Спосіб отримання тетраплоїдів цукрових буряків у культурі in vitro

Спосіб отримання тетраплоідів цукрових буряків у культурі in vitro, що включає обробку колхіцином точок росту стерильних рослин, який відрізняється тим, що бруньки рослин занурюють у рідке живильне середовище з колхіцином при постійному перемішуванні Спосіб стосується селекції сільськогосподарських культур, зокрема створення тетраплоідних форм з використанням бютехнолопчних методів Необхідною умовою селекції високопродуктивних триплоідних гібридів цукрових буряків є створення тетраплоідних вихідних форм Існує декілька, методів індукції тетраплоідів Ефективність їх визначається виходом тетраплоідних рослин Як поліплоідизуючий фактор найбільш широко застосовується колхіцин Існує декілька способів обробки рослин цукрових буряків колхіцином з метою переведення їх на тетраплоідний рівень, які в основному відрізняються способом введення колхіцину в рослину, його концентрацією, часом дм, а також фазою розвитку рослини в момент обробки Відомий спосіб обробки колхіцином (Неговский Н А , Болелова З А , Литвиненко И И Методика получения полиплоидной свеклы с помощью колхицина и методы определения числа хромосом в клетках сахарной свеклы - К 1975 - С 8), який характеризується тим, що колхіцином обробляють - точки росту молодих рослин з попереднім замочуванням (або без нього) насіння в 0,1 - 0,3 % розчині колхіцину або отримують молоді рослини з незамоченого насіння, - точки росту бруньок головки коренеплоду, -точки росту квітконосних пагонів Використовують для першого нанесення колхіцину наточки росту 1,0% розчин, а потім проводять накапування 0,2% розчину два - три рази в день на протязі 15 діб, або 0,5 - 1,0% розчин один раз в чотири доби Спільними ознаками із способом, що заявляється є обробка колхіцином точок росту, але відомий спосіб не дає можливості отримати стабільні тетраплоіди тому, що утворюються химерні рос лини Крім цього спосіб є трудомістким, має низьку ефективність і є небезпечним для здоров'я працюючого - багаторазове накапування колхіцину високих концентрацій, яке супроводжується значним його випаровуванням Відомий спосіб отримання тетраплоідів цукрових буряків у культурі in vitro з використанням модифікованого агаризованого середовища Гамборга з колхіцином (Yarmolyuk J І , Bekh N S The use of tissue culture method fir obtaining sugar beet tetraploid forms // abstract // International Symposium on Plant Biotechnology - K 1988 - p 20) Відомий І пропонований спосіб мають СПІЛЬНІ ознаки застосування колхіцину для обробки матеріалу, але він не вирішує задачу одержання високого виходу тетраплоідів (має низький вихід - 4%) Найбільш близьким за сукупністю, ознак до запропонованого винаходу є спосіб отримання тетраплоідів шовковиці у культурі in vitro (Chakraborti S P , Vijayan К, Roy В N , Qadn S M H In vitro induction of tetraploidi in mulberry (Morus alba L ) // Planet Cell Repts - 1998 - 17, № 10 - С 799 - 803) де апікальні бруньки, взяті від рослин культивованих in vitro обробляють колхіцином в концентрації 0,05, 0,1 і 0,2% на середовищі Мурасіге і Скуга (ЧС) на протязі 24 годин Частота тетраплоідеі при 0,1% колхіцину складала 39,4 ± 4,8%, а при 0,2%-16,7 ±2,3% Спільними суттєвими ознаками для відомого і запропонованого винаходу є використання колхіцину, як поліплоідазуючого фактору, і бруньок стерильних рослин, вирощених in vitro, але незважаючи на це відомий спосіб не забезпечує отримання тетраплоідів цукрових буряків тому, що концентрація колхіцину та час його дії і живильне середовище не є оптимальними для них (О ю (О ю 45656 В основу винаходу поставлена задача розроність Причому рідке середовище можна викорисбити спосіб отримання тетраплоідів цукрових бутовувати повторно без втрати поліплоідизуючого ряків у культурі in vitro шляхом застосування бюефекту технолопчних методів і живильного середовища з Запропонований спосіб отримання тетраплоіоптимальною консистенцією та концентрацією дів цукрових буряків in vitro виконують таким чиколхіцину при певній експозиції, що дає змогу оденом Вводять в стерильну культуру вихідний матержати високий вихід стабільних тетраплоідів, скоріал Проводять тональне мікророзмноження ротити строк їх створення, а також збільшити екойого, в стерильне рідке живильне середовище на номічність і безпечність способу основі Гамборга і Евелега Bs розлите по ЮОмл в 250мл колби, додають колхіцин в концентрації 0,05 Поставлена задача вирішується тим, що в ві- 0,11% В кожну колбу поміщають 40 - 50 бруньок домому способі отримання тетраплоідів цукрових стерильних рослин Культивування проводять буряків у культурі in vitro, що включає обробку колпротягом 5 - 7 діб з постійним перемішуванням в хіцином точок росту стерильних рослин, згідно з режимі 120 об /хв при температурі 24 - 26°С, освівинаходом бруньки рослин занурюють у рідке житленні 6 - 8 клк і 16 годинному фотоперіоді Обровильне середовище з колхіцином при постійному блені таким чином бруньки пересаджують на жиперемішуванні Як вихідний експлант використовильне агаризоване середовище без колхіцину вують бруньки стерильних рослин, які росли на Після другого пасажу проводять цитологічний анамодифікованому агаровому середовищі Гамборга і ліз КІЛЬКОСТІ хромосом Евелеча ЕЇ5(С2оо), а обробку колхіцином проводять в рідкому живильному середовищі того ж складу з Таблиця добавкою колхіцину в концентрації 0,05 - 0,11% на протязі 5 - 7 діб з постійним перемішуванням ПісЗміна рівня ПЛОІДНОСТІ в залежності від концентля другого пасажу на середовище С200 частка брурації колхіцину ньок, меристематнчні клітини яких мали змінену КІЛЬКІСТЬ хромосом становила 42,0 - 59,0% Вихід стабільних тетраплоідів складає 8 - 26% в залежності від генотипу Таким чином нові ознаки винаходу, якими характеризується спосіб отримання тетраплоідів цукрових буряків у культурі in vitro порівняно з відомим способом для обробки бруньок колхіцином є - рідке живильне середовище, - постійне перемішування оброблюваного рослинного матеріалу, - ВІДМІННИЙ склад живильного середовища, - нову концентрацію колхіцину, час його дії на точки росту Кпональне мікророзмноження дозволяє від однієї стерильної тетраплоідної бруньки на протязі року отримати 5 - 1 0 тис тетраплоідних рослин регенерантів Застосування рідкого середовища для обробки бруньок колхіцином дозволяє в ЮОмл середовища одночасно обробляти 40 - 50 бруньок Обробка матеріалу проходить з постійним перемішуванням, що дає змогу підвищити ефектив Варіант сереПЛОІДНІСТЬ в % довища диплоїди тетраплоіди МІКСОПЛОІДИ контроль (без обробки 100 — — колхіцином) 1 58 8 34 2 41 26 33 3 57 19 24 Як видно з таблиці, оцінка ПЛОІДНОСТІ ПІСЛЯ другого пасажу показала, що найбільший вихід бруньок, меристематичні клітини яких мали змінену КІЛЬКІСТЬ хромосом, спостерігався на 2 варіанті середовищ, він становив 59%, із них тетраплоідів 26% Розхимерювання МІКСОПЛОІДІВ in vitro підвищує вихід тетраплоідів до 50 - 60% Таким чином, запропонований спосіб отримання тетраплоідів цукрових буряків in vitro забезпечує скорочення строків створення тетраплоідів у 6 - 8 разів, підвищує коефіцієнт вегетативною розмноження в 500 разів Є більш ефективним і безпечний в застосуванні ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна (044)456-20- 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71