Засіб для лікування цукрового діабету

СОЮЗ СОВЕТСКИХ СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ РЄСПУБЛИН І258415АІ C5D4 А 61 К 37/26 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИИ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3381600/28-14 (22) 10.02.82 (46) 23.09.86. Бюл. » 35 (71) Киевский научно-исследовательский институт эндокринологии и обмена веществ (72) В. П. Комиссаренко, И. В. Когмиссаренко, А. С. Ефимов, И, С. Турчин и А. Г. Лысенко (53) 616.379.008.64(088.8) (56) Проблемы эндокринологии, 1981, * 1, с. 25-30. (54)(57) СРЕДСТВО Д Я ЛЕЧЕНИЯ САХАРН НОГО ДИАБЕТА, содержащее кулотуру островковых клеток поджелудочной же лезы и физиологический раствор, о тл и ч а ю щ е е с я тем, что, с целью сокращения сроков лечения % оно содержит 8-12-дневную культуру о с т ровковых клеток поджелудочной железы новорожденных поросят н дополнительно сыворотку реципиента при с л е дующем соотношении компонентов, мас.%: 8-12-дневная культура островковых клеток поджелудочной железы новорожденных поросят 1,34-1,62 Сыворотка реципиента 1,45-2,87 Физиологический раствор Остальное 'л 30 Ёп 'П.». t 12584 15 Изобретение относит ся к медицине и к а с а е т с я с р е д с т в а для лечения с а харного д и а б е т а . Цель и з о б р е т е н и я - сокращение сроков л е ч е н и я з а с ч е т подбора н е о б ходимого к о л и ч е с т в а г о р м о н а л ь н о - а к тивных остроковых клеток h специфической их о б р а б о т к и . Средство содержит 8-12-дневную культуру островковых клеток поджелудочной железы новорожденных поросят и дополнительно сыворотку реципиента при следующем соотношении компон е н т о в , мас.%: 8-1 2-дневная купьтура островных клеток поджелудочной железы новорожденных п о р о с я т 1,34-1,62 Сыворотка реципиента 1,45-2,87 Физиологический р а с т вор Остальное Средство получают следующим о б разом. Выделенные в а с е п т и ч е с к и х у с л о виях поджелудочные железы новорожденных поросят помещают в с т е р и л ь ную колбу с охлажденным до 4 С р а створом Хенкса и антибиотиками (1000 ед/мл пенициллина и 1000мкг/мл с т р е п т о м и ц и н а ) , В боксе железы п е р е н о с я т в стерильную чашку Петри и измельчают глазными ножницами на кусочки размером 0 , 5 - 1 мм. Перекладывают измельченную ткань в с т е р и л ь ную колбу и промывают раствором Хенкса до отхождення промывных в о д . После промывания р а с т в о р Хенкса с л и вают, а колбу в н о с я т 3-5 мл рабочего раствора коллагеназы (0,1% в 0,3%ном р а с т в о р е т р и п с и н а ) . Р а с т в о р ф е р мента наливают с таким р а с ч е т о м , чтобы измельченная т к а н ь была покрыта слоем жидкости толщиной в 15-20 мм. В колбу опускаю стерильный м а г н и т , закрывают стерильной резиновой пробкой и с т а в я т колбу на магнитную мешалку для перемешивания. Скорость перемегаивания должна быть такой, чтобы над магнитом о б р а з о в а л а с ь н е большая в о р о н к а , а в колбе не происходило о б р а з о в а н и е пены. Д е з а г р е г а цию ткани проводят при температуре 25-27°С. Первую порцию к л е т о к , о т делившихся от кусочков ткани ч е р е з 15-20 мин не используют. В д а л ь н е й шем ч е р е з каждые 10 мин производят слив жидкости со взвешенными в ней клетками во флаконе емкостью 250мл Ї с добавлением 50-70 мл среды 199 с 50% сыворотки для инактивации протеолитических ферментов. К оставшейся ткани вновь добавляют раствор 5 фермента и ставят на магнитную мешалку для ее дальнейшей д е з а г р е г а ции. Такую процедуру повторяют несколько раз в течение 30-40 мин. ]]о мере заполнения флаконов производят 10 центрифугирование в течение 10 мин при 600-700 об/мин. По окончании центрифугирования надосадочнуюжидкость сливают, а осадок ресуспендируют в питательной среде, которая 15 состоит из равных объемов среды 199, 0, 5% гидролизата лактальбумина с добавлением 20% бычьей сыворотки и 100 ед/мл пенициллина. Взвесь клеток засевают во флаконы Карреля. Культивирование проводят при 37 С в течение 8-12 дней (время функциональной активности клеток), после чего начинается их постепенное физиологическое отмирание. 25 За 24 ч до пересадки состав питательной среды меняют. Для лучшего приживления трансплантата к равным объемам среды 199 и 0,5% гидролиза30 та лактальбумина добавляют 1,5-3% сыворотки реципиента. Культуру, предназначенную для пересадки, отделяют от поверхности стекла при помощи 0,2%-ного раствора версена. 35 С этой целью в культуральные Алаконы вносят несколько миллиметров подогретого до 37 С раствора с таким расчетом, чтобы клетки были покрыты слоем жидкости толщиной в 1,540 2 мм. Затем их помещают в термостат при 37°С на 15-20 мин, В течение этого промежутка времени жидкость 3-4 раза осторожно перемешивают. Взвесь клеток отмывают от раствора 45 версена питательной средой методом центрифугирования. Для трансплантации берут 50-70 млн. клеток культуры, добавляют 3-5 мл физиологического раствора и 0,045-0,15 мл ( 1 , 5 so 3%) сыворотки реципиента и вводят больному. Сыворотку реципиента получают за 24 ч до пересадки культуры р-клеток путем забора крови в стерильных условиях (8-10 мл). Затем кровь ставят в холодильник на 2 ч 55 при 4-6 С для отстаивания. После образования сгустка крови последнюю центрифугируют 20 мин при 2000 об/мин. 3 t 258415 4 Полученная сыворотка готова к примеингредиентов (островковых клеток нению. 1,62 мзс.% сиворотки реципиента 2,87 мас.%, остальное - физиологиПри цитологическом анализе кульческий раствор) снижение эффективтур островковых клеток поджелудочной 5 ности применения способа обусловлежелезы новорожденных поросят обнаруно токсическим влиянием значительных жено 4 периода их развития: адаптаконцентраций сыворотки реципиента ционный {2-24 ч ) , интенсивного росна jb -клетки. Больная Б. Производят та (2-7 дней), стабилизации ( 8 - ! 2 трансплантацию культур островковых дней) и физиологического отмирания Ю клеток поджелудочных желез новорож(с 13 д н я ) . Длительность этих периоденных поросят (120 млн.) с содержадов зависит от количества посеянных нием сыворотки 2,87 мас.%. До трансклеток. Наибольшее количество инсуплантации суточная потребность в инлина изучаемая культура выделяет в сулине составляла 46 ед,, колебания период стабилизации (8-12 дней). За '5 уровня гликемии 6,1-16,3 ммоль/л. • первые 7 сут культура выделяет 6 5 В течение 3 мес после проведенной ' 80 мке/мл инсулина, на 8-12 сут. ксенотрансштатации суточная потреб110-280 мке/мл инсулина. Начиная ность в инсулине уменьшилась до 32 ед, с 13 дня количество инсулина прогколебания уровня гликемии в предерессивно уменьшается и на 13-20 день 20 лах 3,6-12,3 ммоль/л. в культуральной среде определяют 30-40 мке/мл инсулина, последний опП р и м е р 3. Более благоприятределяют радиоиммунологическнм метоное влияние на течение сахарного дидом. абета отмечено при трансплантации П р и м е р 1, В случае транссредства с оптимальным содержанием плантации культур с низким содержа- 25 ингредиентов (островковых клеток нием ингредиентов (островковых кле1,48 масі%, сыворотки реципиента ток 1,34 мас.%, сыворотки реципиен2,16 мас,%, остальное - физиологита 1,45 мас.%, остальное - физиолоческий раствор). гический раствор) недостаточная эфБольная К,t 20 лет производят фективность способа связана с малым 30 трансплантацию культур островковых количеством fr-клеток, сниженной клеток поджелудочных желез новорожадаптацией культур клеток в организденных поросят (90 млн.) с содержаме реципиента. нием сыворотки 2,16 мас.%. Перед Больной Я , , 43 года. Производят трансплантацией потребность в инсутрансплантацию островковых клеток лине 210 ед. с колебаниями гликемии 35 поджелудочных желез новорожденных 4,4-16,3 ммоль/л при крайне лабильпоросят {70 млн) с содержанием сывоном течении заболевания.В течение ротки 1,34 мас.%. До трансплантации 6-8 мес после трансплантации потребпотребность в инсулине составляла ность в инсулине не снизилась до 76 ед, 90 ед в сутки при колебаниях глике- 40 течение заболевания приобрело стамии от 6,1 до 11,3 ммоль/л. Спустя бильный характер. 2 недели после трансплантации на Сравнительная оценка эффективносфоне улучшения общего состояния сути предлагаемого и известного споточная доза инсулина уменьшилась до собов лечения сахарного диабета по76 е д . , колебания уровня гликемии 5 средством трансплантации культуры 4 в пределах 4,2-Ь,4 ммоль/л. Относиостровковых клеток поджелудочных тельно удовлетворительное состояние желез плодов человека и культуры наблюдалось в течение 4-6 мес. островковых клеток поджелудочных П р и м е р 2. При трансплантажелез новорожденных поросят приведеции культур с высоким содержанием на в таблице. 50 5 І 2 584 Ч Показатели 6 Способ Известный I Предлагаемый Субъективное улучшение общего состояния больного Через 3 мес, после трансплантации Через 4-6 недель после трансплантации Стабилизация течения диабета Через 5-6 мес. после трансплантации Через 2-3 мес. после трансплантации Появление тенденции к снижению дозы экзогенного инсулина Через 40-50 дней после трансплантации Через 6-10 дней после трансплантации На 40-44% На 50-54% После 8 мес« после трансплантации Через 3-4 мес. после трансплантации Уменьшение суммарной дозы инсулина Регресс полиьейропатий, ангиопатий, нефропатий Сокращение сроков стационарного лечения. Продолжительность стационарного лечения Редактор С. Патрушева Ї-1,5 мес. Составитель М. Позняк Техред И.Верес 2-3 недели Корректор С. Черни Заказ 5052/4 Тираж 660 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета GCCP по делам изобретений и открытий П 3 0 3 5 , Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-полиграфическое предприятие, rv, Ужгород, ул. Проектная, 4