебудови, які збільшують гідрофобність, сприяють формуванню пори й полегшують розділення важких і легких ланцюгів токсину. Після розділення ендопептидаза легкого ланцюга токсину вивільняється із внутрішньоклітинного пухирця в цитозоль, де, як припускають, її специфічними мішенями є основні компоненти апарату вивільнення нейромедіатора. Ці основні білки, зв'язаний з пухирцем мембранний білок (VAMP, vesicle-associated membrane protein)/синаптобревін, зв'язаний із синаптосомою білок масою 25 кДа (SNAP-25, synaptosomal-associated protein of 25 kDa) і Синтаксин, необхідні для стикування синаптичних пухирців й злиття в нервовому закінченні і є членами родини розчинних білкових рецепторів прикріплення N-етилмалеімідчутливого фактора (SNARE, soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor-attachment protein-receptor). BoNT/A й BoNT/E розщеплюють SNAP-25 у карбокси-кінцевій області, вивільняючи фрагмент, що складається відповідно з дев'яти або двадцяти шести амінокислот, а BoNT/C1 також розщеплює SNAP-25 близько карбоксильного кінця, вивільняючи фрагмент, що складається з восьми амінокислот. Ботулінічні серотипи BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F й BoNT/G і токсин правця впливають на консервативну центральну частину VAMP і вивільняють аміно-кінцеву частину VAMP у цитозоль. BoNT/C1 розщеплює синтаксин у єдиному місці близько поверхні цитоплазматичної мембрани. Вибірковий протеоліз синаптичних білків SNARE призводить до блокування вивільнення нейромедіатора, що викликається токсинами клостридій in vivo. Мішені токсинів клостридій, білки SNARE, характерні для екзоцитозу у великій кількості типів клітин, які не відносяться до нейронів; у цих клітинах, як і у нейронах, пептидазна активність легкого ланцюга інгібує екзоцитоз, див., наприклад, Yann Humeau et al., How Botulinum and Tetanus Neurotoxins Block Neurotransmitter Release, 82(5) Biochimie. 427-446 (2000); Kathryn Turton et al., Botulinum and Tetanus Neurotoxins: Structure, Function and Therapeutic Utility, 27(11) Trends Biochem. Sci. 552-558. (2002); Giovanna Lalli et al., The Journey of Tetanus and Botulinum Neurotoxins in Neurons, 11(9) Trends Microbiol. 431-437, (2003). [025] Ендопептидази зі зміненою націленістю зазвичай заміщують сайт розщеплення природних дволанцюгових протеаз із петлевою структурою сайтом розщеплення екзогенних протеаз. Див. наприклад, Dolly, J.O. et al., Activatable Clostridial Toxins, патент США 7419676, включений у дану заявку за допомогою посилання. Хоча ендопептидази зі зміненою націленістю варіюють згідно загальній молекулярній масі через розмір націлюючого домену, процес активації та його залежність від розщеплення за екзогенним сайтом розщеплення з утворенням дволанцюгової молекули є, по суті, тим же самим, як і для токсинів клостридій. Див., наприклад, Steward, L.E. et al., Activatable Clostridial Toxins, публікація заявки на патент США 2009/0005313; Steward, L.E. et al., Modified Clostridial Toxins with Enhanced Translocation Capabilities and Altered Targeting Activity For Non-Clostridial Toxin Target Cells, заявка на патент США 11/776,075; Steward, L.E. et al., Modified Clostridial Toxins with Enhanced Translocation Capabilities and Altered Targeting Activity for Clostridial Toxin Target Cells, публікація заявки на патент США 2008/0241881, зміст кожного з яких включено в дану заявку за допомогою посилання. [026] Частина аспектів даного опису включає композицію, що викликає імунну відповідь, для одержання анти-SNAP-25 антитіл, здатних вибірково зв'язуватися з SNAP-25, карбоксильний кінець якого відповідає залишку P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення токсином BoNT/A. У даній заявці термін "композиція, що викликає імунну відповідь" відноситься до композиції, що включає антиген SNAP-25, який при введенні тварині стимулює імунну відповідь стосовно антигену SNAP-25, тим самим призводячи до утворення анти-SNAP-25 антитіл, здатних вибірково зв'язуватися з SNAP-25, карбоксильний кінець якого відповідає залишку P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення токсином BoNT/A… Термін "імунна відповідь" відноситься до будь-якої відповіді імунної системи тварини на композицію, що викликає імунну відповідь. Приклади імунних відповідей включають, але не обмежуються перерахованими: клітинний, а також місцевий і системний гуморальний імунітет, такі як, наприклад, відповіді цитолітичних лімфоцитів, включаючи антиген-специфічну індукцію CD8 + цитолітичних лімфоцитів, відповіді T-клітин-хелперів, включаючи проліферативні відповіді T-клітин і вивільнення цитокінів, і відповіді B-клітин, включаючи, наприклад, відповідь утворення антитіл. 6 UA 104456 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Термін "стимуляція імунної відповіді" відноситься до введення композиції, що викликає імунну відповідь або полінуклеотиду, який кодує композицію, що викликає імунну відповідь, при якій затронута імунна відповідь, тобто вона стимулюється, ініціюється або індукується. [027] Композиція, що викликає імунну відповідь стосовно SNAP-25, включає антиген SNAP25. У даній заявці термін "антиген" відноситься до молекули, що викликає імунну відповідь і включає, але не обмежуються перерахованими: пептиди, полісахариди й кон'югати ліпідів, такі як, наприклад, ліпопротеїни й гліколіпіди. У даній заявці термін "антиген SNAP-25" відноситься до будь-якого антигену, карбоксильний кінець якого відповідає залишку P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення токсином BoNT/A, здатному викликати імунну відповідь. Антиген SNAP-25, що використовується у складі композиції, що викликає імунну відповідь, повинен бути досить великим для того, щоб його послідовність була по суті унікальною, щоб забезпечити зниження ймовірності одержання антитіл, які мають перехресну націленість стосовно антигенів, відмінних від SNAP-25. Крім того, антиген SNAP-25, що використовується у складі композиції, яка викликає імунну відповідь, повинен бути досить невеликим для того, щоб викликати імунну відповідь істотної інтенсивності тільки проти SNAP-25, карбоксильний кінець якого відповідає залишку P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення токсином BoNT/A, для підвищення ймовірності одержання анти-SNAP-25 антитіл, здатних відрізняти SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A, від SNAP-25, на карбоксильному кінці якого відсутній залишок P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A. Крім того, дуже бажано також одержати з хорошим виходом анти-SNAP25 антитіла однієї амінокислотної послідовності, які відтворювано вибіркові й зв'язуються із прийнятною авідністю, щоб уможливити розробку високочутливого тесту. [028] Послідовність, що оточує сайт розщеплення BoNT/A, присутній в SNAP-25, позначена як P5–P4–P3–P2–P1–P1’–P2’–P3’–P4’–P5’, де P1–P1’ означає розрізуваний зв'язок. Після розщеплення ендопептидазою зі зміненою націленістю, продукти розщеплення, що 5 4 3 2 1 утворюються, містять фрагмент, що включає послідовність P –P –P –P –P , і фрагмент, що 1 2 3 4 5 включає P ’–P ’–P ’–P ’–P ’. Таким чином, у даній заявці термін "SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A" відноситься до будь-якого SNAP-25, у якого карбокси-кінцевою амінокислотою є залишок P1. Наприклад, Q197–R198 SNAP-25 людини (SEQ ID NO: 5) являє собою розрізуваний зв'язок P 1–P1’ сайту розщеплення BoNT/A. У зв'язку із цим "SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться глутамін розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A" є будь-який продукт розщеплення SNAP-25, у якого карбокси-кінцевою амінокислотою є глутамін, причому глутамін являє собою Q197 розрізуваного зв'язку. Як інший приклад можна навести K204–H205 SNAP-25 Torpedo marmorata (SEQ ID NO: 16), що являє собою розрізуваний зв'язок P 1–P1’ сайту розщеплення BoNT/A. У зв'язку із цим "SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться лізин розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A" є будь-який продукт розщеплення SNAP-25, у якого карбокси-кінцевою амінокислотою є лізин, причому лізин являє собою K204 розрізуваного зв'язку. [029] Антиген SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A, можна модифікувати з підвищенням імуногенності антигену SNAP-25, гаптену або будь-якої іншої антигенної сполуки, яка під час відсутності модифікації є імуногенною, неімуногенною або слабоімуногенною. Відповідно до одного аспекту даного варіанта реалізації, карбокси-кінцевий залишок P1 розрізуваного зв'язку антигену SNAP-25 може карбоксилюватися. Карбоксилювання збільшує бажані імуногенні властивості антигену SNAP-25 у двох відношеннях. По-перше, оскільки заряджені амінокислоти збільшують імуногенність, додавання COO--групи до карбокси-кінцевого залишку збільшить загальну імуногенність антигену SNAP-25. По-друге, оскільки залишок P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A знаходиться в зарядженому стані після розщеплення, додавання COO--групи до карбокси-кінцевого залишку підвищить подібність даного антигену до вихідного антигену, для вибіркового зв'язування з яким розроблені анти-SNAP-25 антитіла, описані в даній заявці. [030] Відповідно до одного аспекту даного варіанта реалізації, аміно-кінцевий залишок антигену SNAP-25 може бути модифікований шляхом додавання амінокислоти, пристосованої для приєднання антигену SNAP-25 до білка-носія, такого як, наприклад, гемоціанін фісурели (KLH), овальбумін (OVA), тиреоглобулін (THY), бичачий сироватковий альбумін (BSA), соєвий інгібітор трипсину (STI) або пептид множинного прикріплення (MAP). Наприклад, залишок цистеїну може бути поміщений на N-кінець для того, щоб приєднати білок-носій KLH. [031] Таким чином, відповідно до одного варіанта реалізації, довжина антигену SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P 1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення 7 UA 104456 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 BoNT/A, може становити, наприклад, щонайменше 5, щонайменше 6, щонайменше 7, щонайменше 8, щонайменше 9, щонайменше 10, щонайменше 11, щонайменше 12, щонайменше 13, по меншій мері 14, щонайменше 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 25 або щонайменше 30 амінокислот. Відповідно до іншого варіанта реалізації, довжина антигену SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P 1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A, може становити, наприклад, якнайбільше 5, якнайбільше 6, якнайбільше 7, якнайбільше 8, якнайбільше 9, якнайбільше 10, якнайбільше 11, якнайбільше 12, якнайбільше 13, якнайбільше 14, якнайбільше 15, якнайбільше 16, якнайбільше 17, якнайбільше 18, якнайбільше 19, якнайбільше 20, якнайбільше 25 або якнайбільше 30 амінокислот. Згідно ще одного варіанту реалізації, довжина антигену SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A, може знаходитися, наприклад, у межах 7-12 амінокислот, у межах 10-15 амінокислот або в межах 13-18 амінокислот. [032] Відповідно до іншого варіанту реалізації, антиген SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A, включає SEQ ID NO: 33. Відповідно до аспектів даного варіанта реалізації, антиген SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A, включає SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 або SEQ ID NO: 39. Відповідно до подальшого варіанта реалізації, антиген SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A, включає SEQ ID NO: 40. [033] Згідно ще одного варіанту реалізації, антиген SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A, включає SEQ ID NO: 41. Відповідно до аспектів даного варіанта реалізації, антиген SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A, включає SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44 SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46. Відповідно до подальшого варіанта реалізації, антиген SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A, включає SEQ ID NO: 47. [034] Припускається, що всі без винятку антигени SNAP-25, які викликають імунну відповідь, що призводить до вироблення анти-SNAP-25 антитіл, здатних вибірково зв'язуватися з SNAP25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A, можуть бути придатні як антигени SNAP-25. Таким чином, варіанти амінокислотних послідовностей, що включають SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45 або SEQ ID NO: 46, можуть бути придатні як антигени SNAP-25, які викликають імунну відповідь, що призводить до вироблення анти-SNAP-25 антитіл, здатних вибірково зв'язуватися з SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A. Таким чином, відповідно до одного варіанта реалізації, антиген SNAP-25 може містити щонайменше 1, щонайменше 2, щонайменше 3, щонайменше 4 або щонайменше 5 замін, делецій або інсерцій в амінокислотних послідовностях антигенів SNAP-25, що включають SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45 або SEQ ID NO: 46. Згідно ще одного варіанту реалізації, антиген SNAP-25 може бути щонайменше на 70 %, щонайменше на 75 %, щонайменше на 80 %, щонайменше на 85 %, щонайменше на 90 % або щонайменше на 95 % ідентичний згідно послідовності амінокислот антигенам SNAP-25, що включають SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45 або SEQ ID NO: 46. [035] Припускається, що з антигеном SNAP-25 може бути зв'язаний один або декілька носіїв, які забезпечують підвищення імуногенності антигену SNAP-25, який є імуногенним, неімуногенним або слабоімуногенним у не пов'язаному з носієм виді. Необмежуючі приклади включають, наприклад, гемоціанін фісурели (KLH), овальбумін (OVA), тиреоглобулін (THY), бичачий сироватковий альбумін (BSA), соєвий інгібітор трипсину (STI) або пептид множинного прикріплення (MAP). Як добре відомо в даній галузі техніки, неантигенний або слабоантигенний антиген може бути перетворений в антигенний шляхом зв'язування антигену з носієм. Велика кількість інших носіїв і способів зв'язування антигену з носієм добре відомі в даній галузі техніки. Див., наприклад, Harlow and Lane, див. вище, 1998a; Harlow and Lane, див. вище, 1998b; і David W. Waggoner, Jr. et al., Immunogenicity-enhancing carriers and compositions thereof and methods of 8 UA 104456 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 using the same, публікація заявки на патент США №20040057958 (25 березня 2004 р.). Епітоп також може бути одержаний шляхом експресії епітопа в складі химерного білка. Способи експресії химерних поліпептидів добре відомі фахівцям у даній галузі техніки, як описано, наприклад, в Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Supplement 47), John Wiley & Sons, New York (1999). Оскільки на карбоксильному кінці антигену SNAP-25 повинен знаходитися залишок P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A, носій повинен бути приєднаний до N-кінця антигену SNAP-25. [036] Припускається, що з антигеном SNAP-25 може бути зв'язаний один або декілька гнучких спейсерів, які підвищують імуногенність антигену SNAP-25, який є імуногенним, неімуногенним або слабоімуногенним у не пов'язаному із гнучкими лінкерами виді. Гнучкий спейсер збільшує загальну довжину пептиду антигену SNAP-25 і забезпечує гнучкість, тим самим полегшуючи належну презентацію антигену SNAP-25 імуноцитам. Як необмежуючий приклад, композиція, що викликає імунну відповідь стосовно SNAP-25, може включати антиген SNAP-25, пов'язаний з одним або декількома гнучкими спейсерами в тандемі для кращої презентації антигену SNAP-25 імуноцитам, тим самим полегшуючи імунну відповідь. [037] Гнучкий спейсер, що містить пептид, становить у довжину щонайменше одну амінокислоту й включає незаряджені амінокислоти з невеликими групами бічних ланцюгів (R), такі як, наприклад, гліцин, аланін, валін, лейцин або серин. Таким чином, відповідно до одного варіанта реалізації, довжина гнучкого спейсера може становити, наприклад, щонайменше 1, щонайменше 2, щонайменше 3, щонайменше 4, щонайменше 5, щонайменше 6, щонайменше 7, щонайменше 8, щонайменше 9 або щонайменше 10 амінокислот. Відповідно до іншого варіанта реалізації, довжина гнучкого спейсера може становити, наприклад, щонайменше 1, якнайбільше 2, якнайбільше 3, якнайбільше 4, якнайбільше 5, якнайбільше 6, якнайбільше 7, якнайбільше 8, якнайбільше 9 або якнайбільше 10 амінокислот. Згідно ще одного варіанту реалізації, довжина гнучкого спейсера може знаходитися, наприклад, у межах 1-3 амінокислот, у межах 2-4 амінокислот, у межах 3-5 амінокислот, у межах 4-6 амінокислот або в межах 5-7 амінокислот. Необмежуючі приклади гнучкого спейсера включають, наприклад, G-спейсери, такі як GGG, GGGG (SEQ ID NO: 57) і GGGGS (SEQ ID NO: 58), або A-спейсери, такі як AAA, AAAA (SEQ ID NO: 59) і AAAAV (SEQ ID NO: 60). Гнучкий спейсер пов'язаний з антигеном SNAP-25 в одній рамці зчитування в складі химерного білка. [038] Як відзначалося вище, гнучкий спейсер частково використовують для збільшення загальної довжини пептиду антигену SNAP-25. Наприклад, загальну довжину антигену SNAP-25 з 5-10 амінокислот можна збільшити шляхом приєднання гнучкого спейсера довжиною 3-5 амінокислот до N-кінця антигену SNAP-25. Як інший приклад, загальну довжину антигену SNAP25 з 5-10 амінокислот можна збільшити шляхом приєднання гнучкого спейсера довжиною 4-6 амінокислот до N-кінця антигену SNAP-25. Як інший приклад, загальну довжину антигену SNAP25 з 5-10 амінокислот можна збільшити шляхом приєднання гнучкого спейсера довжиною 7-10 амінокислот до N-кінця антигену SNAP-25. Як інший приклад, загальну довжину антигену SNAP25 з 7-12 амінокислот можна збільшити шляхом приєднання гнучкого спейсера довжиною 1-3 амінокислот до N-кінця антигену SNAP-25. Як інший приклад, загальну довжину антигену SNAP25 з 7-12 амінокислот можна збільшити шляхом приєднання гнучкого спейсера довжиною 4-6 амінокислот до N-кінця антигену SNAP-25. Збільшення довжини, що забезпечується гнучким спейсером, дозволяє вибрати антиген SNAP-25 невеликого розміру, тим самим збільшуючи ймовірність того, що антиген SNAP-25 викликає імунна відповідь істотної інтенсивності тільки проти SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A, таким чином підвищуючи можливість одержання анти-SNAP-25 антитіл, здатних відрізняти SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P 1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A, від SNAP-25, на карбоксильному кінці якого відсутній залишок P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A. [039] Припускається, що композиція, яка викликає імунну відповідь стосовно SNAP-25, яка описана в даній заявці, може включати антиген SNAP-25, описаний у даній заявці, і один або декілька ад'ювантів. У даній заявці термін "ад'ювант" стосовно композиції, що викликає імунну відповідь стосовно SNAP-25, відноситься до будь-якої речовини або суміші речовин, які збільшують або урізноманітнюють імунну відповідь на антиген SNAP-25. Ад'ювант, що викликає імунну відповідь може, наприклад, служити для зниження числа імунізацій або кількості антигену, необхідного для захисної імунізації. Добре відоме використання ад'ювантів, що викликають імунну відповідь, у складі композиції, яка викликає імунну відповідь. Основним призначенням цих ад'ювантів є збільшення імунної відповіді. Необмежуючі приклади ад'ювантів включають, наприклад, ліпосоми, масляні фази, включаючи, без обмеження, ад'юванти типу Фрейнда, такі як, наприклад, повний ад'ювант Фрейнда (ПАФ); неповний ад'ювант Фрейнда 9 UA 104456 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (НАФ); глікозиди сапогеніну, такі як, наприклад, сапоніни; карбопол; N-ацетилмураміл-L-аланілD-ізоглутамін (зазвичай названий мурамілдипептид або "МДП"); і ліпополісахариди (ЛПС). Такі ад'юванти зазвичай використовують у формі емульсії, яка містить водну фазу, або частіше можуть складатися з не розчинних у воді неорганічних солей. Ці неорганічні солі можуть складатися, наприклад, з гідроксиду алюмінію, сульфату цинку, колоїдного гідроксиду заліза, фосфату кальцію або хлориду кальцію. Гідроксид алюмінію (Al(OH) 3) є таким, що широко використовується ад'ювантом. У цей час єдиним ад'ювантом, схваленим FDA для використання у людей, є солі алюмінію (Alum), які використовуються для "депонування" антигенів за допомогою їх преципітації. Зазначені вище ад'юванти наведені просто як приклади. Фактично, будь-який ад'ювант, що викликає імунну відповідь, можна використовувати в складі композиції, що викликає імунну відповідь, описаної в даній заявці, за умови, що ад'ювант має характеристики, необхідні для того, щоб викликати імунну відповідь. [040] Носій, описаний у даній заявці, може також діяти як ад'ювант. Конкретні ад'юванти й способи їхнього одержання й використання описані, наприклад, в Gupta et al. Vaccine, 11: 993306, 1993; Arnon, R. (Ed.) Synthetic Vaccines 1:83-92, CRC Press, Inc., Boca Raton, Fla., 1987; і David W. Waggoner, Jr. et al., Immunogenicity-Enhancing Carriers and Compositions Thereof and Methods of Using the Same, публікація патенту США №20040057958 (25 березня 2004 р.). Додаткові ад'юванти включають будь-які сполуки, описані в 7 главі (стр. 141-227) "Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" (eds. Powell, M. F. and Newman, M. J.) Pharmaceutical Biotechnology, Volume 6, Plenum Press (New York). Приклади із цього довідника включають мурамілдипептид (МДП) і Монтанід 720. Молекули, такі як поліінозин:цитозин (poly:C) або плазмідна ДНК, що містить мотиви CpG, можна також вводити як ад'юванти у комбінації з антигенами, залученими в мікрочастинки. В іншому прикладі ад'ювант являє собою агент, який полегшує проникнення антигенної сполуки в цитоплазму клітини, такої як лістеріолізин, стрептолізин або їхня суміш. [041] Таким чином, відповідно до одного варіанта реалізації, композиція, що викликає імунну відповідь стосовно SNAP-25, включає антиген SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться карбоксильований залишок глутаміну, пов'язаний з пептидом-носієм. Відповідно до аспектів даного варіанта реалізації, антиген SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться карбоксильований залишок глутаміну, включає SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 або SEQ ID NO: 39. Відповідно до іншого аспекту даного варіанта реалізації, антиген SNAP-25 включає SEQ ID NO: 40. Відповідно до аспектів даного варіанта реалізації, пептид-носій являє собою гемоціанін фісурели (KLH), овальбумін (OVA), тиреоглобулін (THY), бичачий сироватковий альбумін (BSA), соєвий інгібітор трипсину (STI) або пептид множинного прикріплення (MAP). [042] Відповідно до іншого варіанта реалізації, композиція, що викликає імунну відповідь стосовно SNAP-25, включає антиген SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться карбоксильований залишок лізину, пов'язаний з пептидом-носієм. Відповідно до аспектів даного варіанта реалізації, антиген SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться карбоксильований залишок лізину, включає SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45 або SEQ ID NO: 46. Відповідно до іншого аспекту даного варіанта реалізації, антиген SNAP-25 включає SEQ ID NO: 47. Відповідно до аспектів даного варіанта реалізації, пептид-носій являє собою гемоціанін фісурели (KLH), овальбумін (OVA), тиреоглобулін (THY), бичачий сироватковий альбумін (BSA), соєвий інгібітор трипсину (STI) або пептид множинного прикріплення (MAP). [043] Згідно ще одного варіанту реалізації, композиція, що викликає імунну відповідь стосовно SNAP-25, включає антиген SNAP-25, на C-кінці якого знаходиться карбоксильований залишок глутаміну, пов'язаний з одним або декількома гнучкими лінкерами й пептидом-носієм, причому гнучкі лінкери поміщені між антигеном SNAP-25 і пептидом-носієм. Відповідно до аспектів даного варіанта реалізації, антиген SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться карбоксильований залишок глутаміну, включає SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 або SEQ ID NO: 39. Відповідно до іншого варіанта реалізації, антиген SNAP-25 включає SEQ ID NO: 46. Відповідно до аспектів даного варіанта реалізації, пептид-носій являє собою гемоціанін фісурели (KLH), овальбумін (OVA), тиреоглобулін (THY), бичачий сироватковий альбумін (BSA), соєвий інгібітор трипсину (STI) або пептид множинного прикріплення (MAP). Відповідно до аспектів даного варіанта реалізації, гнучкий лінкер являє собою G-спейсер або A-спейсер. [044] Згідно ще одного варіанту реалізації, композиція, що викликає імунну відповідь стосовно SNAP-25, включає антиген SNAP-25, на C-кінці якого знаходиться карбоксильований залишок лізину, пов'язаний із гнучким лінкером і пептидом-носієм, причому гнучкий лінкер 10 UA 104456 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 поміщений між антигеном SNAP-25 і пептидом-носієм. Відповідно до аспектів даного варіанта реалізації, антиген SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться карбоксильований залишок лізину, включає SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45 або SEQ ID NO: 46. Відповідно до іншого аспекту даного варіанта реалізації, антиген SNAP-25 включає SEQ ID NO: 47. Відповідно до аспектів даного варіанта реалізації, пептидносій являє собою гемоціанін фісурели (KLH), овальбумін (OVA), тиреоглобулін (THY), бичачий сироватковий альбумін (BSA), соєвий інгібітор трипсину (STI) або пептид множинного прикріплення (MAP). Відповідно до аспектів даного варіанта реалізації, гнучкий лінкер являє собою G-спейсер або A-спейсер. [045] Частина аспектів даного опису включає спосіб одержання анти-SNAP-25 антитіл, здатних вибірково зв'язуватися з SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A. Анти-SNAP-25 антитіла, які вибірково зв'язуються з епітопом SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A, можна одержати великою кількістю способів, добре відомих у даній галузі техніки. Конкретні протоколи для одержання й використання антитіл, а також для детектування й вимірювання специфічності зв'язування, афінності зв'язування й авідності зв'язування антитіл відомі в даній галузі техніки. Див., наприклад, Antibodies: A Laboratory Manual (Edward Harlow & David Lane, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1998a); і Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol No. I (Edward Harlow & David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1998b); Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2001; і Current Protocols in Molecular Biology, 2004; David Anderson et al., Therapeutic Polypeptides, Nucleic Acids Encoding Same, and Methods of Use, патент США 7034132 (25 квітня 2005 р.); і Beatriz M. Carreno et al., Antibodies Against CTLA4, патент США 7034121 (25 квітня 2006 р.). [046] Як необмежуючий приклад можна навести поліклональні анти-SNAP-25 антитіла, які вибірково зв'язуються з SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A, які можуть бути одержані шляхом введення тваринам, таким як, наприклад, кролик, коза, миша або інші ссавці, однієї або декількох ін'єкцій композиції, що викликає імунну відповідь, описану в даній заявці. Як інший необмежуючий приклад можна навести поліклональні анти-SNAP-25 антитіла, які вибірково зв'язуються з SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A, які можуть бути одержані шляхом введення в яйце, таке як, наприклад, куряче яйце, однієї або декількох ін'єкцій композиції, що викликає імунну відповідь, описану в даній заявці. Титр антитіл у імунізованої тварини можна контролювати із часом стандартними методами, такими як твердофазний імуноферментний аналіз (твердофазний ІФА) з використанням іммобілізованого антигену або тест на активність у клітинах. За бажанням, як анти-SNAP-25 антитіла, які вибірково зв'язуються з епітопом SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A, можна використовувати поліклональні антитіла, які можна виділити із ссавців (наприклад, із крові) і далі очистити з використанням добре відомих методів, таких як афінна хроматографія за допомогою білка А для одержання фракції IgG, або з використанням афінного очищення за допомогою пептиду, використовуваного для одержання антитіл. [047] Як інший необмежуючий приклад можна навести моноклональні анти-SNAP-25 антитіла, які вибірково зв'язуються з SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A, які можна одержати з використанням гібридомного способу. Див., наприклад, Chapter 6 Monoclonal Antibodies, pp. 196244, Harlow & Lane, див. вище, 1998a; і Chapter 7 Growing Hybridomas, pp. 245-282, Harlow & Lane, див. вище, 1998a; і Goding, pp. 59-103, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986). Відповідно до цього способу, тварину-хазяїна, таку як, наприклад, миша, хом'як або іншу підходящу тварину-хазяїна, зазвичай піддають одній або декільком ін'єкціям антигену SNAP-25, описаного в даній заявці, для стимуляції утворення лімфоцитів, які виробляють або здатні виробляти анти-SNAP-25 антитіла, які вибірково зв'язуються з SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A. Титр антитіл в імунізованої тварини можна контролювати із часом стандартними методами, такими як твердофазний імуноферментний аналіз (твердофазний ІФА) з використанням іммобілізованого антигену або тест на активність у клітинах. Як альтернатива, лімфоцити можна імунізувати in vitro з використанням підходящої лінії клітинної культури. У підходящий час після імунізації, наприклад, коли титр антитіл є найвищим, клітини, які виробляють антитіла, виділяють із тварини. У цілому, використовують або лімфоцити периферичної крові, якщо потрібні клітини людського походження, або клітини селезінки або 11 UA 104456 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 клітини лімфатичного вузла, якщо як джерела необхідні ссавці, відмінні від людини. Виділені клітини, які виробляють антитіла, поєднують з іморталізованою клітинною лінією, використовуючи підходящий агент, який стимулює злиття клітин, такий як поліетиленгліколь, з одержанням клітини гібридоми. Іморталізовані клітинні лінії зазвичай являють собою трансформовані клітини ссавців, зокрема клітини мієломи гризунів, великої рогатої худоби й людини. Як правило, клітинну лінію мієломи миші поєднують зі спленоцитами, зібраними з відповідним чином імунізованої миші, для одержання гібридоми. Переважні іморталізовані клітинні лінії являють собою клітинні лінії мієломи миші, які чутливі до культурального середовища, що містить гіпоксантин, аміноптерин і тимідин (ГАТ). Кожну з великої кількості клітинних ліній мієломи можна використовувати як партнер для злиття відповідно стандартних методів, наприклад, лінії мієломи P3-NS1/1-Ag4-1, P3-x63-Ag8.653 або Sp2/O-Ag14. Клітини гібридоми, що утворюються в результаті злиття, потім відбирають за допомогою середовища ГАТ, на якому гинуть клітини мієломи, які не пройшли злиття або пройшли непродуктивне злиття (спленоцити, що не пройшли злиття гинуть у культурі після декількох днів, оскільки вони не трансформовані). Культуральне середовище, в якому вирощують клітини гібридоми, можна потім протестувати на присутність моноклональних анти-SNAP-25 антитіл, які вибірково зв'язуються з SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A. Наприклад, можна провести скринінг супернатантів гібридоми з використанням α-SNAP-25-позитивних середовищ шляхом імунопреципітації, аналізу зв'язування in vitro, такого як, наприклад, радиоімунологічний аналіз (РІА) або твердофазний імуноферментний аналіз (твердофазний ІФА), або тесту на активність у клітинах. Подібні методи й тести відомі в даній галузі техніки. Див., наприклад, Chapter 11 Immunoprecipitation, pp. 421-470, Harlow & Lane, див. вище, 1998a; Chapter 12 Immunoblotting, pp. 471-510, Harlow & Lane, див. вище, 1998a; Chapter 14 Immunoassays, pp. 553-612, Harlow & Lane, див. вище, 1998a. Потім можна провести додаткові дослідження, щоб визначити, чи відсутня у антитіл реактивність також стосовно SNAP-25, на карбоксильному кінці якого відсутній залишок P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A. Можна також визначити афінність зв'язування моноклональних анти-SNAP-25 антитіл, наприклад, за допомогою аналізу Скетчарда. Див., наприклад, Peter J. Munson and David Rodbard, Ligand: A Versatile Computerized Approach For Characterization of Ligand-Binding Systems, 107(1) Anal. Biochem. 220-239 (1980). Після ідентифікації шуканих клітин гібридоми використовують метод граничних розведень для ізоляції клонів, що виходять з одної клітини, до одержання клональної клітинної лінії, що експресує необхідні моноклональні антитіла. Ці антитіла, які проявляють істотну вибірковість стосовно SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A, і зв'язуються з досить високою авідністю, відбирають для подальшої характеризації й дослідження. [048] Іншою альтернативою для одержання моноклональних анти-SNAP-25 антитіл, які вибірково зв'язуються з SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A, є скринінг рекомбінантної комбінаторної бібліотеки імуноглобулінів, такої як, наприклад, бібліотека антитіл на основі фагового дисплею, за допомогою пептиду SNAP-25 й ідентифікація компонентів бібліотеки імуноглобулінів, які зв'язуються з SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A. Набори для конструювання й скринінга бібліотек на основі фагового дисплею комерційно доступні, наприклад, Рекомбінантна Фагова Система Антитіл (Amersham GE Healthcare, Пискетеуей, Нью-Джерсі) і Набір для Фагового Дисплея SurfZAP™ (Stratagene, Ла-Хойя, Каліфорнія). Крім того, приклади способів і реагентів, що підходять для одержання й скринінга бібліотеки антитіл на основі дисплею, можна знайти, наприклад, в Ladner et al., патент США 5223409; Borrebaeck et al., патент США 5712089; Griffiths et al., патент США 5885793; Griffiths et al., патент США 5962255; McCafferty et al., патент США 5969108; Griffiths et al., патент США 6010884; Jespers et al., патент США 6017732; Borrebaeck et al., патент США 6027930; Johnson et al., патент США 6140471; McCafferty et al., патент США 6172197, зміст кожного з яких повністю включено в дану заявку за допомогою посилання. [049] Частина аспектів даного опису включає збір зразка, що містить анти-SNAP-25 антитіла або клітини, які виробляють анти-SNAP-25 антитіла. У даній заявці термін "зразок, що містить анти-SNAP-25 антитіла або клітини, які виробляють анти-SNAP-25 антитіла", відноситься до будь-якого біологічного матеріалу, що містить або потенційно містить щонайменше одне антитіло α-SNAP-25, яке вибірково зв'язується з епітопом SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A. Припускається, що всі без винятку зразки, які можуть містити анти-SNAP-25 антитіла, які вибірково зв'язуютьсяз епітопом SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок 12 UA 104456 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A, можна використовувати в цьому способі, включаючи, без обмеження, кров, плазму, сироватку й лімфатичну рідину. Також припускається, що будь-яка клітина, здатна виробляти анти-SNAP-25 антитіла, які вибірково зв'язуються з епітопом SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A, можна використовувати в цьому способі, включаючи, без обмеження, клітини CD8, клітини ЦТЛ, T-клітини-хелпери й B-клітини. Для одержання з особини зразка, що містить анти-SNAP-25 антитіла або клітини, які виробляють анти-SNAP-25 антитіла, можна використовувати велику кількість добре відомих способів, див., наприклад, Harlow & Lane, див. вище, 1998a; і Harlow & Lane, див. вище, 1998b. Подібним чином, велику кількість добре відомих способів можна використовувати для обробки зразка з метою виділення антиSNAP-25 антитіл, які вибірково зв'язуються з епітопом SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A. Процедуру збору зразка можна вибрати виходячи з типу антитіл, які необхідно виділити. Як необмежуючий приклад, при виділенні поліклональних анти-SNAP-25 антитіл, які вибірково зв'язуються з SNAP25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A, зразок, що підходить, може являти собою зразок крові, що містить такі анти-SNAP-25 антитіла, тоді як при виділенні моноклональних анти-SNAP-25 антитіл, які вибірково зв'язуються з SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A, зразок, що підходить, може являти собою клітину, яка виробляє анти-SNAP-25 антитіла, таку як клітина селезінки або гібридома. [050] Частина аспектів даного опису включає виділення зі зразка анти-SNAP-25 антитіл, які вибірково зв'язуються з епітопом SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A. Способи виділення таких анти-SNAP-25 антитіл, таких як, наприклад, поліклональні анти-SNAP-25 антитіла, які вибірково зв'язуються з SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A, або моноклональні анти-SNAP-25 антитіла, які вибірково зв'язуються з SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A, добре відомі фахівцям у даній галузі техніки. Див., наприклад, Harlow and Lane, див. вище, 1998a; і Harlow and Lane, див. вище, 1998b. Наприклад, такі поліклональні анти-SNAP-25 антитіла можна виділити зі зразка за допомогою добре відомих методів, таких як, наприклад, афінна хроматографія з використанням білка A або білка G, який дозволяє виділити головним чином фракцію IgG імунної сироватки. Згодом, або як альтернатива, конкретний антиген SNAP-25 можна імобілізувати на колонці або магнітних кульках для очищення поліклональних анти-SNAP-25 антитіл, які вибірково зв'язуються з SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A, за допомогою імуноафінної хроматографії. Моноклональні анти-SNAP-25 антитіла, які вибірково зв'язуються з SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A, можна виділити з культурального середовища або асцитної рідини за допомогою звичайних процедур для очищення імуноглобулінів, таких як, наприклад, білок A-сефароза, хроматографія з гідроксилапатитом, гель-електрофорез, діаліз або афінна хроматографія. [051] Таким чином, відповідно до одного варіанта реалізації, спосіб одержання анти-SNAP25 антитіл, які здатні вибірково зв'язуватися з SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A, включає етапи (а) введення тварині композиції, яка викликає імунну відповідь стосовно SNAP-25, яка включає антиген SNAP-25, на C-кінці якого знаходиться карбоксильований залишок глутаміну, пов'язаний з пептидом-носієм; (б) добір у тваринного зразка, що містить анти-SNAP-25 антитіла або клітини, які виробляють анти-SNAP-25 антитіла; і (в) виділення компонентів анти-SNAP-25 антитіл зі зразка. Відповідно до одного аспекту даного варіанта реалізації, анти-SNAP-25 антитіла, які здатні вибірково зв'язуватися з SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A, є поліклональними антитілами. Відповідно до іншого аспекту даного варіанта реалізації, анти-SNAP-25 антитіла, які здатні вибірково зв'язуватися з SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P 1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A, є моноклональними антитілами. Відповідно до подальшого аспекту даного варіанта реалізації, одержувані моноклональні анти-SNAP-25 антитіла, які здатні вибірково зв'язуватися з SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A, відносяться до підтипу IgG. Відповідно до інших аспектів даного варіанта реалізації, композиція, що викликає імунну відповідь стосовно SNAP-25, додатково містить ад'ювант, такий як, наприклад, поліетиленгліколь (ПЕГ), монометоксиполіетиленгліколь (мПЕГ) або полівінілалкоголь (ПВА). 13 UA 104456 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 [052] Відповідно до іншого варіанта реалізації, спосіб одержання анти-SNAP-25 антитіл, які здатні вибірково зв'язуватися з SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P 1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A, включає етапи (а) введення тварині композиції, що викликає імунну відповідь стосовно SNAP-25, яка включає пептид SNAP-25, на C-кінці якого знаходиться карбоксильований залишок глутаміну, пов'язаний із гнучким лінкером і пептидом-носієм, причому гнучкий лінкер поміщений між пептидом SNAP-25 і пептидом-носієм; (б) добір у тваринного зразка, що містить анти-SNAP-25 антитіла або клітини, які виробляють анти-SNAP-25 антитіла; і (в) виділення анти-SNAP-25 антитіл зі зразка. Відповідно до одного аспекту даного варіанта реалізації, анти-SNAP-25 антитіла, які здатні вибірково зв'язуватися з SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A, є поліклональними антитілами. Відповідно до іншого аспекту даного варіанта реалізації, анти-SNAP-25 антитіла, які здатні вибірково зв'язуватися з SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P 1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A, є моноклональними антитілами. Відповідно до подальшого аспекту даного варіанта реалізації, одержувані моноклональні анти-SNAP-25 антитіла, які здатні вибірково зв'язуватися з SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A, відносяться до підтипу IgG. Відповідно до інших аспектів даного варіанта реалізації, композиція, що викликає імунну відповідь стосовно SNAP-25, додатково містить ад'ювант, такий як, наприклад, поліетиленгліколь (ПЕГ), монометоксиполіетиленгліколь (мПЕГ) або полівінілалкоголь (ПВА). [053] Частина аспектів даного опису включає ізольовані анти-SNAP-25 антитіла, які вибірково зв'язуються з епітопом SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A. У даній заявці термін "антитіло" відноситься до молекули, що виробляється імунною системою, яка продукується у відповідь на певний антиген й яка специфічно зв'язується із цим антигеном, і охоплює як природні антитіла, так і антитіла, що не зустрічаються в природі. У даній заявці термін "ізольований" відноситься до виділення молекули з її природного оточення в результаті втручання людини. Наприклад, антитіло може бути поліклональним антитілом, моноклональним антитілом, димером, мультимером, мультиспецифічним антитілом, гуманізованим антитілом, химерним антитілом, біфункціональним антитілом, пов'язаним із клітиною антитілом, як ІГ рецептор, лінійним антитілом, діатілом або мініантитілом, якщо фрагмент демонструє бажану біологічну активність, та їхніми похідними, що складаються з одного ланцюга. Антитіло може являти собою повнорозмірну молекулу імуноглобуліну, включаючи домени VH й VL, а також константний домен легкого ланцюга (CL) і константні домени важкого ланцюга, CH1, CH2 й CH3, або імунологічно активний фрагмент повнорозмірної молекули імуноглобуліну, такої як, наприклад, Fabфрагмент, F(ab')2-фрагмент, Fc-фрагмент, Fd-фрагмент, Fv-фрагмент. Антитіло може бути одержане від будь-яких видів хребетних (наприклад, людини, кози, коня, осла, миші, пацюка, кролика або курки) і може належати до будь-якого типу (наприклад, IgG, IgE, IgM, IgD й IgA), класу (наприклад, IgA, IgD, IgE, IgG й IgM) або підкласу (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 й IgA2). Загальний опис структури природних антитіл, антитіл, що не зустрічаються в природі, та їхніх фрагментів, що зв'язують сполуки антигенів можна знайти, наприклад, в Pluckthun в The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg й Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994); Borrabeck, Antibody Engineering, 2d ed. (Oxford University Press 1995), зміст кожного з яких повністю включено в дану заявку за допомогою посилання. [054] Природні антитіла зазвичай являють собою гетеротетрамірні глікопротеїни масою близько 150000 дальтон, які складаються з двох ідентичних легких (L) ланцюгів і двох ідентичних важких (H) ланцюгів. Кожен легкий ланцюг пов'язаний з важким ланцюгом одним ковалентним дисульфідним зв'язком, при цьому число дисульфідних зв'язків варіює для важких ланцюгів різних імуноглобулінових ізотипів. Кожен важкий і легкий ланцюг також містить розташовані з рівними інтервалами дисульфідні містки всередині ланцюга. На одному кінці кожного важкого ланцюга знаходиться варіабельний домен (VH), за яким йде декілька константних доменів. У кожного легкого ланцюга на одному кінці знаходиться варіабельний домен (VL), а на іншому кінці - константний домен. Константний домен легкого ланцюга розташований напроти першого константного домена важкого ланцюга, а варіабельний домен легкого ланцюга розташований навпроти варіабельного домена важкого ланцюга. Певні залишки амінокислот, як припускають, формують область контакту між варіабельними доменами легкого й важкого ланцюга. [055] Повні антигенрозпізнавальна й антигензв'язуюча області містяться в межах варіабельних доменів антитіла, тобто Fv-фрагмента. Цей фрагмент включає димер одного варіабельного домена важкого ланцюга (VH) і одного варіабельного домена легкого ланцюга 14 UA 104456 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (VL), які знаходяться у щільній нековалентній взаємодії. Кожен домен включає чотири каркасні області (FR), які в значній мірі приймають конфігурацію β-шарів, зв'язані трьома гіперваріабельними ділянками, які формують петлі, що з'єднують й у деяких випадках є частиною β-шарової структури. Кожна гіперваріабельна ділянка включає послідовність амінокислот, що відповідає ділянці, яка визначає компліментарність (CDR). У сукупності, ця тривимірна конфігурація шести CDR формує антигензв'язуючу ділянку на поверхні димера VH– VL, що визначає специфічність зв'язування антигену. Див., наприклад, Cyrus Chothia, et al., Conformations of Immunoglobulin Hypervariable Regions, Nature 342(6252): 877-883 (1989); Elvin A. Kabat, et al Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991), кожен з яких повністю включений у дану заявку за допомогою посилання. Константні домени антитіл безпосередньо не беруть участь у зв'язуванні антитіла з антигеном, але демонструють різні ефекторні функції, такі як участь антитіла в антитілозалежній клітинно-опосередкованій цитотоксичності. [056] Антиген-мішень зазвичай має одну або декілька ділянок зв'язування, також називаних епітопами, які розпізнаються антигензв'язуючими ділянками, утвореними CDR. У даній заявці термін "епітоп" є синонімом терміна "антигенна детермінанта" і відноситься до ділянки антигенумішені, такого як, наприклад, пептиду, полісахариду або ліпідвмісної молекули, здатного специфічно зв'язуватися з імуноглобуліном або рецептором Т-лімфоцитів або іншим способом взаємодіючи з молекулою. Антитіла, які специфічно зв'язуються з різними епітопами, мають різну структуру. Таким чином, одному антигену може відповідати більше одного антитіла. [057] Термін "поліклональні антитіла" відноситься до гетерогенної популяції молекул антитіл, яка містить щонайменше два види антитіл, здатних зв'язуватися з конкретним антигеном. Згідно визначенню, поліклональні антитіла включають два різних антитіла, які зв'язуються щонайменше із двома різними епітопами. У даній заявці терміни "моноклональне антитіло" або "моноклональні антитіла" відносяться до по суті гомогенного ступеня популяції молекул антитіл, що містить тільки один вид антитіл, здатних зв'язуватися з конкретним антигеном, тобто індивідуальні антитіла, що становлять популяцію, є ідентичними, за винятком можливих природних мутацій, які можуть бути присутніми у малих кількостях. Згідно визначенню, моноклональні антитіла зв'язуються з єдиним епітопом. Моноклональні антитіла високоспецифічні й направлені проти однієї ділянки антигену. Більше того, на відміну від поліклональних антитіл, кожне моноклональне антитіло направлене проти єдиної антигенної детермінатни. Крім специфічності, перевагою моноклональних антитіл є можливість синтезувати їх під час відсутності забруднення іншими антитілами. Визначення "моноклональні" відображує особливість даних антитіл, яка полягає в тому, що вони одержані з гомогенної в значній мірі популяції антитіл, і не повинно мати на увазі як вимогу, щоб анитіла були одержані яким-небудь конкретним способом. Наприклад, моноклональні антитіла для застосування відповідно до даної заявки можна одержати гібридомним способом, вперше описаним Kohler et al (1975) Nature 256:495, або за допомогою способу, основаного на використанні технологій рекомбінантної ДНК (див., наприклад, патент США № 4816567; патент США № 5807715). Моноклональні антитіла також можна виділити з фагових бібліотек антитіл з використанням методів, описаних, наприклад, в Clackson et al (1991) Nature, 352:624-628; Marks et al (1991) J. Mol. Biol., 222:581-597. [058] Таким чином, відповідно до одного варіанта реалізації, анти-SNAP-25 антитіла включають варіабельний домен важкого ланцюга (VH) і варіабельний домен легкого ланцюга (VL), які вибірково зв'язуються з SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A. Відповідно до одного аспекту даного варіанта реалізації, варіабельний домен важкого ланцюга (VH) являє собою SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82 або SEQ ID NO: 133. Відповідно до іншого аспекту даного варіанта реалізації, варіабельний домен легкого ланцюга (V L) являє собою SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90 або SEQ ID NO: 92. [059] Відповідно до іншого варіанта реалізації, послідовність нуклеїнової кислоти кодує антиSNAP-25 антитіла, що включають варіабельний домен важкого ланцюга (V H) і варіабельний домен легкого ланцюга (VL), які вибірково зв'язуються з SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A. Відповідно до одного аспекту даного варіанта реалізації, варіабельний домен важкого ланцюга (V H) кодує послідовність нуклеїнової кислоти SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81 або SEQ ID NO: 132. Відповідно до іншого аспекту даного варіанта реалізації, варіабельний домен важкого ланцюга (V H) кодує послідовність нуклеїнової кислоти, яка щонайменше на 70 %, щонайменше на 75 %, щонайменше на 80 %, щонайменше на 85 %, щонайменше на 90 %, щонайменше на 95 %, щонайменше на 96 %, щонайменше на 15 UA 104456 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 97 %, щонайменше на 98 % або щонайменше на 99 % ідентична SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81 або SEQ ID NO: 132. Згідно ще одного аспекту даного варіанта реалізації, варіабельний домен легкого ланцюга (V L) кодує SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89 або SEQ ID NO: 91. Згідно ще одного аспекту даного варіанта реалізації, варіабельний домен легкого ланцюга (V L) кодує послідовність нуклеїнової кислоти, яка щонайменше на 70 %, щонайменше на 75 %, щонайменше на 80 %, щонайменше на 85 %, щонайменше на 90 %, щонайменше на 95 %, щонайменше на 96 %, щонайменше на 97 %, щонайменше на 98 % або щонайменше на 99 % ідентична SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89 або SEQ ID NO: 91. [060] Відповідно до іншого варіанту реалізації, анти-SNAP-25 антитіла включають ділянки CDR1, CDR2 й CDR3 варіабельного домена важкого ланцюга (VH) або будь-які їх комбінації, які вибірково зв'язуються з SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A. Відповідно до одного аспекту даного варіанта реалізації, ділянка CDR1 варіабельного домена важкого ланцюга (V H) являє собою SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119 або SEQ ID NO: 120. Відповідно до іншого аспекту даного варіанта реалізації, ділянка CDR2 варіабельного домена важкого ланцюга (VH) являє собою SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 122 або SEQ ID NO: 123. Згідно ще одного аспекту даного варіанта реалізації, ділянка CDR3 варіабельного домена важкого ланцюга (VH) являє собою SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 134 або SEQ ID NO: 135. [061] Відповідно до іншого варіанта реалізації, анти-SNAP-25 антитіла включають ділянки CDR1, CDR2 й CDR3 варіабельного домена легкого ланцюга (VL) або будь-які їхні комбінації, які вибірково зв'язуються з SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A. Відповідно до одного аспекту даного варіанта реалізації, ділянка CDR1 варіабельного домена легкого ланцюга (V L) являє собою SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 128 або SEQ ID NO: 129. Відповідно до іншого аспекту даного варіанта реалізації, ділянка CDR2 варіабельного домена легкого ланцюга (V L) являє собою SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111 або SEQ ID NO: 112. Згідно ще одного аспекту даного варіанта реалізації, ділянка CDR3 варіабельного домена легкого ланцюга (VL) являє собою SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116 або SEQ ID NO: 117. [062] Згідно ще одного варіанту реалізації, анти-SNAP-25 антитіла специфічно зв'язуються з епітопом, що містить SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A. Відповідно до одного аспекту даного варіанта реалізації, епітоп включає SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36 або SEQ ID NO: 37. Відповідно до одного аспекту даного варіанта реалізації, епітоп включає SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43 або SEQ ID NO: 44. [063] Як обговорювалося вище, послідовність, що оточує сайт розщеплення BoNT/A, присутній в SNAP-25, позначена як P5–P4–P3–P2–P1–P1’–P2’–P3’–P4’–P5’, де P1–P1’ означає розрізуваний зв'язок. Після розщеплення BoNT/A продукти розщеплення, що утворюються, містять фрагмент, що включає послідовність P5–P4–P3–P2–P1, і фрагмент, що включає P1’–P2’– P3’–P4’–P5’. У даній заявці термін "анти-SNAP-25 антитіла, які специфічно зв'язуються з SNAP25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A" відноситься до антитіл α-SNAP-25, які специфічно зв'язуються з будьяким фрагментом продукту розщеплення SNAP-25, що містить послідовність P5–P4–P3–P2–P1, але не з будь-яким фрагментом продукту розщеплення SNAP-25, що містить послідовність P1’– P2’–P3’–P4’–P5’, або будь-яким SNAP-25, у якого є присутнім в інтактному виді розрізуваний зв'язок P1–P1’ у сайті розщеплення BoNT/A. У даній заявці термін "анти-SNAP-25 антитіла197" відноситься до антитіл, які вибірково зв'язуються з SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P1, який відповідає глутаміну 197 з SEQ ID NO: 5. У даній заявці термін "анти-SNAP-25 антитіла204" відноситься до антитіл, які вибірково зв'язуються з SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P1, який відповідає лізину 204 з SEQ ID NO: 16. [064] У даній заявці термін "вибірково" відноситься до унікального ефекту або впливу або здатності реагувати тільки одним певним чином або тільки з одним певним партнером. У даній заявці термін "вибірково зв'язується" або "вибіркове зв'язування" стосовно антитіл відноситься до селективного зв'язування антитіл із зазначеним епітопом-мішенню, такого, що антитіла істотно не проявляють перехресної реактивності стосовно епітопів, які не є мішенями. 16 UA 104456 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Відповідно до даної заявки мінімальний розмір пептидного епітопа становить близько п'яти амінокислот, і пептидний епітоп, як правило, містить щонайменше 5, щонайменше 6, щонайменше 7, щонайменше 8, щонайменше 9, щонайменше 10, щонайменше 15 або щонайменше 20 амінокислот. Пептидний епітоп може бути переривчастим, тобто містити залишки амінокислот, які розташовані не поруч один з одним у первинній структурі пептиду, але об'єднані в епітоп за допомогою вторинної, третинної або четвертинної структури пептиду. Крім того, відзначають, що епітоп може включати частину молекули, яка не є послідовністю амінокислот, як, наприклад, вуглеводну групу, ліпідну групу, як у ліпопротеїнів або гліколіпідів, або хімічно модифіковану амінокислотну групу, наприклад, фосфорильовану амінокислоту. Відповідно до деяких аспектів даного варіанта реалізації, анти-SNAP-25 антитіла, які вибірково зв'язуються з епітопом SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A, здатні вибірково зв'язуватися з епітопом SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A, який включає щонайменше 5, щонайменше 6, щонайменше 7, щонайменше 8, щонайменше 9, щонайменше 10, щонайменше 15 або щонайменше 20 амінокислот. Відповідно до інших аспектів даного варіанта реалізації, анти-SNAP-25 антитіла, які вибірково зв'язуються з епітопом SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A, здатні вибірково зв'язуватися з епітопом SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A, який включає якнайбільше 5, якнайбільше 6, якнайбільше 7, якнайбільше 8, якнайбільше 9, якнайбільше 10, якнайбільше 15 або якнайбільше 20 амінокислот. [065] Вибіркове зв'язування включає такі властивості зв'язування, як наприклад афінність зв'язування, специфічність зв'язування й авідність зв'язування. Див. David J. King, Applications and Engineering of Monoclonal Antibodies, pp. 240 (1998). Афінність зв'язування відноситься до тривалості знаходження антитіла в сайті зв'язування відповідного епітопа, і її можна розглядати як силу, з якою антитіло зв'язується зі своїм епітопом. Афінність зв'язування можна описати за допомогою рівноважної константи дисоціації антитіла (KD), яка визначається як співвідношення Kd/Ka у стані рівноваги, де Ka являє собою константу швидкості асоціації антитіла, а Kd константу швидкості дисоціації антитіла. Афінність зв'язування визначається як асоціацією, так і дисоціацією, і окремо ні високий ступінь асоціації, ні низький ступінь дисоціації не може гарантувати високу афінність. Константа швидкості асоціації (Ka), або константа швидкості прямої реакції (Kon), є мірою числа подій зв'язування за одиницю часу або схильності антитіла й антигену піддаватися оборотній асоціації з утворенням комплексу антитіло-антиген. Константа -1 -1 швидкості асоціації виражається в М с і позначається таким чином: [Ab]x[Ag]xKon. Чим більше константа швидкості асоціації, тим швидше антитіло зв'язується з антигеном або тим вище афінність зв'язування між антитілом й антигеном. Константа швидкості дисоціації (Kd), або константа швидкості зворотної реакції (Koff), є мірою числа подій дисоціації за одиницю часу або схильності комплексу антитіло-антиген оборотно розділятися (дисоціювати) на молекулярні -1 компоненти, а саме антитіло й антиген. Константа швидкості дисоціації виражається в с і позначається таким чином: [Ab+Ag]xKoff. Чим менше константа швидкості дисоціації, тим більш міцно антитіло пов'язане з антигеном або тим вище афінність зв'язування між антитілом й антигеном. Рівноважна константа дисоціації (KD) є мірою швидкості, з якої утворюються нові комплекси антитіло-антиген, й дорівнює швидкості, з якою комплекси антитіло-антиген піддаються дисоціації, у рівноважному стані. Рівноважна константа дисоціації виражається в М і визначається як Koff/Kon=[Ab]x[Ag]/[Ab+Ag], де [Ab] відповідає молярній концентрації антитіла, [Ag] відповідає молярній концентрації антигену, а [Ab+Ag] відповідає молярній концентрації комплексу антитіло-антиген, при цьому всі концентрації відповідають рівноважному стану. Чим менше рівноважна константа дисоціації, тим більш міцно антитіло зв'язане з антигеном або тим вище афінність зв'язування між антитілом й антигеном. [066] Таким чином, відповідно до одного варіанта реалізації, афінність зв'язування антиSNAP-25 антитіл, які вибірково зв'язуються з епітопом SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A, може 5 -1 характеризуватися константою швидкості асоціації, що становить, наприклад, менше 1×10 М -1 6 -1 -1 7 -1 -1 8 -1 -1 с , менше 1×10 М с , менше 1×10 М с або менше 1×10 М с . Відповідно до іншого варіанта реалізації, афінність зв'язування анти-SNAP-25 антитіл, які вибірково зв'язуються з 1 епітопом SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A, може характеризуватися константою швидкості асоціації, що 5 -1 -1 6 -1 -1 7 -1 -1 становить, наприклад, більше 1×10 М с , більше 1×10 М с , більше 1×10 М с або більше 8 -1 -1 1×10 М с . Відповідно до інших аспектів, афінність зв'язування анти-SNAP-25 антитіл, які 17 UA 104456 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 вибірково зв'язуються з епітопом SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A, може характеризуватися константою 5 -1 -1 8 -1 -1 6 -1 -1 швидкості асоціації, що знаходиться в діапазоні від 1×10 М с до 1×10 М с , від 1×10 М с 8 -1 -1 5 -1 -1 7 -1 -1 до 1×10 М с , від 1×10 М с до 1×10 М с або від 1×106 М-1 с-1 до 1 × 107 М-1 с-1. [067] Відповідно до іншого варіанта реалізації, афінність зв'язування анти-SNAP-25 антитіл, які вибірково зв'язуються з епітопом SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A, може характеризуватися -3 -1 -4 -1 константою швидкості дисоціації, що становить менше 1×10 с , менше 1×10 с або менше -5 -1 1×10 с . Відповідно до інших аспектів даного варіанта реалізації, афінність зв'язування антиSNAP-25 антитіл, які вибірково зв'язуються з епітопом SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A, може -4 характеризуватися константою швидкості дисоціації, що становить, наприклад, менше 1,0×10 -1 -4 -1 -4 -1 -4 -1 -4 -1 -4 с , менше 2,0×10 с , менше 3,0×10 с , менше 4,0×10 с , менше 5,0×10 с , менше 6,0×10 -1 -4 -1 -4 -1 -4 -1 с , менше 7,0×10 с , менше 8,0×10 с або менше 9,0×10 с . Відповідно до іншого варіанта реалізації, афінність зв'язування анти-SNAP-25 антитіл, які вибірково зв'язуються з епітопом SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A, може характеризуватися константою швидкості дисоціації, що становить, -3 -1 -4 -1 -5 -1 наприклад, більше 1×10 с , більше 1×10 с або більше 1×10 с . Відповідно до інших аспектів даного варіанта реалізації, афінність зв'язування анти-SNAP-25 антитіл, які вибірково зв'язуються з епітопом SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A, може характеризуватися константою -4 -1 -4 -1 швидкості дисоціації, що становить, наприклад, більше 1,0×10 с , більше 2,0×10 с , більше -4 -1 -4 -1 -4 -1 -4 -1 -4 -1 3,0×10 с , більше 4,0×10 с , більше 5,0×10 с , більше 6,0×10 с , більше 7,0×10 с , -4 -1 -4 -1 більше 8,0×10 с або більше 9,0×10 с . [068] Відповідно до іншого варіанта реалізації, афінність зв'язування анти-SNAP-25 антитіл, які вибірково зв'язуються з епітопом SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A, може характеризуватися рівноважною константою дисоціації, що становить менше 0,500 нМ. Відповідно до аспектів даного варіанта реалізації, афінність зв'язування анти-SNAP-25 антитіл, які вибірково зв'язуються з епітопом SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A, може характеризуватися рівноважною константою дисоціації, що становить, наприклад, менше 0,500 нМ, менше 0,450 нМ, менше 0,400 нМ, менше 0,350 нМ, менше 0,300 нМ, менше 0,250 нМ, менше 0,200 нМ, менше 0,150 нМ, менше 0,100 нМ або менше 0,050 нМ. Відповідно до іншого варіанта реалізації, афінність зв'язування анти-SNAP-25 антитіл, які вибірково зв'язуються з епітопом SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P 1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A, може характеризуватися рівноважною константою дисоціації, що становить більше 0,500 нМ. Відповідно до аспектів даного варіанта реалізації, афінність зв'язування анти-SNAP25 антитіл, які вибірково зв'язуються з епітопом SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A, може характеризуватися рівноважною константою дисоціації, що становить, наприклад, більше 0,500 нМ, більше 0,450 нМ, більше 0,400 нМ, більше 0,350 нМ, більше 0,300 нМ, більше 0,250 нМ, більше 0,200 нМ, більше 0,150 нМ, більше 0,100 нМ або більше 0,050 нМ. [069] Згідно ще одного варіанту реалізації, афінність зв'язування анти-SNAP-25 антитіл, які вибірково зв'язуються з епітопом SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A, може характеризуватися константою 0 -1 -1 швидкості асоціації для інтактного SNAP-25, що становить, наприклад, менше 1×10 М с , 1 -1 -1 2 -1 -1 3 -1 -1 4 -1 -1 менше 1×10 М с , менше 1×10 М с , менше 1×10 М с або менше 1×10 М с . Відповідно до іншого варіанта реалізації, афінність зв'язування анти-SNAP-25 антитіл, які вибірково зв'язуються з епітопом SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A, може характеризуватися константою 0 -1 -1 швидкості асоціації для інтактного SNAP-25, що становить, наприклад, не більше 1×10 М с , 1 -1 -1 2 -1 -1 3 -1 -1 4 -1 не більше 1×10 М с , не більше 1×10 М с , не більше 1×10 М с або не більше 1×10 М -1 с . [070] Специфічність зв'язування являє собою здатність антитіл відрізняти молекули, які містять епітоп даного антитіла, від молекул, які не містять цей епітоп. Одним зі способів вимірювання специфічності зв'язування є порівняння швидкості асоціації антитіла Kon для молекули, що містить епітоп даного антитіла, зі швидкістю асоціації антитіла Kon для молекули, що не містить цей епітоп. Наприклад, порівняння константи швидкості асоціації (Ka) анти-SNAP25 антитіл для епітопа SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P1 18 UA 104456 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A, з SNAP-25, що не містить цей епітоп, таким як, наприклад, епітоп SNAP-25, на карбоксильному кінці якого відсутній залишок P 1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A, або епітоп SNAP-25, що містить інтактний розрізуваний зв'язок P1–P1’ у сайті розщеплення BoNT/A. Відповідно до аспектів даного варіанта реалізації, анти-SNAP-25 антитіла, які вибірково зв'язуються з епітопом SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P 1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A, характеризуються константою швидкості асоціації (Ka) для SNAP-25, який не містить 0 -1 -1 1 -1 -1 відповідний епітоп(и), що становить, наприклад, менше 1×10 М с , менше 1×10 М с , менше 2 -1 -1 3 -1 -1 4 -1 -1 1×10 М с , менше 1×10 М с або менше 1×10 М с . Відповідно до інших аспектів даного варіанта реалізації, анти-SNAP-25 антитіла, які вибірково зв'язуються з епітопом SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P 1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A, характеризуються константою швидкості асоціації (Ka) для SNAP-25, який не містить 0 -1 -1 1 -1 -1 відповідний епітоп(и), що становить, наприклад, не більше 1×10 М с , не більше 1×10 М с , 2 -1 -1 3 -1 -1 4 -1 -1 не більше 1×10 М с , не більше 1×10 М с або не більше 1×10 М с . [071] Відповідно до інших аспектів даного варіанта реалізації, анти-SNAP-25 антитіла, які вибірково зв'язуються з епітопом SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A, характеризуються константою швидкості асоціації (Ka) для відповідного їм епітопа, яка, наприклад, щонайменше в 2 рази, щонайменше в 3 рази, щонайменше в 4 рази, щонайменше в 5 раз, щонайменше в 6 раз, щонайменше в 7 раз, щонайменше в 8 раз або щонайменше в 9 раз більша в порівнянні зі значенням для SNAP-25, який не містить цей епітоп. Відповідно до подальших аспектів даного варіанта реалізації, антиSNAP-25 антитіла, які вибірково зв'язуються з епітопом SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A, характеризуються константою швидкості асоціації (Ka) для відповідного їм епітопа, яка, наприклад, щонайменше в 10 раз, щонайменше в 100 раз, щонайменше в 1000 раз або щонайменше в 10000 раз більше у порівнянні зі значенням для SNAP-25, який не містить цей епітоп. Відповідно до інших аспектів даного варіанта реалізації, анти-SNAP-25 антитіла, які вибірково зв'язуються з епітопом SNAP25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A, характеризуються константою швидкості асоціації (Ka) для відповідного їм епітопа, яка, наприклад, не більше ніж однократно, не більше ніж в 2 рази, не більше ніж в 3 рази, не більше ніж в 4 рази, не більше ніж в 5 разів, не більше ніж в 6 разів, не більше ніж в 7 разів, не більше ніж в 8 разів або не більше ніж в 9 разів перевищує значення для SNAP-25, який не містить цей епітоп. Відповідно до інших аспектів даного варіанта реалізації, анти-SNAP25 антитіла, які вибірково зв'язуються з епітопом SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A, характеризуються константою швидкості асоціації (Ka) для відповідного їм епітопа, яка, наприклад, не більше ніж в 10 раз, не більше ніж в 100 раз, не більше ніж в 1000 раз або не більше ніж в 10000 раз перевищує значення для SNAP-25, який не містить цей епітоп. [072] Специфічність зв'язування анти-SNAP-25 антитіл, які вибірково зв'язуються з епітопом SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A, можна також охарактеризувати як співвідношення, з яким дані антиSNAP-25 антитіла здатні відрізняти відповідний їм епітоп SNAP-25 від SNAP-25, який не містить цей епітоп, таких як, наприклад, епітоп SNAP-25, на карбоксильному кінці якого відсутній залишок P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A, або епітоп SNAP-25, який містить інтактний розрізуваний зв'язок P1–P1’ у сайті розщеплення BoNT/A. Відповідно до аспектів даного варіанта реалізації, анти-SNAP-25 антитіла, які вибірково зв'язуються з епітопом SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A, характеризуються співвідношенням специфічності зв'язування відповідного епітопа SNAP-25 у порівнянні зі зв'язуванням SNAP-25, який не містить цей епітоп, що становить, наприклад, щонайменше 2:1, щонайменше 3:1, щонайменше 4:1, щонайменше 5:1, щонайменше 6:1, щонайменше 7:1, щонайменше 8:1, щонайменше 9:1, щонайменше 10:1, щонайменше 15:1, щонайменше 20:1, щонайменше 25:1, щонайменше 30:1, щонайменше 35:1 або щонайменше 40:1. Відповідно до інших аспектів даного варіанта реалізації, анти-SNAP-25 антитіла, які вибірково зв'язуються з епітопом SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A, характеризуються співвідношенням специфічності зв'язування відповідного епітопа SNAP-25 у порівнянні зі зв'язуванням SNAP-25, на карбоксильному кінці якого відсутній залишок P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A, що становить, наприклад, щонайменше 2:1, щонайменше 3:1, щонайменше 4:1, щонайменше 5:1, щонайменше 6:1, щонайменше 7:1, щонайменше 8:1, щонайменше 9:1, щонайменше 10:1, щонайменше 15:1, щонайменше 20:1, щонайменше 25:1, 19 UA 104456 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 щонайменше 30:1, щонайменше 35:1 або щонайменше 40:1. Відповідно до інших аспектів даного варіанта реалізації, анти-SNAP-25 антитіла, які вибірково зв'язуються з епітопом SNAP25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A, характеризуються співвідношенням специфічності зв'язування відповідного епітопа SNAP-25 у порівнянні зі зв'язуванням SNAP-25, який містить інтактний розрізуваний зв'язок P1–P1" у сайті розщеплення BoNT/A, що становить, наприклад, щонайменше 2:1, щонайменше 3:1, щонайменше 4:1, щонайменше 5:1, щонайменше 6:1, щонайменше 7:1, щонайменше 8:1, щонайменше 9:1, щонайменше 10:1, щонайменше 15:1, щонайменше 20:1, щонайменше 25:1, щонайменше 30:1, щонайменше 35:1 або щонайменше 40:1. [073] Авідність зв'язування, також відома як функціональна афінність, відноситься до сумарної загальної сили функціонального зв'язування антигену мультивалентним антитілом. Молекули антитіла можуть мати більше однієї ділянки зв'язування (наприклад, 2 у випадку IgG, 10 у випадку IgМ), і багато антигенів містять більше однієї антигенної ділянки. У той час як авідність антитіла залежить від афінностей зв'язування індивідуальних ділянок зв'язування антитіла, авідність зв'язування перевищує афінність зв'язування, тому що для повної дисоціації антитіла від антигену необхідний одночасний розрив всіх взаємодій антитіло-антиген. Припускається, що анти-SNAP-25 антитіла, які вибірково зв'язуються з епітопом SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P 1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A, здатні вибірково зв'язуватися всіма без винятку епітопами, які відповідають даним антитілам. [074] Таким чином, відповідно до одного варіанта реалізації, анти-SNAP-25 антитіла являють собою анти-SNAP-25 антитіла, які вибірково зв'язуються з епітопом SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P 1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A. Відповідно до аспектів даного варіанта реалізації, анти-SNAP-25 антитіла являють собою анти-SNAP-25 антитіла, які вибірково зв'язуються з епітопом SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться глутамін, або анти-SNAP-25 антитіла, які вибірково зв'язуються з епітопом SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться лізин. Відповідно до інших аспектів даного варіанта реалізації, анти-SNAP-25 антитіла являють собою антиSNAP-25 антитіла, які вибірково зв'язуються з епітопом SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P1, що відповідає глутаміну 197 з SEQ ID NO: 5, або анти-SNAP-25 антитіла, які вибірково зв'язуються з епітопом SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P1, що відповідає лізину 204 з SEQ ID NO: 16. Відповідно до інших аспектів даного варіанта реалізації, анти-SNAP-25 антитіла являють собою анти-SNAP-25 антитіла, які вибірково зв'язуються з епітопом SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться послідовність амінокислот з SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45 або SEQ ID NO: 46. [075] Частина аспектів даного опису включає імунологічний спосіб детектування ендопептидаз зі зміненою націленістю. Імунологічні способи, описані в даній заявці, можна оцінювати за допомогою декількох параметрів, включаючи, наприклад, погрішність, розкид результатів, межу детектування (МД), межі кількісного вимірювання (МКВ), діапазон, специфічність, вибірковість, лінійність, надійність і придатність системи. Погрішність способу є мірою точності аналітичного методу або близькості відповідності між обмірюваним значенням і значенням, що прийняте як дійсне значення або опорне значення. Розкид результатів способу являє собою ступінь відповідності між результатами індивідуальних тестів, повторно проведених на багаторазових пробах, взятих з гомогенного зразка. У зв'язку із цим, розсіювання результатів є оцінкою 1) мінливості в межах одного тесту; 2) мінливості в межах одного дня (повторюваності); і 3) мінливості між різними днями (внутрілабораторної погрішності); і 4) міжлабораторної мінливості (відтворюваності). Коефіцієнт варіації (CV%) є кількісним показником розкиду результатів, вираженим стосовно спостережуваного або теоретичного середнього значення. [076] Імунологічний спосіб, описаний у даній заявці, повинен бути здатним детектувати присутність комплексу антитіло α-SNAP-25-антиген, що включає SNAP-25, на карбоксильному кінці якого знаходиться залишок P1 розрізуваного зв'язку у сайті розщеплення BoNT/A, з урахуванням фону. Межа детектування (МД) способу відноситься до концентрації аналізованої речовини, яка викликає появу сигналу, що значно відрізняється від негативного контролю або холостої проби й відповідної найменшої концентрації аналізованої речовини, яку можна відрізнити від фону. 20 UA 104456 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 [077] Таким чином, відповідно до одного варіанта реалізації, імунологічний спосіб, описаний у даній заявці, здатний детектувати МД ендопептидаз зі зміненою націленістю в кількості, що значно відрізняється від негативного контролю або холостої проби. Відповідно до одного аспекту даного варіанта реалізації, імунологічний спосіб, описаний у даній заявці, характеризується МД, наприклад, 10 нг або менше, 9 нг або менше, 8 нг або менше, 7 нг або менше, 6 нг або менше, 5 нг або менше, 4 нг або менше, 3 нг або менше, 2 нг або менше, 1 нг або менше ендопептидази зі зміненою націленістю. Відповідно до інших аспектів даного варіанта реалізації, імунологічний спосіб, описаний у даній заявці, характеризується МД, наприклад, 900 пг або менше, 800 пг або менше, 700 пг або менше, 600 пг або менше, 500 пг або менше, 400 пг або менше, 300 пг або менше, 200 пг або менше, 100 пг або менше ендопептидази зі зміненою націленістю. Відповідно до подальших аспектів даного варіанта реалізації, імунологічний спосіб, описаний у даній заявці, характеризується МД, наприклад, 90 пг або менше, 80 пг або менше, 70 пг або менше, 60 пг або менше, 50 пг або менше, 40 пг або менше, 30 пг або менше, 20 пг або менше, 10 пг або менше ендопептидази зі зміненою націленістю. Відповідно до інших аспектів даного варіанта реалізації, імунологічний спосіб, описаний у даній заявці, характеризується МД, наприклад, 9 пг або менше, 8 пг або менше, 7 пг або менше, 6 пг або менше, 5 пг або менше, 4 пг або менше, 3 пг або менше, 2 пг або менше, 1 пг або менше ендопептидази зі зміненою націленістю. Відповідно до інших аспектів даного варіанта реалізації, імунологічний спосіб, описаний у даній заявці, характеризується МД, наприклад, 0,9 пг або менше, 0,8 пг або менше, 0,7 пг або менше, 0,6 пг або менше, 0,5 пг або менше, 0,4 пг або менше, 0,3 пг або менше, 0,2 пг або менше, 0,1 пг або менше ендопептидази зі зміненою націленістю. [078] Відповідно до іншого аспекту даного варіанта реалізації, імунологічний спосіб, описаний у даній заявці, характеризується МД, наприклад, 100 нМ або менше, 90 нМ або менше, 80 нМ або менше, 70 нМ або менше, 60 нМ або менше, 50 нМ або менше, 40 нМ або менше, 30 нМ або менше, 20 нМ або менше, 10 нМ або менше, 9 нМ або менше, 8 нМ або менше, 7 нМ або менше, 6 нМ або менше, 5 нМ або менше, 4 нМ або менше, 3 нМ або менше, 2 нМ або менше або 1 нМ або менше ендопептидази зі зміненою націленістю. Відповідно до інших аспектів даного варіанта реалізації, імунологічний спосіб, описаний у даній заявці, характеризується МД, наприклад, 900 пМ або менше, 800 пМ або менше, 700 пМ або менше, 600 пМ або менше, 500 пМ або менше, 400 пМ або менше, 300 пМ або менше, 200 пМ або менше або 100 пМ або менше ендопептидази зі зміненою націленістю. Відповідно до інших аспектів даного варіанта реалізації, імунологічний спосіб, описаний у даній заявці, характеризується МД, наприклад, 100 пМ або менше, 90 пМ або менше, 80 пМ або менше, 70 пМ або менше, 60 пМ або менше, 50 пМ або менше, 40 пМ або менше, 30 пМ або менше, 20 пМ або менше або 10 пМ або менше ендопептидази зі зміненою націленістю. Відповідно до інших аспектів даного варіанта реалізації, імунологічний спосіб, описаний у даній заявці, характеризується МД, наприклад, 10 пМ або менше ендопептидази зі зміненою націленістю, 9 пМ або менше, 8 пМ або менше, 7 пМ або менше, 6 пМ або менше, 5 пМ або менше, 4 пМ або менше, 3 пМ або менше, 2 пМ або менше або 1 пМ або менше ендопептидази зі зміненою націленістю. [079] Межі кількісного вимірювання (МКВ) являють собою найменші й найбільші концентрації аналізованої речовини в зразку або препараті, які можна виміряти із припустимим рівнем погрішності й розкиду результатів. Нижня межа кількісного вимірювання відноситься до найменшої дози, яку метод детектування здатний одноманітно вимірювати на рівні фону. Верхня межа кількісного вимірювання являє собою найбільшу дозу, яку метод детектування здатний одноманітно вимірювати до настання насичення сигналу. Лінійний діапазон способу являє собою область між нижньою й верхньою межею кількісного вимірювання. Лінійний діапазон обчислюють шляхом вирахування нижньої межі кількісного вимірювання з верхньої межі кількісного вимірювання. У даній заявці термін "співвідношення сигналу до шуму для нижньої асимптоти" відноситься до сигналу, що детектується даним способом на нижній межі детектування, поділеному на фоновий сигнал. У даній заявці термін "спввідношення сигналу до шуму для верхньої асимптоти" відноситься до сигналу, що детектується даним способом на верхній межі детектування, поділеному на фоновий сигнал. [080] Таким чином, відповідно до одного варіанта реалізації, імунологічний спосіб, описаний у даній заявці, здатний детектувати МКВ ендопептидази зі зміненою націленістю в кількості, яка значно відрізняється від негативного контролю або холостої проби. Відповідно до одного аспекту даного варіанта реалізації, імунологічний спосіб, описаний у даній заявці, характеризується МКВ, наприклад, 10 нг або менше, 9 нг або менше, 8 нг або менше, 7 нг або менше, 6 нг або менше, 5 нг або менше, 4 нг або менше, 3 нг або менше, 2 нг або менше, 1 нг 21 UA 104456 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 або менше ендопептидази зі зміненою націленістю. Відповідно до інших аспектів даного варіанта реалізації, імунологічний спосіб, описаний у даній заявці, характеризується МКВ, наприклад, 900 пг або менше, 800 пг або менше, 700 пг або менше, 600 пг або менше, 500 пг або менше, 400 пг або менше, 300 пг або менше, 200 пг або менше, 100 пг або менше ендопептидази зі зміненою націленістю. Відповідно до подальших аспектів даного варіанта реалізації, імунологічний спосіб, описаний у даній заявці, характеризується МКВ, наприклад, 90 пг або менше, 80 пг або менше, 70 пг або менше, 60 пг або менше, 50 пг або менше, 40 пг або менше, 30 пг або менше, 20 пг або менше, 10 пг або менше ендопептидази зі зміненою націленістю. Відповідно до інших аспектів даного варіанта реалізації, імунологічний спосіб, описаний у даній заявці, характеризується МКВ, наприклад, 9 пг або менше, 8 пг або менше, 7 пг або менше, 6 пг або менше, 5 пг або менше, 4 пг або менше, 3 пг або менше, 2 пг або менше, 1 пг або менше ендопептидази зі зміненою націленістю. Відповідно до інших аспектів даного варіанта реалізації, імунологічний спосіб, описаний у даній заявці, характеризується МКВ, наприклад, 0,9 пг або менше, 0,8 пг або менше, 0,7 пг або менше, 0,6 пг або менше, 0,5 пг або менше, 0,4 пг або менше, 0,3 пг або менше, 0,2 пг або менше, 0,1 пг або менше ендопептидази зі зміненою націленістю. [081] Відповідно до іншого аспекту даного варіанта реалізації, імунологічний спосіб, описаний у даній заявці, характеризується МКВ, наприклад, 100 нМ або менше, 90 нМ або менше, 80 нМ або менше, 70 нМ або менше, 60 нМ або менше, 50 нМ або менше, 40 нМ або менше, 30 нМ або менше, 20 нМ або менше, 10 нМ або менше, 9 нМ або менше, 8 нМ або менше, 7 нМ або менше, 6 нМ або менше, 5 нМ або менше, 4 нМ або менше, 3 нМ або менше, 2 нМ або менше або 1 нМ або менше ендопептидази зі зміненою націленістю. Відповідно до інших аспектів даного варіанта реалізації, імунологічний спосіб, описаний у даній заявці, характеризується МКВ, наприклад, 900 пМ або менше, 800 пМ або менше, 700 пМ або менше, 600 пМ або менше, 500 пМ або менше, 400 пМ або менше, 300 пМ або менше, 200 пМ або менше або 100 пМ або менше ендопептидази зі зміненою націленістю. Відповідно до інших аспектів даного варіанта реалізації, імунологічний спосіб, описаний у даній заявці, характеризується МКВ, наприклад, 100 пМ або менше, 90 пМ або менше, 80 пМ або менше, 70 пМ або менше, 60 пМ або менше, 50 пМ або менше, 40 пМ або менше, 30 пМ або менше, 20 пМ або менше або 10 пМ або менше ендопептидази зі зміненою націленістю. Відповідно до інших аспектів даного варіанта реалізації, імунологічний спосіб, описаний у даній заявці, характеризується МКВ, наприклад, 10 пМ або менше ендопептидази зі зміненою націленістю, 9 пМ або менше, 8 пМ або менше, 7 пМ або менше, 6 пМ або менше, 5 пМ або менше, 4 пМ або менше, 3 пМ або менше, 2 пМ або менше або 1 пМ або менше ендопептидази зі зміненою націленістю. [082] В імунологічному тесті, що підходить для застосування в практичному аспекті описаних способів, повинен спостерігатися розкид результатів, що не перевищує 50 %. Відповідно до аспектів даного варіанта реалізації, в імунологічному тесті спостерігається розкид результатів, що не перевищує 50 %, що не перевищує 40 %, що не перевищує 30 % або що не перевищує 20 %. Відповідно до інших аспектів даного варіанта реалізації, в імунологічному тесті спостерігається розкид результатів, що не перевищує 15 %, що не перевищує 10 % або що не перевищує 5 %. Відповідно до інших аспектів даного варіанта реалізації, в імунологічному тесті спостерігається розкид результатів, що не перевищує 4 %, що не перевищує 3 %, що не перевищує 2 % або що не перевищує 1 %. [083] Імунологічний тест, що підходить для застосування в здійсненні описаних способів, повинен мати точність щонайменше 50 %. Відповідно до аспектів даного варіанта реалізації, імунологічний тест має точність щонайменше 50 %, щонайменше 60 %, щонайменше 70 % або щонайменше 80 %. Відповідно до інших аспектів даного варіанта реалізації, імунологічний тест має точність щонайменше 85 %, щонайменше 90 % або щонайменше 95 %. Відповідно до інших аспектів даного варіанта реалізації, імунологічний тест має точність щонайменше 96 %, щонайменше 97 %, щонайменше 98 % або щонайменше 99 %. [084] Імунологічний спосіб, описаний у даній заявці, повинен характеризуватися статистично значимим співвідношенням сигналу до шуму для нижньої асимптоти й статистично значимим співвідношенням сигналу до шуму для верхньої асимптоти. Відповідно до аспектів даного варіанта реалізації, імунологічний спосіб, описаний у даній заявці, характеризується співвідношенням сигналу до шуму для нижньої асимптоти, що становить, наприклад, щонайменше 3:1, щонайменше 4:1, щонайменше 5:1, щонайменше 6:1, щонайменше 7:1, щонайменше 8:1, щонайменше 9:1, щонайменше 10:1, щонайменше 15:1 або щонайменше 20:1. Відповідно до інших аспектів даного варіанта реалізації, імунологічний спосіб характеризується співвідношенням сигналу до шуму для верхньої асимптоти, що становить, наприклад, 22 UA 104456 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 щонайменше 10:1, щонайменше 15:1, щонайменше 20:1, щонайменше 25:1, щонайменше 30:1, щонайменше 35:1, щонайменше 40:1, щонайменше 45:1, щонайменше 50:1, щонайменше 60:1, щонайменше 70:1, щонайменше 80:1, щонайменше 90:1 або щонайменше 100:1, щонайменше 150:1, щонайменше 200:1, щонайменше 250:1, щонайменше 300:1, щонайменше 350:1, щонайменше 400:1, щонайменше 450:1, щонайменше 500:1, щонайменше 550:1 або щонайменше 600:1. [085] Специфічність способу визначає здатність способу вимірювати аналізовану речовину, яка являє собою інтерес, за винятком інших супутніх компонентів, таких як, наприклад, частково активна або неактивна аналізована речовина. Селективність способу описує здатність аналітичного методу розрізняти різні речовини в зразку. Лінійність способу відповідає його здатності давати результати, які прямо, або за допомогою однозначно визначеного математичного перетворення, пропорційні концентрації аналізованої речовини в зразку. Таким чином, відповідно до одного варіанта реалізації, імунологічний спосіб, описаний у даній заявці, здатний відрізняти повністю активну ендопептидазу зі зміненою націленістю від частково активної ендопептидази зі зміненою націленістю, що має, наприклад, 70 % або менше, 60 % або менше, 50 % або менше, 40 % або менше, 30 % або менше, 20 % або менше або 10 % або менше активності повністю активної ендопептидази зі зміненою націленістю. [086] Надійність способу являє собою відтворюваність результатів тесту, одержаних для ідентичних зразків при нормальних (але змінюваних) умовах тесту. Стійкість процедури є мірою її здатності залишатися несприйнятливою стосовно невеликих, але навмисних змін параметрів способу і являє собою показник його надійності при нормальному використанні. Таким чином, у той час як надійність оцінює неминучі зміни, стійкість оцінює навмисні зміни. Типові параметри, оцінювані за допомогою показників надійності й стійкості, включають ефекти заморожування/відтавання, часу інкубації, температури інкубації, довговічності реагенту, приготування зразка, зберігання зразка, числа клітинних пасажів, партії ендопептидази зі зміненою націленістю, мінливості між очищеннями й мінливості між реакціями розщеплення. Параметри стійкості для клітинних тестів включають банк клітин (початок, середина й кінець заморожування), рівень клітинного пасажу, щільність висіву клітин, щільність маткового розчину клітин (кількість днів у культурі), вік клітин у флаконі (час очікування до висіву), час інкубації, розходження між планшетами, надмірні кількості сироватки й джерело реагентів. Придатність системи даного способу визначає експлуатаційні якості тесту в часі, включаючи експлуатаційні якості реагентів й інструментів, шляхом аналізу еталонного стандарту або еталонної молекули. Придатність системи в керівництві FDA виділена в тому відношенні, що устаткування, електроніка, експлуатаційні якості тесту й зразки для аналізу становлять єдину систему. Придатність системи можна оцінити шляхом аналізу на паралелізм, який полягає в тому, що при побудові графіка залежності відповіді від логарифма дози кривих графіків серійних розведень еталона й серійних розведень зразків повинні бути паралельними. [087] Частина аспектів даного опису відноситься до клітини зі стабільної клітинної лінії. У даній заявці термін "клітина" відноситься до будь-якої еукаріотичної клітини, чутливої до активності ендопептидаз зі зміненою націленістю, або будь-якої еукаріотичної клітини, яка здатна поглинати ендопептидази зі зміненою націленістю. Термін "клітина" охоплює клітини з великої кількості організмів, такі як, наприклад, клітини мишей, пацюків, свиней, великої рогатої худоби, коней, приматів і людину; з великої кількості типів клітин, таких як, наприклад, нервові й такі, що не відносяться до нервових; і клітини, які можуть бути ізольовані з гетерогенної популяції клітин, тканини або організму (цілого або їх частини). У даній заявці термін "стабільна клітинна лінія" є синонімом термінів "іморталізована клітинна лінія" або "трансформована клітинна лінія" і відноситься до культури клітин, відібраних для необмеженого розділення з популяції клітин, одержаної з організму, тканини або органа-джерела. Згідно визначенню, стабільна клітинна лінія не включає клітинну культуру первинних клітин. У даній заявці термін "первинні клітини" включає клітини, зібрані безпосередньо зі свіжих тканин або органів і такі, що не мають потенціалу необмеженого розділення. Стабільна клітинна лінія може включати гетерогенну популяцію клітин або однорідну популяцію клітин. Стабільна клітинна лінія, одержана з єдиної клітини, називається клональною клітинною лінією. Стабільна клітинна лінія може являти собою лінію клітин, які ендогенно експресують всі компоненти, необхідні для функціонування всього клітинного механізму, за допомогою якого ендопептидаза зі зміненою націленістю протеолітично розщеплює субстрат SNAP-25 і який включає зв'язування ендопептидази зі зміненою націленістю з відповідним рецептором, інтерналізацію комплексу ендопептидаза/рецептор, транслокацію легкого ланцюга ендопептидази зі зміненою націленістю із внутрішньоклітинного пухирця в цитоплазму й протеолітичне розщеплення SNAP-25. Як альтернатива, стабільна клітинна лінія може являти собою лінію клітин, у які із зовнішнього 23 UA 104456 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 джерела був введений щонайменше один із компонентів, необхідний для повного функціонування клітинного механізму, за допомогою якого ендопептидаза зі зміненою націленістю протеолітично розщеплює субстрат SNAP-25 і який включає зв'язування ендопептидази зі зміненою націленістю з відповідним рецептором, інтерналізацію комплексу ендопептидаза/рецептор, транслокацію легкого ланцюга ендопептидази зі зміненою націленістю із внутрішньоклітинного пухирця в цитоплазму й протеолітичне розщеплення SNAP-25. Клітини такої стабільної клітинної лінії, також названої генетично модифікованою клітинною лінією, можуть, наприклад, експресувати екзогенну ендопептидазу зі зміненою націленістю, таку як, наприклад, екзогенний ORL1, екзогенний DOR, екзогенний KOR, екзогенний MOR, екзогенний рецептор Галаніну 1, екзогенний рецептор Галаніну 2, екзогенний рецептор Галаніну 3 або будь-яку їх комбінацію. [088] Частина аспектів даної заявки включає клітину зі стабільної клональної клітинної лінії, чутливу до активності ендопептидаз зі зміненою націленістю. У даній заявці термін "клітина(и), чутливі до активності ендопептидаз зі зміненою націленістю", "клітина(и), чутливі до активності ендопептидаз зі зміненою націленістю за допомогою ендопептидаз зі зміненою націленістю" або "клітина(и) зі стабільної клональної клітинної лінії, чутливі до активності ендопептидаз зі зміненою націленістю за допомогою ендопептидаз зі зміненою націленістю" відносяться до клітин(и), у яких може повністю функціонувати клітинний механізм, за допомогою якого ендопептидаза зі зміненою націленістю протеолітично розщеплює субстрат SNAP-25, що призводить до інгібування екзоцитозу, і який включає зв'язування ендопептидази зі зміненою націленістю з відповідним рецептором, інтерналізацію комплексу ендопептидаза/рецептор, транслокацію ланцюга ендопептидази зі зміненою націленістю, що забезпечує її активність, із внутрішньоклітинного пухирця в цитоплазму й протеолітичне розщеплення SNAP-25. Згідно визначенню, клітина(и), чутлива(і) до активності ендопептидаз зі зміненою націленістю, повинна(і) експресувати, або бути сконструйована(ими) із забезпеченням експресії, щонайменше один рецептор ендопептидази зі зміненою націленістю й щонайменше один субстрат SNAP-25. У даній заявці терміни "клітина(и), здатна поглинати ендопептидази зі зміненою націленістю" або "клітина(и), що включає стабільну клональну клітинну лінію, яка може поглинати ендопептидази зі зміненою націленістю" відносяться до клітин, у яких може повністю функціонувати клітинний механізм, за допомогою якого ендопептидаза зі зміненою націленістю протеолітично розщеплює субстрат SNAP-25, тим самим інгібуючи екзоцитоз, і який включає зв'язування ендопептидази зі зміненою націленістю з відповідним рецептором, інтерналізацію комплексу ендопептидаза/рецептор, транслокацію легкого ланцюга ендопептидази зі зміненою націленістю із внутрішньоклітинного пухирця в цитоплазму й протеолітичне розщеплення SNAP-25. Згідно визначенню, клітина(и), здатна поглинати ендопептидази зі зміненою націленістю, повинна експресувати, або бути сконструйована із забезпеченням експресії, щонайменше один рецептор ендопептидази зі зміненою націленістю й щонайменше один субстрат SNAP-25. [089] Таким чином, відповідно до одного варіанта реалізації, клітини зі стабільної клональної клітинної лінії чутливі до активності ендопептидаз зі зміненою націленістю. Відповідно до деяких аспектів цього варіанта реалізації, клітини зі стабільної клональної клітинної лінії чутливі до активності ендопептидаз зі зміненою націленістю при концентрації ендопептидази зі зміненою націленістю, наприклад, близько 100 нМ або нижче, близько 90 нМ або нижче, близько 80 нМ або нижче, близько 70 нМ або нижче, близько 60 нМ або нижче, близько 50 нМ або нижче, близько 40 нМ або нижче, близько 30 нМ або нижче, близько 20 нМ або нижче або близько 10 нМ або нижче. Відповідно до інших аспектів, клітини зі стабільної клональної клітинної лінії чутливі до активності ендопептидаз зі зміненою націленістю при концентрації ендопептидази зі зміненою націленістю, наприклад, близько 9 нМ або нижче, близько 8 нМ або нижче, близько 7 нМ або нижче, близько 6 нМ або нижче, близько 5 нМ або нижче, близько 4 нМ або нижче, близько 3 нМ або нижче, близько 2 нМ або нижче або близько 1 нМ або нижче. Згідно інших аспектів, клітини зі стабільної клональної клітинної лінії чутливі до активності ендопептидаз зі зміненою націленістю при концентрації ендопептидази зі зміненою націленістю, наприклад, близько 0,9 нМ або нижче, близько 0,8 нМ або нижче, близько 0,7 нМ або нижче, близько 0,6 нМ або нижче, близько 0,5 нМ або нижче, близько 0,4 нМ або нижче, близько 0,3 нМ або нижче, близько 0,2 нМ або близько 0,1 нМ або нижче. У даній заявці термін "близько" або "приблизно" при кількісній характеристиці згадуваного об'єкта, числа, відсотка або терміна відноситься до діапазону плюс або мінус десять відсотків зазначеного значення кількісної характеристики цього об'єкта, відсотка, параметра або терміна. [090] Відповідно до іншого варіанта реалізації, клітини, що включають стабільну клональну клітинну лінію, здатні поглинати ендопептидази зі зміненою націленістю. Відповідно до аспектів 24 UA 104456 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 цього варіанта реалізації, клітини, що включають стабільну клональну клітинну лінію, здатні поглинати, наприклад, близько 100 нМ або менше, близько 90 нМ або менше, близько 80 нМ або менше, близько 70 нМ або менше, близько 60 нМ або менше, близько 50 нМ або менше, близько 40 нМ або менше, близько 30 нМ або менше, близько 20 нМ або менше, близько 10 нМ або менше ендопептидази з зміненою націленістю. Відповідно до інших аспектів, клітини, що включають стабільну клональну клітинну лінію, мають здатність поглинати близько 9 нМ або менше, близько 8 нМ або менше, близько 7 нМ або менше, близько 6 нМ або менше, близько 5 нМ або менше, близько 4 нМ або менше, близько 3 нМ або менше, близько 2 нМ або менше або близько 1 нМ або менше ендопептидази зі зміненою націленістю. Відповідно до інших аспектів, клітини, що включають стабільну клональну клітинну лінію, мають здатність поглинати близько 0,9 нМ або менше, близько 0,8 нМ або менше, близько 0,7 нМ або менше, близько 0,6 нМ або менше, близько 0,5 нМ або менше, близько 0,4 нМ або менше, близько 0,3 нМ або менше, близько 0,2 нМ або менше або близько 0,1 нМ або менше ендопептидази зі зміненою націленістю. [091] Частина аспектів даного опису відноситься до клітин зі стабільної клітинної лінії, що демонструє вибіркове зв'язування ендопептидаз зі зміненою націленістю, описаних у даній заявці. У даній заявці термін "вибірково зв'язується" або "вибіркове зв'язування" стосовно ендопептидаз зі зміненою націленістю відноситься до виняткового зв'язування ендопептидази зі зміненою націленістю із зазначеним рецептором-мішенню, такого, що ендопептидаза зі зміненою націленістю істотно не зв'язується з рецепторами, які не є мішенями. Ступінь, з якого клітини зі стабільної клітинної лінії демонструють вибіркове зв'язування ендопептидаз зі зміненою націленістю, можна виміряти за допомогою ступеня, з якого ці клітини демонструють невибіркове поглинання молекул, у яких відсутній націлюючий домен ендопептидаз зі зміненою націленістю. Одним зі способів оцінки невибіркового поглинання молекул, у яких відсутній націлюючий домен ендопептидаз зі зміненою націленістю, є вимірювання невибіркового поглинання фрагмента LHN. Фрагмент LHN містить транслокаційний домен токсину клостридій і ферментативний домен токсину клостридій, але не містить якого-небудь націлюючого домена. Необмежуючі приклади фрагментів LHN включають фрагмент LHN/A, фрагмент LHN/B, фрагмент LHN/C, фрагмент LHN/D, фрагмент LHN/E, фрагмент LHN/F і фрагмент LHN/G. Прикладом фрагмента LHN/A є SEQ ID NO: 146, який кодується молекулою полінуклеотида SEQ ID NO: 147. [092] Таким чином, відповідно до одного варіанта реалізації, клітини зі стабільної клітинної лінії демонструють вибіркове зв'язування ендопептидаз зі зміненою націленістю. Відповідно до аспектів даного варіанта реалізації, клітини зі стабільної клітинної лінії демонструють вибіркове зв'язування ендопептидази зі зміненою націленістю, що відповідає, наприклад, щонайменше 75 % загальної активності, виявленої в тесті, щонайменше 80 % загальної активності, виявленої в тесті, щонайменше 85 % загальної активності, виявленої в тесті, щонайменше 90 % загальної активності, виявленої в тесті, або щонайменше 95 % загальної активності, виявленої в тесті. Відповідно до інших аспектів даного варіанта реалізації, клітини зі стабільної клітинної лінії демонструють вибіркове зв'язування ендопептидази зі зміненою націленістю, що відповідає, наприклад, приблизно від 75 % до 100 % загальної активності, виявленої в тесті, приблизно від 80 % до 100 % загальної активності, виявленої в тесті, приблизно від 85 % до 100 % загальної активності, виявленої в тесті, приблизно від 90 % до 100 % загальної активності, виявленої в тесті. [093] Відповідно до іншого варіанта реалізації, клітини зі стабільної клітинної лінії демонструють мінімальне невибіркове поглинання фрагмента LHN. Відповідно до аспектів даного варіанта реалізації, клітини зі стабільної клітинної лінії демонструють невибіркове поглинання фрагмента LHN, що становить, наприклад, не більше 25 % загального поглинання, виявленого в тесті, не більше 20 % загального поглинання, виявленого в тесті, не більше 15 % загального поглинання, виявленого в тесті, не більше 10 % загального поглинання, виявленого в тесті, або не більше 5 % загального поглинання, виявленого в тесті. Відповідно до інших аспектів даного варіанта реалізації, клітини зі стабільної клітинної лінії демонструють невибіркове поглинання фрагмента LHN, що становить, наприклад, приблизно від 0 % до 25 % загального поглинання, виявленого в тесті, приблизно від 0 % до 20 % загального поглинання, виявленого в тесті, приблизно від 0 % до 15 % загального поглинання, виявленого в тесті, приблизно від 0 % до 10 % загального поглинання, виявленого в тесті, або приблизно від 0 % до 5 % загального поглинання, виявленого в тесті. [094] Згідно ще одного варіанту реалізації, клітини зі стабільної клітинної лінії демонструють мінімальне невибіркове поглинання фрагмента LHN/A. Відповідно до аспектів даного варіанта реалізації, клітини зі стабільної клітинної лінії демонструють невибіркове поглинання фрагмента 25 UA 104456 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 LHN/A, що становить, наприклад, не більше 25 % загального поглинання, виявленого в тесті, не більше 20 % загального поглинання, виявленого в тесті, не більше 15 % загального поглинання, виявленого в тесті, не більше 10 % загального поглинання, виявленого в тесті, або не більше 5 % загального поглинання, виявленого в тесті. Відповідно до інших аспектів даного варіанта реалізації, клітини зі стабільної клітинної лінії демонструють невибіркове поглинання фрагмента LHN/A, що становить, наприклад, приблизно від 0 % до 25 % загального поглинання, виявленого в тесті, приблизно від 0 % до 20 % загального поглинання, виявленого в тесті, приблизно від 0 % до 15 % загального поглинання, виявленого в тесті, приблизно від 0 % до 10 % загального поглинання, виявленого в тесті, або приблизно від 0 % до 5 % загального поглинання, виявленого в тесті. [095] Частина аспектів даного опису відноситься до клітин зі стабільної клітинної лінії, що експонує достатнє число рецепторних ділянок зв'язування на плазматичній мембрані, що забезпечує чутливе й вибіркове зв'язування ендопептидаз зі зміненою націленістю. У тесті зв'язування з рівноважним насиченням вимірюють повне й неспецифічне зв'язування ліганду при різних концентраціях. Рівноважна константа дисоціації (Kd) ліганду й максимальне число рецепторних ділянок зв'язування, Bmax, можна обчислити на основі даних згідно специфічного зв'язуванню з використанням нелінійного регресійного аналізу. Специфічне зв'язування обчислюють шляхом вирахування неспецифічного зв'язування ліганду зі спостережуваного загального зв'язування. Kd являє собою концентрацію ліганду, необхідну для досягнення половини максимального значення зв'язування, і вимірюється в одиницях молярної концентрації. Bmax являє собою максимальне число ділянок зв'язування, що є присутнім на плазматичній мембрані, і вимірюється в одиницях пмоль/мг, пмоль/клітина, фмоль/клітина або сайти/клітина. [096] Таким чином, відповідно до одного варіанта реалізації, клітини зі стабільної клітинної лінії експонують достатнє число рецепторних сайтів зв'язування на плазматичній мембрані, що забезпечує чутливе й вибіркове зв'язування ендопептидаз зі зміненою націленістю. Відповідно до аспектів даного варіанта реалізації, клітини зі стабільної клітинної лінії демонструють значення Bmax, що становить, наприклад, щонайменше 0,1 фмоль/клітину, щонайменше 0,2 фмоль/клітину, щонайменше 0,3фмоль/клітину, щонайменше 0,4 фмоль/клітину, щонайменше 0,5 фмоль/клітину, щонайменше 0,6 фмоль/клітину, по меншій мері 0,7 фмоль/клітину, щонайменше 0,8 фмоль/клітину, щонайменше 0,9 фмоль/клітину або щонайменше 1,0 фмоль/клітину для напрямку ліганду ендопептидази зі зміненою націленістю. Відповідно до інших аспектів даного варіанта реалізації, клітини зі стабільної клітинної лінії демонструють значення Bmax, що становить, наприклад, щонайменше 1 фмоль/клітину, щонайменше 2 фмоль/клітину, щонайменше 3 фмоль/клітину, щонайменше 4 фмоль/клітину, щонайменше 5 фмоль/клітину, щонайменше 6 фмоль/клітину, щонайменше 7 фмоль/клітину, щонайменше 8 фмоль/клітину, щонайменше 9 фмоль/клітину або щонайменше 10 фмоль/клітину для напрямку ліганду ендопептидази зі зміненою націленістю. [097] Частина аспектів даного опису включає клітини зі стабільної клональної клітинної лінії, чутливої до активності ендопептидаз зі зміненою націленістю, які більш стабільні, ніж клітини з батьківської клітинної лінії, з якої була одержана клональна клітинна лінія. У даній заявці термін "стабільний" відноситься до клітин зі стабільної клональної клітинної лінії, які після певної кількості пасажів демонструють відносну EC50, чутливість, ефективність, чітко виражену верхню асимптоту та/або чітко виражену криву доза-ефект активності ендопептидази зі зміненою націленістю, подібні зі значеннями стосовної EC50, чутливості, ефективності, чітко вираженої верхньої асимптоти та/або чітко вираженох кривої доза-ефект, що демонструються клітинами з батьківської клітинної лінії, з якої була одержана клональна клітинна лінія, після рівної або близької кількості пасажів, причому в обох тестах використовуються ідентичні умови й ідентичні ендопептидази зі зміненою націленістю. [098] Таким чином, відповідно до одного варіанта реалізації, клітини зі стабільної клональної клітинної лінії більш стабільні, ніж клітини з батьківської клітинної лінії, з якої була одержана клональна клітинна лінія. Відповідно до одного аспекту цього варіанта реалізації, клітини зі стабільної клональної клітинної лінії більш стабільні, ніж батьківська клітинна лінія SK-N-DZ. Відповідно до інших аспектів цього варіанта реалізації, клітини зі стабільної клональної клітинної лінії більш стабільні ніж батьківська клітинна лінія SK-N-DZ ATCC CRL-2149. Відповідно до інших аспектів цього варіанта реалізації, клітини зі стабільної клональної клітинної лінії більш стабільні протягом, наприклад, щонайменше ще 5 пасажів, щонайменше ще 10 пасажів, щонайменше ще 15 пасажів, щонайменше ще 20 пасажів, щонайменше ще 25 пасажів або щонайменше ще 30 пасажів у порівнянні із клітинами з батьківської клітинної лінії, з якої була одержана клональна клітинна лінія. 26 UA 104456 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 [099] Частина аспектів даного опису включає клітини зі стабільної клональної клітинної лінії, чутливої до активності ендопептидаз зі зміненою націленістю, які стабільні протягом великої кількості клітинних пасажів. У даній заявці термін "стабільний" відноситься до клітин зі стабільної клональної клітинної лінії, які після певної кількості пасажів демонструють відносну EC50, чутливість, ефективність, чітко виражену верхню асимптоту та/або чітко виражену криву доза-ефект активності ендопептидази зі зміненою націленістю, подібні значенням відносної EC50, чутливості, ефективності, чітко вираженої верхньої асимптоти та/або чітко вираженої кривої доза-ефект, що демонструється клітинами з тієї ж самої стабільної клональної клітинної лінії, але з попереднього пасажу або пасажів, причому в обох тестах використовуються ідентичні умови й ідентичні ендопептидази зі зміненою націленістю. [0100] Клітини зі стабільної клітинної лінії, описані в даній заявці, здатні демонструвати стійку чутливість до активності ендопептидаз зі зміненою націленістю протягом великої кількості клітинних пасажів. У даній заявці термін "чутливість до активності ендопептидаз зі зміненою націленістю" відноситься до найнижчої дози, яка може бути стабільно вимірювана в тесті і яка перевищує рівень сигналу, вимірюваного в неопрацьованому контролі, або фонового сигналу. [0101] Таким чином, відповідно до одного варіанта реалізації, клітини зі стабільної клональної клітинної лінії демонструють чутливість до активності ендопептидаз зі зміненою націленістю для будь-яких даних пасажів, що становить, наприклад, 100 нМ або нижче, близько 80 нМ або нижче, близько 70 нМ або нижче, близько 60 нМ або нижче, близько 50 нМ або нижче, близько 40 нМ або нижче, близько 30 нМ або нижче,близько 20 нМ або нижче, близько 10 нМ або нижче, близько 1 нМ або нижче, близько 0,9 нМ або нижче, близько 0,8 нМ або нижче, близько 0,7 нМ або нижче, близько 0,6 нМ або нижче, близько 0,5 нМ або нижче, близько 0,4 нМ або нижче, близько 0,3 нМ або нижче, близько 0,2 нМ або нижче або близько 0,1 нМ або нижче. Відповідно до аспектів даного варіанта реалізації, клітини зі стабільної клональної клітинної лінії демонструють чутливість до активності ендопептидаз зі зміненою націленістю для будь-яких даних пасажів, що становить, наприклад, приблизно від 0,01 нМ до 100 нМ, приблизно від 0,01 нМ до 75 нМ, приблизно від 0,01 нМ до 50 нМ, приблизно від 0,01 нМ до 25 нМ, приблизно від 0,01 нМ до 20 нМ, приблизно від 0,01 нМ до 15 нМ, приблизно від 0,01 нМ до 10 нМ, приблизно від 0,01 нМ до 5 нМ, приблизно від 0,001 нМ до 100 нМ, приблизно від 0,001 нМ до 75 нМ, приблизно від 0,001 нМ до 50 нМ, приблизно від 0,001 нМ до 25 нМ, приблизно від 0,001 нМ до 20 нМ, приблизно від 0,001 нМ до 15 нМ, приблизно від 0,001 нМ до 10 нМ або приблизно від 0,001 нМ до 5 нМ. [0102] Відповідно до іншого варіанта реалізації, клітини зі стабільної клональної клітинної лінії демонструють чутливість до активності ендопептидаз зі зміненою націленістю, що становить близько 100 нМ або нижче, близько 75 нМ або нижче, близько 50 нМ або нижче, близько 25 нМ або нижче, близько 20 нМ або нижче, близько 15 нМ або нижче, близько 10 нМ або нижче або близько 1 нМ або нижче, протягом, наприклад, 5 або більше клітинних пасажів, 10 або більше клітинних пасажів, 15 або більше клітинних пасажів, 20 або більше клітинних пасажів, 25 або більше клітинних пасажів, 30 або більше клітинних пасажів, 35 або більше клітинних пасажів, 40 або більше клітинних пасажів, 45 або більше клітинних пасажів або 50 або більше клітинних пасажів. Відповідно до інших аспектів даного варіанта реалізації, клітини зі стабільної клональної клітинної лінії демонструють чутливість до активності ендопептидаз зі зміненою націленістю, що становить близько 100 нМ або нижче, близько 75 нМ або нижче, близько 50 нМ або нижче, близько 25 нМ або нижче, близько 20 нМ або нижче, близько 15 нМ або нижче, близько 10 нМ або нижче або близько 1 нМ або нижче, протягом, наприклад, приблизно від 15 до 60 пасажів, приблизно від 20 до 60 пасажів, приблизно від 25 до 60 пасажів, приблизно від 30 до 60 пасажів, приблизно від 35 до 60 пасажів, приблизно від 40 до 60 пасажів, приблизно від 45 до 60 пасажів, приблизно від 50 до 60 пасажів, приблизно від 15 до 50 пасажів, приблизно від 20 до 50 пасажів, приблизно від 25 до 50 пасажів, приблизно від 30 до 50 пасажів, приблизно від 35 до 50 пасажів, приблизно від 40 до 50 пасажів, приблизно від 15 до 40 пасажів, приблизно від 20 до 40 пасажів, приблизно від 25 до 40 пасажів або приблизно від 30 до 40 пасажів. [0103] Клітини зі стабільної клітинної лінії, описані в даній заявці, здатні демонструвати стійку відносну ефективність поглинання ендопептидаз зі зміненою націленістю або активність ендопептидаз зі зміненою націленістю протягом великої кількості клітинних пасажів. У даній заявці термін "відносна ефективність" відноситься до ступеня збігу верхньої асимптоти активності ендопептидаз зі зміненою націленістю, детектованою у поточному тесті, з верхньою асимптотою активності ендопептидаз зі зміненою націленістю в еталонному стандарті, еталонній молекулі або еталонному числі пасажів, використовуваному в даному тесті. У даній заявці термін "співвідношення сигналу до шуму для верхньої асимптоти" відноситься до 27 UA 104456 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 сигналу, детектованому в тесті на верхній межі детектування, поділеному на сигнал, детектований у неопрацьованому контролі, або фоновий сигнал. Верхня межа детектування являє собою найвищу дозу, яка може бути стійко вимірювана в тесті до настання насичення сигналу. [0104] Таким чином, відповідно до одного варіанта реалізації, клітини зі стабільної клітинної лінії, описані в даній заявці, здатні демонструвати чітко виражену верхню асимптоту протягом великої кількості клітинних пасажів і підтримувати співвідношення сигналу до шуму, яке стійке й адекватне для тесту. Відповідно до аспектів даного варіанта реалізації, клітини зі стабільної клітинної лінії, описані в даній заявці, повинні мати чітко виражене співвідношення сигналу до шуму для верхньої асимптоти активності ендопептидаз зі зміненою націленістю, що становить, наприклад, щонайменше 3:1, щонайменше 4:1, щонайменше 5:1, щонайменше 6:1, щонайменше 7:1, щонайменше 8:1, щонайменше 9:1, щонайменше 10:1, щонайменше 15:1, щонайменше 20:1, щонайменше 25:1, щонайменше 30:1, щонайменше 35:1, щонайменше 40:1, щонайменше 45:1, щонайменше 50:1, щонайменше 60:1, щонайменше 70:1, щонайменше 80:1, щонайменше 90:1 або щонайменше 100:1, щонайменше 150:1, щонайменше 200:1, щонайменше 250:1, щонайменше 300:1, щонайменше 350:1, щонайменше 400:1, щонайменше 450:1, щонайменше 500:1, щонайменше 550:1 або щонайменше 600:1, протягом, наприклад, 5 або більше клітинних пасажів, 10 або більше клітинних пасажів, 15 або більше клітинних пасажів, 20 або більше клітинних пасажів, 25 або більше клітинних пасажів, 30 або більше клітинних пасажів, 35 або більше клітинних пасажів, 40 або більше клітинних пасажів, 45 або більше клітинних пасажів або 50 або більше клітинних пасажів. Відповідно до інших аспектів даного варіанта реалізації, клітини зі стабільної клітинної лінії, описані в даній заявці, повинні мати чітко виражене співвідношення сигналу до шуму для верхньої асимптоти активності ендопептидаз зі зміненою націленістю, що становить, наприклад, щонайменше 3:1, щонайменше 4:1, щонайменше 5:1, щонайменше 6:1, щонайменше 7:1, щонайменше 8:1, щонайменше 9:1, щонайменше 10:1, щонайменше 15:1, щонайменше 20:1, щонайменше 25:1, щонайменше 30:1, щонайменше 35:1, щонайменше 40:1, щонайменше 45:1, щонайменше 50:1, щонайменше 60:1, щонайменше 70:1, щонайменше 80:1, щонайменше 90:1 або щонайменше 100:1, щонайменше 150:1, щонайменше 200:1, щонайменше 250:1, щонайменше 300:1, щонайменше 350:1, щонайменше 400:1, щонайменше 450:1, щонайменше 500:1, щонайменше 550:1 або щонайменше 600:1, протягом, наприклад, приблизно від 15 до 60 пасажів, приблизно від 20 до 60 пасажів, приблизно від 25 до 60 пасажів, приблизно від 30 до 60 пасажів, приблизно від 35 до 60 пасажів, приблизно від 40 до 60 пасажів, приблизно від 45 до 60 пасажів, приблизно від 50 до 60 пасажів, приблизно від 15 до 50 пасажів, приблизно від 20 до 50 пасажів, приблизно від 25 до 50 пасажів, приблизно від 30 до 50 пасажів, приблизно від 35 до 50 пасажів, приблизно від 40 до 50 пасажів, приблизно від 15 до 40 пасажів, приблизно від 20 до 40 пасажів, приблизно від 25 до 40 пасажів або приблизно від 30 до 40 пасажів. [0105] Клітини зі стабільної клітинної лінії, описані в даній заявці, здатні демонструвати чітко виражену криву доза-ефект для активності ендопептидаз зі зміненою націленістю протягом великої кількості клітинних пасажів. У даній заявці термін "крива доза-ефект" відноситься до ступеня відповідності вихідних даних обраної статистичної моделі для даного тесту. Як необмежуючий приклад можна навести сигмоїдальну криву з логістичним підбором на основі чотирьох параметрів, яка являє собою криву доза-ефект для експериментів згідно аналізу ферментативної активності, таких як, наприклад, тест на активність. Як інший необмежуючий приклад можна навести криву насичення для зв'язування ліганду з одним сайтом, що являє собою криву доза-ефект для експериментів згідно зв'язуванню ліганду/антитіла. [0106] Таким чином, відповідно до одного варіанта реалізації, клітини зі стабільної клітинної лінії, описані в даній заявці, демонструють чітко виражену криву доза-ефект для активності ендопептидаз зі зміненою націленістю протягом великої кількості клітинних пасажів. Відповідно до аспектів даного варіанта реалізації, клітини зі стабільної клітинної лінії, описані в даній заявці, демонструють чітко виражену криву доза-ефект для активності ендопептидаз зі зміненою націленістю протягом, наприклад, 5 або більше клітинних пасажів, 10 або більше клітинних пасажів, 15 або більше клітинних пасажів, 20 або більше клітинних пасажів, 25 або більше клітинних пасажів, 30 або більше клітинних пасажів, 35 або більше клітинних пасажів, 40 або більше клітинних пасажів, 45 або більше клітинних пасажів або 50 або більше клітинних пасажів. Відповідно до інших аспектів даного варіанта реалізації, клітини зі стабільної клітинної лінії, описані в даній заявці, демонструють чітко виражену криву доза-ефект для активності ендопептидаз зі зміненою націленістю протягом, наприклад, приблизно від 15 до 60 пасажів, приблизно від 20 до 60 пасажів, приблизно від 25 до 60 пасажів, приблизно від 30 до 60 пасажів, приблизно від 35 до 60 пасажів, приблизно від 40 до 60 пасажів, приблизно від 45 до 60 пасажів, 28