Спосіб визначення пародонтопатогенних мікроорганізмів в атеросклеротичних бляшках

Спосіб визначення пародонтопатогенних мікроорганізмів в атеросклеротичних бляшках, що включає виділення ДНК, ампліфікацію методом полімеразної ланцюгової реакції, їх ідентифікацію за допомогою електрофорезу, який відрізняється тим, що як біологічні зразки використовують тканини судин з атеросклеротичною бляшкою, а виділення ДНК з них проводять лізуючим методом. (19) (21) u201011721 (22) 04.10.2010 (24) 25.05.2011 (46) 25.05.2011, Бюл.№ 10, 2011 р. (72) КАЙДАШЕВ ІГОР ПЕТРОВИЧ, БОБРОВА НЕЛЛЯ ОЛЕКСАНДРІВНА, СКОЧКО ОЛЬГА ВІКТОРІВНА, ІЗМАЙЛОВА ОЛЬГА ВАТАЛІЇВНА, ШЛИКОВА ОКСАНА АНАТОЛІЇВНА (73) ВИЩИЙ ДЕРЖАВНИЙ НАВЧАЛЬНИЙ ЗАКЛАД УКРАЇНИ "УКРАЇНСЬКА МЕДИЧНА СТОМАТОЛОГІЧНА АКАДЕМІЯ" 3 59572 intermedia, Bacteroides forsythus, Treponema denticola, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis за допомогою електрофорезу [Роль микробного фактора в развитии пародонтита / Н.П. Ярынич-Бучинская, И.П. Кайдашев, П.Н. Скрипников и др. // Стоматолог. - 2007. №10, Т. 113, - №10. - С. 4-5.]. Недоліком існуючого способу є те, що він не дозволяє визначити пародонтопатогену мікрофлору в уражених судинах. В основу корисної моделі поставлене завдання розробити спосіб визначення пародонтопатогенних мікроорганізмів в атеросклеротичних бляшках, удосконаленням відомого способу, шляхом використання в якості біологічного матеріалу тканин судин з атеросклеротичними бляшками та застосуванням методу ДНК із цих тканин, досягти визначення пародонтопатогенних мікроорганізмів в атеросклеротичних бляшках судин, підтвердити їх роль та участь в розвитку серцево-судинних захворювань, що дозволить своєчасно виявляти групу ризику хворих, призначити патогенетичну терапію та забезпечити підвищення ефективності лікувально-профілактичних заходів при даній патології. Поставлена задача вирішується створенням способу визначення парадонтопатогенних мікроорганізмів в атеросклеротичних бляшках, що включає виділення ДНК, ПЛР із наступною ампліфікацією, їх ідентифікацією за допомогою електрофорезу, який згідно корисної моделі відрізняється тим, що як біологічні зразки використовують тканини судин з атеросклеротичними бляшками, а виділення ДНК з них проводять лізуючим методом. Заявлений спосіб виконується наступним чином: Було відібрано п'ять тканин судин без наявності атеросклеротичної бляшки (контрольна група) та 31 тканина з наявністю на стінці судини атеросклеротичної бляшки (дослідна група) у померлих людей. Для виділення ДНК пародонтопатогенів використовували реагенти набору для виділення ДНК із біоптату «ХЕЛИКОПОЛ» («ЛИТЕХ», Москва, Росія). Для цього відрізали шматочок судини розміром 2×3 мм та додавали 100 мкл лізуючого розчину. Інкубували у твердотілому термостаті при температурі 55°С до повного розчинення тканини (2-4 години), центрифугували 5 сек. при 8 тис. 4 об/хв. Далі додавали 300 мкл розчину І та 10 мкл суспензії сорбенту. Суміш інкубували 10 хв при кімнатній температурі з періодичним струшуванням. Центрифугували 15 хв при 8 тис. об/хв., видаляли супернатант, додавали розчин II, струшували на вортексі, знову центрифугувати. Відбирали супернатант та продовжували 2-х кратне промивання осаду з розчином III. Після останнього відбирання супернатанту осад просушували 5 хв при 50°С, додавали 50 мкл ТЕ-буфера, струшували на вортексі, інкубували 5 хв при 50°С, знову центрифугували. Таким чином отримували розчин ДНК, який використовували для подальшого якісного визначення пародонтопатогенів. Ампліфікацію ДНК пародонтопатогенів проводили на ампліфікаторі «Терцик» (ДНК-Технология, Москва, Росія) із додаванням специфічних праймерів, використовуючи набір «МультиДент» (ООО НПФ «Гентех», Росія). Ідентифікацію ДНК проводили за допомогою електрофорезу в 2% агарозному гелі, забарвленому етидіумом бромідом із подальшою візуалізацією в УФ світлі. Результати ПЦР вважали позитивними при наявності специфічної люмінесценції, яка співпадала із рівнем позитивного контрольного зразка, негативними - при відсутності специфічної люмінесценції в зразку. Математичну обробку отриманих даних проводили з використанням програмного пакету «STATISTICA 7.0 for Windows» і електронних таблиць MS Excel. Статистично значимими вважали відмінності при р