Спосіб диференційної діагностики підтипів інсуліннезалежного цукрового діабету

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической эндокринологии для дифференциальной диагностики подтипов инсулин независимого сахарного диабета. Наиболее близким к предлагаемому способу (прототипом) является предложенный Kuroda Tsugunisa метод диагностики подтипов инсулиннезависимого сахарного диабета [1], заключающийся в том, что в плазме крови больных общепринятыми методами определяют содержание триглицеридов и кетоновых тел. При повышении содержания триглицеридов и кетоновых тел авторы выделяют первый тип инсулиннезависимого сахарного диабета, а при нормальном содержании триглицеридов и значительном повышении уровня кетоновых тел - дифференцируют второй тип инсулиннезависимого сахарного диабета. Оба типа диабета независимы от индекса массы тела. Однако используемый критерий для выделения двух подтипов инсулин независимого сахарного диабета не отражает различий первичных механизмов нарушения обменных процессов в патогенезе заболевания и не дает возможности проводить дифференциальную диагностику на его ранних стадиях, В основу изобретения поставлена задача создать способ дифференциальной диагностики подтипов инсулиннезависимого сахарного диабета, который позволил бы на основании полученных данных диагностировать подтипы инсулиннезависимого сахарного диабета, в том числе на ранних стадиях заболевания, а также являлся бы новым объективным показателем, отражающим степень тяжести заболевания в каждом случае и эффективность проводимой терапии. Поставленная задача решается тем, что в освобожденной от эндогенного инсулина плазме крови больных методом твердофазного иммуноферментного анализа определяют специфическую активность контррецепторного фактора, для чего твердую фазу сенсибилизируют рецептором инсулина, а связавшийся с ним фактор выявляют антителами к IgG человека или животных, мечеными пероксидазой хрена, и специфическую активность контринсулинового фактора путем сенсибилизации твердой фазы инсулином человека и выявления связавшегося фактора лектином зародышей пшеницы, меченым пероксидазой хрена, после чего определяют соотношение этих двух показателей и при значении коэффициента больше единицы диагностируют инсулиннезависимый сахарный диабет с повышенным содержанием контррецепторного фактора, а при значении меньше единицы - инсулиннезависимый диабет с повышенным содержанием контринсулинового фактора. Способ осуществляемся следующим образом. Кровь для исследования получают из вены или из пальца больного в объеме не менее 0,5 мл, смешивают в раствором гепарина в соотношении 20:1, центрифугируют при 3000 об/мин в течении 10-18 мин и отдаляют плазму крови, к которой затем добавляют равный объем 1 %-ной суспензии угля Norlt А в 0,1%-ном водном растворе декстрана, инкубируют при покачивании в течение 15 мин и осадок угля отделяют центрифугированием (3000 об/мин, 15 мин). Надосадочную жидкость сохраняют при -20°С в течение 1-2 мес и используют для определения активности факторов, блокирующих рецепцию инсулина: контррецепторного фактора (КРФ) и контринсулинового фактора (КИФ). Для проведения иммуноферментного анализа используют 96-луночные планшеты с плоским дном для иммунологических исследований, которые сенсибилизируют рецепторами инсулина (планшет №1) или инсулином человека (планшет №2). Сорбцию рецепторов инсулина или человеческого инсулина осуществляют внесением в каждую лунку соответствующего планшета 5 мкг сенсибилизирующего белка в 100 мкл 0,02 М натрий-карбонатного буфера, рН 9,5, оставляют планшеты на 18 ч при 4°С, промывают 10 раз водой и 1 раз 0,1 М фосфатным буферным раствором (PBS) рН 7,4, содержащим 0,15 М NaCI и 0,05% тритона Х-100. Для определения активности КРФ и КИФ в лунки планшетов №1 и №2, сенсибилизированных соответственно рецептором инсулина или инсулином, вносят подготовленные как описано выше исследуемые образцы плазмы в объеме 5 мкл и добавляют в каждую лунку по 100 мкл PBS. Одновременно в каждом планшете проводят реакцию со стандартной плазмой крови, которая представляет собой смесь равных количеств - плазмы 20-ти здоровых доноров, очищенной от инсулина и хранящейся в аликвотах в замороженном виде. Для этого в лунки "стандарт" каждого планшета вносят по 2,5-5,0-7,5-10,0-12,5 мкл стандартной плазмы и по 100 мкл PBS. Все определения проводят в тре х параллелях. В 3 лунки "контроль" вносят по 100 мкл PBS. Инкубацию проводят при 37°С в течение 2 ч, после чего планшеты промывают и вносят в лунки растворы конъюгатов: в планшет №1 - по 0,2-0,5 мкг антител против IgG кролика, крысы или мыши,меченых пероксидазой хрена, а в планшет №2 - по 5 мкг лектина зародышей пшеницы, меченого пероксидазой хрена. После инкубации при 37°С в течение 2 ч и промывания планшетов проводят субстратн ую реакцию. Для колориметрической оценки цветной реакции применяют фотометры для иммунологических исследований при длина волны 492 нм. Фиксируют оптические плотности Д1-3 трех параллельных определений и вычисляют средние значения для каждой пробы (Дп.ср), контрольных (Дк.ср) и стандартных (Дст.ср) лунок, затем вычитают из величии Дп.ср и Дст.ср среднее значение "контрольной" пробы Дк.ср с целью учета уровня неспецифического связывания конъюгатов. После этого строят два калибровочных графика: 1) зависимость оптической плотности пяти стандартных проб в планшете №1 (КРФ) от объема внесенной стандартной плазмы, 2) зависимость оптической плотности пяти стандартных проб в планшете №2 (КИФ) от количества плазмы в пробе. Пользуясь графиком №1, по величине средней оптической плотности Дп.ср исследуемой плазмы, полученной в планшете №1, находят активность контррецепторного фактора (Акрф ), а график №2 и результат определения средней оптической плотности той же пробы в планшете №2 используют для нахождения активности контринсулинового фактора (Акиф ), выражая результаты в единицах объема плазмы. Согласно нашим данным, у больных диабетом II типа активность обоих факторов, блокирующих рецепцию инсулина, выше, чем у здоровых людей (табл.1), однако необходимо отметить важное различие: если у здоровых субъектов соотношение k - Акрф /Акиф близко к единице (1,0 ±0,03, n - 10), то среди больных диабетом выделяются две группы: 1-ая - с преобладанием в плазме крови КРФ (k - 1,15 ± 0,03, n - 17), и 2-ая с преобладанием КИФ (k - 0,82 ± 0,02, n - 14). В каждой группе имеется корреляция между активностью того фактора, который преобладает в плазме, и уровнем глюкозы в крови (r1-0,84 и r2-0.88, соответственно в 1-ой и 2-ой группе), а также инсулин - связывающей активностью рецепторов инсулина эритроцитов и уровнем гликемии (r1-0,77 и r2-0,78). Имеются также характерные особенности формы гликемической кривой у больных двух разных групп, в частности уровень гликемии натощак в 1-ой группе (9,3 ±0,7 ммоль/л) выше, чем во 2-ой (6,0 ± 0,4 ммоль/л, Р1. что позволяет диагностировать у данной больной 1-ый подтип инсулиннезависимого сахарного диабета с преобладанием в плазме крови контррецепторного фактора. Пример 2. Больной Б, 69 лет. Болеет инсулиннезависимым диабетом 5 лет, получал сахароснижающие средства (манинил). В момент исследования отмечено состояние декомпенсации. Содержание глюкозы в крови натощак 6,0 ммоль/л, гликемический профиль в течение дня 6,0-5,0-3,0-9,8 ммоль/л. Глюкозурия не обнаружена. В планшете №1 оптические плотности пробы: Д1-0,451, Д2-0.462, Д3-0,454, Дп.ср-0,456, Дк.ср-0,110, Дп-Д п.срДк.ср-0,346. По калибровочному графику №1 нашли, что Акрф - 10,7 мкл, В планшете №2: Д1-0,567, Д2-0,555, Д30,562, Дп.ср-0,561, Дк.ср-0,162, откуда Дп.Дп.ср-Дк.ср-0,399, По калибровочному графику №2 найдено Акиф - 11,4, Коэффициент k - Акрф /Акиф - 10,7 мкл/15,4 мкл - 0,69