Спосіб відбору стійких до засолення клітинних ліній рослин

УКРАЇНА (із) U A ( іі»44487 (із, А (51,6А01Н1/04,А01Н4/00 МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ ДЕРЖАВНИЙ ДЕПАРТАМЕНТ ІНТЕЛЕКТУАЛЬНОЇ ВЛАСНОСТІ ОПИС видається під відповідальність власника патенту ДО ДЕКЛАРАЦІЙНОГО ПАТЕНТУ НА ВИНАХІД (54, СПОСІБ ВІДБОРУ СТІЙКИХ ДО ЗАСОЛЕННЯ КЛІТИННИХ ЛІНІЙ РОСЛИН (21)2001042627 (22,18 04 2001 (24,15 02 2002 (46,15 02 2002, Бюл № 2, 2002 р (72, Сергеева Лариса Євгенівна (73, ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ РОСЛИН І ГЕНЕТИКИ НАН УКРАЇНИ (57, Спосіб відбору стійких до засолення клітинних ЛІНІЙ рослин, що полягає у пасируванні суспензії Винахід відноситься до клітинної біологи, а саме культури клітин, і може бути використаний для одержання нових форм рослин методами клітинної селекції В основу винаходу поставлено задачу удосконалення методів гарантованого відбору солестійких клітинних ЛІНІЙ рослин, шляхом створення нових модельних систем В результаті цього з'являються умови виділення клітинних ЛІНІЙ рослин, що характеризуються комплексною СТІЙКІСТЮ до дії декількох стресових факторів Напрямок відбору стійких клітинних ЛІНІЙ завжди визначається модельною селективною системою Вона створюється додаванням до будьякого стандартного живильного середовища необхідної, попередньо визначеної КІЛЬКОСТІ селектуючої речовини гербіциду, антибіотику, аналогу амінокислоти, тощо (1 - 4) Відбір солестійких клітинних ЛІНІЙ рослин звичайно відбувається при використанні модельованого засолення (хлорид ного чи сульфатного, комбінованого) (патент № 1687139, 3 0 1 0 9 1 , бюл № 40 МКИ А01Н 4/00, С12 5/04 "Способ получения солеустойчивых клеточных линий люцерны") За цих умов існує можливість паралельного відбору як генетично змінених форм, так і клітин з розширеним діапазоном фізіологічної норми реакції Останні для клітинної селекції не придатні Запропонований метод відрізняється тим, що створюється модельна система з іонами важкого металу барію На селективному середовищі, що містить токсичну концентрацію вказаних ІОНІВ, клітин на агаризоване селективне середовище з подальшим виділенням резистентних клонів, який відрізняється тим, що застосовується модельна система, що створюється додаванням ІОНІВ важкого металу барію у токсичній для клітинної культури концентрації та модифікацією якісного складу живильного середовища, яка зберігає КІЛЬКІСНИЙ вміст фізіологічно необхідних ІОНІВ і виключає осадження ІОНІВ барію відбираються барій - СТІЙКІ КЛІТИННІ ЛІНІЇ рослин Одержані лінії відзначаються комплексною СТІЙКІСТЮ як до оригінального селективного агенту (іони важкого металу), так і до засолення В основі комплексної СТІЙКОСТІ до різних стресових чинників звичайно лежать генетичні причини Приклад реалізації винаходу При розробці способу використовували суспензійні культури клітин сої та тютюну двох сортів вітчизняного Самсун і кубинського Ескомбрай, які вирощували на загальновідомих живильних середовищах В5 Гамборга (соя) та Мурасіге-Скуга (МС) (тютюн) Модельні селективні системи створювали додаванням ІОНІВ барію (нітрат барію у дослідах із соєю та хлорид барію в експериментах із тютюном) та одночасною модифікацією складу середовищ МС і В5 Проведені зміни виключали випадання ІОНІВ барію із розчинної суміші в осад Для забезпечення цього сполуки, що містили аніони осаджувачі (сульфати, фосфати), вилучались і заміщувались на хлориди При змінах враховувався КІЛЬКІСНИЙ ВМІСТ корисних катіонів, який завжди відповідав оригінальному Концентрація ІОНІВ барію визначалась для клітинних культур сої та тютюну окремо Селектуючою вважалась мінімальна КІЛЬКІСТЬ, яка була летальною для клітин дикого типу Для сої вона складала 2,0мМ, для тютюну - З.ОмМ Суспензійні культури клітин рослин пасирували на агаризовані модельні селективні системи Через 35 діб проліферуючі клітини 1 00 44487 переносили на свіже селективне живильне середовище (склад аналогічний до попереднього) Клітини, ЩО зберегали ріст і проліферацію, утворювали КЛІТИННІ лінії Відібрані КЛІТИННІ лінії тютюну та сої в подальшому вирощували на селективних середовищах двох різних типів на модельному середовищі нового типу з іонами барію та на середовищі, яке містило солі морської води традиційна модель сульфатно-хлоридного засолення - в концентрації 20г/л Така концентрація є летальною для клітинних культур сої та тютюну дикого типу (5) СТІЙКІ ДО ДІЇ ІОНІВ барію КЛІТИННІ Барій - стійка клітинна; Лшдя№! Лінія №2 Тютюн Самс>н ішіяЖ? і ,73 ± 0,18 Самсун щнія Ш 0,90 + 0,14 Самсун лінія №І 0 81 + 0 25 ЕскомЄрай тіоя№і 1,2S ± 0 М Секомбрай лінія №4 0,62 + 0 09 ЛІНІЇ відзначались стабільним ростом в умовах модельованого засолення Для оцінки росту клітинних культур застосовували стандартний показник відносного приросту біомаси (Zl/77) Відносний приріст біомаси (Zl/77) , Таблиця де ДРІО - маса клітин (г) на початку пасажу, - маса клітин (г) в кінці пасажу. Цей параметр є загальновизнаним показником життєздатності клітинної культури і завжди застосовується при аналогічних процедурах селекції В таблиці наведено показник відносного приросту біомаси барій-стійких клітинних ЛІНІЙ при культивуванні в умовах 2,0%-ного засолення Примітка в таблиці наведено середнє арифметичне даних трьох пасажів В кожному пасажі клітинна ЛІНІЯ була репрезентована утрьох біологічних повторностях Література 1 Белянская С Л , Шамина З Б Получение и характеристика клонов риса резистентных к стрессовым факторам // Физиология растений 1993 -Т 40 - № 4 -С 681 -685 2 Влахова М , Атанасов А Селекция на клонов люцерна, резистентнт към аналози на аминокиселин и стрептомицин // Генет и селекц 1990 -23 - № 6 -С 517-524, Болгария 3 Долгих Ю И Принципы скринига in vitro с целью получения устойчивых к абиотическим стрессам форм растений // 2-й Росс Симпозиум «Новые методы биотехнологии растений», Пущино, 18-20 мая 1993г, Тез докл , Пущино, 1993 -С 103 4 Новожилов О В , Левенко Б А Получение клеточных линий люцерны, устойчивых к тиазолидинкарбоновой кислоте // Цитол и генет 1990 -24 - № 4 -С 28-31 5 Сергеева Л Е Изучение клеточных линий табака, устойчивых к солевому и водному стрессам, и регенерантов из них Автореф дис канд биол наук - Киев, 1991 - 20 с ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна (044) 456 - 20 - 90