Спосіб визначення мікрофлори в атеросклеротично уражених судинах

Спосіб визначення мікрофлори в атеросклеротично уражених судинах, що включає виділення ДНК з наступною ампліфікацією та детекцією результатів, який відрізняється тим, що як біологічні зразки використовують тканини уражених судин, виділення ДНК здійснюється лізуючим методом, а мультиплексна полімеразна ланцюгова реакція виконується в режимі реального часу. (19) (21) u201011720 (22) 04.10.2010 (24) 25.05.2011 (46) 25.05.2011, Бюл.№ 10, 2011 р. (72) КАЙДАШЕВ ІГОР ПЕТРОВИЧ, БОБРОВА НЕЛЛЯ ОЛЕКСАНДРІВНА, СКОЧКО ОЛЬГА ВІКТОРІВНА, ІЗМАЙЛОВА ОЛЬГА ВІТАЛІЄВНА, ШЛИКОВА ОКСАНА АНАТОЛІЇВНА (73) ВИЩИЙ ДЕРЖАВНИЙ НАВЧАЛЬНИЙ ЗАКЛАД УКРАЇНИ "УКРАЇНСЬКА МЕДИЧНА СТОМАТОЛОГІЧНА АКАДЕМІЯ" 3 59571 льного паперового штифта з наступним виділенням ДНК методом термо-коагуляційного кондиціонування, із подальшою ампліфікацією ДНК зі специфічною парою праймерів та ідентифікацією пародонтопатогенних ДНК Prevotella intermedia, Bacteroides forsythus, Treponema denticola, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis методом електрофорезу [Роль микробного фактора в развитии пародонтита / Н. П. Ярынич-Бучинская, И. П. Кайдашев, П. Н. Скрипников и др. // Стоматолог. - 2007. - № 10, Т. 113, - № 10. - С. 4-5.]. Недоліком існуючого способу є те, що він визначає обмежену кількість мікроорганізмів мікрофлори в біологічних зразках, відсутність внутрішнього контролю, що може призвести до появи хибно негативних результатів, неможливість визначення кількісного складу окремих видів мікроорганізмів. В основу корисної моделі поставлено завдання розробити спосіб визначення мікрофлори в атеросклеротично уражених судинах, шляхом удосконалення відомого способу, досягти визначення максимальної кількості мікроорганізмів мікрофлори та кількісного складу окремих видів умовно та умовно-патогенних мікроорганізмів в атеросклеротично уражених судинах, оцінити стан мікроцитозу, виявити рівень дисбалансу мікрофлори в атеросклеротично уражених судинах та покращити ефективність лікувально-профілактичних заходів при серцево-судинних патологіях. Поставлена задача вирішується створенням способу визначення мікрофлори в атеросклеротично уражених судин, що включає виділення ДНК з наступною ампліфікацією та детекцією результатів, який, згідно корисної моделі, відрізняється тим, що як біологічні зразки використовують тканини уражених судин, виділення ДНК проводять методом сорбції ДНК на сорбенті та використанням мультиплексної ПЛР із в режимі реального часу. Заявлений спосіб виконується наступним чином: Була відібрана тканина з наявністю на стінці судини атеросклеротичної бляшки у померлої людини. Для цього відрізали шматочок судини розміром 23 мм та додавали 100 мкл лізуючого розчину. Інкубували у твердотілому термостаті при тем Комп’ютерна верстка А. Крижанівський 4 температурі 55 °С до повного розчинення тканини (2-4 години), центрифугували 5 сек. при 8 тис. об/хв. Далі додавали 300 мкл розчину І та 10 мкл суспензії сорбенту. Суміш інкубували 10 хв. при кімнатній температурі з періодичним струшуванням. Центрифугували 15 хв. при 8 тис. об/хв., видаляли супернатант, додавали розчин II, струшували на вортексі, знову центрифугували. Відбирали супернатант та продовжували 2-х кратне промивання осаду з розчином III. Після останнього відбирання супернатанту осад просушували 5 хв. при 50 °С, додавали 50 мкл ТЕ-буфера, струшували на вортексі, інкубували 5 хв. при 50°С, знову центрифугували («ЛИТЕХ», Москва, Росія). Таким чином отримували розчин ДНК, який використовували для подальшої ампліфікації. Ампліфікацію проводили методом мультиплексної ПЛР в режимі реального часу з використанням набору реагентів (ООО «НПО ДНК-Технология», Москва), який призначений для визначення загальної маси мікроорганізмів біологічного зразку, Lactobacillus spp, Enterobacterium spp., Streptococcus spp., Gardnerella vaginalis/Prevotella bivia/Porphyromonas spp., Eubacterium spp., Mycoplasma genitalium+hominins, Candida spp. Для цього в стрип з реакційною сумішшю додавали 10 мкл ретельно перемішаної Tag-полімерази, нашаровували краплю мінерального маслу та 5,0 мкл розчину отриманої ДНК, не пошкоджуючи шар парафіну. Стрип центрифугували на вортексі при 1000 тис об/хв. 5 сек. Ампліфікацію проводили на детектувальному ампліфікаторі ДТ-322 (ООО «НПО ДНКТехнологія», Москва) в режимі реального часу. Підрахунок результатів ПЛР мікроорганізмів судини з атеросклеротичною бляшкою проводили за допомогою програмного забезпечення. Відмічено, що концентрація біомаси біологічного зразку становила 5,3 log. Також знайдено Lactobacillus spp. концентрацією 4,3 log та Eubacterium spp. 5,6 log. Позитивний результат від заявленого способу визначення мікрофлори атеросклеротично уражених судин полягає у виявлені умовно-патогенних та патогенних мікроорганізмів та їх участі у розвитку патологічних станів, що необхідно враховувати при профілактиці та терапії серцево-судинних захворювань. Підписне Тираж 24 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601